一株降解石油污染物的红球菌jzx-01及其培养方法
专利名称：一株降解石油污染物的红球菌jzx-01及其培养方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体的说涉及一种红球菌JZX-01，CGMCCNo. 5958、(Rhodococcus sp. JZX-Ol)培养方法及用途；他的培养条件以及该菌株在石油污染物降解过程中的作用。
背景技术：
在日常生活和工业生产等领域，石油及其衍生产品具有非常重要的作用。但是，石油在开采、冶炼、储存、运输和使用的过程中的排放，对环境造成了巨大的损害，加上世界各地频繁发生的漏油事故更加加剧了这种危害。地球上大部分的水域，尤其是海洋常年遭受石油的污染，已经引起了全世界的高度关注。 石油中不同的成分对人类和动植物有着不同的影响。低沸点的饱和烃会引起麻痹、昏迷、浓度过高时甚至会导致死亡。高沸点的烃类容易附着在植物的根系表面，形成一层阻碍营养物质和氧气穿过的粘膜，造成植物根部腐烂，影响植物的生长。石油中的反应基团，能与土壤中的无机氮和磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用。从而使土壤中有效的氮磷含量减少，影响作物的产量。石油中的多环芳烃类物质虽然含量不多，却是具有强烈毒性而且能对人体产生致癌作用的物质。多环芳烃能够在动植物尤其是海洋双壳类生物体内富集，通过食物链影响人类的身体健康。石油泄漏后引起的海域和陆地的污染也是对当地自然景观的极大损害，受污染的盐碱滩中，溢油的渗透可以达到很深的深度，难以清除，产生长期的有害影响。对石油的污染物的处理问题已经成为一个严重的，备受世界范围内瞩目的重大课题。石油污染物的处理方法主要包括三种，分别是物理法，化学法和生物法。其中的生物降解法由于具有花费小、适应能力强、高效安全且没有二次污染的优势成为研究的热点。微生物降解石油烃的能力取决于石油中各种组分的组成，碳链和多环芳烃的复杂程度，环境情况、菌株种类，表面活性剂、产生表面活性剂的细菌是否存在，以及环境的理化性质等诸(PH、温度、C N P的比率)诸多因素的综合影响。概括起来说，影响微生物对石油降解的非生物影响因素主要包括两大类第一是石油烃的情况，第二是环境因素。石油的烃类情况包括石油浓度、石油与水的互溶状态机石油的化学组成。环境因素包括温度、PH、氧气、营养物质和盐度等。由于石油烃在水中的溶解性极低，使得石油烃的利用率很低，导致生物降解石油的能力下降。在解决这个问题，提出了利用生物表面活性剂进行乳化油相与水相，使石油更加容易接触到细菌。生物表面活性剂是有微生物产生的两性复合物，它不仅能够黏附在细胞表面，而且也可以直接排除到胞外。将生物表面活性剂应用到石油工业中，不仅降低了石油的开采和运输的难度，而且增加了石油的开采量，对于环境保护方面来说，生物表面活性剂可以增加泄露在环境中的石油污染物的可生物降解能力。目前石油污染物生物降解的重点集中在高效石油降解菌的筛选和分离上，石油烃中最容易被降解的是短链的烷烃，Subarna等在2002年发现石油烃中ClO到C20的烷烃最容易被降解，2009年，Le Thi Nhi-Cong等发现在石油烃的降解过程中，首先降解掉的是直链烷烃，有分支的长链烷烃在降解过程中能够积累在一起，几乎不会被降解掉。然而，1986年Rontani等以及2001年Alvarez等发现有一些细菌具有氧化这些顽固底物的能力。例如，1993年，Sorkhon等发现芽孢杆菌只能降解C15到C17的烃类；2001年Kato等发现喜热噬油芽胞杆菌能降解烷烃的到C23 ；2005年，Nazina等发现脂肪地芽孢杆菌只在能在C6到C16碳源的烷烃中生长。只有少数几种菌株具有大范围的降解能力，Sakai等在1994年分离得到的不动杆菌属能降解C13到C44链烧烃；2003年，van Beilen等筛选的红球菌属能将长链烷烃降解到C36。因此找到能够降解范围广泛，可以将石油污染物内的C38以内的组分高效降解的微生物具有非常大的理论和实际应用价值，这在石油污染区域的生物修复，改良生态环境和人类的安全健康方面具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的石油污染物降解菌株，即红球菌JZX-01。本发明的另一个目的是提供上述红球菌JZX-OI的培养条件。本发明的目的还包括提供红球菌JZX-OI在实际生活中的应用，具体的说是用于降解石油或原油等污染物为环境友好物质。本发明所拱的菌株是采取逐级筛选的方法，直接从土壤中筛选含有所需的目的菌种并分离纯化而得到，而且提供了该菌种的培养条件和在石油或原油等污染物降解的用途。本发明所述的红球菌JZX-Ol的16S rDNA的鉴定是通过在美国国立生物技术信息中心NCBI中进行的，通过提交序列后得到的16S rDNA的序列号为JQ648650。本发明的技术方案如下一种红球菌JZX-01，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的登记号为CGMCC No. 5958的红球菌；保藏日期2012年4月9日。一种红球菌JZX-01，是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，上游和下游引物都是通用引物，上游引物是27F，具体的序列是5’-AGA GTT TGATCC TGG CTCAG-3’，下游引物是 1492R，具体的序列是 5’ -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3’。本发明的红球菌JZX-Ol的培养方法，步骤如下(I)红球菌JZX-Ol菌体或者孢子接到斜面上，在斜面上培养1-4天，所述的培养基成分是碳源l_20g/L，氮源l-5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素混合溶液溶液l_20mL/L、琼脂l-30g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l-5g/L,加蒸懼水定容至1L。(2)将菌体从斜面上取得后，转接到培养液中培养1-4天，所述的培养液的成分是氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l_5g/L，诱导剂1-10ML/L，加蒸馏水定容至1L，pH值是3-9，培养温度是5°C -45 °C。所述的碳源是为可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油。所述的氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黄豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠或硝酸钾。所述的微量元素是猛、锌、钴、镍、镁、铁、 丐、铜、铬、硒、钥、钴或氟。所述的诱导剂添加到培养基或培养液中作为JZX-Ol的唯一碳源进行培养，保证菌种只能利用此种碳源进行生长代谢；所述的诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。培养1-4天后的培养液在lOOO-lOOOOrpm的转速下，0_20°C的温度下进行离心1-10分钟。离心后的到的菌体JZX-01用不含碳源的无机盐培养基洗涤1-3次，除去培养基中的营养物质，将纯净的JZX-01加入到培养基中进行培养。
本发明提供的红球菌已于2012年4月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏的编号为CGMCC No. 5958，分类命名为红球菌(Rhodococcus sp)。本发明的效果是红球菌JZX-01能够以很高的效率降解诱导剂，而且在较短的时间内降解率较高。本发明的效果还有红球菌JZX-01能够高效的产生生物表面活性剂，而降低培养液的表面张力，增加诱导剂与无机盐溶液的相互乳化能力。本发明所述的红球菌JZX-01具有产生生物表面活性剂的能力，这种能力在以石油烃等诱导剂为底物的降解过程中具有重要意义。本发明提供的红球菌JZX-01的生理生化特征，具体的说如下表
实验项目结果实验项目结果实验项目结果实验项目结果
精氨酸-硝酸盐还原 +ONPG__+硫化氢__+_
鸟氨酸 -尿素__+蔗糖__+葡萄糖__+_
赖氨酸 -七叶苷__-麦芽糖 +氧化酶__+_
枸橡酸盐__+__青定基质试验 -__木糖__^__革兰氏染色 +_注表中+表示阳性，-表示阴性。具体说明如下本发明的红球菌的鉴定是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，所用的16S rDNA的上游引物是通用引物27F，具体的序列是5’-AGA GTTTGATCC TGG CTCAG-3’，下游的通用引物是1492R，具体的序列是5’-GGT TAC CTT GTTACG ACT T-3，。本发明的红球菌JZX-01的筛选方法，具体的说是将诱导剂加入到培养基或者培养液中，并将土壤加入到培养液或者培养基，在摇床中进行培养，培养的温度是10_40°C，培养的转速是100-300rpm。培养1_4天后，转接到新鲜的培养基或培养液中进行筛选。本发明的红球菌JZX-01的培养方法，具体的说是用接种针挑取从土壤中分离筛选纯化得到的红球菌jZX-ΟΙ菌体或孢子接种到斜面上，在斜面培养基生长1-4天，所述的培养基成分是碳源(可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油)l_20g/L，氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、琼脂l_30g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l-5g/L加蒸懼水定容至1L。在生长良好的斜面培养基中加入没有诱导剂的液体无机盐培养基，洗涤下菌体之后将菌体直接倒入培养液中进行培养，培养温度是是5°C _45°C，培养基或培养液的成分是氮源l-5g/L、NaCl 0_2g/L、微量元素混合溶液l_20mL/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物0_5g/L，诱导剂1-50ML/L，加蒸馏水定容，PH值是3_9，培养温度是5°C -45°C，所述的诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。本发明的培养方法中，经过培养液培养后分离的到的菌体，可以用除去碳源的培养基或培养液洗涤菌体，再离心分离，所得到的菌群可以直接加入到含诱导剂的无机盐培养基中进行诱导剂的降解反应。上述碳源是可溶性淀粉、甘油、葡萄糖。其中菌体在葡萄糖、甘油和可溶性淀粉中的生长旺盛。上述氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黄豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾。其中牛肉膏、牛肉浸取物、硝酸钠或硫酸铵的存在下，菌体生长良好，在硝酸根离子单独存在的情况下，菌体也可以良好生长。表明JZX-01具备氧化 高价氮元素的作用。蛋白胨由于其双性电解的性质，具备良好的缓冲作用，便于细菌吸收利 用，但是在使用时细胞生长缓慢。上述诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。用烷烃、原油、柴油和汽油作为诱导剂时，JZX-01表现出良好的降解性能。其中以烷烃或柴油作为诱导剂时，JZX-01还能产生生物表面活性剂，降低菌液的表面张力，促进这些水不溶性物质的乳化作用和降解作用。诱导剂是在波长为400-700的菌体初始OD值为O. 1-2的条件下加入的。诱导剂的量对菌体的生长有着先促进后抑制的作用，每升溶液的合适诱导剂为l_20g。上述微量元素是微量元素是锰、锌、钴、镍、镁、铁、钙、铜、铬、硒、钥、钴或氟。微量元素溶液如，MnSO4 · 4H20, ZnSO4 · 7H20, Na2MoO4 · 2H20, CuSO4 · 5H20, FeSO4 · 7H20, CaCl2,NaSO4 或 H3BO3 等。本发明优选的培养基成分是可溶性淀粉l_5g/L，牛肉浸取物l_5g/L，硝酸钠l-5g/L, K2HP04 O. 5_5g/L，KH2P04 O. 5_5g/L，NaCl O. l_2g/L，微量元素溶液 1-20ML/L。本发明筛选得到的红球菌JZX-Ol能够降解石油污染物，降解范围广泛，可以将石油污染物内的C38以内的组分高效的降解掉。不仅如此，难以降解的支链成分，例如姥鲛烷和植烷都可以被大部分的降解。红球菌JZX-Ol产生表面活性剂的能力又进一步的增加了石油降解的效率。经过考察，红球菌JZX-Ol可以将石油污染物高效、安全的降解，可以用于对石油污染物的生物处理。
图I是红球菌JZX-Ol与相关菌株的进化树。JZX-Ol的16S rDNA是通过在美国国立生物技术信息中心NCBI进行鉴定的并得到16S rDNA的序列号为JQ648650。采用N-J方法，自展值为1000的条件下得到JZX-Ol的系统进化树。
具体实施例方式通过下面结合具体实例将有助于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限制于此实施例I :红球菌JZX-OI的筛选从环渤海地带中受石油污染严重的区域取回被污染土壤，在收集土壤样品的过程中，在不同的深度和位点进行土壤的取样。取回的土壤样品用将诱导剂加入到培养基或者培养液中，并将土壤加入到培养液或者培养基，在摇床中进行培养，培养的温度是10-40°C，培养的转速是100-300rpm。培养1_4天后，转接到新鲜的培养基或培养液中进行筛选。其中，所述的培养基成分是硫酸铵5g/L、NaCl O. 5g/L、微量元素混合溶液10mL/L、磷酸氢二钾3g/L、磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。添加的诱导剂5mL/L，培养温度是是30°C，PH值是7. 0，所述的诱导剂是柴油。上述的培养基或者培养液均在121°C灭菌30分钟。培养3天后，将菌液转移至新鲜的培养基或培养液中，加入等量的诱导剂，重复操作3次。实施例2红球菌JZX-Ol的纯化将得到的菌液稀释后在固体营养培养基中涂布，固体营养培养基的成分是可溶性淀粉2g/L、硫酸铵5g/L、NaCl O. 5g/L、微量元素溶液10mL/L、琼脂20g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物3g/L、磷酸氢二钾3g/L、磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。挑取 单菌落进行保藏。得到单菌落后，分别验证每个菌株对柴油的降解能力，其中一株降解能力最好的菌株命名为JZX-Ol。实施例3碳源对红球菌JZX-Ol生长的影响获得的红球菌JZX-Ol在液体营养培养基中进行扩大培养，液体营养培养基的碳源分别是可溶性淀粉2g/L、甘油2g/L、葡萄糖2g/L，氮源是硫酸铵5g/L，NaClO. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。分别考察上述三种碳源对菌体生长的影响，结果发现添加可溶性淀粉2g/L的培养基中，JZX-Ol的生长状况最好。实施例4氮源对红球菌JZX-Ol生长的影响获得的红球菌JZX-Ol在液体营养培养基中进行扩大培养，液体营养培养基的氮源分别是牛肉膏5g/L、牛肉浸取物5g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、黄豆粉浸液5g/L、L-谷氨酸氨5g/L、硫酸铵5g/L、氯化铵5g/L、硝酸钠5g/L、硝酸钾5g/L，碳源是可溶性淀粉2g/L，NaCl O. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。分别考察上述十种碳源对菌体生长的影响，结果发现添加硫酸铵5g/L的培养基中，JZX-Ol的生长状况最好。实施例5用于培养JZX-Ol的微量兀素混合液本发明的微量兀素是固体营养培养基、液体营养培养基和无机盐培养基中必须添加的混合溶液，为红球菌JZX-Ol生长提供必需的微量元素。微量元素混合液的成分是Na2EDTA · H2O I. 2g/L,固体 NaOH O. 6g/L, MnSO4 · 4H20 O. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 08g/L,98%浓硫酸 0. 06g/L, Na2M0O4 · 2H20 0. 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 03g/L, CuSO4 · 5H20 0. Olg/L, CaCl20. 3g/L 以及固体 NaSO4 0. 5g/L。实施例6不同诱导剂对红球菌JZX-01生长的影响红球菌JZX-01在无机盐培养基中，使用不同的诱导剂进行生长，无机盐培养基的诱导剂分别是体积比为1%的烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡和多环芳烃，氮源是硫酸铵5g/L，NaCl O. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。分别考察上述六种诱导剂对菌体生长的影响，结果发现在添加1%体积比的柴油培养基中，JZX-Ol的生长状况最好。实施例7扩大培养后红球菌JZX-Ol纯菌体的获得红球菌JZX-Ol在液体营养培养基，300C，200rpm的摇床中生长3天后，吸取IOmL的培养液在，弃去上清液之后，用无菌无机盐溶液进行在IOOOrpm的漩涡震荡器中震荡洗涤10分钟，将混合均匀的溶液重新在8000rpm的离心机中离心10分钟，重复上述过程3次，弃净上清液，得到大量的红球菌JZX-Ol。实施例8
上述红球菌(Rhodococcus.Sp JZX-OI) CGMCC No. 5958 菌株 16SrDNA 基因的提取将JZX-Ol在培养基或培养液中培养3天，得到高浓度的细胞培养液。取I. 5mL的培养液，在SOOOrpm的转速下进行离心，沉淀物中加入灭菌无机盐培养基进行洗涤，再次离心弃上清，得到的沉淀加入IOOuL的破菌缓冲液，漩涡震荡混匀。然后依次加入O. 4g石英砂，300uL苯酚氯仿异戊醇(比例为25 24 I)的混合液，再次漩涡震荡三分钟，进行细菌破壁处理。加入IOOuL的TE缓缓冲液后，漩涡震荡混匀。之后在12000rpm的转速下离心10分钟，取大约300uL的上清液。在上清液中加入30uL的3M NaAC和600uL的无水乙醇，混匀后室温下静置30分钟以上。之后在12000rpm的转速下离心8分钟，弃净上清。沉淀物中加入如70%的乙醇进行洗涤，12000rpm离心5分钟，弃上清，自然风干。烘干后的样品中，加入50uL的EB缓冲液进行洗脱，洗脱后放置于-20°C的冰箱中保藏。至此，得到JZX-Ol基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，以购买于上海生物工程公司的通用引物27f和1492r为引物，加入上游引物27f 2uL，下游引物1492r 2uL，加入模板即红球菌(Rhodococcus. Sp JZX-01) CGMCC No. 5958 菌株的基因组 DNA 3uL, plus master mix taqDNA合成酶25uL，补充双蒸水18uL后，加入到PCR扩增仪之中。PCR扩增仪的升温程序如下94°C加热4分钟，94°C进行变性I分钟，温度53 °C进行退火30秒，72 °C进行延伸2分钟，将从53°C到72°C的循环进行30次，最后在72°C保持10分钟，使反应混合物充分扩增，后转到4°C终止扩增反应，一段时间后从PCR扩增仪中拿出样品，放置于4°C冰箱里进行短期保存或者-20°C下进行长期保存。扩增得到的16S rDNA产物取出5uL，在含0. 8%的琼脂凝胶电泳中进行验证，使用IOObp的基因标记物进行标记。含目的片段(1500bp)的PCR产物混合，0. 8%琼脂糖凝胶电泳回收，回收时更换新的电泳液，切胶纯化，对电泳检测验证合格的PCR样品进行测序。实施例9红球菌JZX-OI的系统进化树根据红球菌的测序结果进行对比，红球菌(Rhodococcus. sp) CGMCC No. 5958菌株的16 SrDNA基因序列长度为1376bp，核苷酸序列如下I tcgaacgatg aagcccagct tgctgggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg61 gtgatctgcc ctgcacttcg ggataagcct gggaaactgg gtctaatacc ggataggacc121 tcgggatgca tgttccgggg tggaaaggtt ttccggtgca ggatgggccc gcggcctatc
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权利要求
1.一种红球菌JZX-01，其特征是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的登记号为CGMCC No. 5958的红球菌；保藏日期2012年4月9日。
2.一种如权利要求I所述的红球菌JZX-Ol的培养方法，其特征是步骤如下 (1)红球菌JZX-Ol菌体或者孢子接到斜面上，在斜面上培养1-4天，所述的培养基成分是碳源l_20g/L，氮源l-5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素混合溶液溶液l_20mL/L、琼脂l_30g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l-5g/L,加蒸懼水定容至1L。
(2)将菌体从斜面上取得后，转接到培养液中培养1-4天，所述的培养液的成分是氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l-5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l_5g/L,诱导剂1-10ML/L,加蒸懼水定容至1L,pH值是3-9，培养温度是5°C -45 0C。
3.一种红球菌JZX-OI，其特征是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，上游和下游引物都是通用引物，上游引物是27F，具体的序列是5’ -AGAGTT TGA TCC TGG CTCAG-3’，下游引物是 1492R，具体的序列是 5’ -GGT TAC CTTGTT ACG ACT T-3’。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的碳源是为可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油。
5.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黄豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠或硝酸钾。
6.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的微量元素是锰、锌、钴、镍、镁、铁、I丐、铜、铬、硒、钥、钴或氟。
7.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的诱导剂添加到培养基或培养液中作为JZX-Ol的唯一碳源进行培养，保证菌种只能利用此种碳源进行生长代谢；所述的诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。
8.如权利要求3所述的培养方法，其特征是培养14天后的培养液在转速lOOO-lOOOOrpm，温度0_20°C下进行离心1-10分钟。
9.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的离心后的到的菌体JZX-01用不含碳源的无机盐培养基洗涤1-3次，除去培养基中的营养物质，将纯净的JZX-01加入到培养基中进行培养。
全文摘要
本发明涉及一株降解石油污染物的红球菌JZX-01及其培养方法；红球菌的鉴定是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，所用的16S rDNA的上游引物是通用引物27F，具体的序列是5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3'，下游的通用引物是1492R，具体的序列是5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'。将诱导剂加入到培养基或者培养液中，并将土壤加入到培养液或者培养基，在摇床中进行培养，培养的温度是10-40℃，培养的转速是100-300rpm。培养1-4天后，转接到新鲜的培养基或培养液中进行筛选。由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的登记号为CGMCC No.5958的红球菌；保藏日期2012年4月9日。红球菌JZX-01产生表面活性剂的能力又进一步的增加了石油降解的效率。可以用于对石油污染物的生物处理。
文档编号A62D101/20GK102851234SQ201210198948
公开日2013年1月2日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者贾晓强, 周征西, 闻建平 申请人:天津大学
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体的说涉及一种红球菌JZX-01，CGMCCNo. 5958、(Rhodococcus sp. JZX-Ol)培养方法及用途；他的培养条件以及该菌株在石油污染物降解过程中的作用。
背景技术：
在日常生活和工业生产等领域，石油及其衍生产品具有非常重要的作用。但是，石油在开采、冶炼、储存、运输和使用的过程中的排放，对环境造成了巨大的损害，加上世界各地频繁发生的漏油事故更加加剧了这种危害。地球上大部分的水域，尤其是海洋常年遭受石油的污染，已经引起了全世界的高度关注。 石油中不同的成分对人类和动植物有着不同的影响。低沸点的饱和烃会引起麻痹、昏迷、浓度过高时甚至会导致死亡。高沸点的烃类容易附着在植物的根系表面，形成一层阻碍营养物质和氧气穿过的粘膜，造成植物根部腐烂，影响植物的生长。石油中的反应基团，能与土壤中的无机氮和磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用。从而使土壤中有效的氮磷含量减少，影响作物的产量。石油中的多环芳烃类物质虽然含量不多，却是具有强烈毒性而且能对人体产生致癌作用的物质。多环芳烃能够在动植物尤其是海洋双壳类生物体内富集，通过食物链影响人类的身体健康。石油泄漏后引起的海域和陆地的污染也是对当地自然景观的极大损害，受污染的盐碱滩中，溢油的渗透可以达到很深的深度，难以清除，产生长期的有害影响。对石油的污染物的处理问题已经成为一个严重的，备受世界范围内瞩目的重大课题。石油污染物的处理方法主要包括三种，分别是物理法，化学法和生物法。其中的生物降解法由于具有花费小、适应能力强、高效安全且没有二次污染的优势成为研究的热点。微生物降解石油烃的能力取决于石油中各种组分的组成，碳链和多环芳烃的复杂程度，环境情况、菌株种类，表面活性剂、产生表面活性剂的细菌是否存在，以及环境的理化性质等诸(PH、温度、C N P的比率)诸多因素的综合影响。概括起来说，影响微生物对石油降解的非生物影响因素主要包括两大类第一是石油烃的情况，第二是环境因素。石油的烃类情况包括石油浓度、石油与水的互溶状态机石油的化学组成。环境因素包括温度、PH、氧气、营养物质和盐度等。由于石油烃在水中的溶解性极低，使得石油烃的利用率很低，导致生物降解石油的能力下降。在解决这个问题，提出了利用生物表面活性剂进行乳化油相与水相，使石油更加容易接触到细菌。生物表面活性剂是有微生物产生的两性复合物，它不仅能够黏附在细胞表面，而且也可以直接排除到胞外。将生物表面活性剂应用到石油工业中，不仅降低了石油的开采和运输的难度，而且增加了石油的开采量，对于环境保护方面来说，生物表面活性剂可以增加泄露在环境中的石油污染物的可生物降解能力。目前石油污染物生物降解的重点集中在高效石油降解菌的筛选和分离上，石油烃中最容易被降解的是短链的烷烃，Subarna等在2002年发现石油烃中ClO到C20的烷烃最容易被降解，2009年，Le Thi Nhi-Cong等发现在石油烃的降解过程中，首先降解掉的是直链烷烃，有分支的长链烷烃在降解过程中能够积累在一起，几乎不会被降解掉。然而，1986年Rontani等以及2001年Alvarez等发现有一些细菌具有氧化这些顽固底物的能力。例如，1993年，Sorkhon等发现芽孢杆菌只能降解C15到C17的烃类；2001年Kato等发现喜热噬油芽胞杆菌能降解烷烃的到C23 ；2005年，Nazina等发现脂肪地芽孢杆菌只在能在C6到C16碳源的烷烃中生长。只有少数几种菌株具有大范围的降解能力，Sakai等在1994年分离得到的不动杆菌属能降解C13到C44链烧烃；2003年，van Beilen等筛选的红球菌属能将长链烷烃降解到C36。因此找到能够降解范围广泛，可以将石油污染物内的C38以内的组分高效降解的微生物具有非常大的理论和实际应用价值，这在石油污染区域的生物修复，改良生态环境和人类的安全健康方面具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的石油污染物降解菌株，即红球菌JZX-01。本发明的另一个目的是提供上述红球菌JZX-OI的培养条件。本发明的目的还包括提供红球菌JZX-OI在实际生活中的应用，具体的说是用于降解石油或原油等污染物为环境友好物质。本发明所拱的菌株是采取逐级筛选的方法，直接从土壤中筛选含有所需的目的菌种并分离纯化而得到，而且提供了该菌种的培养条件和在石油或原油等污染物降解的用途。本发明所述的红球菌JZX-Ol的16S rDNA的鉴定是通过在美国国立生物技术信息中心NCBI中进行的，通过提交序列后得到的16S rDNA的序列号为JQ648650。本发明的技术方案如下一种红球菌JZX-01，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的登记号为CGMCC No. 5958的红球菌；保藏日期2012年4月9日。一种红球菌JZX-01，是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，上游和下游引物都是通用引物，上游引物是27F，具体的序列是5’-AGA GTT TGATCC TGG CTCAG-3’，下游引物是 1492R，具体的序列是 5’ -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3’。本发明的红球菌JZX-Ol的培养方法，步骤如下(I)红球菌JZX-Ol菌体或者孢子接到斜面上，在斜面上培养1-4天，所述的培养基成分是碳源l_20g/L，氮源l-5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素混合溶液溶液l_20mL/L、琼脂l-30g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l-5g/L,加蒸懼水定容至1L。(2)将菌体从斜面上取得后，转接到培养液中培养1-4天，所述的培养液的成分是氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l_5g/L，诱导剂1-10ML/L，加蒸馏水定容至1L，pH值是3-9，培养温度是5°C -45 °C。所述的碳源是为可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油。所述的氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黄豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠或硝酸钾。所述的微量元素是猛、锌、钴、镍、镁、铁、 丐、铜、铬、硒、钥、钴或氟。所述的诱导剂添加到培养基或培养液中作为JZX-Ol的唯一碳源进行培养，保证菌种只能利用此种碳源进行生长代谢；所述的诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。培养1-4天后的培养液在lOOO-lOOOOrpm的转速下，0_20°C的温度下进行离心1-10分钟。离心后的到的菌体JZX-01用不含碳源的无机盐培养基洗涤1-3次，除去培养基中的营养物质，将纯净的JZX-01加入到培养基中进行培养。
本发明提供的红球菌已于2012年4月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏的编号为CGMCC No. 5958，分类命名为红球菌(Rhodococcus sp)。本发明的效果是红球菌JZX-01能够以很高的效率降解诱导剂，而且在较短的时间内降解率较高。本发明的效果还有红球菌JZX-01能够高效的产生生物表面活性剂，而降低培养液的表面张力，增加诱导剂与无机盐溶液的相互乳化能力。本发明所述的红球菌JZX-01具有产生生物表面活性剂的能力，这种能力在以石油烃等诱导剂为底物的降解过程中具有重要意义。本发明提供的红球菌JZX-01的生理生化特征，具体的说如下表
实验项目结果实验项目结果实验项目结果实验项目结果
精氨酸-硝酸盐还原 +ONPG__+硫化氢__+_
鸟氨酸 -尿素__+蔗糖__+葡萄糖__+_
赖氨酸 -七叶苷__-麦芽糖 +氧化酶__+_
枸橡酸盐__+__青定基质试验 -__木糖__^__革兰氏染色 +_注表中+表示阳性，-表示阴性。具体说明如下本发明的红球菌的鉴定是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，所用的16S rDNA的上游引物是通用引物27F，具体的序列是5’-AGA GTTTGATCC TGG CTCAG-3’，下游的通用引物是1492R，具体的序列是5’-GGT TAC CTT GTTACG ACT T-3，。本发明的红球菌JZX-01的筛选方法，具体的说是将诱导剂加入到培养基或者培养液中，并将土壤加入到培养液或者培养基，在摇床中进行培养，培养的温度是10_40°C，培养的转速是100-300rpm。培养1_4天后，转接到新鲜的培养基或培养液中进行筛选。本发明的红球菌JZX-01的培养方法，具体的说是用接种针挑取从土壤中分离筛选纯化得到的红球菌jZX-ΟΙ菌体或孢子接种到斜面上，在斜面培养基生长1-4天，所述的培养基成分是碳源(可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油)l_20g/L，氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、琼脂l_30g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l-5g/L加蒸懼水定容至1L。在生长良好的斜面培养基中加入没有诱导剂的液体无机盐培养基，洗涤下菌体之后将菌体直接倒入培养液中进行培养，培养温度是是5°C _45°C，培养基或培养液的成分是氮源l-5g/L、NaCl 0_2g/L、微量元素混合溶液l_20mL/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物0_5g/L，诱导剂1-50ML/L，加蒸馏水定容，PH值是3_9，培养温度是5°C -45°C，所述的诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。本发明的培养方法中，经过培养液培养后分离的到的菌体，可以用除去碳源的培养基或培养液洗涤菌体，再离心分离，所得到的菌群可以直接加入到含诱导剂的无机盐培养基中进行诱导剂的降解反应。上述碳源是可溶性淀粉、甘油、葡萄糖。其中菌体在葡萄糖、甘油和可溶性淀粉中的生长旺盛。上述氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黄豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾。其中牛肉膏、牛肉浸取物、硝酸钠或硫酸铵的存在下，菌体生长良好，在硝酸根离子单独存在的情况下，菌体也可以良好生长。表明JZX-01具备氧化 高价氮元素的作用。蛋白胨由于其双性电解的性质，具备良好的缓冲作用，便于细菌吸收利 用，但是在使用时细胞生长缓慢。上述诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。用烷烃、原油、柴油和汽油作为诱导剂时，JZX-01表现出良好的降解性能。其中以烷烃或柴油作为诱导剂时，JZX-01还能产生生物表面活性剂，降低菌液的表面张力，促进这些水不溶性物质的乳化作用和降解作用。诱导剂是在波长为400-700的菌体初始OD值为O. 1-2的条件下加入的。诱导剂的量对菌体的生长有着先促进后抑制的作用，每升溶液的合适诱导剂为l_20g。上述微量元素是微量元素是锰、锌、钴、镍、镁、铁、钙、铜、铬、硒、钥、钴或氟。微量元素溶液如，MnSO4 · 4H20, ZnSO4 · 7H20, Na2MoO4 · 2H20, CuSO4 · 5H20, FeSO4 · 7H20, CaCl2,NaSO4 或 H3BO3 等。本发明优选的培养基成分是可溶性淀粉l_5g/L，牛肉浸取物l_5g/L，硝酸钠l-5g/L, K2HP04 O. 5_5g/L，KH2P04 O. 5_5g/L，NaCl O. l_2g/L，微量元素溶液 1-20ML/L。本发明筛选得到的红球菌JZX-Ol能够降解石油污染物，降解范围广泛，可以将石油污染物内的C38以内的组分高效的降解掉。不仅如此，难以降解的支链成分，例如姥鲛烷和植烷都可以被大部分的降解。红球菌JZX-Ol产生表面活性剂的能力又进一步的增加了石油降解的效率。经过考察，红球菌JZX-Ol可以将石油污染物高效、安全的降解，可以用于对石油污染物的生物处理。
图I是红球菌JZX-Ol与相关菌株的进化树。JZX-Ol的16S rDNA是通过在美国国立生物技术信息中心NCBI进行鉴定的并得到16S rDNA的序列号为JQ648650。采用N-J方法，自展值为1000的条件下得到JZX-Ol的系统进化树。
具体实施例方式通过下面结合具体实例将有助于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限制于此实施例I :红球菌JZX-OI的筛选从环渤海地带中受石油污染严重的区域取回被污染土壤，在收集土壤样品的过程中，在不同的深度和位点进行土壤的取样。取回的土壤样品用将诱导剂加入到培养基或者培养液中，并将土壤加入到培养液或者培养基，在摇床中进行培养，培养的温度是10-40°C，培养的转速是100-300rpm。培养1_4天后，转接到新鲜的培养基或培养液中进行筛选。其中，所述的培养基成分是硫酸铵5g/L、NaCl O. 5g/L、微量元素混合溶液10mL/L、磷酸氢二钾3g/L、磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。添加的诱导剂5mL/L，培养温度是是30°C，PH值是7. 0，所述的诱导剂是柴油。上述的培养基或者培养液均在121°C灭菌30分钟。培养3天后，将菌液转移至新鲜的培养基或培养液中，加入等量的诱导剂，重复操作3次。实施例2红球菌JZX-Ol的纯化将得到的菌液稀释后在固体营养培养基中涂布，固体营养培养基的成分是可溶性淀粉2g/L、硫酸铵5g/L、NaCl O. 5g/L、微量元素溶液10mL/L、琼脂20g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物3g/L、磷酸氢二钾3g/L、磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。挑取 单菌落进行保藏。得到单菌落后，分别验证每个菌株对柴油的降解能力，其中一株降解能力最好的菌株命名为JZX-Ol。实施例3碳源对红球菌JZX-Ol生长的影响获得的红球菌JZX-Ol在液体营养培养基中进行扩大培养，液体营养培养基的碳源分别是可溶性淀粉2g/L、甘油2g/L、葡萄糖2g/L，氮源是硫酸铵5g/L，NaClO. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。分别考察上述三种碳源对菌体生长的影响，结果发现添加可溶性淀粉2g/L的培养基中，JZX-Ol的生长状况最好。实施例4氮源对红球菌JZX-Ol生长的影响获得的红球菌JZX-Ol在液体营养培养基中进行扩大培养，液体营养培养基的氮源分别是牛肉膏5g/L、牛肉浸取物5g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、黄豆粉浸液5g/L、L-谷氨酸氨5g/L、硫酸铵5g/L、氯化铵5g/L、硝酸钠5g/L、硝酸钾5g/L，碳源是可溶性淀粉2g/L，NaCl O. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。分别考察上述十种碳源对菌体生长的影响，结果发现添加硫酸铵5g/L的培养基中，JZX-Ol的生长状况最好。实施例5用于培养JZX-Ol的微量兀素混合液本发明的微量兀素是固体营养培养基、液体营养培养基和无机盐培养基中必须添加的混合溶液，为红球菌JZX-Ol生长提供必需的微量元素。微量元素混合液的成分是Na2EDTA · H2O I. 2g/L,固体 NaOH O. 6g/L, MnSO4 · 4H20 O. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 08g/L,98%浓硫酸 0. 06g/L, Na2M0O4 · 2H20 0. 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 03g/L, CuSO4 · 5H20 0. Olg/L, CaCl20. 3g/L 以及固体 NaSO4 0. 5g/L。实施例6不同诱导剂对红球菌JZX-01生长的影响红球菌JZX-01在无机盐培养基中，使用不同的诱导剂进行生长，无机盐培养基的诱导剂分别是体积比为1%的烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡和多环芳烃，氮源是硫酸铵5g/L，NaCl O. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾3g/L加蒸馏水定容至1L。分别考察上述六种诱导剂对菌体生长的影响，结果发现在添加1%体积比的柴油培养基中，JZX-Ol的生长状况最好。实施例7扩大培养后红球菌JZX-Ol纯菌体的获得红球菌JZX-Ol在液体营养培养基，300C，200rpm的摇床中生长3天后，吸取IOmL的培养液在，弃去上清液之后，用无菌无机盐溶液进行在IOOOrpm的漩涡震荡器中震荡洗涤10分钟，将混合均匀的溶液重新在8000rpm的离心机中离心10分钟，重复上述过程3次，弃净上清液，得到大量的红球菌JZX-Ol。实施例8
上述红球菌(Rhodococcus.Sp JZX-OI) CGMCC No. 5958 菌株 16SrDNA 基因的提取将JZX-Ol在培养基或培养液中培养3天，得到高浓度的细胞培养液。取I. 5mL的培养液，在SOOOrpm的转速下进行离心，沉淀物中加入灭菌无机盐培养基进行洗涤，再次离心弃上清，得到的沉淀加入IOOuL的破菌缓冲液，漩涡震荡混匀。然后依次加入O. 4g石英砂，300uL苯酚氯仿异戊醇(比例为25 24 I)的混合液，再次漩涡震荡三分钟，进行细菌破壁处理。加入IOOuL的TE缓缓冲液后，漩涡震荡混匀。之后在12000rpm的转速下离心10分钟，取大约300uL的上清液。在上清液中加入30uL的3M NaAC和600uL的无水乙醇，混匀后室温下静置30分钟以上。之后在12000rpm的转速下离心8分钟，弃净上清。沉淀物中加入如70%的乙醇进行洗涤，12000rpm离心5分钟，弃上清，自然风干。烘干后的样品中，加入50uL的EB缓冲液进行洗脱，洗脱后放置于-20°C的冰箱中保藏。至此，得到JZX-Ol基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，以购买于上海生物工程公司的通用引物27f和1492r为引物，加入上游引物27f 2uL，下游引物1492r 2uL，加入模板即红球菌(Rhodococcus. Sp JZX-01) CGMCC No. 5958 菌株的基因组 DNA 3uL, plus master mix taqDNA合成酶25uL，补充双蒸水18uL后，加入到PCR扩增仪之中。PCR扩增仪的升温程序如下94°C加热4分钟，94°C进行变性I分钟，温度53 °C进行退火30秒，72 °C进行延伸2分钟，将从53°C到72°C的循环进行30次，最后在72°C保持10分钟，使反应混合物充分扩增，后转到4°C终止扩增反应，一段时间后从PCR扩增仪中拿出样品，放置于4°C冰箱里进行短期保存或者-20°C下进行长期保存。扩增得到的16S rDNA产物取出5uL，在含0. 8%的琼脂凝胶电泳中进行验证，使用IOObp的基因标记物进行标记。含目的片段(1500bp)的PCR产物混合，0. 8%琼脂糖凝胶电泳回收，回收时更换新的电泳液，切胶纯化，对电泳检测验证合格的PCR样品进行测序。实施例9红球菌JZX-OI的系统进化树根据红球菌的测序结果进行对比，红球菌(Rhodococcus. sp) CGMCC No. 5958菌株的16 SrDNA基因序列长度为1376bp，核苷酸序列如下I tcgaacgatg aagcccagct tgctgggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg61 gtgatctgcc ctgcacttcg ggataagcct gggaaactgg gtctaatacc ggataggacc121 tcgggatgca tgttccgggg tggaaaggtt ttccggtgca ggatgggccc gcggcctatc
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权利要求
1.一种红球菌JZX-01，其特征是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的登记号为CGMCC No. 5958的红球菌；保藏日期2012年4月9日。
2.一种如权利要求I所述的红球菌JZX-Ol的培养方法，其特征是步骤如下 (1)红球菌JZX-Ol菌体或者孢子接到斜面上，在斜面上培养1-4天，所述的培养基成分是碳源l_20g/L，氮源l-5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素混合溶液溶液l_20mL/L、琼脂l_30g/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l-5g/L,加蒸懼水定容至1L。
(2)将菌体从斜面上取得后，转接到培养液中培养1-4天，所述的培养液的成分是氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、磷酸根的一价金属离子或者其水合物l-5g/L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物l_5g/L,诱导剂1-10ML/L,加蒸懼水定容至1L,pH值是3-9，培养温度是5°C -45 0C。
3.一种红球菌JZX-OI，其特征是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，上游和下游引物都是通用引物，上游引物是27F，具体的序列是5’ -AGAGTT TGA TCC TGG CTCAG-3’，下游引物是 1492R，具体的序列是 5’ -GGT TAC CTTGTT ACG ACT T-3’。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的碳源是为可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油。
5.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黄豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠或硝酸钾。
6.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的微量元素是锰、锌、钴、镍、镁、铁、I丐、铜、铬、硒、钥、钴或氟。
7.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的诱导剂添加到培养基或培养液中作为JZX-Ol的唯一碳源进行培养，保证菌种只能利用此种碳源进行生长代谢；所述的诱导剂是烷烃、原油、柴油、汽油、液态石蜡或多环芳烃。
8.如权利要求3所述的培养方法，其特征是培养14天后的培养液在转速lOOO-lOOOOrpm，温度0_20°C下进行离心1-10分钟。
9.如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述的离心后的到的菌体JZX-01用不含碳源的无机盐培养基洗涤1-3次，除去培养基中的营养物质，将纯净的JZX-01加入到培养基中进行培养。
全文摘要
本发明涉及一株降解石油污染物的红球菌JZX-01及其培养方法；红球菌的鉴定是通过16S rDNA测序以及在NCBI上进行比对得到的，所用的16S rDNA的上游引物是通用引物27F，具体的序列是5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3'，下游的通用引物是1492R，具体的序列是5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'。将诱导剂加入到培养基或者培养液中，并将土壤加入到培养液或者培养基，在摇床中进行培养，培养的温度是10-40℃，培养的转速是100-300rpm。培养1-4天后，转接到新鲜的培养基或培养液中进行筛选。由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的登记号为CGMCC No.5958的红球菌；保藏日期2012年4月9日。红球菌JZX-01产生表面活性剂的能力又进一步的增加了石油降解的效率。可以用于对石油污染物的生物处理。
文档编号A62D101/20GK102851234SQ201210198948
公开日2013年1月2日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者贾晓强, 周征西, 闻建平 申请人:天津大学
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