一种适用于海洋环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂及其制备方法和应用的制作方法
专利名称：一种适用于海洋环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体说，涉及一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染修复的微生物固化吸附菌剂制备方法，及其在海洋滩涂和海底沉积物石油污染生物修复中的应用。
背景技术：
随着海上石油开发和油轮事故的频发，海上石油污染日益严重，直接影响了海洋养殖和捕捞业的发展。海上溢油不仅直接造成污染危害，而且因无法完全清除，一些残余油在自然条件下很难降解，有毒、有害成分具有积累性，因而对海洋生态造成长期的损害。2005年国家监测结果显示，渤海海域，特别是黄河口和莱州湾生态监控区，石油污染仍较严重，海洋生物种类和数量减少，产卵场严重退化，造成这种现象的因素很多，其中烃类污染的加剧不容忽视。因此，在大力发展海上石油开采和运输的同时，必须看到石油污染事件逐石油污染的技术研究刻不容缓。尤其是2010年7月16日在大连发生的溢油事故，及后来在山东蓬莱发生的溢油事故后，海洋年增多的事实，开展减少或消除海洋石油污染的治理日益受到政府的高度重视。溢油事故发生后，经物理方法(如机械回收等)可清除部分表面溢油，剩余的溢油在风、浪、流的作用下，会漂移至滩涂，密度较大的会沉入海底。石油中难降解的芳烃组分(致癌物质)长期滞留在滩涂土壤和海底沉积物环境中，对海洋生态系统及人体健康造成巨大的持久性损害。微生物治理技术是国际上公认的高效修复石油污染的新技术，是指利用微生物来催化降解环境污染物，减小 或最终消除环境污染的受控或自发过程。微生物能适应各种复杂的生态环境，其繁殖代谢能力极强，能快速降解石油中各种有毒物质，而且具有价格低廉、自然环保、二次污染少、对人畜无害等诸多优势，已经成为现场去除溢油污染修复的重要选择途径。采用该技术处理物理方法无法清除的溢油是恢复生态环境的最佳途径，已受到各国政府、科学家和企业家的高度重视。发展和推广微生物治理技术适合我国的国情，对保护我国海洋生态环境，维持海洋资源的可持续性发展具有重大的科学意义和应用价值。在海洋石油污染生物修复处理的过程中，经常会用到低温耐盐的烃降解菌株，它们以自己的方式摄取烃类，然后参与自身代谢，最终生成小分子有机酸或气体。针对生物添加法的研究有两个发展趋势一是针对微生物降解能力不足的生态系统，加入外源微生物做补充；二是针对土著微生物不能降解的原油类型或重要的石油成分，选择或改造优良性能的降解微生物。美国政府资助的“自然与加速生物治理研究项目”力图通过现代分子生物学手段，在阐明污染物代谢机理的基础上发展适宜的分子调控手段，以降低生物修复过程中降解菌的营养添加量和生物累积量；也有学者以铜绿假单胞菌作为受体，将恶臭假单胞菌等携带的各种质粒转入其中，构成了带有多种质粒的“超级嗜油工程菌”，用于海上溢油处理，其清除油污的能力比野生菌高几十倍到几百倍。国内也有学者利用混合菌协同作用加强石油烃的降解效果，王加宁等人公开了一种降解石油污染物及石油产品的固体微生物混合菌剂及其制备方法(公开号CN 101050435A)，可应用于石油污染土壤及石油产品泄露等突发事故应急处理的生物修复技术中，其中，微生物菌剂是由枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇单胞菌混合发酵制成。朱生凤等人公开了溢油污染海岸线生物修复用菌剂及制备方法(公开号CN 101717725A)，利用硅藻土、高岭土、草炭和甲壳质等至少一种固定化载体包埋短小芽孢杆菌、威尼斯不动杆菌、门多萨假单胞菌和皮氏罗尔斯通菌等微生物菌剂，以提高溢油污染海岸线生物降解效果。这些发明可以提高石油污染的生物修复效率，也可以应用在浅海修复作业区，但是由于菌剂的密度较小，不能应用于海底沉积物的修复区域，因此限制了其应用范围。加快国内生物修复技术的发展，符合我国海洋环境保护发展的需要，加强低温耐盐烃降解菌、微生物降解机理、缓释营养剂和更多疏水固定化载体的研究，有利于海洋溢油生物修复技术的发展和工业化应用。海洋滩涂石油污染的生物修复具有很好的发展前景。
发明内容
本发明目的是解决现有微生物修复方法是使用的修复菌剂存在菌剂密度较小，不能应用于海底沉积物的修复区域等，因此限制了菌剂应用范围的问题，提供一种适用于海洋滩涂和海底沉积物等海洋环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂制备方法，及其在海洋滩涂和海底沉积物等海洋环境石油污染的生物修复中的应用。本发明提供的适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂，是由菌浓为IO8IOltl个/mL的适合降解目标油品的微生物发酵菌液中加入100^1000g/L多孔介质和f 2g/L絮凝剂，充分混合制成。所述的微生物包括红球菌(Rhodococcus erythoropolis T7-3,保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No. 6104，以下简称T7-3)，或伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei ATCC 23344，购买于美国典型培养物中心，其货号为 ATCC23344,以下简称 ATCC23344),或不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus ATCC19194，购买于美国典型培 养物中心，其货号为ATCC19194，以下简称ATCC 19194)，或芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ATCC 14580，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC14580,以下简称ATCC 14580),或假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PA01,购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC15692，以下简称ATCC 15692)，或这些菌的等比例混合物(以下简称混合菌)。所述的多孔介质为沸石或陶粒。本发明同时提供了一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂制备方法，具体过程是第1、选取适合降解污染区域原油的微生物菌种(具体微生物如前所述)；第2、经斜面培养、摇瓶种子发酵和发酵罐级联放大获得菌浓为IO8KT个/mL的发酵菌液；第3、向第2步的发酵菌液中添加10(Tl000g/L多孔介质，充分混合；所述的多孔介质为沸石或陶粒；第4、向第3步的混合物中添加絮凝剂f 2g/L，充分混合，混合后静置O. 5^24h,制得菌体吸附率彡90%的固化吸附菌剂。本发明还提供了以上所述固化吸附菌剂在海洋滩涂或海底沉积物环境石油污染的生物修复中的应用。具体应用过程是，按f2kg/m2修复面积加入所述固化吸附菌剂，按O. 2^1kg/m2修复面积添加营养盐肥料。所述营养盐肥料为硫酸氨或磷酸氢二钠。本发明固化吸附菌剂在室内模拟、滩涂和海底现场条件下均有利于长期持菌，并降解石油烃，因此可用于滩涂和海底现场石油污染的生物修复领域。本发明的优点和积极效果本发明提供一种利用沸石或陶粒吸附石油烃高效降解菌剂及其营养剂的方法，能将石油烃高效降解菌及其营养携带到海底沉积物中，并能延长石油烃高效降解菌及其营养剂在滩涂的滞留时间，明显提高目标菌在目标地点的存活率，扩大了修复菌剂的应用范围，因此具有海洋滩涂和海底沉积物石油污染生物修复能力。
图1是烃降解菌对原油的降解率随时间变化曲线图。图2是固体材料吸附前后上清液残留微生物效果比较图(A为未吸附的发酵液上清100 μ I涂平板效果，B为吸附后的发酵液上清100 μ I涂平板效果)。图3是固体材料吸附前后发酵液外观图(Α为吸附后的发酵液，B为未吸附的发酵液)。图4是固体材料吸附前后扫描电镜(SBO图(Α为吸附前的材料多孔介质内部，B为吸附后的材料多孔介质 内部)。图5是室内模拟实验沉积物中细菌总数变化曲线图。图6是室内模拟实验沉积物中烃降解菌总数变化曲线图。图7是室内模拟实验的石油烃降解曲线图。图8是滩涂现场实验沉积物中总石油烃变化曲线图。图9是滩涂现场实验沉积物中总菌数变化曲线图。图10是滩涂现场实验沉积物中烃降解菌的变化曲线图。图11是滩涂现场试验沉积物中总石油烃60天降解率直方图。
具体实施例方式实施例1、红球菌Τ7-3固化吸附菌剂的制备方法1、降解菌种的筛选以污染地域收集原油(本实施例暂以海二站混合原油为例，以下简称原油)，以2%的质量体积比加入到无机盐培养基(KH2PO4 3. 48g/L, Na2HPO41. 5g/L, MgSO4 O. 70g/L,(NH4)2SO4 4g/L，NaCl 20g/L，酵母粉0. 05g/L，pH 7. 0 7. 2)中，形成原油无机盐培养基，121°C灭菌20min，筛选对原油降解性能好的菌种，培养条件为25°C，150r/min，接种量2%，培养时间为7d。本实施例从30种待选菌株中选择红球菌(Rhodococcus erythoropoIis)Τ7~3,(已于2012年5月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No. 6104，建议分类命名为红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)以下简称T7-3)。接种至以灭菌的原油无机盐培养基，测定了菌种在降解过程中的原油降解率，其中原油降解率％=(降解前原油含量一降解后原油含量)/降解前原油浓度X 100%，原油含量测定参照国标GB17378. 4-2007法测定。结果见图1所示。从图中可以看出，T7-3对原油的降解率为75%。2、菌种的扩大培养本发明的菌种扩大培养方法经过平板分纯，斜面培养、摇瓶种子培养和发酵罐培养四个步骤，最终菌体细胞密度达到2X IO8个/mL以上。下面选择的是发明内容中所述微生物中的一种，并不限制本发明。I)、平板分纯将菌种T7-3以灭菌接种环挑取单菌落接种到I号固体培养基平板上，反复划线，25°C下培养72h后，观察有无杂菌，以验证目标菌的纯度。其中，I号固体培养基平板制备方法如下分别称取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次搅拌溶解于IOOOmL陈化海水中，然后称取18g琼脂粉，煮沸溶解后，调pH7. 6^7. 8，于121°C下灭菌20min后降至50°C，以每20mL倒入并平铺于培养皿(d=10cm)底部，冷却后得到固体培养基平板。2)、斜面培养 将上述平板上验证正确的单菌落以灭菌接种环挑取一环，接种到I号固体培养基斜面上，反复划线，25°C下培养72h后，备用。其中，I号固体培养基斜面制备方法如下分别称取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次搅拌溶解于IOOOmL陈化海水中，然后称取18g琼脂粉，煮沸溶解后，调pH7. 6^7. 8，于121 °C下灭菌20min后降至50°C,以每5mL分装于180mmX 18mm (长X直径)试管中，10° -20°倾斜室温放置，冷却后得到固体培养基斜面。3)、摇瓶种子培养将上述斜面上的菌种，在超净工作台上无菌操作接种到装有200mL的I号液体培养基的500mL锥形瓶中，25°C，200r/min培养到细胞密度刚达到5 X IO8个/mL即停止培养，备用。其中I号液体培养基制备方法如下分别称取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次搅拌溶解于IOOOmL陈化海水中，每200mL分装到500mL锥形瓶中，于121°C下灭菌20min。4)、发酵罐培养将上述种子液培养液以3-5%的接种量分别在装有4(Γ60%液量已灭菌发酵培养基的发酵罐中逐级放大发酵培养。发酵过程中，控制PH为7. 2，培养温度为25°C，转速为600r/min，通气量为l.(T2. 0L/min，培养60h至菌体细胞密度达到2 X IO8个/mL以上。上述发酵培养基的制备方法如下分别称取30. Og葡萄糖、80. Og液体石蜡、4. Og磷酸二氢钾、6. Og磷酸氢二钾、10. Og硫酸铵、25. Og氯化钠、0. 2g硫酸镁、0. Olg氯化钙、
0.005g生物素依次添加到IOOOmL的蒸馏水中，搅拌溶解后调pH至7. 2，于115°C灭菌15min。3、固化吸附菌剂的吸附下面公开的是菌种T7-3与固体材料以几种不同比例的制备过程，并不限制本发明。
将T7-3种子液与沸石(或陶粒)以表I所列的比例进行吸附实验，其中1-9组加固体吸附介质后搅拌2min再静止1. 5h，吸附后的体系取上清液100 μ I稀释涂营养琼脂平板计算剩余菌浓(cful)，并以初始种子液中的菌浓(cfu2)作对照，计算沸石吸附的菌体量(cfu3)和吸附率(％)(见图2),其中吸附率的计算方法如下cfu3=cfu2-cful,吸附率％=cfu3/cfu2X 100%。以第3组实验形成的菌剂3号为例，沸石吸附前T7-3菌体浓度为9X108CFU/mL,吸附后菌体浓度为1. 9X 108CFU/mL，吸附率达到78. 9%，平均每g沸石吸附1.8 X IO9CFU 菌体。表I多孔介质对T7-3菌体细胞的吸附作用
权利要求
1.一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂的制备方法，其特征在于所述的固化吸附菌剂的制备过程是 第1、选取适合降解污染区域原油的微生物菌种； 第2、经斜面培养、摇瓶种子发酵和发酵罐级联放大获得菌浓为IO8IOltl个/mL的发酵菌液； 第3、向第2步的发酵菌液中添加10(Tl000g/L多孔介质，充分混合； 第4、向第3步的混合物中添加絮凝剂f 2g/L，充分混合，混合后静置O. 5^24h,制得菌体吸附率彡90%的固化吸附菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的多孔介质为沸石或陶粒。
3.一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂，其特征在于所述的固化吸附菌剂是由菌浓为1(Τ101(Ι个/mL的适合降解目标油品的微生物发酵菌液中加入10(Tl000g/L多孔介质和f 2g/L絮凝剂，充分混合制成。
4.根据权利要求3所述的固化吸附菌剂，其特征在于所述的微生物包括 红球菌(Rhodococcus erythoropolis T7-3),保藏号为 CGMCC No.6104;或伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei ATCC23344);或不动杆菌(Acinetobacter haemolyticusATCC19194);或芽抱杆菌(Bacillus licheniformis ATCC14580);或假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa PAOI);或这些菌的等比例混合物。
5.根据权利要求3或4所述的固化吸附菌剂，其特征在于所述的多孔介质为沸石或陶粒。
6.权利要求1所述方法制备的或权利要求3所述的固化吸附菌剂在海洋滩涂或海底沉积物环境石油污染的生物修复中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于按f2kg/m2修复面积加入所述固化吸附菌齐IJ，按O. 2^1kg/m2修复面积添加营养盐肥料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的营养盐肥料为硫酸氨或磷酸氢二钠。
全文摘要
一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染修复的固化吸附菌剂制备方法及应用。所述固化吸附菌剂制备过程是选取适合降解污染区域原油的微生物菌种；经逐级扩大培养获得菌浓为108~1010个/mL的发酵菌液；然后添加100~1000g/L的多孔介质(沸石或陶粒)，进一步可添加0.1~2g/L的絮凝剂，充分混合，静置0.5~24h，制得菌体吸附率≥90%的固化吸附菌剂。所述固化吸附菌剂可应用于海洋滩涂或海底沉积物等海洋环境石油污染的生物修复中，能将石油烃高效降解菌及其营养携带到海底沉积物中，并能延长石油烃高效降解菌及其营养剂在滩涂的滞留时间，明显提高目标菌在目标地点的存活率，扩大了修复菌剂的应用范围。
文档编号A62D3/02GK103045579SQ20121054904
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者马挺, 李国强, 梁凤来 申请人:南开大学
技术领域：
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体说，涉及一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染修复的微生物固化吸附菌剂制备方法，及其在海洋滩涂和海底沉积物石油污染生物修复中的应用。
背景技术：
随着海上石油开发和油轮事故的频发，海上石油污染日益严重，直接影响了海洋养殖和捕捞业的发展。海上溢油不仅直接造成污染危害，而且因无法完全清除，一些残余油在自然条件下很难降解，有毒、有害成分具有积累性，因而对海洋生态造成长期的损害。2005年国家监测结果显示，渤海海域，特别是黄河口和莱州湾生态监控区，石油污染仍较严重，海洋生物种类和数量减少，产卵场严重退化，造成这种现象的因素很多，其中烃类污染的加剧不容忽视。因此，在大力发展海上石油开采和运输的同时，必须看到石油污染事件逐石油污染的技术研究刻不容缓。尤其是2010年7月16日在大连发生的溢油事故，及后来在山东蓬莱发生的溢油事故后，海洋年增多的事实，开展减少或消除海洋石油污染的治理日益受到政府的高度重视。溢油事故发生后，经物理方法(如机械回收等)可清除部分表面溢油，剩余的溢油在风、浪、流的作用下，会漂移至滩涂，密度较大的会沉入海底。石油中难降解的芳烃组分(致癌物质)长期滞留在滩涂土壤和海底沉积物环境中，对海洋生态系统及人体健康造成巨大的持久性损害。微生物治理技术是国际上公认的高效修复石油污染的新技术，是指利用微生物来催化降解环境污染物，减小 或最终消除环境污染的受控或自发过程。微生物能适应各种复杂的生态环境，其繁殖代谢能力极强，能快速降解石油中各种有毒物质，而且具有价格低廉、自然环保、二次污染少、对人畜无害等诸多优势，已经成为现场去除溢油污染修复的重要选择途径。采用该技术处理物理方法无法清除的溢油是恢复生态环境的最佳途径，已受到各国政府、科学家和企业家的高度重视。发展和推广微生物治理技术适合我国的国情，对保护我国海洋生态环境，维持海洋资源的可持续性发展具有重大的科学意义和应用价值。在海洋石油污染生物修复处理的过程中，经常会用到低温耐盐的烃降解菌株，它们以自己的方式摄取烃类，然后参与自身代谢，最终生成小分子有机酸或气体。针对生物添加法的研究有两个发展趋势一是针对微生物降解能力不足的生态系统，加入外源微生物做补充；二是针对土著微生物不能降解的原油类型或重要的石油成分，选择或改造优良性能的降解微生物。美国政府资助的“自然与加速生物治理研究项目”力图通过现代分子生物学手段，在阐明污染物代谢机理的基础上发展适宜的分子调控手段，以降低生物修复过程中降解菌的营养添加量和生物累积量；也有学者以铜绿假单胞菌作为受体，将恶臭假单胞菌等携带的各种质粒转入其中，构成了带有多种质粒的“超级嗜油工程菌”，用于海上溢油处理，其清除油污的能力比野生菌高几十倍到几百倍。国内也有学者利用混合菌协同作用加强石油烃的降解效果，王加宁等人公开了一种降解石油污染物及石油产品的固体微生物混合菌剂及其制备方法(公开号CN 101050435A)，可应用于石油污染土壤及石油产品泄露等突发事故应急处理的生物修复技术中，其中，微生物菌剂是由枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇单胞菌混合发酵制成。朱生凤等人公开了溢油污染海岸线生物修复用菌剂及制备方法(公开号CN 101717725A)，利用硅藻土、高岭土、草炭和甲壳质等至少一种固定化载体包埋短小芽孢杆菌、威尼斯不动杆菌、门多萨假单胞菌和皮氏罗尔斯通菌等微生物菌剂，以提高溢油污染海岸线生物降解效果。这些发明可以提高石油污染的生物修复效率，也可以应用在浅海修复作业区，但是由于菌剂的密度较小，不能应用于海底沉积物的修复区域，因此限制了其应用范围。加快国内生物修复技术的发展，符合我国海洋环境保护发展的需要，加强低温耐盐烃降解菌、微生物降解机理、缓释营养剂和更多疏水固定化载体的研究，有利于海洋溢油生物修复技术的发展和工业化应用。海洋滩涂石油污染的生物修复具有很好的发展前景。
发明内容
本发明目的是解决现有微生物修复方法是使用的修复菌剂存在菌剂密度较小，不能应用于海底沉积物的修复区域等，因此限制了菌剂应用范围的问题，提供一种适用于海洋滩涂和海底沉积物等海洋环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂制备方法，及其在海洋滩涂和海底沉积物等海洋环境石油污染的生物修复中的应用。本发明提供的适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂，是由菌浓为IO8IOltl个/mL的适合降解目标油品的微生物发酵菌液中加入100^1000g/L多孔介质和f 2g/L絮凝剂，充分混合制成。所述的微生物包括红球菌(Rhodococcus erythoropolis T7-3,保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No. 6104，以下简称T7-3)，或伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei ATCC 23344，购买于美国典型培养物中心，其货号为 ATCC23344,以下简称 ATCC23344),或不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus ATCC19194，购买于美国典型培 养物中心，其货号为ATCC19194，以下简称ATCC 19194)，或芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ATCC 14580，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC14580,以下简称ATCC 14580),或假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PA01,购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC15692，以下简称ATCC 15692)，或这些菌的等比例混合物(以下简称混合菌)。所述的多孔介质为沸石或陶粒。本发明同时提供了一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂制备方法，具体过程是第1、选取适合降解污染区域原油的微生物菌种(具体微生物如前所述)；第2、经斜面培养、摇瓶种子发酵和发酵罐级联放大获得菌浓为IO8KT个/mL的发酵菌液；第3、向第2步的发酵菌液中添加10(Tl000g/L多孔介质，充分混合；所述的多孔介质为沸石或陶粒；第4、向第3步的混合物中添加絮凝剂f 2g/L，充分混合，混合后静置O. 5^24h,制得菌体吸附率彡90%的固化吸附菌剂。本发明还提供了以上所述固化吸附菌剂在海洋滩涂或海底沉积物环境石油污染的生物修复中的应用。具体应用过程是，按f2kg/m2修复面积加入所述固化吸附菌剂，按O. 2^1kg/m2修复面积添加营养盐肥料。所述营养盐肥料为硫酸氨或磷酸氢二钠。本发明固化吸附菌剂在室内模拟、滩涂和海底现场条件下均有利于长期持菌，并降解石油烃，因此可用于滩涂和海底现场石油污染的生物修复领域。本发明的优点和积极效果本发明提供一种利用沸石或陶粒吸附石油烃高效降解菌剂及其营养剂的方法，能将石油烃高效降解菌及其营养携带到海底沉积物中，并能延长石油烃高效降解菌及其营养剂在滩涂的滞留时间，明显提高目标菌在目标地点的存活率，扩大了修复菌剂的应用范围，因此具有海洋滩涂和海底沉积物石油污染生物修复能力。
图1是烃降解菌对原油的降解率随时间变化曲线图。图2是固体材料吸附前后上清液残留微生物效果比较图(A为未吸附的发酵液上清100 μ I涂平板效果，B为吸附后的发酵液上清100 μ I涂平板效果)。图3是固体材料吸附前后发酵液外观图(Α为吸附后的发酵液，B为未吸附的发酵液)。图4是固体材料吸附前后扫描电镜(SBO图(Α为吸附前的材料多孔介质内部，B为吸附后的材料多孔介质 内部)。图5是室内模拟实验沉积物中细菌总数变化曲线图。图6是室内模拟实验沉积物中烃降解菌总数变化曲线图。图7是室内模拟实验的石油烃降解曲线图。图8是滩涂现场实验沉积物中总石油烃变化曲线图。图9是滩涂现场实验沉积物中总菌数变化曲线图。图10是滩涂现场实验沉积物中烃降解菌的变化曲线图。图11是滩涂现场试验沉积物中总石油烃60天降解率直方图。
具体实施例方式实施例1、红球菌Τ7-3固化吸附菌剂的制备方法1、降解菌种的筛选以污染地域收集原油(本实施例暂以海二站混合原油为例，以下简称原油)，以2%的质量体积比加入到无机盐培养基(KH2PO4 3. 48g/L, Na2HPO41. 5g/L, MgSO4 O. 70g/L,(NH4)2SO4 4g/L，NaCl 20g/L，酵母粉0. 05g/L，pH 7. 0 7. 2)中，形成原油无机盐培养基，121°C灭菌20min，筛选对原油降解性能好的菌种，培养条件为25°C，150r/min，接种量2%，培养时间为7d。本实施例从30种待选菌株中选择红球菌(Rhodococcus erythoropoIis)Τ7~3,(已于2012年5月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No. 6104，建议分类命名为红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)以下简称T7-3)。接种至以灭菌的原油无机盐培养基，测定了菌种在降解过程中的原油降解率，其中原油降解率％=(降解前原油含量一降解后原油含量)/降解前原油浓度X 100%，原油含量测定参照国标GB17378. 4-2007法测定。结果见图1所示。从图中可以看出，T7-3对原油的降解率为75%。2、菌种的扩大培养本发明的菌种扩大培养方法经过平板分纯，斜面培养、摇瓶种子培养和发酵罐培养四个步骤，最终菌体细胞密度达到2X IO8个/mL以上。下面选择的是发明内容中所述微生物中的一种，并不限制本发明。I)、平板分纯将菌种T7-3以灭菌接种环挑取单菌落接种到I号固体培养基平板上，反复划线，25°C下培养72h后，观察有无杂菌，以验证目标菌的纯度。其中，I号固体培养基平板制备方法如下分别称取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次搅拌溶解于IOOOmL陈化海水中，然后称取18g琼脂粉，煮沸溶解后，调pH7. 6^7. 8，于121°C下灭菌20min后降至50°C，以每20mL倒入并平铺于培养皿(d=10cm)底部，冷却后得到固体培养基平板。2)、斜面培养 将上述平板上验证正确的单菌落以灭菌接种环挑取一环，接种到I号固体培养基斜面上，反复划线，25°C下培养72h后，备用。其中，I号固体培养基斜面制备方法如下分别称取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次搅拌溶解于IOOOmL陈化海水中，然后称取18g琼脂粉，煮沸溶解后，调pH7. 6^7. 8，于121 °C下灭菌20min后降至50°C,以每5mL分装于180mmX 18mm (长X直径)试管中，10° -20°倾斜室温放置，冷却后得到固体培养基斜面。3)、摇瓶种子培养将上述斜面上的菌种，在超净工作台上无菌操作接种到装有200mL的I号液体培养基的500mL锥形瓶中，25°C，200r/min培养到细胞密度刚达到5 X IO8个/mL即停止培养，备用。其中I号液体培养基制备方法如下分别称取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次搅拌溶解于IOOOmL陈化海水中，每200mL分装到500mL锥形瓶中，于121°C下灭菌20min。4)、发酵罐培养将上述种子液培养液以3-5%的接种量分别在装有4(Γ60%液量已灭菌发酵培养基的发酵罐中逐级放大发酵培养。发酵过程中，控制PH为7. 2，培养温度为25°C，转速为600r/min，通气量为l.(T2. 0L/min，培养60h至菌体细胞密度达到2 X IO8个/mL以上。上述发酵培养基的制备方法如下分别称取30. Og葡萄糖、80. Og液体石蜡、4. Og磷酸二氢钾、6. Og磷酸氢二钾、10. Og硫酸铵、25. Og氯化钠、0. 2g硫酸镁、0. Olg氯化钙、
0.005g生物素依次添加到IOOOmL的蒸馏水中，搅拌溶解后调pH至7. 2，于115°C灭菌15min。3、固化吸附菌剂的吸附下面公开的是菌种T7-3与固体材料以几种不同比例的制备过程，并不限制本发明。
将T7-3种子液与沸石(或陶粒)以表I所列的比例进行吸附实验，其中1-9组加固体吸附介质后搅拌2min再静止1. 5h，吸附后的体系取上清液100 μ I稀释涂营养琼脂平板计算剩余菌浓(cful)，并以初始种子液中的菌浓(cfu2)作对照，计算沸石吸附的菌体量(cfu3)和吸附率(％)(见图2),其中吸附率的计算方法如下cfu3=cfu2-cful,吸附率％=cfu3/cfu2X 100%。以第3组实验形成的菌剂3号为例，沸石吸附前T7-3菌体浓度为9X108CFU/mL,吸附后菌体浓度为1. 9X 108CFU/mL，吸附率达到78. 9%，平均每g沸石吸附1.8 X IO9CFU 菌体。表I多孔介质对T7-3菌体细胞的吸附作用
权利要求
1.一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂的制备方法，其特征在于所述的固化吸附菌剂的制备过程是 第1、选取适合降解污染区域原油的微生物菌种； 第2、经斜面培养、摇瓶种子发酵和发酵罐级联放大获得菌浓为IO8IOltl个/mL的发酵菌液； 第3、向第2步的发酵菌液中添加10(Tl000g/L多孔介质，充分混合； 第4、向第3步的混合物中添加絮凝剂f 2g/L，充分混合，混合后静置O. 5^24h,制得菌体吸附率彡90%的固化吸附菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的多孔介质为沸石或陶粒。
3.一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂，其特征在于所述的固化吸附菌剂是由菌浓为1(Τ101(Ι个/mL的适合降解目标油品的微生物发酵菌液中加入10(Tl000g/L多孔介质和f 2g/L絮凝剂，充分混合制成。
4.根据权利要求3所述的固化吸附菌剂，其特征在于所述的微生物包括 红球菌(Rhodococcus erythoropolis T7-3),保藏号为 CGMCC No.6104;或伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei ATCC23344);或不动杆菌(Acinetobacter haemolyticusATCC19194);或芽抱杆菌(Bacillus licheniformis ATCC14580);或假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa PAOI);或这些菌的等比例混合物。
5.根据权利要求3或4所述的固化吸附菌剂，其特征在于所述的多孔介质为沸石或陶粒。
6.权利要求1所述方法制备的或权利要求3所述的固化吸附菌剂在海洋滩涂或海底沉积物环境石油污染的生物修复中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于按f2kg/m2修复面积加入所述固化吸附菌齐IJ，按O. 2^1kg/m2修复面积添加营养盐肥料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的营养盐肥料为硫酸氨或磷酸氢二钠。
全文摘要
一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染修复的固化吸附菌剂制备方法及应用。所述固化吸附菌剂制备过程是选取适合降解污染区域原油的微生物菌种；经逐级扩大培养获得菌浓为108~1010个/mL的发酵菌液；然后添加100~1000g/L的多孔介质(沸石或陶粒)，进一步可添加0.1~2g/L的絮凝剂，充分混合，静置0.5~24h，制得菌体吸附率≥90%的固化吸附菌剂。所述固化吸附菌剂可应用于海洋滩涂或海底沉积物等海洋环境石油污染的生物修复中，能将石油烃高效降解菌及其营养携带到海底沉积物中，并能延长石油烃高效降解菌及其营养剂在滩涂的滞留时间，明显提高目标菌在目标地点的存活率，扩大了修复菌剂的应用范围。
文档编号A62D3/02GK103045579SQ20121054904
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者马挺, 李国强, 梁凤来 申请人:南开大学
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