短帚霉菌及其应用的制作方法
专利名称：短帚霉菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及一株短帚霉菌及其在降解多环芳烃中的应用。
背景技术：
多环芳经(Polycyclicaromatic hydrocarbons, PAHs)是环境中普遍存在的一类有机污染物，由于其在环境中的半衰期较长和致癌、致畸、致突变的性质而受到人们的重视。美国环保局在20世纪80年代初把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物，我国也将其列入环境污染的黑名单中。微生物具有很强的分解代谢能力，微生物降解是环境中PAHs去除的最主要途径。近年来，国内外报道了很多能降解PAHs的微生物，但是成功应用到土壤修复中的还很少，这主要与PAHs的性质、微生物的降解能力，及各种环境因素的影响有关。因此，筛选能够同 时降解多组分PAHs的微生物，具有重要的现实意义。近年来，国内外对高分子量PAHs的微生物降解研究表明，能够同时降解多种高分子量PAHs (如四环和五环)的微生物资源还很少。因此，筛选能够同时降解多种PAHs的微生物具有重要的现实意义。
发明内容
鉴于现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供一株短帚霉菌，其能实现对多环芳烃，特别是高分子量PAHs的有效降解。本发明的短帚霉菌iScopulariopsis的编号为4Z,其已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，具体信息如下
保藏日期2012年11月22日；
保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，邮编100101 ；
保藏编号为CGMCC No. 6870。本发明的另一目的在于提供前述短帚霉菌(Scopulariopsis brevicaulis) Al在降解有机芳香化合物中的应用。本发明的又一目的在于提供前述短帚霉菌iScopulariopsis brevicaulis) Al在制备有机芳香化合物的生物降解试剂中的应用。本发明的再一目的在于提供一种有机芳香化合物降解试剂，它包含前述短帚霉菌(Scopulari opsi s bre vi caul is、41。本发明还提供了前述短帚霉菌{Scopulariopsis brevicaulis) Al在修复有机芳香化合物污染土壤中的应用。本发明还提供了一种土壤修复试剂，包含前述短帚霉菌iScopulariopsisbrevicaul is、41。其中，前述有机芳香化合物包括多环芳烃。更具体的讲，所述有机芳香化合物至少选自菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘，但不限于此。本发明的短帚霉菌具有较广的底物谱，对环境中的多环芳烃有很好的降解能力，适于制备环境修复制剂，特别是有机芳香化合物污染土壤试剂，藉以消除有机芳香化合物造成的环境污染。
图1为实施例1中菌株4Z在固体培养基上的菌落形态；
图2a_2d分别为实施例2中菌株4Z在含菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘的培养液中的生长曲线；
图3a_3d分别为实施例2中在菌株4Z培养液中菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘浓度随时间的变化曲线，CK为加入相同量灭活菌株的处理对照；
本发明短帚霉菌iScopulariopsis brevicaulis、Al的保藏日期为2012年11月22日，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6870。
具体实施例方式本发明采用富集培养方法从多环芳烃污染土壤中筛选分离得到一株能降解多环芳烃的真菌菌株。该菌株在平板上生长4天后呈白色凸起菌落，菌落直径约为4 10 mm。形态特征观察和18S rDNA序列分析结果表明，该菌株为短帚霉brevicaulis)，编号为4Z,研究发现,该菌株对PAHs具有很好的降解潜力。以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作更为详细的说明。实施例1 :多环芳烃降解真菌(亦即前述短帚霉{Scopulariopsisbrevicaulis) Al,以下亦可简称“菌株4Z”)的分离、纯化、鉴定。1、培养基①马丁氏培养基无机盐培养基(MS):每升含K2HPO4 6. 0 g，KH2PO45.5 g,NH4NO3 2.0 g, Na2SO4 2.0 g，KCl 2.0 g，MgS04_7H20 0.2 g，微量金属盐溶液 1.0 mL，蒸馏水，pH 7. 0 ;③含PAHs的无机盐培养基以DMF配制1000 mg/L的不同PAHs (菲，苯并[a]芘，芘，荧蒽)溶液，按适当的浓度加入灭菌的无机盐培养基。2、PAHs降解菌的分离与纯化
称取10 g新鲜土壤，加入装有IOOmL无机盐液体培养基(芘浓度为100.0 mg /L)的三角瓶中，28°C下200 r /min振荡培养I周。按10%接种量转接到新鲜的芘无机盐培养基中，继续培养I周，反复5次。最后吸取0.1 mL培养液稀释不同梯度涂布于马丁氏培养基平板上，挑取单菌落，将平板划线纯化后的单菌落再接种到芘无机盐液体培养基中，选取生长速度最快的菌株作为研究菌株。3、形态观察及鉴定
将已充分活化的菌株接种到马丁氏培养基中，28°C培养4天，革兰氏染色后在光学显微镜下观察细胞形态、菌体大小。将活化菌种在马丁氏平皿上划线接种，28°C培养箱中倒置培养4天，观察菌落形态，并测量菌落大小，具体请参阅图1。4、18S rDNA的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建
真菌基因的DNA提取、PCR以及PCR产物的测序由上海生工生物技术有限公司完成。真菌菌18S rDNA序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析。然后利用MEGA4. O软件构建系统发育树,采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析。5、通过生物量变化看，菌株4Z在含有菲、芘、荧蒽和苯并芘的马丁氏培养基上均能生长，尤其在含荧蒽和苯并芘的培养基上，生物量较大，说明菌株4Z对这两种污染物有着良好的降解或耐受能力。实施例2 :多环芳烃降解真菌对多环芳烃的降解特性1、在无菌条件下将菌株4Z接种于含有100. mg/L多环芳烃的马丁氏液体培养基中，28°C下200 r /min振荡培养I周，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤3次，再用磷酸盐缓冲液将菌悬液调至所需浓度备用。2、菌株4Z对多环芳烃的降解将10%的菌悬液加入50 mL液体培养基中，以加灭 活菌悬液的处理作为对照，加入多环芳烃母液，使菲、芘、荧蒽的最终浓度约为100 mg/L，苯并[a]花的最终浓度约为20 mg/Lo每个处理设3个重复。28°C下150 r /min避光振荡培养6周，在不同时段取样，4°C冷冻保存。测定溶液中PAHs的浓度和0D_的变化。3、溶液中多环芳烃的提取与分析
将三角瓶中的菌液全部倒入分液漏斗，加入50 mL乙酸乙酯提取三次，合并提取液后用无水Na2SO4去除水分。在水温为36°C的旋转蒸发器中旋转浓缩至干。加2. 0 ml乙腈溶解，用高效液相色谱(HPLC)测定溶液中多环芳烃的浓度。4、降解结果通过降解试验可以看出菌株4Z对多环芳烃有着良好的降解效果，在6周的时间里，菌株4Z对菲、芘、荧蒽、苯并芘的降解率分别为60. 0%、64. 3%、61. 9%和82. 1%。此外，本案发明人还以与前述实施例1-2相近的操作方法，利用菌株4Z对其它习见的PAHs，如前述的美国环保局指定的16种未带分支的PAHs进行了降解实验，结果显示，该菌株4Z均表现出较高的降解能力。再及，本案发明人还以与前述实施例1-2相近的操作方法，利用菌株4Z对含菲、芘、荧蒽、苯并芘等污染物的土壤进行了修复处理，并对修复后土壤中多环芳烃污染物的含量进行了再次测定，其结果显示，被污染土壤得以有效修复。需要指出的是，以上说明及优选实施例不可解释为限定本发明的设计思想。在本发明的技术领域里持有相同知识者可以将本发明的技术性思想以多样的形态改良变更，这样的改良及变更应理解为属于本发明的保护范围内。
权利要求
1.短帚霉菌4Ζ，其保藏编号为CGMCC No. 6870。
2.权利要求1所述短帚霉菌在降解有机芳香化合物中的应用。
3.如权利要求2所述短帚霉菌在降解有机芳香化合物中的应用，其特征在于，所述有机芳香化合物包括多环芳烃。
4.如权利要求2或3所述短帚霉菌在降解有机芳香化合物中的应用，其特征在于，所述有机芳香化合物至少选自菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘。
5.权利要求1所述短帚霉菌在制备有机芳香化合物的生物降解试剂中的应用，所述有机芳香化合物包括多环芳烃。
6.一种有机芳香化合物降解试剂，所述有机芳香化合物包括多环芳烃，其特征在于，所述降解试剂包含权利要求1所述的短帚霉菌。
7.权利要求1所述短帚霉菌在修复有机芳香化合物污染土壤中的应用，所述有机芳香化合物包括多环芳烃。
8.一种土壤修复试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的短帚霉菌。
全文摘要
本发明公开了一株短帚霉菌及其应用，所述短帚霉菌(Scopulariopsisbrevicaulis)4Z的保藏编号为CGMCCNo.6870，其具有较广的底物谱，对环境中的有机芳香化合物，特别是多环芳烃有很好的降解能力，可被应用环境污染的治理，例如可作为有机芳香化合物污染土壤的生物修复试剂广泛应用。
文档编号A62D101/20GK103013841SQ20121056317
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者毛健, 荆磊, 邓宗武 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
技术领域：
本发明特别涉及一株短帚霉菌及其在降解多环芳烃中的应用。
背景技术：
多环芳经(Polycyclicaromatic hydrocarbons, PAHs)是环境中普遍存在的一类有机污染物，由于其在环境中的半衰期较长和致癌、致畸、致突变的性质而受到人们的重视。美国环保局在20世纪80年代初把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物，我国也将其列入环境污染的黑名单中。微生物具有很强的分解代谢能力，微生物降解是环境中PAHs去除的最主要途径。近年来，国内外报道了很多能降解PAHs的微生物，但是成功应用到土壤修复中的还很少，这主要与PAHs的性质、微生物的降解能力，及各种环境因素的影响有关。因此，筛选能够同 时降解多组分PAHs的微生物，具有重要的现实意义。近年来，国内外对高分子量PAHs的微生物降解研究表明，能够同时降解多种高分子量PAHs (如四环和五环)的微生物资源还很少。因此，筛选能够同时降解多种PAHs的微生物具有重要的现实意义。
发明内容
鉴于现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供一株短帚霉菌，其能实现对多环芳烃，特别是高分子量PAHs的有效降解。本发明的短帚霉菌iScopulariopsis的编号为4Z,其已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，具体信息如下
保藏日期2012年11月22日；
保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，邮编100101 ；
保藏编号为CGMCC No. 6870。本发明的另一目的在于提供前述短帚霉菌(Scopulariopsis brevicaulis) Al在降解有机芳香化合物中的应用。本发明的又一目的在于提供前述短帚霉菌iScopulariopsis brevicaulis) Al在制备有机芳香化合物的生物降解试剂中的应用。本发明的再一目的在于提供一种有机芳香化合物降解试剂，它包含前述短帚霉菌(Scopulari opsi s bre vi caul is、41。本发明还提供了前述短帚霉菌{Scopulariopsis brevicaulis) Al在修复有机芳香化合物污染土壤中的应用。本发明还提供了一种土壤修复试剂，包含前述短帚霉菌iScopulariopsisbrevicaul is、41。其中，前述有机芳香化合物包括多环芳烃。更具体的讲，所述有机芳香化合物至少选自菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘，但不限于此。本发明的短帚霉菌具有较广的底物谱，对环境中的多环芳烃有很好的降解能力，适于制备环境修复制剂，特别是有机芳香化合物污染土壤试剂，藉以消除有机芳香化合物造成的环境污染。
图1为实施例1中菌株4Z在固体培养基上的菌落形态；
图2a_2d分别为实施例2中菌株4Z在含菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘的培养液中的生长曲线；
图3a_3d分别为实施例2中在菌株4Z培养液中菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘浓度随时间的变化曲线，CK为加入相同量灭活菌株的处理对照；
本发明短帚霉菌iScopulariopsis brevicaulis、Al的保藏日期为2012年11月22日，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6870。
具体实施例方式本发明采用富集培养方法从多环芳烃污染土壤中筛选分离得到一株能降解多环芳烃的真菌菌株。该菌株在平板上生长4天后呈白色凸起菌落，菌落直径约为4 10 mm。形态特征观察和18S rDNA序列分析结果表明，该菌株为短帚霉brevicaulis)，编号为4Z,研究发现,该菌株对PAHs具有很好的降解潜力。以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作更为详细的说明。实施例1 :多环芳烃降解真菌(亦即前述短帚霉{Scopulariopsisbrevicaulis) Al,以下亦可简称“菌株4Z”)的分离、纯化、鉴定。1、培养基①马丁氏培养基无机盐培养基(MS):每升含K2HPO4 6. 0 g，KH2PO45.5 g,NH4NO3 2.0 g, Na2SO4 2.0 g，KCl 2.0 g，MgS04_7H20 0.2 g，微量金属盐溶液 1.0 mL，蒸馏水，pH 7. 0 ;③含PAHs的无机盐培养基以DMF配制1000 mg/L的不同PAHs (菲，苯并[a]芘，芘，荧蒽)溶液，按适当的浓度加入灭菌的无机盐培养基。2、PAHs降解菌的分离与纯化
称取10 g新鲜土壤，加入装有IOOmL无机盐液体培养基(芘浓度为100.0 mg /L)的三角瓶中，28°C下200 r /min振荡培养I周。按10%接种量转接到新鲜的芘无机盐培养基中，继续培养I周，反复5次。最后吸取0.1 mL培养液稀释不同梯度涂布于马丁氏培养基平板上，挑取单菌落，将平板划线纯化后的单菌落再接种到芘无机盐液体培养基中，选取生长速度最快的菌株作为研究菌株。3、形态观察及鉴定
将已充分活化的菌株接种到马丁氏培养基中，28°C培养4天，革兰氏染色后在光学显微镜下观察细胞形态、菌体大小。将活化菌种在马丁氏平皿上划线接种，28°C培养箱中倒置培养4天，观察菌落形态，并测量菌落大小，具体请参阅图1。4、18S rDNA的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建
真菌基因的DNA提取、PCR以及PCR产物的测序由上海生工生物技术有限公司完成。真菌菌18S rDNA序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析。然后利用MEGA4. O软件构建系统发育树,采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析。5、通过生物量变化看，菌株4Z在含有菲、芘、荧蒽和苯并芘的马丁氏培养基上均能生长，尤其在含荧蒽和苯并芘的培养基上，生物量较大，说明菌株4Z对这两种污染物有着良好的降解或耐受能力。实施例2 :多环芳烃降解真菌对多环芳烃的降解特性1、在无菌条件下将菌株4Z接种于含有100. mg/L多环芳烃的马丁氏液体培养基中，28°C下200 r /min振荡培养I周，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤3次，再用磷酸盐缓冲液将菌悬液调至所需浓度备用。2、菌株4Z对多环芳烃的降解将10%的菌悬液加入50 mL液体培养基中，以加灭 活菌悬液的处理作为对照，加入多环芳烃母液，使菲、芘、荧蒽的最终浓度约为100 mg/L，苯并[a]花的最终浓度约为20 mg/Lo每个处理设3个重复。28°C下150 r /min避光振荡培养6周，在不同时段取样，4°C冷冻保存。测定溶液中PAHs的浓度和0D_的变化。3、溶液中多环芳烃的提取与分析
将三角瓶中的菌液全部倒入分液漏斗，加入50 mL乙酸乙酯提取三次，合并提取液后用无水Na2SO4去除水分。在水温为36°C的旋转蒸发器中旋转浓缩至干。加2. 0 ml乙腈溶解，用高效液相色谱(HPLC)测定溶液中多环芳烃的浓度。4、降解结果通过降解试验可以看出菌株4Z对多环芳烃有着良好的降解效果，在6周的时间里，菌株4Z对菲、芘、荧蒽、苯并芘的降解率分别为60. 0%、64. 3%、61. 9%和82. 1%。此外，本案发明人还以与前述实施例1-2相近的操作方法，利用菌株4Z对其它习见的PAHs，如前述的美国环保局指定的16种未带分支的PAHs进行了降解实验，结果显示，该菌株4Z均表现出较高的降解能力。再及，本案发明人还以与前述实施例1-2相近的操作方法，利用菌株4Z对含菲、芘、荧蒽、苯并芘等污染物的土壤进行了修复处理，并对修复后土壤中多环芳烃污染物的含量进行了再次测定，其结果显示，被污染土壤得以有效修复。需要指出的是，以上说明及优选实施例不可解释为限定本发明的设计思想。在本发明的技术领域里持有相同知识者可以将本发明的技术性思想以多样的形态改良变更，这样的改良及变更应理解为属于本发明的保护范围内。
权利要求
1.短帚霉菌4Ζ，其保藏编号为CGMCC No. 6870。
2.权利要求1所述短帚霉菌在降解有机芳香化合物中的应用。
3.如权利要求2所述短帚霉菌在降解有机芳香化合物中的应用，其特征在于，所述有机芳香化合物包括多环芳烃。
4.如权利要求2或3所述短帚霉菌在降解有机芳香化合物中的应用，其特征在于，所述有机芳香化合物至少选自菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘。
5.权利要求1所述短帚霉菌在制备有机芳香化合物的生物降解试剂中的应用，所述有机芳香化合物包括多环芳烃。
6.一种有机芳香化合物降解试剂，所述有机芳香化合物包括多环芳烃，其特征在于，所述降解试剂包含权利要求1所述的短帚霉菌。
7.权利要求1所述短帚霉菌在修复有机芳香化合物污染土壤中的应用，所述有机芳香化合物包括多环芳烃。
8.一种土壤修复试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的短帚霉菌。
全文摘要
本发明公开了一株短帚霉菌及其应用，所述短帚霉菌(Scopulariopsisbrevicaulis)4Z的保藏编号为CGMCCNo.6870，其具有较广的底物谱，对环境中的有机芳香化合物，特别是多环芳烃有很好的降解能力，可被应用环境污染的治理，例如可作为有机芳香化合物污染土壤的生物修复试剂广泛应用。
文档编号A62D101/20GK103013841SQ20121056317
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者毛健, 荆磊, 邓宗武 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
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