蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构的制作方法
专利名称：蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒去整合素突变体蛋白的氨基酸残基序列与相应的核苷酸序列，及其抑制实体恶性肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤作用；抑制血小板聚集的抗血栓作用；以及促进嗜中性白细胞趋向性的作用，特别涉及到蛇源去整合素突变体安吉康蛋白的氨基酸残基序列及其相应的核苷酸序列。
背景技术：
抑制恶性实体肿瘤的血管生成可有效地抑制肿瘤生长和转移。肿瘤在1mm3以上时，便有血管生成和长入，肿瘤从血液获取营养而迅速张大，并有利于转移。如果没有血管生长，肿瘤将发生退化。如果肿瘤的血管生成受到抑制，则肿瘤将不再生长，并可以进一步发生萎缩和凋亡，不能对机体造成危害。国内外虽有一些抑制恶性实体肿瘤血管生成的研究，但均不成熟。目前尚无这方面的基因重组药物进入市场。我们曾用基因工程手段，从旅顺白眉蝮蛇(Gloydiusblomhoffi brevicaudus)的毒腺中克隆出一种可以编码小分子量蛋白质(艾丁比特)的cDNA，并在大肠杆菌和酵母菌中成功地表达。这方面的成果已经申请了专利。艾丁比特含有模体RGD，可以与血管内皮细胞膜上的粘附因子整合蛋白αvβ3结合，抑制其活性。艾丁比特与我国台湾学者从Calloselasma rhodostoma提取纯化(不是基因重组)出的rhodostomin序列相比，有28个氨基酸的差异。美国学者也曾经从蛇毒中提取出一种小分子量的蛋白质，称为albolabrin，仅研究其对血小板聚集的抑制作用，而且不是用分子克隆的方法，是直接从蛇毒中提取的。艾丁比特仅与目前韩国Yonsei大学生物产品研究中心生物化学系研究的Saxatilin相似，但有9个核苷酸的差异和6个氨基酸的差异。韩国学者发现，Saxatilin含有12个半胱氨酸，形成6个二硫键。我们将艾丁比特进行定点突变修饰，产生出含有ECD模体和RGD模体，和含有11个半胱氨酸，形成含5个二硫键的安吉康。此物质具有较强地抑制新生血管生长、促进肿瘤细胞凋亡，较弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促进嗜中性白细胞趋向化的作用。因此，具有很好的抗实体肿瘤生长的作用。
发明内容
本发明的目的是给出比重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特更为优化的小分子蛋白质安吉康的氨基酸残基顺序，及其抑制实体肿瘤组织内血管生成和促进肿瘤细胞凋亡，较弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促进嗜中性白细胞趋向化的作用，进而达到抑制肿瘤生长的作用。
本发明的技术解决方案是采用基因工程的技术手段，对用于抗肿瘤疗法的重组白眉蝮艾丁比特分子进行修饰，以增强其抑制实体肿瘤组织内血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的作用，进而增强其抑制肿瘤生长的作用。安吉康为由73个氨基酸残基组成的小分子量的蛋白质，含有谷氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸ECD模体和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸RGD模体，含11个半胱氨酸残基，形成5个二硫键。二硫键的位置是Cys8-Cys16、Cys21-Cys35、Cys29-Cys59、Cys34-Cys38、Cys47-Cys66，其氨基酸残基的序列(例)为1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA51 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA其二硫键的位置如下 上述的一级结构中，第十五位为除半胱氨酸以外的以下十九种氨基酸中的任何一种这十九种氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
本发明的有益效果是，安吉康与野生型相比，存在游离的巯基，即存在ECD模体，具有比重组旅顺白眉蝮蛇艾丁比特更强的抑制实体肿瘤组织内血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的作用，较弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促进嗜中性白细胞趋向化的作用。更有利于用于实体肿瘤的治疗，可作为抗实体恶性肿瘤的药物，进一步开发。
具体实施例方式
用于抗肿瘤疗法的安吉康的克隆，包括定点突变，均采用分子生物学的手段进行。安吉康的核苷酸序列含222个碱基对，此核苷酸序列为1 GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGAGCTGTGA51 TGCTGCAACC TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT101 GTTGTGACCA GTGCAGATTT ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA151 AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT GGCATATCTG CTGGCTGTCC201 CAGAAATCCC TTCCATGCCT AG蛋白质安吉康由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA52 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA以本实验室保存的含有野生型基因克隆载体pPET23b-Ad为模板，点突变的步骤是1.设计引物引物A5’-GCCAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACG-3’(含限制性内切酶Bgl II)引物B5’-CGGATTTCCAGGAGAGCCACAG-3’引物C5，-AGCTGTGATGCTGCAACCTG-3’
引物D5’-ATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3’(含限制性内切酶Hind III)2.合成DNA片段1)以质粒pPET23b-Ad为模板，利用引物A和B进行PCR扩增，得到长度为138bp的DNA片段。其具体反应体系是25mmol/L MgCl21.5μl10×PCR buffer 2.5μl无菌蒸馏水 18.35μldNTP mixture 2μlTaKaRa Taq 0.15μlPrimer A 0.25μlPrimer B 0.25μl总体积25μl反应条件94℃ 2min 反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在140bp附近有一条带为目的基因片段带。
2)以质粒pPET23b-Ad为模板，利用引物C和D进行PCR扩增，得到长度为180bp的DNA片段。其具体反应体系是
25mmol/L MgCl21.6μl10×PCR buffer 2.5μl无菌蒸馏水 18.35μldNTP mixture 2μlTaKaRa Taq 0.15μlPrimer C 0.25μlPrimer D 0.25μl反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在180bp附近有一条带为目的基因片段带。
3)连接电泳后将两条带进行平端连接，通过T4连接酶可以连接成一条含约320bp的DNA片段。具体方法如下采用宝生物工程有限公司生产的DNA Ligation Kit Ver2进行连接反应，反应混合物组成是两个PCR产物的混合液沉淀+10μl DNA Ligation Kit Ver2+双蒸水9μl，于室温下反应5小时，然后置于冰箱中。
4)构建入质粒pPET23b、扩增并测序。
利用Bgl II和Hind III双酶切将已连接的DNA片段构建入质粒pPET23b。并在大肠杆菌DH5α中扩增。制备感受态细菌采用氯化钙法。构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。并送宝生物工程有限公司测序，以确定定点突变的正确结果。
权利要求
1.蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，由73个氨基酸残基组成，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸模体和谷氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸模体，含11个半胱氨酸残基和五个二硫键；安吉康的一级结构中，这五个二硫键的位置分别是Cys8-Cys16、Cys21-Cys35、Cys29-Cys59、Cys34-Cys38、Cys47-Cys66；其一级结构是1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA51 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA
2.根据权利要求1所述的蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，第15位为丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，酪氨酸中的任一个氨基酸；即第6位的半胱氨酸为游离氨基酸。
3.根据权利要求1所述的蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，在基因工程中所产生的含有安吉康氨基酸序列的融合蛋白或多肽。
4.根据权利要求1所述的蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，在基因工程中所形成的与安吉康上述的氨基酸序列相对应的核苷酸序列，含简并密码子，包括存在于载体上的可编码安吉康氨基酸序列的核苷酸序列。
全文摘要
蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构属于生物技术领域，涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒去整合素突变体蛋白的氨基酸残基序列与相应的核苷酸序列，特别涉及到蛇源去整合素突变体安吉康蛋白的氨基酸残基序列及其相应的核苷酸序列。其抑制实体恶性肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤作用；抑制血小板聚集的抗血栓作用；以及促进嗜中性白细胞趋向性的作用。
文档编号A61P35/00GK1616488SQ20041005057
公开日2005年5月18日 申请日期2004年10月12日 优先权日2004年10月12日
发明者赵宝昌 申请人:赵宝昌
技术领域：
本发明属于生物技术领域；涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒去整合素突变体蛋白的氨基酸残基序列与相应的核苷酸序列，及其抑制实体恶性肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤作用；抑制血小板聚集的抗血栓作用；以及促进嗜中性白细胞趋向性的作用，特别涉及到蛇源去整合素突变体安吉康蛋白的氨基酸残基序列及其相应的核苷酸序列。
背景技术：
抑制恶性实体肿瘤的血管生成可有效地抑制肿瘤生长和转移。肿瘤在1mm3以上时，便有血管生成和长入，肿瘤从血液获取营养而迅速张大，并有利于转移。如果没有血管生长，肿瘤将发生退化。如果肿瘤的血管生成受到抑制，则肿瘤将不再生长，并可以进一步发生萎缩和凋亡，不能对机体造成危害。国内外虽有一些抑制恶性实体肿瘤血管生成的研究，但均不成熟。目前尚无这方面的基因重组药物进入市场。我们曾用基因工程手段，从旅顺白眉蝮蛇(Gloydiusblomhoffi brevicaudus)的毒腺中克隆出一种可以编码小分子量蛋白质(艾丁比特)的cDNA，并在大肠杆菌和酵母菌中成功地表达。这方面的成果已经申请了专利。艾丁比特含有模体RGD，可以与血管内皮细胞膜上的粘附因子整合蛋白αvβ3结合，抑制其活性。艾丁比特与我国台湾学者从Calloselasma rhodostoma提取纯化(不是基因重组)出的rhodostomin序列相比，有28个氨基酸的差异。美国学者也曾经从蛇毒中提取出一种小分子量的蛋白质，称为albolabrin，仅研究其对血小板聚集的抑制作用，而且不是用分子克隆的方法，是直接从蛇毒中提取的。艾丁比特仅与目前韩国Yonsei大学生物产品研究中心生物化学系研究的Saxatilin相似，但有9个核苷酸的差异和6个氨基酸的差异。韩国学者发现，Saxatilin含有12个半胱氨酸，形成6个二硫键。我们将艾丁比特进行定点突变修饰，产生出含有ECD模体和RGD模体，和含有11个半胱氨酸，形成含5个二硫键的安吉康。此物质具有较强地抑制新生血管生长、促进肿瘤细胞凋亡，较弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促进嗜中性白细胞趋向化的作用。因此，具有很好的抗实体肿瘤生长的作用。
发明内容
本发明的目的是给出比重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特更为优化的小分子蛋白质安吉康的氨基酸残基顺序，及其抑制实体肿瘤组织内血管生成和促进肿瘤细胞凋亡，较弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促进嗜中性白细胞趋向化的作用，进而达到抑制肿瘤生长的作用。
本发明的技术解决方案是采用基因工程的技术手段，对用于抗肿瘤疗法的重组白眉蝮艾丁比特分子进行修饰，以增强其抑制实体肿瘤组织内血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的作用，进而增强其抑制肿瘤生长的作用。安吉康为由73个氨基酸残基组成的小分子量的蛋白质，含有谷氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸ECD模体和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸RGD模体，含11个半胱氨酸残基，形成5个二硫键。二硫键的位置是Cys8-Cys16、Cys21-Cys35、Cys29-Cys59、Cys34-Cys38、Cys47-Cys66，其氨基酸残基的序列(例)为1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA51 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA其二硫键的位置如下 上述的一级结构中，第十五位为除半胱氨酸以外的以下十九种氨基酸中的任何一种这十九种氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
本发明的有益效果是，安吉康与野生型相比，存在游离的巯基，即存在ECD模体，具有比重组旅顺白眉蝮蛇艾丁比特更强的抑制实体肿瘤组织内血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的作用，较弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促进嗜中性白细胞趋向化的作用。更有利于用于实体肿瘤的治疗，可作为抗实体恶性肿瘤的药物，进一步开发。
具体实施例方式
用于抗肿瘤疗法的安吉康的克隆，包括定点突变，均采用分子生物学的手段进行。安吉康的核苷酸序列含222个碱基对，此核苷酸序列为1 GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGAGCTGTGA51 TGCTGCAACC TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT101 GTTGTGACCA GTGCAGATTT ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA151 AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT GGCATATCTG CTGGCTGTCC201 CAGAAATCCC TTCCATGCCT AG蛋白质安吉康由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA52 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA以本实验室保存的含有野生型基因克隆载体pPET23b-Ad为模板，点突变的步骤是1.设计引物引物A5’-GCCAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACG-3’(含限制性内切酶Bgl II)引物B5’-CGGATTTCCAGGAGAGCCACAG-3’引物C5，-AGCTGTGATGCTGCAACCTG-3’
引物D5’-ATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3’(含限制性内切酶Hind III)2.合成DNA片段1)以质粒pPET23b-Ad为模板，利用引物A和B进行PCR扩增，得到长度为138bp的DNA片段。其具体反应体系是25mmol/L MgCl21.5μl10×PCR buffer 2.5μl无菌蒸馏水 18.35μldNTP mixture 2μlTaKaRa Taq 0.15μlPrimer A 0.25μlPrimer B 0.25μl总体积25μl反应条件94℃ 2min 反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在140bp附近有一条带为目的基因片段带。
2)以质粒pPET23b-Ad为模板，利用引物C和D进行PCR扩增，得到长度为180bp的DNA片段。其具体反应体系是
25mmol/L MgCl21.6μl10×PCR buffer 2.5μl无菌蒸馏水 18.35μldNTP mixture 2μlTaKaRa Taq 0.15μlPrimer C 0.25μlPrimer D 0.25μl反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在180bp附近有一条带为目的基因片段带。
3)连接电泳后将两条带进行平端连接，通过T4连接酶可以连接成一条含约320bp的DNA片段。具体方法如下采用宝生物工程有限公司生产的DNA Ligation Kit Ver2进行连接反应，反应混合物组成是两个PCR产物的混合液沉淀+10μl DNA Ligation Kit Ver2+双蒸水9μl，于室温下反应5小时，然后置于冰箱中。
4)构建入质粒pPET23b、扩增并测序。
利用Bgl II和Hind III双酶切将已连接的DNA片段构建入质粒pPET23b。并在大肠杆菌DH5α中扩增。制备感受态细菌采用氯化钙法。构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。并送宝生物工程有限公司测序，以确定定点突变的正确结果。
权利要求
1.蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，由73个氨基酸残基组成，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸模体和谷氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸模体，含11个半胱氨酸残基和五个二硫键；安吉康的一级结构中，这五个二硫键的位置分别是Cys8-Cys16、Cys21-Cys35、Cys29-Cys59、Cys34-Cys38、Cys47-Cys66；其一级结构是1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA51 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA
2.根据权利要求1所述的蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，第15位为丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，酪氨酸中的任一个氨基酸；即第6位的半胱氨酸为游离氨基酸。
3.根据权利要求1所述的蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，在基因工程中所产生的含有安吉康氨基酸序列的融合蛋白或多肽。
4.根据权利要求1所述的蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构，其特征在于，在基因工程中所形成的与安吉康上述的氨基酸序列相对应的核苷酸序列，含简并密码子，包括存在于载体上的可编码安吉康氨基酸序列的核苷酸序列。
全文摘要
蛇源去整合素突变体抗肿瘤药安吉康蛋白的一级结构属于生物技术领域，涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒去整合素突变体蛋白的氨基酸残基序列与相应的核苷酸序列，特别涉及到蛇源去整合素突变体安吉康蛋白的氨基酸残基序列及其相应的核苷酸序列。其抑制实体恶性肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤作用；抑制血小板聚集的抗血栓作用；以及促进嗜中性白细胞趋向性的作用。
文档编号A61P35/00GK1616488SQ20041005057
公开日2005年5月18日 申请日期2004年10月12日 优先权日2004年10月12日
发明者赵宝昌 申请人:赵宝昌
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