一种促进猪生长的生物制剂的制备方法
专利名称：一种促进猪生长的生物制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术与猪的饲养技术领域，具体是指一种促进猪生长的生物制剂的制备方法。
背景技术：
提高动物的生产性能一直是畜牧业中一个重要的研究课题。人们通过各种途径(包括选育良种、改进饲料配方、增加某些饲料添加剂等)以求达到这一目的。使用外源性生长激素应该是一个快速、有效的方法。猪生长激素(Porcine Growth Hormone，pGH)是一种脑垂体前叶分泌、含190个氨基酸的单链多肽激素，具有刺激骨及软骨组织的生长、调节蛋白质、脂类和糖类代谢的功能。大量的研究结果表明猪生长激素能显著提高动物的生长速度、瘦肉率及饲料报酬、降低脂肪的积聚，具有明显的经济效益。由于生长激素是蛋白质，不具有象类固醇类激素那样的残毒污染，是一种很有生产实用价值的生物制剂，但在目前的生产实际中却不能普遍应用。其主要原因是1、猪生长激素在动物组织中含量极少，从组织中提取的猪生长激素显然不能满足于生产的需要。近十多年来，人们通过生物技术的方法，包括大肠杆菌表达、昆虫杆状病毒表达、重组痘苗病毒表达或腺相关病毒(adeno-associatedvirus)表达等，可以生产重组猪生长激素(例如中国专利申请00103044.2号)。但由于用这些方法(如腺相关病毒)制备复杂，滴度不高，并需要去除辅助病毒的污染等，因此，其产品都必需进行提纯、浓缩，其生产成本一般都比较高，不容易为畜主所接受。2、重组猪生长激素在动物体内的半衰期很短，必需每天注射给药，除了在生产实际应用中带来极大的不便之外，还增加了动物的应激反应，不利于动物的生长。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种促进猪生长的生物制剂的制备方法。该制剂的制作方法简单，生产成本低，在动物体内发挥作用时间长。
本发明通过如下技术方案实现
第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物(P15’TTAGATCTATGGCTGCAGGCCCTCGGACCTCC；P25’TTAGATCTCTAGAAGGCACAGCTGCTCTCCACAGATCT)，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体(pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP)中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒转染293细胞(人胚胎肾细胞株)；由于该表达载体可以同时表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因，因此，在荧光显微镜下观察到带绿色荧光的细胞，即可初步确定细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；经空斑技术进一步分离病毒克隆，并对病毒DNA进行PCR分析，证实重组腺病毒含有猪生长激素基因。用感染重组腺病毒的293细胞和PK-15细胞(猪肾细胞株)的培养液及细胞裂解物进行Western blot等分子生物学方法的检测，证明所分离的重组腺病毒能在人源和猪源细胞培养中正确地表达猪生长激素蛋白。
第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为5～10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下生长，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，冻融，离心，取上清液，即为本生物制剂。
测定病毒空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)或半数组织培养感染量(tissue culture infectious dose 50，TCID50)作为本生物制剂的效价。
为了更好地实现本发明，所述克隆猪生长激素基因采用RT-PCR DNA扩增技术；所述共转化大肠杆菌BJ5183菌株采用电激转化方法。
本发明应用时，将所述一种促进猪生长的生物制剂直接肌肉注射到猪体内，由重组腺病毒将猪生长激素基因带到动物体内的组织细胞中高效表达，其基因表达产物——重组猪生长激素将从细胞释放到血流中而产生生物学效应，从而达到促进动物生长的目的。
腺病毒(Adenovirus)为线状双链DNA、无包膜病毒。重组腺病毒作为基因表达载体，广泛用于人类基因治疗及其他基因表达方面的研究和应用，在全世界600项基因治疗的临床试验中，28％是应用重组腺病毒作为基因表达载体。其优点是1、安全性好，尤其是应用复制缺陷型的重组腺病毒；2、高效的基因表达；3、可感染的宿主范围大，能感染分裂和不分裂的细胞；4、重组腺病毒感染时，病毒DNA游离在细胞核内，而不整合到染色体上，因而没有激活原癌基因或灭活抑癌基因的危险性。据报道，腺病毒介导的基因表达，在动物体内可持续六个星期以上。因此，可以有效地解决每天注射猪生长激素的问题。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1、本发明采用复制缺陷型腺病毒作为猪生长激素基因的表达载体，直接在猪体内高效生物合成具有生物学活性的重组猪生长激素，因而省去在体外表达、生产、提纯重组生长激素等工序，大大降低了生产成本。
2、本发明使猪生长激素基因在动物体内连续表达，表达时间长，表达量高，因而无需每天注射给药，可达到长效的效果，既节省劳动力又减少对动物生活的干扰，更利于动物的生长，有效改善肉质。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
在本发明实施例中，人胚胎肾细胞采用美国ATCC公司的293细胞株，DMEM细胞培养基购于美国Invitrogen公司，新生牛血清购于上海赛达生物药业有限公司。
实施例一第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，应用RT-PCR DNA扩增技术，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒用电激转化方法(采用美国Bio-Rad公司的电激仪，参数为200Ω，25μF，2.5kV)共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒用脂质体法(采用美国GIBCOBRL公司的Lipofectamine)转染293细胞，在细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为5％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下，等细胞生长成单层后，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，在倒置显微镜下观察，待细胞发生病变后，如细胞变圆，脱落，即可收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，-20℃/37℃反复冻融三次，3000rpm离心十分钟，取上清液，即为本生物制剂。
实施例二第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计和合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，应用RT-PCR DNA扩增技术，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒用电激转化方法(采用美国Bio-Rad公司的电激仪，参数为200Ω，25μF，2.5kV)共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒用脂质体法(采用美国GIBCOBRL公司的Lipofectamine)转染293细胞，在细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为7％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下，等细胞生长成单层后，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，如细胞变圆，脱落，即可收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，-20℃/37℃反复冻融三次，3000rpm离心十分钟，取上清液，即为本生物制剂。
实施例三第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计和合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，应用RT-PCR DNA扩增技术，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒用电激转化方法(采用美国Bio-Rad公司的电激仪，参数为200Ω，25μF，2.5kV)共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒用磷酸钙共沉淀法转染293细胞，在细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下，等细胞生长成单层后，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，如细胞变圆，脱落，即可收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，-20℃/37℃反复冻融三次，3000rpm离心十分钟，取上清液，即为本生物制剂。
实施例四对比试验(在实验室进行)8头杂交长白猪(平均体重为18公斤)随机分成2组，每组4头。对照组肌肉注射生理盐水；试验组肌肉注射带猪生长激素基因的重组腺病毒(1011TCID50/头)。所有试验猪均采用自由采食方式，喂饲混合饲料。在注射前和注射后第四、六周称体重。通过测定体重来评价外源猪生长激素对猪生长的促进作用及生物学活性。试验结果表明，试验组的猪平均增重比对照组的猪增加37％(注射后第四周)和18％(注射后第六周)(见表1)。饲料报酬提高28％(注射后第四周)和18％(注射后第六周)(见表2)。该试验结果证明，由重组腺病毒表达的猪生长激素具有其生物学活性，在猪体内起到促进动物生长的作用。重组腺病毒介导的猪生长激素基因在猪体内的表达期应在四个星期之内。
表1 Ad-pGH注射后猪平均体重增重比较
表2 Ad-pGH注射后饲料报酬比较
实施例五对比试验(在养猪农场中进行)对照组9头杂交长白猪平均体重为51公斤，肌肉注射生理盐水；试验组12头杂交长白猪，平均体重为55公斤，肌肉注射含猪生长激素基因的重组腺病毒(3×109TCID50/头)。所有试验猪均采用自由采食方式，喂饲混合饲料。在注射前和注射后第四周称体重。结果表明，试验组的猪平均增重比对照组的猪增加12％(见表3)。
表3 Ad-pGH注射后猪平均体重增重比较
实施例六对比试验(在养猪农场中进行)对照组9头杂交长白猪，平均体重为52公斤，肌肉注射生理盐水；试验组11头杂交长白猪，平均体重为45公斤，肌肉注射含猪生长激素基因的重组腺病毒(3×109TCID50/头)。所有试验猪均采用自由采食方式，喂饲泔水。在注射前和注射后第35天称体重。结果表明，试验组的猪平均增重比对照组的猪增加12％(见表4)。
表4 Ad-pGH注射后猪平均体重增重比较
实施例七毒性试验1、用本生物制剂皮下注射0.1ml(108TCID50/只)3天龄的小白鼠8只。观察四周。结果表明，全部小白鼠都存活，未见任何异常症状。
2、用本生物制剂静脉注射0.5ml(5×108TCID50/只)35天龄的小白鼠5只。观察四周。结果表明，全部小白鼠都存活，未见任何异常症状。
3、在所有的试验猪只均没有发现任何不良反应。
上述的试验结果证明，本生物制剂对动物是安全的。
如上所述，即可较好地实现本发明。
权利要求
1.一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，包括如下步骤第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒转染293细胞；第三步 生物制剂的制备
293细胞培养于含体积百分比浓度为5～10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下生长，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，冻融，离心，取上清液，即为本生物制剂。
2.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述PCR引物为P15’TTAGATCTATGGCTGCAGGCCCTCGGACCTCC；P25’TTAGATCTCTAGAAGGCACAGCTGCTCTCCACAGATCT。
3.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述含有人巨细胞病毒早期启动子的表达载体为pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP。
4.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述克隆猪生长激素基因采用RT-PCR DNA扩增技术。
5.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述共转化大肠杆菌BJ5183菌株采用电激转化方法。
全文摘要
本发明是一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，首先设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，克隆猪生长激素基因的cDNA片断；然后将猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒共转化大肠杆菌BJ5183菌株，所得到的重组腺病毒质粒转染293细胞；最后接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，取上清液即为本生物制剂。本发明省去在体外表达、生产、提纯重组生长激素等工序，大大降低了生产成本，使猪生长激素基因在动物体内连续表达，表达时间长，表达量高，无需每天注射给药，既节省劳动力又减少对动物生活的干扰，利于动物生长，有效改善肉质。
文档编号A61K48/00GK1616106SQ20041005140
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月9日 优先权日2004年9月9日
发明者曹汉威, 黄忠, 林洁 申请人:广东省农业科学院兽医研究所
技术领域：
本发明涉及生物技术与猪的饲养技术领域，具体是指一种促进猪生长的生物制剂的制备方法。
背景技术：
提高动物的生产性能一直是畜牧业中一个重要的研究课题。人们通过各种途径(包括选育良种、改进饲料配方、增加某些饲料添加剂等)以求达到这一目的。使用外源性生长激素应该是一个快速、有效的方法。猪生长激素(Porcine Growth Hormone，pGH)是一种脑垂体前叶分泌、含190个氨基酸的单链多肽激素，具有刺激骨及软骨组织的生长、调节蛋白质、脂类和糖类代谢的功能。大量的研究结果表明猪生长激素能显著提高动物的生长速度、瘦肉率及饲料报酬、降低脂肪的积聚，具有明显的经济效益。由于生长激素是蛋白质，不具有象类固醇类激素那样的残毒污染，是一种很有生产实用价值的生物制剂，但在目前的生产实际中却不能普遍应用。其主要原因是1、猪生长激素在动物组织中含量极少，从组织中提取的猪生长激素显然不能满足于生产的需要。近十多年来，人们通过生物技术的方法，包括大肠杆菌表达、昆虫杆状病毒表达、重组痘苗病毒表达或腺相关病毒(adeno-associatedvirus)表达等，可以生产重组猪生长激素(例如中国专利申请00103044.2号)。但由于用这些方法(如腺相关病毒)制备复杂，滴度不高，并需要去除辅助病毒的污染等，因此，其产品都必需进行提纯、浓缩，其生产成本一般都比较高，不容易为畜主所接受。2、重组猪生长激素在动物体内的半衰期很短，必需每天注射给药，除了在生产实际应用中带来极大的不便之外，还增加了动物的应激反应，不利于动物的生长。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种促进猪生长的生物制剂的制备方法。该制剂的制作方法简单，生产成本低，在动物体内发挥作用时间长。
本发明通过如下技术方案实现
第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物(P15’TTAGATCTATGGCTGCAGGCCCTCGGACCTCC；P25’TTAGATCTCTAGAAGGCACAGCTGCTCTCCACAGATCT)，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体(pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP)中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒转染293细胞(人胚胎肾细胞株)；由于该表达载体可以同时表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因，因此，在荧光显微镜下观察到带绿色荧光的细胞，即可初步确定细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；经空斑技术进一步分离病毒克隆，并对病毒DNA进行PCR分析，证实重组腺病毒含有猪生长激素基因。用感染重组腺病毒的293细胞和PK-15细胞(猪肾细胞株)的培养液及细胞裂解物进行Western blot等分子生物学方法的检测，证明所分离的重组腺病毒能在人源和猪源细胞培养中正确地表达猪生长激素蛋白。
第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为5～10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下生长，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，冻融，离心，取上清液，即为本生物制剂。
测定病毒空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)或半数组织培养感染量(tissue culture infectious dose 50，TCID50)作为本生物制剂的效价。
为了更好地实现本发明，所述克隆猪生长激素基因采用RT-PCR DNA扩增技术；所述共转化大肠杆菌BJ5183菌株采用电激转化方法。
本发明应用时，将所述一种促进猪生长的生物制剂直接肌肉注射到猪体内，由重组腺病毒将猪生长激素基因带到动物体内的组织细胞中高效表达，其基因表达产物——重组猪生长激素将从细胞释放到血流中而产生生物学效应，从而达到促进动物生长的目的。
腺病毒(Adenovirus)为线状双链DNA、无包膜病毒。重组腺病毒作为基因表达载体，广泛用于人类基因治疗及其他基因表达方面的研究和应用，在全世界600项基因治疗的临床试验中，28％是应用重组腺病毒作为基因表达载体。其优点是1、安全性好，尤其是应用复制缺陷型的重组腺病毒；2、高效的基因表达；3、可感染的宿主范围大，能感染分裂和不分裂的细胞；4、重组腺病毒感染时，病毒DNA游离在细胞核内，而不整合到染色体上，因而没有激活原癌基因或灭活抑癌基因的危险性。据报道，腺病毒介导的基因表达，在动物体内可持续六个星期以上。因此，可以有效地解决每天注射猪生长激素的问题。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1、本发明采用复制缺陷型腺病毒作为猪生长激素基因的表达载体，直接在猪体内高效生物合成具有生物学活性的重组猪生长激素，因而省去在体外表达、生产、提纯重组生长激素等工序，大大降低了生产成本。
2、本发明使猪生长激素基因在动物体内连续表达，表达时间长，表达量高，因而无需每天注射给药，可达到长效的效果，既节省劳动力又减少对动物生活的干扰，更利于动物的生长，有效改善肉质。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
在本发明实施例中，人胚胎肾细胞采用美国ATCC公司的293细胞株，DMEM细胞培养基购于美国Invitrogen公司，新生牛血清购于上海赛达生物药业有限公司。
实施例一第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，应用RT-PCR DNA扩增技术，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒用电激转化方法(采用美国Bio-Rad公司的电激仪，参数为200Ω，25μF，2.5kV)共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒用脂质体法(采用美国GIBCOBRL公司的Lipofectamine)转染293细胞，在细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为5％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下，等细胞生长成单层后，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，在倒置显微镜下观察，待细胞发生病变后，如细胞变圆，脱落，即可收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，-20℃/37℃反复冻融三次，3000rpm离心十分钟，取上清液，即为本生物制剂。
实施例二第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计和合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，应用RT-PCR DNA扩增技术，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒用电激转化方法(采用美国Bio-Rad公司的电激仪，参数为200Ω，25μF，2.5kV)共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒用脂质体法(采用美国GIBCOBRL公司的Lipofectamine)转染293细胞，在细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为7％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下，等细胞生长成单层后，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，如细胞变圆，脱落，即可收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，-20℃/37℃反复冻融三次，3000rpm离心十分钟，取上清液，即为本生物制剂。
实施例三第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计和合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，应用RT-PCR DNA扩增技术，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子(CMV)的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒用电激转化方法(采用美国Bio-Rad公司的电激仪，参数为200Ω，25μF，2.5kV)共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒用磷酸钙共沉淀法转染293细胞，在细胞内产生带猪生长激素基因的重组腺病毒；第三步 生物制剂的制备293细胞培养于含体积百分比浓度为10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下，等细胞生长成单层后，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，如细胞变圆，脱落，即可收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，-20℃/37℃反复冻融三次，3000rpm离心十分钟，取上清液，即为本生物制剂。
实施例四对比试验(在实验室进行)8头杂交长白猪(平均体重为18公斤)随机分成2组，每组4头。对照组肌肉注射生理盐水；试验组肌肉注射带猪生长激素基因的重组腺病毒(1011TCID50/头)。所有试验猪均采用自由采食方式，喂饲混合饲料。在注射前和注射后第四、六周称体重。通过测定体重来评价外源猪生长激素对猪生长的促进作用及生物学活性。试验结果表明，试验组的猪平均增重比对照组的猪增加37％(注射后第四周)和18％(注射后第六周)(见表1)。饲料报酬提高28％(注射后第四周)和18％(注射后第六周)(见表2)。该试验结果证明，由重组腺病毒表达的猪生长激素具有其生物学活性，在猪体内起到促进动物生长的作用。重组腺病毒介导的猪生长激素基因在猪体内的表达期应在四个星期之内。
表1 Ad-pGH注射后猪平均体重增重比较
表2 Ad-pGH注射后饲料报酬比较
实施例五对比试验(在养猪农场中进行)对照组9头杂交长白猪平均体重为51公斤，肌肉注射生理盐水；试验组12头杂交长白猪，平均体重为55公斤，肌肉注射含猪生长激素基因的重组腺病毒(3×109TCID50/头)。所有试验猪均采用自由采食方式，喂饲混合饲料。在注射前和注射后第四周称体重。结果表明，试验组的猪平均增重比对照组的猪增加12％(见表3)。
表3 Ad-pGH注射后猪平均体重增重比较
实施例六对比试验(在养猪农场中进行)对照组9头杂交长白猪，平均体重为52公斤，肌肉注射生理盐水；试验组11头杂交长白猪，平均体重为45公斤，肌肉注射含猪生长激素基因的重组腺病毒(3×109TCID50/头)。所有试验猪均采用自由采食方式，喂饲泔水。在注射前和注射后第35天称体重。结果表明，试验组的猪平均增重比对照组的猪增加12％(见表4)。
表4 Ad-pGH注射后猪平均体重增重比较
实施例七毒性试验1、用本生物制剂皮下注射0.1ml(108TCID50/只)3天龄的小白鼠8只。观察四周。结果表明，全部小白鼠都存活，未见任何异常症状。
2、用本生物制剂静脉注射0.5ml(5×108TCID50/只)35天龄的小白鼠5只。观察四周。结果表明，全部小白鼠都存活，未见任何异常症状。
3、在所有的试验猪只均没有发现任何不良反应。
上述的试验结果证明，本生物制剂对动物是安全的。
如上所述，即可较好地实现本发明。
权利要求
1.一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，包括如下步骤第一步 克隆猪生长激素基因参照基因库发表的猪生长激素基因cDNA序列，设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，从猪的脑垂体组织mRNA中克隆猪生长激素基因的cDNA片断；第二步 构建重组腺病毒猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在菌体内进行病毒基因的同源重组，将所得到的重组腺病毒质粒转染293细胞；第三步 生物制剂的制备
293细胞培养于含体积百分比浓度为5～10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中，在体积百分比含量5％二氧化碳、37℃的条件下生长，接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，收集含有重组腺病毒的细胞和培养液，冻融，离心，取上清液，即为本生物制剂。
2.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述PCR引物为P15’TTAGATCTATGGCTGCAGGCCCTCGGACCTCC；P25’TTAGATCTCTAGAAGGCACAGCTGCTCTCCACAGATCT。
3.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述含有人巨细胞病毒早期启动子的表达载体为pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP。
4.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述克隆猪生长激素基因采用RT-PCR DNA扩增技术。
5.根据权利要求1所述的一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，其特征是，所述共转化大肠杆菌BJ5183菌株采用电激转化方法。
全文摘要
本发明是一种促进猪生长的生物制剂的制备方法，首先设计合成用于克隆猪生长激素基因的PCR引物，克隆猪生长激素基因的cDNA片断；然后将猪生长激素基因克隆到含有人巨细胞病毒早期启动子的表达载体中，将重组表达载体和腺病毒基因组的质粒共转化大肠杆菌BJ5183菌株，所得到的重组腺病毒质粒转染293细胞；最后接种含有猪生长激素基因的重组腺病毒，待细胞发生病变后，取上清液即为本生物制剂。本发明省去在体外表达、生产、提纯重组生长激素等工序，大大降低了生产成本，使猪生长激素基因在动物体内连续表达，表达时间长，表达量高，无需每天注射给药，既节省劳动力又减少对动物生活的干扰，利于动物生长，有效改善肉质。
文档编号A61K48/00GK1616106SQ20041005140
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月9日 优先权日2004年9月9日
发明者曹汉威, 黄忠, 林洁 申请人:广东省农业科学院兽医研究所
最新回复(0)