人头皮毛乳头分离方法
专利名称：人头皮毛乳头分离方法
技术领域：
本发明涉及一种从人头皮标本分离出毛乳头的方法。
背景技术：
人头皮毛乳头位于毛囊球部的基底，由毛乳头细胞、基质和基底膜组成。体外培养人头皮毛乳头细胞对于理论研究和临床应用具有十分重要的意义，要培养人头皮毛乳头细胞，首先必须获取纯净的毛乳头。然而由于毛乳头特殊的解剖位置和生物学特性，使其难以从头皮标本分离出来，为此人们进行了不懈的研究探索。
1984年采用显微镜解剖法首次成功地从头皮标本分离出毛乳头。目前显微镜解剖法已被进一步改进并广泛应用，具体如下取用人头皮标本并从真皮-皮下组织交界处剪开，轻压皮下组织显露毛囊切缘尖端，用显微镊夹持切缘尖端，将毛囊中下部从皮下组织中拔出，在毛囊近毛球上方用显微镊夹持，使毛球形成一内部富含压力的球形，同时用1ml注射器的针尖将毛球近毛乳头根茎部的真皮鞘切开，于是毛球内部的压力将毛乳头完整挤出。上述方法存在以下缺点1、操作繁复，主要工序过程都是在显微镜下操作，要求术者有熟练的显微解剖技术，并且需要长时间在显微镜下工作，容易使操作者疲劳；2、效率和人力的限制还会造成标本的严重浪费；3、长时间敞开器皿进行解剖也增加了污染机会；4、分离出来的毛乳头由于基底膜光滑完整、厚度大，导致其后续培养过程中贴壁率低，毛乳头细胞迁出困难，迁出时间长。
《毛乳头细胞高效培养方法探索》(伍津津刘荣卿叶庆佾，等《中华皮肤科》杂志1997年第30期P383-385)公开了显微镜解剖加酶消化法分离得到毛乳头，该方法是将毛囊中下部从皮下组织中拔出，在双目解剖显微镜下将毛囊上皮部分挤出，然后将包裹着毛乳头的真皮鞘加入到含胶原酶D(0.2％)的DMEM液中，在37℃消化2小时，至毛乳头游离出来，离心，显微镜下捡出毛乳头。上述方法使得分离出来的毛乳头贴壁率明显提高，毛乳头细胞迁出时间缩短。但在上述方法中，将毛囊上皮部分挤出的工序仍然需要在显微镜下进行较长时间的手工精细操作，而且需要熟练的专业操作技能，还容易使操作者疲劳，使毛乳头获取仍然比较困难，获取成本高，且仍然存在较大污染机会。
发明内容
本发明的目的是要提供一种人头皮毛乳头分离方法，它将毛乳头从头皮标本分离出来的主要工序不需要在显微镜下进行精细的手工操作，污染机会小，而且分离出来的毛乳头贴壁率高，毛乳头细胞迁出时间短。
为实现以上目的，本发明的人头皮毛乳头分离方法依次包括以下主要步骤①、取无菌处理后的头皮标本，在真皮-皮下组织交界处剪开，使毛囊的中下部保留在皮下脂肪层，并彻底剔除残余在皮下脂肪中的真皮层；②、将皮下脂肪层置于器皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在器皿中加入2-5倍体积的含胶原酶I(浓度为1-3mg/ml)的DMEM液，在35℃-37℃温度下进行消化，消化至显微镜下观测到真皮鞘变得松散但仍能包裹住毛乳头；④、用吸管吸取器皿中的液体后重新将它们排挤到器皿中，如此反复多次，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此使毛乳头游离出来；⑤、向上述液体中加入DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的液体转入到试管中，混匀，静置若干秒，使毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，至肉眼见大块组织沉淀于试管底部；⑦、将上清液吸出、收集；⑧、用微吸管在显微镜下从上清液中捡拾出毛乳头。
上述第③步骤中的所谓“2-5倍体积”，是以第②步骤中肉泥状头皮标本的体积为基数。
上述第⑥步骤中的游离细胞，是指在第④步骤震动过程中附带游离出来的其它细胞，这些游离细胞并非本发明方法所要分离、提取的物质。
实现上述目的较好的方案是在上述第⑦步骤中，将上清液吸出、收集后，继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、静置若干秒，使上述第⑥步骤中仍残留在管底沉淀部分的毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，至肉眼见大块组织沉于管底，再次将该上清液吸出、收集，如此反复若干次。
实现上述目的更好的方案是在上述第⑦步骤和第⑧步骤之间，将第⑦步骤收集得到的上清液进行离心、分层，使游离细胞悬浮在该上清液上部，毛乳头沉淀在该上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部。
在上述第③步骤中，将肉泥状皮下脂肪层进行消化的时间长度最好为3.5-5.5小时。
在上述第⑤步骤中，所加入DMEM液的体积可以为第③步骤中所加入DMEM液体积的1/3-4/3。
本发明具有以下优点和效果1.本发明巧妙地利用了“毛乳头较毛囊其他成分及周围脂肪难于消化”及“毛乳头的密度低于DMEM液而毛乳头周围其他成分的密度高于DMEM液”等规律，先利用胶原酶I将毛囊消化，消化至真皮鞘松散但仍能包裹毛乳头时，用冲击震动的吹打方法，简单易行地帮助毛乳头分离出来。
2、本发明在毛乳头分离过程中间只需在显微镜下进行粗略的目视观察(而不需象以前的方法一样需要在分离过程中间进行镜下手工操作)；在毛乳头分离出来后也只需要在显微镜下用微吸管将毛乳头捡拾出来，该显微镜下操作也简单易行，操作方法简单，在显微镜下操作的时间极短。总之，本发明不需要在显微镜下进行高难度、长时间的手工精细操作，无需特殊训练即可掌握，在显微镜下工作的时间短，污染机会小，而且工作效率高，所获得的毛乳头纯度高，使毛乳头能够轻松容易地获得。
3、实验中发现，基底膜被消化至很松散的毛乳头，贴壁率明显增高，毛乳头细胞迁出容易；但如果毛乳头基底膜被过度消化，则毛乳头存活率极低，严重影响分离效果；反之，如果毛乳头基底膜根本不被消化，则会使获得的毛乳头不易贴壁，毛乳头细胞迁出困难。本发明在使用胶原酶I消化毛囊真皮鞘的过程中，辅以冲击、震动的措施，帮助毛乳头提前从毛囊中游离出来，这样既可避免毛囊消化时间过长而导致毛乳头基底膜被过度消化的问题，又可避免显微镜解剖法中毛乳头基底膜根本不被消化的问题，在两种极端情况中间找到平衡点，达到理想的分离效果，提高了培养出来的毛乳头的贴壁率，同时还减轻了各毛乳头由于大小不同等个体差异原因而导致的消化不同步的程度。
本发明在毛乳头分离过程以及分离后继续培养方面实验效果显著。
在毛乳头分离过程实验方面，取大小约1cm×1cm正常头皮标本，标本采集后立即置于4℃无菌D-hands液中保存，保存时间不超过24小时，标本随机分为3组，三组标本分别采用显微镜解剖法、显微镜解剖加酶消化法以及本发明方法进行毛乳头分离，结果见表1，可见本发明方法在显微镜下的工作强度方面明显低于显微镜解剖法和显微镜解剖加酶消化法，其污染机会也明显低于后两者。表1中所指污染机会，是指污染次数与总操作次数之比。在本发明方法12次操作中，由于细菌污染致培养液明显浑浊的次数为0，而显微镜解剖法的相应污染次数为4，显微镜解剖加酶消化法的相应污染次数为2。
表1本发明方法与其它常用方法的工作强度与污染机会的比较 在毛乳头分离后继续培养实验方面，将前述实验所得的毛乳头放入培养皿中，每个培养皿含10个毛乳头，加入含15％胎牛血清的DMEM液，置于5％CO2培养箱培养。5天后第一次换液，其后每周换液2次，取3-4代传代细胞进行鉴定，其特征为呈现明显的多层聚集性生长，α-actin免疫组化染色阳性，其它方面的结果见表2，从表2可见由于胶原酶I对毛乳头表面基底膜的消化作用，使毛乳头的贴壁率明显提高，毛乳头细胞的迁出加快。表2中所指迁出时间，是指从第一个毛乳头有细胞迁出的时间，至所有毛乳头中不再有细胞迁出的时间。本发明方法的实验例中，第一个毛乳头有细胞迁出的时间为第5天，所有毛乳头中不再有细胞迁出的时间为第7天。
表2 本发明方法与其它传统方法对毛乳头贴壁率和毛乳头细胞迁出时间的比较具体实施方式
实施例一该分离方法依次包括以下主要步骤①、取1cm×1cm的头皮标本，无菌处理后，在真皮-皮下组织交界处剪开，剔除真皮层，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层；②、将皮下脂肪层置于培养皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在培养皿中加入4ml(约相当于头皮标本剔除真皮层后剪碎至肉泥状时的体积的3.5倍)的含胶原酶I(浓度为2mg/ml)的DMEM液，使肉泥状皮下脂肪层在37℃温度下消化4.5小时，此时在显微镜下可见到真皮鞘变得松散但仍包裹毛乳头；④、用吸管吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，反复多次，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此使毛乳头游离出来，至显微镜下观测到有大量毛乳头游离出来；⑤、向上述液体(消化液)中继续加入2ml的DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的消化液转入到离心管中，吹吸混匀，静置30秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，此时毛乳头及游离细胞由于浮力作用悬浮于上清液中；⑦、将上清液吸出、收集；继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、再静置30秒，至肉眼见毛干等大块组织沉于管底，由于管底沉淀部分还残留有毛乳头及游离细胞，则又有毛乳头及游离细胞悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集；⑧、将第⑦步骤收集得到的上清液进行300转/分钟地离心、分层，使游离细胞悬浮在上清液上部，而毛乳头沉淀在上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部；⑨、在显微镜下用10μl微吸管从上清液中捡拾毛乳头，将捡拾得到的毛乳头加入含15％的胎牛血清的DMEM，50ml/LCO2的条件下培养，细胞融合后传代，取第三代细胞进行实验。
本发明第二个实施例的头皮毛乳头分离方法，依次包括以下主要步骤①、取1.2cm×1.3cm的头皮标本，无菌处理后，在真皮-皮下组织交界处剪开，剔除真皮层，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层；②、将皮下脂肪层置于培养皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在培养皿中加入6ml(约相当于头皮标本剔除真皮层后剪碎至肉泥状时的体积的5倍)的含胶原酶I(浓度为1mg/ml)的DMEM液，在35℃温度下消化5.5小时，此时在显微镜下可见到真皮鞘变得松散但仍包裹毛乳头；④、用吸管反复吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此帮助毛乳头游离出来，至显微镜下观测到有大量毛乳头游离出来；⑤向上述消化液中加入2ml的DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的消化液转入到离心管中，吹吸混匀，静置35秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，此时毛乳头及游离细胞由于浮力作用悬浮于上清液中；⑦、将上清液吸出、收集；继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、再静置40秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，则又有毛乳头及游离细胞悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集；重复第⑦步骤4遍；⑧、将第⑦步骤收集得到的上清液进行250转/分钟地离心、分层，使游离的毛乳头细胞悬浮在上清液上部，毛乳头沉淀在上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部；⑨、在显微镜下用10μl微吸管从上清液中捡拾毛乳头，将捡拾得到的毛乳头加入含15％的胎牛血清的DMEM，50ml/LCO2的条件下培养，细胞融合后传代，取第三代细胞进行实验。
在本发明第三个实施例的头皮毛乳头分离方法，依次包括以下主要步骤①、取1.3cm×1.3cm的头皮标本，无菌处理后，在真皮-皮下组织交界处剪开，剔除真皮层，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层；②、将皮下脂肪层置于培养皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在培养皿中加入3ml(约相当于头皮标本剔除真皮层后剪碎至肉泥状时的体积的2倍)的含胶原酶I(浓度为3mg/ml)的DMEM液，在37℃温度下消化3.5小时，此时在显微镜下可见到真皮鞘变得松散但仍包裹毛乳头；④、用吸管反复吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，至显微镜下观测到有大量毛乳头游离出来；⑤向上述消化液中加入4ml的DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的消化液转入到离心管中，吹吸混匀，静置35秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，此时毛乳头及游离细胞由于浮力作用悬浮于上清液中；⑦、将上清液吸出、收集；继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、再静置40秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，则又有毛乳头及游离细胞悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集；重复第⑦步骤4遍；⑧、将第⑦步骤收集得到的上清液进行250转/分钟地离心、分层，使游离的毛乳头细胞悬浮在上清液上部，毛乳头沉淀在上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部；⑨、在显微镜下用10μl微吸管从上清液中捡拾毛乳头，将捡拾得到的毛乳头加入含15％的胎牛血清的DMEM，50ml/LCO2的条件下培养，细胞融合后传代，取第三代细胞进行实验。
权利要求
1.一种头皮毛乳头分离方法，其特征在于依次包括以下主要步骤①、取无菌处理后的头皮标本，在真皮-皮下组织交界处剪开，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层，并彻底剔除残余在皮下脂肪中的真皮层；②、将皮下脂肪层置于器皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在器皿中加入2-5倍体积的含胶原酶I(浓度为1-3mg/ml)的DMEM液，在35℃-37℃温度下进行消化，至显微镜下观测到真皮鞘变得松散但仍能包裹住毛乳头；④、用吸管吸取器皿中的液体后重新将它们排挤到器皿中，如此反复多次，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此帮助毛乳头游离出来；⑤、向上述液体中加入DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的液体转入到试管中，混匀，静置若干秒，使毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，至肉眼见大块组织沉淀于试管底部；⑦、将上清液吸出、收集；⑧、用微吸管在显微镜下从上清液中捡拾出毛乳头。
2.根据权利要求1的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑦步骤中，将上清液吸出、收集后，继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、静置若干秒，至肉眼见到大块组织沉于管底，使毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集，如此反复若干次。
3.根据权利要求1或2的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑦步骤和第⑧步骤之间，将第⑦步骤收集得到的上清液进行离心、分层，使游离细胞悬浮在该上清液上部，毛乳头沉淀在该上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部。
4.根据权利要求1或2的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第③步骤中，消化的时间为3.5-5.5小时。
5.根据权利要求3的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第③步骤中，消化的时间为3.5-5.5小时。
6.根据权利要求1或2的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑤步骤中，所加入DMEM液的体积为第③步骤中所加入DMEM液体积的1/3-4/3。
7.根据权利要求3的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑤步骤中，所加入DMEM液的体积为第③步骤中所加入DMEM液体积的1/3-4/3。
全文摘要
一种头皮毛乳头分离方法，包括以下主要步骤将头皮标本在真皮－皮下组织交界处剪开；将皮下脂肪层反复剪碎至肉泥状；加入含胶原酶I的DMEM液，在常温下进行消化，使皮鞘变得松散但仍能包裹住毛乳头；用吸管反复吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，由此产生震动、冲击，使毛乳头游离出来；最后捡拾出毛乳头。本发明不需要在显微镜下进行高难度的手工精细操作，无需特殊训练即可掌握，在显微镜下工作的时间短，污染机会小。
文档编号A61B16/00GK1613428SQ20041005188
公开日2005年5月11日 申请日期2004年10月15日 优先权日2004年10月15日
发明者李宇 申请人:李宇, 汕头大学医学院第一附属医院
技术领域：
本发明涉及一种从人头皮标本分离出毛乳头的方法。
背景技术：
人头皮毛乳头位于毛囊球部的基底，由毛乳头细胞、基质和基底膜组成。体外培养人头皮毛乳头细胞对于理论研究和临床应用具有十分重要的意义，要培养人头皮毛乳头细胞，首先必须获取纯净的毛乳头。然而由于毛乳头特殊的解剖位置和生物学特性，使其难以从头皮标本分离出来，为此人们进行了不懈的研究探索。
1984年采用显微镜解剖法首次成功地从头皮标本分离出毛乳头。目前显微镜解剖法已被进一步改进并广泛应用，具体如下取用人头皮标本并从真皮-皮下组织交界处剪开，轻压皮下组织显露毛囊切缘尖端，用显微镊夹持切缘尖端，将毛囊中下部从皮下组织中拔出，在毛囊近毛球上方用显微镊夹持，使毛球形成一内部富含压力的球形，同时用1ml注射器的针尖将毛球近毛乳头根茎部的真皮鞘切开，于是毛球内部的压力将毛乳头完整挤出。上述方法存在以下缺点1、操作繁复，主要工序过程都是在显微镜下操作，要求术者有熟练的显微解剖技术，并且需要长时间在显微镜下工作，容易使操作者疲劳；2、效率和人力的限制还会造成标本的严重浪费；3、长时间敞开器皿进行解剖也增加了污染机会；4、分离出来的毛乳头由于基底膜光滑完整、厚度大，导致其后续培养过程中贴壁率低，毛乳头细胞迁出困难，迁出时间长。
《毛乳头细胞高效培养方法探索》(伍津津刘荣卿叶庆佾，等《中华皮肤科》杂志1997年第30期P383-385)公开了显微镜解剖加酶消化法分离得到毛乳头，该方法是将毛囊中下部从皮下组织中拔出，在双目解剖显微镜下将毛囊上皮部分挤出，然后将包裹着毛乳头的真皮鞘加入到含胶原酶D(0.2％)的DMEM液中，在37℃消化2小时，至毛乳头游离出来，离心，显微镜下捡出毛乳头。上述方法使得分离出来的毛乳头贴壁率明显提高，毛乳头细胞迁出时间缩短。但在上述方法中，将毛囊上皮部分挤出的工序仍然需要在显微镜下进行较长时间的手工精细操作，而且需要熟练的专业操作技能，还容易使操作者疲劳，使毛乳头获取仍然比较困难，获取成本高，且仍然存在较大污染机会。
发明内容
本发明的目的是要提供一种人头皮毛乳头分离方法，它将毛乳头从头皮标本分离出来的主要工序不需要在显微镜下进行精细的手工操作，污染机会小，而且分离出来的毛乳头贴壁率高，毛乳头细胞迁出时间短。
为实现以上目的，本发明的人头皮毛乳头分离方法依次包括以下主要步骤①、取无菌处理后的头皮标本，在真皮-皮下组织交界处剪开，使毛囊的中下部保留在皮下脂肪层，并彻底剔除残余在皮下脂肪中的真皮层；②、将皮下脂肪层置于器皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在器皿中加入2-5倍体积的含胶原酶I(浓度为1-3mg/ml)的DMEM液，在35℃-37℃温度下进行消化，消化至显微镜下观测到真皮鞘变得松散但仍能包裹住毛乳头；④、用吸管吸取器皿中的液体后重新将它们排挤到器皿中，如此反复多次，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此使毛乳头游离出来；⑤、向上述液体中加入DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的液体转入到试管中，混匀，静置若干秒，使毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，至肉眼见大块组织沉淀于试管底部；⑦、将上清液吸出、收集；⑧、用微吸管在显微镜下从上清液中捡拾出毛乳头。
上述第③步骤中的所谓“2-5倍体积”，是以第②步骤中肉泥状头皮标本的体积为基数。
上述第⑥步骤中的游离细胞，是指在第④步骤震动过程中附带游离出来的其它细胞，这些游离细胞并非本发明方法所要分离、提取的物质。
实现上述目的较好的方案是在上述第⑦步骤中，将上清液吸出、收集后，继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、静置若干秒，使上述第⑥步骤中仍残留在管底沉淀部分的毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，至肉眼见大块组织沉于管底，再次将该上清液吸出、收集，如此反复若干次。
实现上述目的更好的方案是在上述第⑦步骤和第⑧步骤之间，将第⑦步骤收集得到的上清液进行离心、分层，使游离细胞悬浮在该上清液上部，毛乳头沉淀在该上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部。
在上述第③步骤中，将肉泥状皮下脂肪层进行消化的时间长度最好为3.5-5.5小时。
在上述第⑤步骤中，所加入DMEM液的体积可以为第③步骤中所加入DMEM液体积的1/3-4/3。
本发明具有以下优点和效果1.本发明巧妙地利用了“毛乳头较毛囊其他成分及周围脂肪难于消化”及“毛乳头的密度低于DMEM液而毛乳头周围其他成分的密度高于DMEM液”等规律，先利用胶原酶I将毛囊消化，消化至真皮鞘松散但仍能包裹毛乳头时，用冲击震动的吹打方法，简单易行地帮助毛乳头分离出来。
2、本发明在毛乳头分离过程中间只需在显微镜下进行粗略的目视观察(而不需象以前的方法一样需要在分离过程中间进行镜下手工操作)；在毛乳头分离出来后也只需要在显微镜下用微吸管将毛乳头捡拾出来，该显微镜下操作也简单易行，操作方法简单，在显微镜下操作的时间极短。总之，本发明不需要在显微镜下进行高难度、长时间的手工精细操作，无需特殊训练即可掌握，在显微镜下工作的时间短，污染机会小，而且工作效率高，所获得的毛乳头纯度高，使毛乳头能够轻松容易地获得。
3、实验中发现，基底膜被消化至很松散的毛乳头，贴壁率明显增高，毛乳头细胞迁出容易；但如果毛乳头基底膜被过度消化，则毛乳头存活率极低，严重影响分离效果；反之，如果毛乳头基底膜根本不被消化，则会使获得的毛乳头不易贴壁，毛乳头细胞迁出困难。本发明在使用胶原酶I消化毛囊真皮鞘的过程中，辅以冲击、震动的措施，帮助毛乳头提前从毛囊中游离出来，这样既可避免毛囊消化时间过长而导致毛乳头基底膜被过度消化的问题，又可避免显微镜解剖法中毛乳头基底膜根本不被消化的问题，在两种极端情况中间找到平衡点，达到理想的分离效果，提高了培养出来的毛乳头的贴壁率，同时还减轻了各毛乳头由于大小不同等个体差异原因而导致的消化不同步的程度。
本发明在毛乳头分离过程以及分离后继续培养方面实验效果显著。
在毛乳头分离过程实验方面，取大小约1cm×1cm正常头皮标本，标本采集后立即置于4℃无菌D-hands液中保存，保存时间不超过24小时，标本随机分为3组，三组标本分别采用显微镜解剖法、显微镜解剖加酶消化法以及本发明方法进行毛乳头分离，结果见表1，可见本发明方法在显微镜下的工作强度方面明显低于显微镜解剖法和显微镜解剖加酶消化法，其污染机会也明显低于后两者。表1中所指污染机会，是指污染次数与总操作次数之比。在本发明方法12次操作中，由于细菌污染致培养液明显浑浊的次数为0，而显微镜解剖法的相应污染次数为4，显微镜解剖加酶消化法的相应污染次数为2。
表1本发明方法与其它常用方法的工作强度与污染机会的比较 在毛乳头分离后继续培养实验方面，将前述实验所得的毛乳头放入培养皿中，每个培养皿含10个毛乳头，加入含15％胎牛血清的DMEM液，置于5％CO2培养箱培养。5天后第一次换液，其后每周换液2次，取3-4代传代细胞进行鉴定，其特征为呈现明显的多层聚集性生长，α-actin免疫组化染色阳性，其它方面的结果见表2，从表2可见由于胶原酶I对毛乳头表面基底膜的消化作用，使毛乳头的贴壁率明显提高，毛乳头细胞的迁出加快。表2中所指迁出时间，是指从第一个毛乳头有细胞迁出的时间，至所有毛乳头中不再有细胞迁出的时间。本发明方法的实验例中，第一个毛乳头有细胞迁出的时间为第5天，所有毛乳头中不再有细胞迁出的时间为第7天。
表2 本发明方法与其它传统方法对毛乳头贴壁率和毛乳头细胞迁出时间的比较具体实施方式
实施例一该分离方法依次包括以下主要步骤①、取1cm×1cm的头皮标本，无菌处理后，在真皮-皮下组织交界处剪开，剔除真皮层，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层；②、将皮下脂肪层置于培养皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在培养皿中加入4ml(约相当于头皮标本剔除真皮层后剪碎至肉泥状时的体积的3.5倍)的含胶原酶I(浓度为2mg/ml)的DMEM液，使肉泥状皮下脂肪层在37℃温度下消化4.5小时，此时在显微镜下可见到真皮鞘变得松散但仍包裹毛乳头；④、用吸管吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，反复多次，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此使毛乳头游离出来，至显微镜下观测到有大量毛乳头游离出来；⑤、向上述液体(消化液)中继续加入2ml的DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的消化液转入到离心管中，吹吸混匀，静置30秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，此时毛乳头及游离细胞由于浮力作用悬浮于上清液中；⑦、将上清液吸出、收集；继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、再静置30秒，至肉眼见毛干等大块组织沉于管底，由于管底沉淀部分还残留有毛乳头及游离细胞，则又有毛乳头及游离细胞悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集；⑧、将第⑦步骤收集得到的上清液进行300转/分钟地离心、分层，使游离细胞悬浮在上清液上部，而毛乳头沉淀在上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部；⑨、在显微镜下用10μl微吸管从上清液中捡拾毛乳头，将捡拾得到的毛乳头加入含15％的胎牛血清的DMEM，50ml/LCO2的条件下培养，细胞融合后传代，取第三代细胞进行实验。
本发明第二个实施例的头皮毛乳头分离方法，依次包括以下主要步骤①、取1.2cm×1.3cm的头皮标本，无菌处理后，在真皮-皮下组织交界处剪开，剔除真皮层，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层；②、将皮下脂肪层置于培养皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在培养皿中加入6ml(约相当于头皮标本剔除真皮层后剪碎至肉泥状时的体积的5倍)的含胶原酶I(浓度为1mg/ml)的DMEM液，在35℃温度下消化5.5小时，此时在显微镜下可见到真皮鞘变得松散但仍包裹毛乳头；④、用吸管反复吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此帮助毛乳头游离出来，至显微镜下观测到有大量毛乳头游离出来；⑤向上述消化液中加入2ml的DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的消化液转入到离心管中，吹吸混匀，静置35秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，此时毛乳头及游离细胞由于浮力作用悬浮于上清液中；⑦、将上清液吸出、收集；继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、再静置40秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，则又有毛乳头及游离细胞悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集；重复第⑦步骤4遍；⑧、将第⑦步骤收集得到的上清液进行250转/分钟地离心、分层，使游离的毛乳头细胞悬浮在上清液上部，毛乳头沉淀在上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部；⑨、在显微镜下用10μl微吸管从上清液中捡拾毛乳头，将捡拾得到的毛乳头加入含15％的胎牛血清的DMEM，50ml/LCO2的条件下培养，细胞融合后传代，取第三代细胞进行实验。
在本发明第三个实施例的头皮毛乳头分离方法，依次包括以下主要步骤①、取1.3cm×1.3cm的头皮标本，无菌处理后，在真皮-皮下组织交界处剪开，剔除真皮层，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层；②、将皮下脂肪层置于培养皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在培养皿中加入3ml(约相当于头皮标本剔除真皮层后剪碎至肉泥状时的体积的2倍)的含胶原酶I(浓度为3mg/ml)的DMEM液，在37℃温度下消化3.5小时，此时在显微镜下可见到真皮鞘变得松散但仍包裹毛乳头；④、用吸管反复吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，至显微镜下观测到有大量毛乳头游离出来；⑤向上述消化液中加入4ml的DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的消化液转入到离心管中，吹吸混匀，静置35秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，此时毛乳头及游离细胞由于浮力作用悬浮于上清液中；⑦、将上清液吸出、收集；继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、再静置40秒，至肉眼见毛干、未完全消化的皮下脂肪等大块组织沉于管底，则又有毛乳头及游离细胞悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集；重复第⑦步骤4遍；⑧、将第⑦步骤收集得到的上清液进行250转/分钟地离心、分层，使游离的毛乳头细胞悬浮在上清液上部，毛乳头沉淀在上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部；⑨、在显微镜下用10μl微吸管从上清液中捡拾毛乳头，将捡拾得到的毛乳头加入含15％的胎牛血清的DMEM，50ml/LCO2的条件下培养，细胞融合后传代，取第三代细胞进行实验。
权利要求
1.一种头皮毛乳头分离方法，其特征在于依次包括以下主要步骤①、取无菌处理后的头皮标本，在真皮-皮下组织交界处剪开，使毛囊中下部保留在皮下脂肪层，并彻底剔除残余在皮下脂肪中的真皮层；②、将皮下脂肪层置于器皿中，反复剪碎至肉泥状；③、在器皿中加入2-5倍体积的含胶原酶I(浓度为1-3mg/ml)的DMEM液，在35℃-37℃温度下进行消化，至显微镜下观测到真皮鞘变得松散但仍能包裹住毛乳头；④、用吸管吸取器皿中的液体后重新将它们排挤到器皿中，如此反复多次，使消化后的毛囊中下部在此过程中不断受到冲击、震动，由此帮助毛乳头游离出来；⑤、向上述液体中加入DMEM液进行稀释；⑥、将上述稀释后的液体转入到试管中，混匀，静置若干秒，使毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，至肉眼见大块组织沉淀于试管底部；⑦、将上清液吸出、收集；⑧、用微吸管在显微镜下从上清液中捡拾出毛乳头。
2.根据权利要求1的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑦步骤中，将上清液吸出、收集后，继续向管底沉淀部分加入DMEM液，重新混匀、静置若干秒，至肉眼见到大块组织沉于管底，使毛乳头及游离细胞在浮力作用下悬浮于上清液中，再次将该上清液吸出、收集，如此反复若干次。
3.根据权利要求1或2的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑦步骤和第⑧步骤之间，将第⑦步骤收集得到的上清液进行离心、分层，使游离细胞悬浮在该上清液上部，毛乳头沉淀在该上清液下部，弃除分层后的上清液上部，保留富含毛乳头的上清液下部。
4.根据权利要求1或2的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第③步骤中，消化的时间为3.5-5.5小时。
5.根据权利要求3的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第③步骤中，消化的时间为3.5-5.5小时。
6.根据权利要求1或2的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑤步骤中，所加入DMEM液的体积为第③步骤中所加入DMEM液体积的1/3-4/3。
7.根据权利要求3的头皮毛乳头分离方法，其特征在于在上述第⑤步骤中，所加入DMEM液的体积为第③步骤中所加入DMEM液体积的1/3-4/3。
全文摘要
一种头皮毛乳头分离方法，包括以下主要步骤将头皮标本在真皮－皮下组织交界处剪开；将皮下脂肪层反复剪碎至肉泥状；加入含胶原酶I的DMEM液，在常温下进行消化，使皮鞘变得松散但仍能包裹住毛乳头；用吸管反复吸取培养皿中的液体然后重新将它们排挤到培养皿中，由此产生震动、冲击，使毛乳头游离出来；最后捡拾出毛乳头。本发明不需要在显微镜下进行高难度的手工精细操作，无需特殊训练即可掌握，在显微镜下工作的时间短，污染机会小。
文档编号A61B16/00GK1613428SQ20041005188
公开日2005年5月11日 申请日期2004年10月15日 优先权日2004年10月15日
发明者李宇 申请人:李宇, 汕头大学医学院第一附属医院
最新回复(0)