嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)及其制造方法
专利名称：嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)及其制造方法
一、[技术领域]嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltrophilia)又称嗜麦芽窄食单胞菌制剂(疫苗)及其制造方法属微生物工程领域。利用这种细菌体或代谢产物(多糖)等生产特异性治疗或预防特效药物。
二、[背景技术]嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)及其制造方法，本申请通过上网检索未见有同类项目或技术，据所知与本申请最接近的现有技术，可见《中国生物制品规程》2000年版，“绿脓杆菌制造及检定规程”P262-266，和“假单胞菌制剂制造及检定规程”P272-276。但绿脓杆菌制剂或假单胞菌制剂仅限于治疗肿瘤用途，而对嗜麦芽假单胞菌的预防和治疗无效，因此本发明均无可取代，表明本申请具有新颖性。
(一)一般情况嗜麦芽假单胞菌与其他绿脓假单胞菌是广泛存在于自然界和临床常见的致病菌，一般认为条件致病菌，由于本菌具在天然的耐药性，对抗生素可产生耐药，因此开发特异性细菌免疫制剂代替抗生素化学疗法当今受到极大重视，实践证明用上述细菌制剂或其中提取物制剂，用于临床治疗和预防假单胞菌感染已取得较好效果。
已往理论认为假单胞菌均为低毒条件致病菌，其实本菌在住院病人中是一个高危潜在的致病菌，ICU病房中有40-50％病人均受该菌感染，从多年对假单胞菌感染防治研究中发现，假单胞菌虽多数是低毒细菌，但嗜麦芽假单胞菌是一株毒力较强的致病菌。
从假单胞菌感染发病率可以发现在近今十年中占全部临床致病菌感染30％多，尽管国内外生产的抗生素日新月异，包括头孢类、奎诺酮类、氨基糖类，但本菌的发病率和死亡率仍居高不下，尤其嗜麦芽假单胞菌死亡率甚高，占所有假单胞菌感染死亡率35％左右。而从最近上网查找的资料情况，国内外尚未见专一特异性对嗜麦芽假单胞菌的特效制剂面市，据此认为，当前抓紧开发对本菌特效制剂是当务之急，临床十分需要这一类药物。
嗜麦芽假单胞菌感染死亡率高的原因，动物实验证明，嗜麦芽假单胞菌的毒力比一般其他绿脓假单胞菌的毒力强，对当今各类抗生素耐药达90％以上，本菌除产生B奈酰胺酶还可产生诱导酶和超广谱酶，所以嗜麦芽假单胞菌是一种临床非常难治的致病菌。本制剂菌种是从医院病患者随机获得的一株嗜麦芽假单胞菌，嗜麦芽假单胞菌制剂研究成功有望彻底解决当前对住院ICU患者的最大死亡威胁从多年全国住院感染性疾病学术会议中根据不完全统计，对住院获得性假单胞菌感染加上自然假单胞菌感染年发病率约1000万人次，而其中嗜麦芽假单胞菌感染病例约占三分之一，即每年约为300-400万人次，说明假单胞菌感染病特别对住院病人深受其害，甚至病人在住院期间不间断地多次假单胞菌不同菌种反复感染，以致死于本菌严重毒血症告终。这是国内外近10年来对院内感染的突出难题，要解决本菌的防治问题唯一办法就是开发嗜麦芽假单胞菌制剂，这一制剂安全、高效，无耐药性，是一种最具特异性防治药物。
(二)嗜麦芽假单胞菌的文献出处1、嗜麦芽假胞菌是1960年由Hugh和Rysehemkow首次发现并命名嗜麦芽假单胞菌。HughR，Ryschemkow E.An alcaligenes Like Pseudomonas species(abstract).Bacteriol Proc，1960，6078.
2、SMA 1983年Swings等人认为本菌的基因及生化有别于假单胞菌将之重新归类于黄单胞菌属，即嗜麦芽黄单胞菌，1995年再次更名为嗜麦芽窄食单胞菌。Swings J，De VosM，Vanden Mooter M，et al.Transfer of Pseudomonas maltophilia(Hugh 1981)Comb Nov.Int J SystBacteriol，1983，33409-413.
3、嗜麦芽假单胞菌是广谱抗生素大量使用之后新发现的病原菌，多侵犯危重病人或免疫功低下的病人，可引起败血症、心内膜炎、呼吸道、尿道和伤口感染等，并可从这些病人的血液、痰液、伤口、肺心病等培养分离获得嗜麦芽假单胞菌菌种。本人承诺，从本发明申请之日起20年内，可向有关公众发放“嗜麦芽假单胞菌”菌种，特此声明。专利权人余国华。
4、Mett H.Rostas，Schacher B，etat.Outer Member Penneability and B-Lactamase Contemt inPseudomonas Malto Philia Clincae isolates and Labcratory mutants.Rev Infect Dis，1988，10765-769.
5、Davin-Regli A，Bollet C.Sufftay JP，et al，Use of random amplified polymorphic DNArorepidemiological typing of stenotrophomonas maltophilia.J Hosp Infect 1996 32(1)396、Von Graevenitz A.Acinetobacter，Alcaliyenes，Moraxella and other nonfermentatiye Gramnegative bacteria InMurry PR(ed).Manual of Clinial Microbiology.6thed.WashingtonDCAmerican Society for Microbiology 19955207、Fujita J，Yamadori I，Xu G，et al.Clinical features of stenotrophomonas maltophiliapneumonia in immunocomproised pat inents.Respir Med，1996，9035-38.
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9、Elsner HA，Duhrsen U，Hollwitz B，et al.Fatal pulmonary hemorrhage in patients with acuteleukemia and fulminant pneumonia caused by stenotrophomonas maltophilia.Ann Heatol，1997，74155-161.
10、Muder RR，Harris AP，Muller S，et al.Bacteremia due to stenotrophomonas(xanthomonas)maltophiliaa prospective，multicenter study of 91 episodes.Clin Infect Dis，1996，55508-512.本发明的嗜麦芽假单胞菌的来源是从“八五”国家玫关期间收集全国从住院病人分离的360株嗜麦芽假单胞菌中随机抽取的其中一株菌种，经培养传代并冻干(牛奶)制备主种子批和工作种子批用于制造制剂(疫苗)，保存备用。
(三)本菌株的形态及生物学特征1嗜麦芽假单胞菌生物学特征将待检假单胞菌种接种于PH7.2-7.4的肉汤琼脂、营养琼脂或其它适宜培养基，均为革兰氏阴性杆菌，最适宜温度35℃-37℃，可产生菌毛无定形排列，或能溶血和产生绿色素。
菌种名称形态和培养特征嗜麦芽假单 形态为长或略呈弯曲的革兰氏阴性杆菌，菌落光滑有光泽，白色或淡黄色，胞菌 最适宜生长温度37℃，在血琼脂平板上不溶血，在普通脂平板培养基可形成不透明淡黄色菌落，氧化酶阴性。2嗜麦芽假单胞菌生化反应菌种用Vek法国梅里埃全自动微生物系统鉴定，鉴定确认为嗜麦芽假单胞菌，结果如下菌种嗜芽假单胞菌
99％ Pseudomonas maltrophilia3血清凝集试验用嗜麦芽假单胞菌37℃培养18-20小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌10×108/ml与假单胞菌免疫诊断血清(做定量凝集试验)。充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集(+)之血清最高稀释度为凝集效价。
4毒力试验嗜麦芽假单胞菌分别用37℃培养18-20小时的琼脂培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌1.2×109/ml、8×108/ml、4×108/ml、2×108/ml等浓度菌液，腹腔注射体重14-16g小鼠，每个浓度菌液使用5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天，计算LD50结果。
5毒性试验分别采用嗜麦芽假单胞菌37℃培养18-20小时的琼脂培养物混悬于生理氯化钠溶液内，56℃加温2小时(或其也方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，分别将每种假单胞菌液稀释成1ml含菌6.0×109、3.0×1091.5×109共3个浓度，每一假单胞菌浓度悬液0.5ml腹腔注射体重16-18g小鼠5只，观察3天，注射7.5×108至3.0×109个灭活菌体的小鼠观察结果。
从临床血液、痰液、体液等标本分离嗜麦芽假单胞菌，直接将标本接种于肉汤、血平板和唛康凯氏培养(见“全国临床检验操作规程”中华人民共和国卫生部医政司编.1991年一版P379-381)，然后按操作规程方法进行细菌分离鉴定，即可获得纯嗜麦芽假单胞菌。
三、[发明内容](一)存在问题嗜麦芽假单胞菌是广谱抗生素大量使用后新发现的病原菌，侵犯重危病人，可引起菌血症、心内膜尖、呼吸道、尿道和伤口等。研究结果表明，本菌对头孢霉素类抗生素、头霉素类，一代、二代、三代头孢菌素(除CAZ和CFP)，加酶抑制剂复合抗生素(除外TIM)，单环β-内酰胺药，亚胺培南等其活性很低，其敏感率仅为0.6-23.10％，说明嗜麦芽假单菌对当今的抗生素广泛耐药，而高效治疗药物和预防问题未见面市，本发明是针对解决嗜麦芽假单胞菌感染的预防和治疗以及抗生素耐药性问题获得“八五”玫关的重大科研成果奖，具有创造性和实用性。虽然嗜麦芽假单胞菌是早已为人所知的一种微生物，由于它的毒性较强或各种原因，但在现有技术人们不知道用它可以制造出对嗜芽假单胞感染能防能治兼对腹水癌、肺癌有特殊疗效的药物。
(二)技术方案本发明其特征是通过制造一种嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)达到对本菌感染特异性预防和治疗为目的兼有对某些恶性肿瘤治疗效果，至今在国内外尚属首创研究证明，其技术特征是由已知的任何一种嗜麦芽假单胞菌制成嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)加入乳糖或甘露醇、右旋糖酐组合冻干粉针剂产品均可达到上述同样效果。
嗜麦芽假单胞制剂(疫苗)制造方法其特征是由本菌经过培养或发酵收集培养物、代谢产物、裂解产物、制取菌体制剂、活性蛋白制剂、多糖蛋白制剂或亚单位等生产系列制剂(疫苗)包括针剂、粉针剂、气雾剂、栓剂、含服片剂等常用剂型。
1、菌体制剂(疫苗)嗜麦芽假单胞菌固体培养采用35-38℃恒温培养16-20小时培养物，在70-100℃，30-60分钟加热灭菌或用0.5-0.6甲醛灭活，于0.8-1.1％甲醛恒温36-38℃，7天脱毒，使制剂(疫苗)达到最佳抗原性和免疫原性，能保证制品的有效性与安全性。
2、多糖蛋白制剂(疫苗)采用培养罐液体培养8-18小时，加甲醛溶液，其最终浓度为0.5-2.0％(ml/ml)，经去核酸处理，用十六烷基溴化铵或其他适宜的沉淀剂沉淀。用冷酚提取，氯化钙或其他适宜溶液透析。制取精制提纯多糖。
由嗜麦芽假单胞菌制造菌体制剂和多糖蛋白，还可制造活性蛋白内毒素蛋白，微粒蛋白，外毒素蛋或亚单位制品等，用于防治本菌感染和治疗恶性肿瘤。
本发明制造菌体制剂(疫苗)和多糖蛋白制剂的方法，亦可应用于制造其他微生物疫苗和多糖等制品的生产，如制造伤寒杆菌制剂(疫苗)炭疽菌制剂(疫苗)肉毒杆菌制剂(疫苗)和脑膜炎球菌多糖制剂(疫苗)等系列产品。
(三)、发明效果本发明的用途是一种特异性针对嗜麦芽假单胞菌以毒攻毒，能防能治的生物制品，应用后，可使机体产生特异性抗体，即产生自动免疫，从而达到预防和治疗以及提高抗生素治疗效果，尤其不会导致细菌对制品产生耐药性。除对嗜麦芽假单胞菌有效外，研究证明对小鼠腹水肿瘤和血癌有抑制作用。本发明主要对机体产生特异和非特异性免疫，提升体液免疫和细胞免疫，因此除对嗜麦芽假单胞菌预防和治疗以及对肿瘤有一定治疗价值。本发明的另一优点是药物生产成本比抗生素低得多，相对价格便宜，患者易于接受，可大大减轻病人经济负担。
1、效力试验免疫接种和毒菌攻击实验评价制剂(疫苗)的保护效果用终浓度不超过1.1±0.1％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液用无菌生理盐水制剂(疫苗)稀释，使其含嗜麦芽假单胞菌2×109/ml亿。选体重14-16克小鼠，每只皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射一次，共注射3次，未次免疫后7-10天，用3个LD50毒菌攻击，同时应用同批饲养或体重与免疫相同的小鼠至少10只作对照，分别于腹腔注射3个LD50嗜麦芽假单胞毒菌，观察3天，对照组小鼠死亡数90％，制剂(疫苗)免疫组小鼠保护率100％。
2、抗原性试验结果选体重2公斤左右的家兔至少3只，嗜麦芽假单胞菌单价免疫菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价，2/3家兔血清凝集效价在1∶2560。
以上表明本发明制造方法，生产的制剂(疫苗)产品动物试验证明临床疗效显著。从检验报告结果可见，按中华人民共和国卫生部药鉴局的各项新药产品指标，均符合有关质量标准和合格规定。
3、交叉免疫力试验用终浓度不超过1.1±0.1％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使期含嗜麦芽假单胞菌2×109/ml。选体重14-16克小鼠，每只皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射一次，共注射3次，末次免疫后7-10天，分别用不同的绿脓假单胞菌3个LD50毒菌攻击，同时应用同批饲养或体重与免疫相同的小鼠至少10只作对照，分别于腹腔注射3个LD50毒菌，观察3天，结果对照组小鼠保护率为15％，免疫组小鼠保护率为87.5％。说明嗜麦芽假单胞菌制剂对绿脓假单胞菌有广谱免疫作用。
嗜麦芽假单胞菌制剂免疫与绿脓假单胞菌毒菌攻击免疫力试验结果
4、抑瘤试验抑瘤试验结果，抑瘤率81.2％。
嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)及制造方法Repuirements for Pseudomonas maltrophilia Preparation1.定义、组成及用途本品系用嗜麦芽假单胞菌株培养后，取菌苔制成悬液，用甲醛灭活，以PBS稀释，每小瓶2ml含菌2×109加右旋糖酐60mg冻干制成，用于嗜麦芽假单胞菌感染和恶性肿瘤的辅助治疗。
2制造
2.1基本要求2.1.1设施与生产管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。
2.1.2原料及辅料应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。
2.1.3生产用水生产用水应符合国家饮用水标准，纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。
2.1.4生产用器具直接用于生产的金属或玻璃等器具，必须严格清洗及去热源处理或灭菌下理。
2.1.5生产及检定用动物家兔、小鼠、豚鼠应符合清洁级或SPF级标准。
2.2菌种2.2.1菌种名称及来源制造用广州嗜麦芽假单胞菌种应经国家药品管理当局批准，由国家药品检定机构或国家指定的单位保管和分发。
2.2.2种子批的建立生产用菌种应采用种子批系统。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性，从原始种子批传代、护增冻干保存为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。
2.2.3种子批菌种检定2.2.3.1将待检菌种接种于PH7.2-7.4的肉汤琼肠、马丁琼脂或其他适宜培养基，应为革兰氏阴性无芽胞杆菌，最适宜温度35℃，约0.5um×1.5um，可产生菌毛，菌落光滑，有光泽边缘整齐白灰色或淡黄色。
2.2.3.2生化反应麦芽糖、丙二酸盐枸椽酸盐及DNA试验呈阳性，氧化酶阴性反应。
2.2.3.3血清凝集试验用35℃培养18-20小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌10×108ml，与嗜麦芽假单胞菌免疫诊断血清(效价2560-5210)做定量凝集试验，充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价应不低于原血清效价之半。
2.2.3.4毒力试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌2×107/ml、1×107/ml、5×106/ml、2.5×106/mlt等浓度菌液，腹腔注射体重14-16g小鼠，每个浓度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天，计算LD50。一个LD50含菌数应不低于5×106。
2.2.3.5毒性试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物混悬于生理氯化钠溶液内，60℃加温2小时(或其他方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，稀释成每1ml含菌4.0×109、2.0×109、及1.0×109、共3浓度，每个浓度菌悬液0.5ml腹腔注射体重15-18g小鼠15只，观察3天，注射1.0×109至2.0×109个死菌体的小鼠应全部生存。
2.2.3.6免疫力试验用终浓度不超过1.1±0.10％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使其含菌2.0×109ml。选体重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射1次.共注射3次，末次免疫后7-10天，用3个LD50的毒菌攻击。同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小鼠死亡数应不低于80％，免疫组小鼠保护率应不低于70％。
2.2.3.7抗原性试验选体重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力试验用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价。2/3家兔血清凝集价应不低于1∶2560。
2.2.4菌种传代及保存2.2.4.1菌种应冻干保存于2-8℃，主种子批自启开后传代不得超过6次。
2.2.4.2生产前应检查菌种的全部特性，合格后方可用于生产。
2.3原液制备2.3.1生产用种子将工作种子批菌种启开后，接种于营养琼脂或其他适宜培养基，置35-36℃培养，一般不超过18小时，传代不得超过5代，由此制备适宜数量的生产用工作种子，用于生产。
2.3.2生产用培养基用PH7.2-7.4的营养琼脂或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏原物质。
2.3.3菌种接种和培养采用克氏瓶涂种法，置35℃培养18-20小时，在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌剂的原液放置20-26℃ 14-16天离心洗涤后保存于2-8℃。
2.3.4收获和杀菌培养结束后，于采集的培养物中加入适量PBS至甲醛终浓度不超过1％，加杀菌剂的原液放置20-26℃ 14-16天离心洗涤后保存于2-8℃。
2.3.5无菌试验取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基和马丁培养基及普通琼脂斜面各3管。置35℃培养5天，如有本菌生长，重新杀菌后加倍量复试一次，如有杂菌生长应废弃。
2.4原液检定按3.1项进行。
2.5半成品配制可用单批或多批检定合格的原液合并，用PBS稀释加入3.0％右旋糖酐，经除菌过滤，加入原液使每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
2.6半成品检定按3.2项进行。
2.7分批按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。
2.8分装、冻干按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。
2.9规格本品规格为每小瓶2ml，含菌1.8×109-2.2×109，内含右旋糖酐50mg。
2.10包装按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。
3检定3.1原液检定3.1.1细菌形态应正常3.1.2无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.1.3浓度测定按“中国药品生物制品检定所细菌浊度标准”进行测定。
3.1.4原液保存原液浓度应不高于1.0×1011/ml，保存于2-8℃。
原夜自采集杀菌之日起至制剂稀释时，不得少于2个月，保存期自采集杀菌之日起不超过6个月。
3.2半成品检定3.2.1无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.2.2制剂浓度每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
3.3成品检定3.3.1鉴别试验与相应高效价血清进行凝集试验，应呈强凝集反应。
3.3.2外观为白色冻干粉针剂、溶解后不应含有摇不散的凝块或异物。
3.3.3化学检定按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
3.3.3.1PH值为6.4-7.4。
3.3.3.2游离甲醛应小于0.06g/L。
3.3.3.3右旋糖酐按现行《中国药典》进行。含30g/L。
3.3.4无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行3.3.5异常毒性试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》进行。小鼠注射0.5ml，豚鼠注射1.5ml。
3.3.6浓底测定按“中国药品生物制品检定所细菌浊度标准”进行浓度测定，每小瓶2ml含菌应为2.0×109，误差不得超过10％。
3.3.7菌型及纯菌染色镜检至少观察10个视野，应为革兰氏阴性短小无芽胞杆菌，不应有杂菌。
3.3.8抑瘤试验取体重为18-20g的BALB/c小鼠腹腔接种S180细胞，5天后取小鼠腹水瘤细胞，台酚兰染色并计数，配制细胞浓度为2.5×106/ml的细胞液，按5.0×105(0.2ml)鼠的剂量腹股沟皮下接种18-20g的BALB/c小鼠(植瘤)至少30只，随机分为治疗与对照两组，治疗组在植瘤后隔日腋部皮下注射本品0.5ml/鼠，共注射8次，对照组注射等量无菌生理氯化钠溶液，末次注射后5天，处死小鼠，取瘤并称重，计算制剂的抑瘤率，计算公式如下。
抑瘤率超过50％，方为合格。
4保存、运输及有效期于2-8℃避光保存和运输，自效力检定合格之日起有效期为3年。
使用说明组成和性状本品系用嗜麦芽假单胞菌经培养杀菌后稀释至一定浓义制备而成，成品外观白色。
规格本品规格为每小瓶2ml，含菌2.0×109。
质量标准本品依据《中国生物制品规程》生产和检定，质量符合要求。
药理作用本菌株是病患者分离的嗜麦芽假单胞菌，本菌在目前所有致病性假单胞菌中毒力最强，毒性最小和免疫力最好的假单胞菌，动物试验证明；对动物免疫系统有明显提高机体免疫作用，激活吞噬细胞功能和产生高效特异性抗体，以及对肿瘤有明显的抑制作用。
适应症接种后能改善机体免疫状况，可用于治疗嗜麦芽假单胞菌感染和恶性肿瘤患者的辅助治疗，降低本病的发病率和死亡率。
用法与剂量用无菌注射用水2ml溶解，上臂皮下注射，隔日注射1次，10次为1个疗程，第1次注射1ml，以后每次注射双臂皮下各1ml。儿童减半。
嗜麦芽假单胞多糖制剂、疫苗及制造方法Repuirements for Ps.maltrophilia Typhoid Vaccine1定义、组成及用途本品系用嗜麦芽假单胞菌经培养的提纯精制的多糖制成，用于住院病人预防和治疗住院获得性嗜芽单胞和其他绿脓假单胞菌感染，以及恶性肿瘤的辅助治疗。
2制造2.1基本要求2.1.1设施与生产质量管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。
2.1.2原料及辅料应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅料质控标准》的要求，未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。
2.1.3生产用水生产用水源应符合国家饮用水标准纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。
2.1.4生产用器具直接用于生产的金属或玻璃器具，必须严格清洗并作去热原质处理和灭菌处理。
2.1.5生产及检定用动物小鼠、豚鼠应符合清洁级标准。
2.2菌种2.2.1菌种名称及来源制造多糖疫苗用的菌种(嗜麦芽假单胞菌)及检定用的诊断血清，应经国家药品管理当局批准，并由国家药品检定机构或国家指定单位分发。
2.2.2种子批的建立生产用菌种应采用种子批系统。原始种子的比应验明其记录、历史、来源和生物特性。从原始种子批传代、扩增后冻干保存的为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。
2.2.3种子批的检定检定菌种可用PH7.2-7.4肉汤琼脂或其他适宜培养基。
2.2.3.1形态及培养特征将待检的菌种接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，35-37℃培养16-20小时，涂片镜检应为革兰氏阴性杆菌，菌形整齐。在普通琼脂平板上应为圆形、中等大小、无色半透明、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落。
2.2.3.2生化反应待检的菌中氧化酶阴性，麦芽糖阳性，L精氨酸水解，液化明胶。用Viek法国梅里埃全自动生化系统鉴定，确认为嗜麦芽假单胞菌(99％ Sgenotl opomonas maltophilia)。
2.2.3.3血清学特性用35-37℃培养16-20小时活的培养物与嗜麦芽假单胞菌血清做玻片凝集试验，应有强凝集(+++)，与对照血清不凝集或仅有较弱凝集。
用上述培养物，以PBS稀释成含菌6.0×108/ml制成经100℃ 30分钟加热杀菌或用终浓度为0.5％(ml/ml)甲醛溶液杀菌处理的菌液(亦可用活菌)，分别与嗜芽假单胞血清(用甲醛杀菌或活菌菌液)血清(用加热杀菌菌液)作定量凝集效价应不低于血清原效价之半。
2.3原液制备2.3.1生产用种子启开工作种批菌种，接种于改良半综合培养基或其他适家养基，35-37℃培养，一般不超过20小时。可使用固体或液体培养基传代，由此制备数量适宜的生产用工作种子，但传代不得超过5代。
2.3.2生产用培养基生产嗜麦芽假单胞菌多糖疫苗用改良半综合培养基或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基不应含有能加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成份，也不能含有对人体有害或其他过敏原物质。
2.3.3菌种接种和培养采用培养罐液体培养，于培养基中接种菌后，在培养过程中及杀菌前取样进行细菌浓度测定及纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发出污染杂菌，应废弃。
2.3.4收获和杀菌培养物于对数生期后期、静止期前期收获，一般培养8-12小时为宜(根据菌种接种量及所用培养种类而异)。加入甲醛溶液杀菌，期最终浓度为0.5％-2.0％(ml/ml)。
2.3.5提纯和精制2.3.5.1去核酸杀菌完成后，离心去菌体收集上清液，加入十六烷基三甲溴化铵，充分混匀，形成沉淀放置适当时间离心，收集沉淀物。用蒸馏水溶解沉淀，并加入适量1mol./L氯化钠(或2mol./L氯化钙)溶液，摇动或搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％(ml/ml)，冷库静置1-3小时或过夜，离心去沉淀，收集澄清的上清液。
2.3.5.2沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％(ml/ml)，充分振摇，使多糖沉淀，离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥，即为多糖制品，保存于-20℃以下，待进一步提纯。
2.3.5.3多糖的的精制将精制品溶解小于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达5-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml 1/10饱和醋酸钠溶液)提取3-5次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，必要时或有条件时也可用其他方法去除内毒素活性。再加入乙醇至最终浓度为75％-80％(ml/ml)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用无热原质蒸馏水溶解，经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取过程应尽量在15℃以下进行。提纯多糖应保存于-20℃以下。
2.3.5.4再制提纯多糖的蛋白，核酸含量及其他指标若达不到要求，可再制一次。
2.4原液检定按3.1项进行
2.5原液保存原液应保存于-20℃以下，自收菌之日起有效期为5年。
2.6半成品配制可用单批或多批多糖合并，在无菌条件下，用无热原PH6.5-7.5PBS稀释，每人用剂量含多糖应不低于30ug。
2.7半成品检定按3.2项进行2.8分批按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品分批规程》进行。
2.9分装按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品分装规程》进行。
2.10规格本品规格为每瓶5ml、1ml或0.5ml；每人用剂量0.5ml，含嗜麦芽假单胞菌多糖应不低于30ug。
2.11包装按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品包装规程》进行。
3检定3.1原液检定3.1.1化学检定按《中国生物制品规格》年版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
3.1.1.1固体总量测定每批多糖应按干烤法测定固体总量，计算干重。
3.1.1.2蛋白质含量每批提纯多糖的蛋白质含量应小于10mg/g，按Lowry法测定，用牛血清白蛋白作对照。
3.1.1.3核酸含量每批提纯多糖的核酸含量应小于20mg/g，用紫外分光度法测定，核酸在260nm波长处的吸收系数(E1cm1％)为200。
3.1.1.4O-乙酰基含量每批提纯多糖的O-乙酰基含量应不低于2mmol/g，按Hestrin法测定。
3.1.1.5分子大小测定每批提纯多糖的分子大小应用琼脂糖CL-4B凝胶过滤法测定。KD值在0.25以前的洗脱液多糖回收率应在50％以上。
3.1.2特异性测定每批提纯多糖应采用琼脂扩散试验方法进行血清学特异性试验，嗜芽假单胞菌多糖与嗜麦芽假单胞菌特异性血清48小时内形成明显沉淀线，与对照血清不形成沉淀线。
3.2半成品检定无菌试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.3成品检定3.3.1鉴别试验每批疫苗至少取1瓶进行鉴别试验，按3.1.2项进行。
3.3.2外观应为无色透明液体，无异物。
3.3.3化学检定按《中国生物制品规程》年版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
3.3.3.1PH值为6.5-7.5。
3.3.3.2防腐剂含量如加苯酚防腐剂，其含量为2.5-5.0g/L。
3.3.4无菌试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.3.5异常毒性试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行。
3.3.6热原质试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行，家兔注射量为0.025ug/kg体重。
3.3.7多糖含量测定每批疫苗应检查多糖含量，采用火箭电泳法测定，每人用剂量多糖含量应不低于30ug。
4保存、运输及效期于2-8℃避光保存和运输，自稀释之日起有效期为2年。
5使用说明组成和性状本品系用嗜芽假单胞菌经培养后提纯精制的多糖稀释制成，为无色透明液体，不含有异物或凝块。
规格本品规格为每瓶5ml、1ml或0.5ml；每人用剂量0.5ml，含嗜麦芽假单胞菌多糖应不低于30ug。
质量标准本品依据《中国生物制品规格》年版生产和检定，质量符合要求。
作用和用途本疫苗接种后，可使机体产生体液免疫应答。用于预防和治疗嗜麦芽假单胞菌和其他绿脓假单胞菌感染。
接种对象重点用于住院病人预防和治疗住院获得性嗜麦芽假单胞菌和其他绿脓假单胞菌感染。
用法与剂量(1)途径上臂外侧三角肌经消毒后肌内注射。
(2)剂量每人0.5ml.
(3)免疫次数预防用1-2次，治疗用5-6次。
禁忌有下列情况者，不得使用本疫苗(1)发热、严重心脏病、高血压、肝、肾脏病及活动性结核。
(2)孕妇、有经及哺乳期妇女。
(3)有过敏反应病史者。
(实施例1)菌种名称及来源制造嗜麦芽假单胞菌种 经国家药品管管当局批准，由国家药品检定机构或国家指定的单位保管和分发。
种子批的建立生产用菌种应采用种子批系统。从主种子批制备工作种子批。工作种子批用于生产。种子批菌种检定形态及培养检定将待检菌种接种于PH7.2-7.4的肉汤琼肠、马丁琼脂或其他适宜培养基，应为革兰氏阴性无芽胞杆菌，最适宜温度35℃，约0.5цm×15цm，可产生菌毛，菌落光滑，有光泽边缘整齐白灰色或淡黄色。
生化反应丙二酸盐枸椽酸盐及DNA试验呈阳性，氧化酶阴性反应。
血清凝集试验用35℃培养18-20小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌10×108ml，与嗜麦芽假单胞菌免疫诊断血清(效价2560-5120)做定量凝集试验，充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价就不低于原血清效价之半。
毒力试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌2×107ml、1×107ml、5×106ml、2.5×106ml等浓度菌液，腹腔注射体重14-10g小鼠，每个浓度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天，计算LD50。一个LD50含菌数应不低于5×106。
毒性试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物悬于生理氯化钠溶液内，60℃加温2小时(或其他方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，稀释成每1ml含菌4.0×109、2.0×109及1.0×109共3浓度，每个浓度菌悬液0.5ml腹腔注射体重15-18g小鼠15只，观察3天，注射1.0×109至2.0×109个死菌休的小鼠应全部生存。
免疫力试验用终浓度不超过1.1％±0.10％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使其含菌2.0×109ml。选体重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫后7-10天，用3个LD50的毒菌攻击。同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小鼠至少10只作对照，分别于腹腔注射3个LD50毒菌，观察3天，对照组小鼠死亡数应不低于80％，免疫组小鼠保护率应不低于70％。
抗原性试验选体重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力度验用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价。2/3家兔血清凝集价应不低于1∶2560。生产前应检查菌种的全部特性生产用种子将工作种子批菌种启开后，接种于营养琼脂或其他适宜培养基，置35-36℃培养，一般不超过18小时。
菌种接种和培养采用克氏瓶涂种法，置35℃培养18-20小时，在培养过种中及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检。
收获和杀菌培养结束后，于采集的培养物中加入适量PBS至甲醛终浓度不超过1％，加杀菌剂的原液放置20-26℃，14-16天离心洗涤后保存于2-8℃。
单批或多批检定合格的原液合并，用PBS稀释加入3.0％右旋糖酐，经除菌过滤，加入原液使每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
原液检定细菌形态应正常，无杂菌。
原液自采集杀菌之日起至制剂稀释时，不得少于2个月，保存期采集杀菌之日起不超过6个月。
制剂浓度每2ml含菌1.8×109-2.2×109。或所需不同浓度和各种制型。
浓度测定按“中国药品生物制品检定所细菌浊度标准”进行浓度测定，每小瓶2ml含菌应为2.×109，误左不得超过10％。
抑瘤试验取体重为18-20gBALB/C小鼠腹腔接种S180细胞，5天后取小鼠腹水瘤细胞，台酚兰染色并计数，配制细胞浓度为2.5×106/ml的细胞液，按5.0×105(0.2ml)/鼠的剂量腹股沟皮下接种18-20g的BALB/C小鼠(植瘤)至少30只，随机分为治疗与对照两组，治疗组在植瘤后隔日腋部皮下注射本品0.5ml/鼠，共注射8次，对照组注射等量无菌生理氯化钠溶液，末次注射后5天，处死小鼠，取瘤并称重，计算制剂的抑瘤北，计算公式如下。
抑瘤率超过50％，方可合格。
(实施例2)菌种名称及来源制造多糖疫苗用的菌种(嗜麦芽假单胞菌)及检定用的诊断血清，应经国家药品管理当局批准，并由国家药品检定机构或国家指定单位分发。
生产用菌种应采用种子批系统。扩增后冻干保存的为主种子批。从主种子批制备工作种子批。
工作种子批用于生产。
种子批的检定检定菌种可用PH7.2-7.4的肉汤琼脂基或其他适宜培养基。
形态及培养特征将待检的菌种接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，35-37℃培养16-20小时，涂片镜检应为革针阴性杆菌，菌形整齐。在普通琼脂平板上应为圆形、中等大小、无色透明、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落。
生化反应待检的菌种氧化酶阴性，麦芽糖阳性，L精氨酸水解，液化明胶。用Vilek法国梅里埃全自动生化系统鉴定，确认为嗜麦芽假单胞菌(99％ Stenotl ophomonas maltophilia)。
血清学特性用35-37℃培养16-20小时活的培养物与嗜麦芽假单胞菌血清做玻片凝集试验，应有强凝集(+++)，与对照血清不凝集或仅有车水马龙弱凝集。
用上述培养物，以PBS稀释成含菌6.0×108/ml制成经100℃ 30分钟加热杀菌或用终浓度为0.5％(ml/ml)甲醛溶液杀菌处理的菌液(亦右用活菌)，分别与嗜芽假单胞菌血清(用甲醛杀菌或活菌菌液)血清(用加热杀菌菌液)作定量凝集试验。充分混匀后，放37℃过夜以肉眼观察结果，凝集(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价不低于血清原效价之半。
生产用种子启开工作种子批菌种，接种于改良半综合培养基或其他适宜养基，35-37℃培养，一般不超过20小时，可使用固体或液体培养基传代，由此制备数量适宜的生产用工作种子，但传代不进超过5代。
生产用培养基生产嗜芽假单胞菌多糖疫苗用改良半综合培养基或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基不应含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分，也不能含有对人体有害或其他过敏原物质。
菌种接种和培养采用罐液体培养，于培养基中接中接种菌种后，在培养过程中及杀菌前取样进行细菌浓度测定及纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
收获和杀菌培养物于对数生长期后期、静止期前期收获，一般培养8-12小时为宜(根据菌种接种量及所用培养基种类而异)。加入甲醛溶液杀菌，其最终浓度为0.5％-2.0％(ml/ml)。
提纯和精制去核酸杀菌完成后，离心去菌体收集上清液，加入十六烷基三甲溴化铵，充分混匀，形成沉淀放置适当时间离心，收集沉淀物。用蒸馏水溶解沉淀，并加入适量lmol/L氯化钠(或2mol/L)溶液，摇动或撑拌1小时，使多糖与十六烷基三甲溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％(ml/ml)，冷库静置1-3小时或过夜，离心去沉淀，收集澄清的上清液。
沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％(ml/ml)，充分振摇，使多糖沉淀，离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥，即为多糖制品，保存于-20℃以下，待进一步提纯。
多糖的精制将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达5-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml 1/10饱和醋酸钠溶液)提取3-5次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，必要时或有条件时也可用其他方法去除内毒素活性。再加入乙醇至最终浓度为75％-80％(ml/ml)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用无热原质蒸馏水溶解，经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取进程应尽量在15℃以下进行。提纯多糖保存于-20℃以下。
原液应保存于-20℃以下，自收菌之日起有效期为5年。
可用单批或多批多糖合并，在无菌条件下，用无热原PH6.5-7.5PBS稀释，每人剂量含多糖应不低于30ug。
化学检定每批多糖应按干烤法则定固体总量，计算干重。
蛋白质含量每批提纯多糖的蛋白质含量应小于10mg/g，按Lowry法测定，用牛血清白蛋白作对照。
核酸含量每批提纯多糖的核酸含量应小于20mg/g，用紫外分光度法测定，核酸在260nm波长处的吸收系数(E1cm1％)为200。
O-乙酰基含量每批提纯多糖的O-乙酰基含量应不低于2mmol/g，按Hestrin法测定。
每批提纯多糖的分子大小应用琼脂糖CL-4B凝胶过滤法测定。KD值在0.25以前的洗脱液多糖回收率应在50％以上。
特异性测定每批提纯多糖应采用琼脂扩散试验方法进行血清学特异性试验，嗜芽假单胞菌多糖与嗜芽假单胞菌特异性血清48小时内形成明显沉淀线，与对照血清不形成沉淀线。
防腐剂含量如加苯酚防腐剂，其含量为2.5-5.0g/L。
多糖含量测定每批疫苗应检查多糖含量，采用火箭电泳法测定，每人用剂量多糖含量不低于30Ug。
权利要求
1.本发明涉及一种嗜麦芽假单胞菌制剂疫苗及其制造方法，其特征是由嗜麦芽假单胞菌制造嗜麦芽假单胞菌制剂疫苗，同时加入乳糖或甘露醇、右旋糖酐组合成产品，作医药用途。
2.根据权利要求1嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗产品、其特征是一种嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗和嗜麦芽假单胞菌多糖或多糖蛋白制剂疫苗，包括液体注射剂、冻干粉针剂、气雾剂、栓剂或含服片剂等常用剂型。
3.根据权利要求1嗜麦芽假胞菌制剂、疫苗的制造方法、其特征是通过嗜麦芽假单胞菌固体培养，控制在35-38℃恒温培养16-20小时、在70-100℃、30-60分钟灭菌或0.5-0.6甲醛灭活，于0.8-1.1％甲醛溶液中控温36-37℃，脱毒7天，最后制成嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗产品。
4.根据权利要求1-3嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗的制造方法，其特征是通过采用培养罐液体培养8-10小时，用甲醛溶液灭菌，其最终浓度为0.5-2.0％(ml/ml)，经过去核酸处理，用十六烷基溴化铵或其他适宜沉淀剂沉淀，然后用冷酚提取，氯化钙或其他适宜的溶液透析，得嗜麦芽假单胞菌精制提纯多糖，由此进一步组合成产品，本方法同时可用于制造炭疽菌疫苗和其他微生物多糖制剂、疫苗。
5.根据权利要求1-2嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗产品的用途，其特征是用于防治嗜麦芽假单胞菌和绿脓假单胞菌感染以及治疗腹水癌和血癌等。
全文摘要
本发明公开一种对嗜麦芽假单胞菌(又称嗜麦芽窄食单胞菌)和绿脓假单胞菌以及恶性肿瘤患者提高体液免疫和细胞免疫的生物制品，其特征是由嗜麦芽假单胞菌制备而成，嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)和嗜麦芽假单胞菌多糖制剂(疫苗)产品它可以被制备成各种常用的免疫制剂或免疫调节剂型，本发明药物具有预防和治疗嗜麦芽假胞菌和绿脓假单胞菌感染以及治疗腹水癌、血癌的特殊效果。
文档编号A61P31/04GK1781552SQ20041005242
公开日2006年6月7日 申请日期2004年11月30日 优先权日2004年11月30日
发明者余国华 申请人:余国华
一、[技术领域]嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltrophilia)又称嗜麦芽窄食单胞菌制剂(疫苗)及其制造方法属微生物工程领域。利用这种细菌体或代谢产物(多糖)等生产特异性治疗或预防特效药物。
二、[背景技术]嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)及其制造方法，本申请通过上网检索未见有同类项目或技术，据所知与本申请最接近的现有技术，可见《中国生物制品规程》2000年版，“绿脓杆菌制造及检定规程”P262-266，和“假单胞菌制剂制造及检定规程”P272-276。但绿脓杆菌制剂或假单胞菌制剂仅限于治疗肿瘤用途，而对嗜麦芽假单胞菌的预防和治疗无效，因此本发明均无可取代，表明本申请具有新颖性。
(一)一般情况嗜麦芽假单胞菌与其他绿脓假单胞菌是广泛存在于自然界和临床常见的致病菌，一般认为条件致病菌，由于本菌具在天然的耐药性，对抗生素可产生耐药，因此开发特异性细菌免疫制剂代替抗生素化学疗法当今受到极大重视，实践证明用上述细菌制剂或其中提取物制剂，用于临床治疗和预防假单胞菌感染已取得较好效果。
已往理论认为假单胞菌均为低毒条件致病菌，其实本菌在住院病人中是一个高危潜在的致病菌，ICU病房中有40-50％病人均受该菌感染，从多年对假单胞菌感染防治研究中发现，假单胞菌虽多数是低毒细菌，但嗜麦芽假单胞菌是一株毒力较强的致病菌。
从假单胞菌感染发病率可以发现在近今十年中占全部临床致病菌感染30％多，尽管国内外生产的抗生素日新月异，包括头孢类、奎诺酮类、氨基糖类，但本菌的发病率和死亡率仍居高不下，尤其嗜麦芽假单胞菌死亡率甚高，占所有假单胞菌感染死亡率35％左右。而从最近上网查找的资料情况，国内外尚未见专一特异性对嗜麦芽假单胞菌的特效制剂面市，据此认为，当前抓紧开发对本菌特效制剂是当务之急，临床十分需要这一类药物。
嗜麦芽假单胞菌感染死亡率高的原因，动物实验证明，嗜麦芽假单胞菌的毒力比一般其他绿脓假单胞菌的毒力强，对当今各类抗生素耐药达90％以上，本菌除产生B奈酰胺酶还可产生诱导酶和超广谱酶，所以嗜麦芽假单胞菌是一种临床非常难治的致病菌。本制剂菌种是从医院病患者随机获得的一株嗜麦芽假单胞菌，嗜麦芽假单胞菌制剂研究成功有望彻底解决当前对住院ICU患者的最大死亡威胁从多年全国住院感染性疾病学术会议中根据不完全统计，对住院获得性假单胞菌感染加上自然假单胞菌感染年发病率约1000万人次，而其中嗜麦芽假单胞菌感染病例约占三分之一，即每年约为300-400万人次，说明假单胞菌感染病特别对住院病人深受其害，甚至病人在住院期间不间断地多次假单胞菌不同菌种反复感染，以致死于本菌严重毒血症告终。这是国内外近10年来对院内感染的突出难题，要解决本菌的防治问题唯一办法就是开发嗜麦芽假单胞菌制剂，这一制剂安全、高效，无耐药性，是一种最具特异性防治药物。
(二)嗜麦芽假单胞菌的文献出处1、嗜麦芽假胞菌是1960年由Hugh和Rysehemkow首次发现并命名嗜麦芽假单胞菌。HughR，Ryschemkow E.An alcaligenes Like Pseudomonas species(abstract).Bacteriol Proc，1960，6078.
2、SMA 1983年Swings等人认为本菌的基因及生化有别于假单胞菌将之重新归类于黄单胞菌属，即嗜麦芽黄单胞菌，1995年再次更名为嗜麦芽窄食单胞菌。Swings J，De VosM，Vanden Mooter M，et al.Transfer of Pseudomonas maltophilia(Hugh 1981)Comb Nov.Int J SystBacteriol，1983，33409-413.
3、嗜麦芽假单胞菌是广谱抗生素大量使用之后新发现的病原菌，多侵犯危重病人或免疫功低下的病人，可引起败血症、心内膜炎、呼吸道、尿道和伤口感染等，并可从这些病人的血液、痰液、伤口、肺心病等培养分离获得嗜麦芽假单胞菌菌种。本人承诺，从本发明申请之日起20年内，可向有关公众发放“嗜麦芽假单胞菌”菌种，特此声明。专利权人余国华。
4、Mett H.Rostas，Schacher B，etat.Outer Member Penneability and B-Lactamase Contemt inPseudomonas Malto Philia Clincae isolates and Labcratory mutants.Rev Infect Dis，1988，10765-769.
5、Davin-Regli A，Bollet C.Sufftay JP，et al，Use of random amplified polymorphic DNArorepidemiological typing of stenotrophomonas maltophilia.J Hosp Infect 1996 32(1)396、Von Graevenitz A.Acinetobacter，Alcaliyenes，Moraxella and other nonfermentatiye Gramnegative bacteria InMurry PR(ed).Manual of Clinial Microbiology.6thed.WashingtonDCAmerican Society for Microbiology 19955207、Fujita J，Yamadori I，Xu G，et al.Clinical features of stenotrophomonas maltophiliapneumonia in immunocomproised pat inents.Respir Med，1996，9035-38.
8、Sitges M，Mito O，Pedrol E.Hospital Pneumonia due to xanthomonas maltophilia and AIDS.Arch Broncopneumol，1996，32259-260.
9、Elsner HA，Duhrsen U，Hollwitz B，et al.Fatal pulmonary hemorrhage in patients with acuteleukemia and fulminant pneumonia caused by stenotrophomonas maltophilia.Ann Heatol，1997，74155-161.
10、Muder RR，Harris AP，Muller S，et al.Bacteremia due to stenotrophomonas(xanthomonas)maltophiliaa prospective，multicenter study of 91 episodes.Clin Infect Dis，1996，55508-512.本发明的嗜麦芽假单胞菌的来源是从“八五”国家玫关期间收集全国从住院病人分离的360株嗜麦芽假单胞菌中随机抽取的其中一株菌种，经培养传代并冻干(牛奶)制备主种子批和工作种子批用于制造制剂(疫苗)，保存备用。
(三)本菌株的形态及生物学特征1嗜麦芽假单胞菌生物学特征将待检假单胞菌种接种于PH7.2-7.4的肉汤琼脂、营养琼脂或其它适宜培养基，均为革兰氏阴性杆菌，最适宜温度35℃-37℃，可产生菌毛无定形排列，或能溶血和产生绿色素。
菌种名称形态和培养特征嗜麦芽假单 形态为长或略呈弯曲的革兰氏阴性杆菌，菌落光滑有光泽，白色或淡黄色，胞菌 最适宜生长温度37℃，在血琼脂平板上不溶血，在普通脂平板培养基可形成不透明淡黄色菌落，氧化酶阴性。2嗜麦芽假单胞菌生化反应菌种用Vek法国梅里埃全自动微生物系统鉴定，鉴定确认为嗜麦芽假单胞菌，结果如下菌种嗜芽假单胞菌
99％ Pseudomonas maltrophilia3血清凝集试验用嗜麦芽假单胞菌37℃培养18-20小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌10×108/ml与假单胞菌免疫诊断血清(做定量凝集试验)。充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集(+)之血清最高稀释度为凝集效价。
4毒力试验嗜麦芽假单胞菌分别用37℃培养18-20小时的琼脂培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌1.2×109/ml、8×108/ml、4×108/ml、2×108/ml等浓度菌液，腹腔注射体重14-16g小鼠，每个浓度菌液使用5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天，计算LD50结果。
5毒性试验分别采用嗜麦芽假单胞菌37℃培养18-20小时的琼脂培养物混悬于生理氯化钠溶液内，56℃加温2小时(或其也方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，分别将每种假单胞菌液稀释成1ml含菌6.0×109、3.0×1091.5×109共3个浓度，每一假单胞菌浓度悬液0.5ml腹腔注射体重16-18g小鼠5只，观察3天，注射7.5×108至3.0×109个灭活菌体的小鼠观察结果。
从临床血液、痰液、体液等标本分离嗜麦芽假单胞菌，直接将标本接种于肉汤、血平板和唛康凯氏培养(见“全国临床检验操作规程”中华人民共和国卫生部医政司编.1991年一版P379-381)，然后按操作规程方法进行细菌分离鉴定，即可获得纯嗜麦芽假单胞菌。
三、[发明内容](一)存在问题嗜麦芽假单胞菌是广谱抗生素大量使用后新发现的病原菌，侵犯重危病人，可引起菌血症、心内膜尖、呼吸道、尿道和伤口等。研究结果表明，本菌对头孢霉素类抗生素、头霉素类，一代、二代、三代头孢菌素(除CAZ和CFP)，加酶抑制剂复合抗生素(除外TIM)，单环β-内酰胺药，亚胺培南等其活性很低，其敏感率仅为0.6-23.10％，说明嗜麦芽假单菌对当今的抗生素广泛耐药，而高效治疗药物和预防问题未见面市，本发明是针对解决嗜麦芽假单胞菌感染的预防和治疗以及抗生素耐药性问题获得“八五”玫关的重大科研成果奖，具有创造性和实用性。虽然嗜麦芽假单胞菌是早已为人所知的一种微生物，由于它的毒性较强或各种原因，但在现有技术人们不知道用它可以制造出对嗜芽假单胞感染能防能治兼对腹水癌、肺癌有特殊疗效的药物。
(二)技术方案本发明其特征是通过制造一种嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)达到对本菌感染特异性预防和治疗为目的兼有对某些恶性肿瘤治疗效果，至今在国内外尚属首创研究证明，其技术特征是由已知的任何一种嗜麦芽假单胞菌制成嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)加入乳糖或甘露醇、右旋糖酐组合冻干粉针剂产品均可达到上述同样效果。
嗜麦芽假单胞制剂(疫苗)制造方法其特征是由本菌经过培养或发酵收集培养物、代谢产物、裂解产物、制取菌体制剂、活性蛋白制剂、多糖蛋白制剂或亚单位等生产系列制剂(疫苗)包括针剂、粉针剂、气雾剂、栓剂、含服片剂等常用剂型。
1、菌体制剂(疫苗)嗜麦芽假单胞菌固体培养采用35-38℃恒温培养16-20小时培养物，在70-100℃，30-60分钟加热灭菌或用0.5-0.6甲醛灭活，于0.8-1.1％甲醛恒温36-38℃，7天脱毒，使制剂(疫苗)达到最佳抗原性和免疫原性，能保证制品的有效性与安全性。
2、多糖蛋白制剂(疫苗)采用培养罐液体培养8-18小时，加甲醛溶液，其最终浓度为0.5-2.0％(ml/ml)，经去核酸处理，用十六烷基溴化铵或其他适宜的沉淀剂沉淀。用冷酚提取，氯化钙或其他适宜溶液透析。制取精制提纯多糖。
由嗜麦芽假单胞菌制造菌体制剂和多糖蛋白，还可制造活性蛋白内毒素蛋白，微粒蛋白，外毒素蛋或亚单位制品等，用于防治本菌感染和治疗恶性肿瘤。
本发明制造菌体制剂(疫苗)和多糖蛋白制剂的方法，亦可应用于制造其他微生物疫苗和多糖等制品的生产，如制造伤寒杆菌制剂(疫苗)炭疽菌制剂(疫苗)肉毒杆菌制剂(疫苗)和脑膜炎球菌多糖制剂(疫苗)等系列产品。
(三)、发明效果本发明的用途是一种特异性针对嗜麦芽假单胞菌以毒攻毒，能防能治的生物制品，应用后，可使机体产生特异性抗体，即产生自动免疫，从而达到预防和治疗以及提高抗生素治疗效果，尤其不会导致细菌对制品产生耐药性。除对嗜麦芽假单胞菌有效外，研究证明对小鼠腹水肿瘤和血癌有抑制作用。本发明主要对机体产生特异和非特异性免疫，提升体液免疫和细胞免疫，因此除对嗜麦芽假单胞菌预防和治疗以及对肿瘤有一定治疗价值。本发明的另一优点是药物生产成本比抗生素低得多，相对价格便宜，患者易于接受，可大大减轻病人经济负担。
1、效力试验免疫接种和毒菌攻击实验评价制剂(疫苗)的保护效果用终浓度不超过1.1±0.1％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液用无菌生理盐水制剂(疫苗)稀释，使其含嗜麦芽假单胞菌2×109/ml亿。选体重14-16克小鼠，每只皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射一次，共注射3次，未次免疫后7-10天，用3个LD50毒菌攻击，同时应用同批饲养或体重与免疫相同的小鼠至少10只作对照，分别于腹腔注射3个LD50嗜麦芽假单胞毒菌，观察3天，对照组小鼠死亡数90％，制剂(疫苗)免疫组小鼠保护率100％。
2、抗原性试验结果选体重2公斤左右的家兔至少3只，嗜麦芽假单胞菌单价免疫菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价，2/3家兔血清凝集效价在1∶2560。
以上表明本发明制造方法，生产的制剂(疫苗)产品动物试验证明临床疗效显著。从检验报告结果可见，按中华人民共和国卫生部药鉴局的各项新药产品指标，均符合有关质量标准和合格规定。
3、交叉免疫力试验用终浓度不超过1.1±0.1％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使期含嗜麦芽假单胞菌2×109/ml。选体重14-16克小鼠，每只皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射一次，共注射3次，末次免疫后7-10天，分别用不同的绿脓假单胞菌3个LD50毒菌攻击，同时应用同批饲养或体重与免疫相同的小鼠至少10只作对照，分别于腹腔注射3个LD50毒菌，观察3天，结果对照组小鼠保护率为15％，免疫组小鼠保护率为87.5％。说明嗜麦芽假单胞菌制剂对绿脓假单胞菌有广谱免疫作用。
嗜麦芽假单胞菌制剂免疫与绿脓假单胞菌毒菌攻击免疫力试验结果
4、抑瘤试验抑瘤试验结果，抑瘤率81.2％。
嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)及制造方法Repuirements for Pseudomonas maltrophilia Preparation1.定义、组成及用途本品系用嗜麦芽假单胞菌株培养后，取菌苔制成悬液，用甲醛灭活，以PBS稀释，每小瓶2ml含菌2×109加右旋糖酐60mg冻干制成，用于嗜麦芽假单胞菌感染和恶性肿瘤的辅助治疗。
2制造
2.1基本要求2.1.1设施与生产管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。
2.1.2原料及辅料应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。
2.1.3生产用水生产用水应符合国家饮用水标准，纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。
2.1.4生产用器具直接用于生产的金属或玻璃等器具，必须严格清洗及去热源处理或灭菌下理。
2.1.5生产及检定用动物家兔、小鼠、豚鼠应符合清洁级或SPF级标准。
2.2菌种2.2.1菌种名称及来源制造用广州嗜麦芽假单胞菌种应经国家药品管理当局批准，由国家药品检定机构或国家指定的单位保管和分发。
2.2.2种子批的建立生产用菌种应采用种子批系统。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性，从原始种子批传代、护增冻干保存为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。
2.2.3种子批菌种检定2.2.3.1将待检菌种接种于PH7.2-7.4的肉汤琼肠、马丁琼脂或其他适宜培养基，应为革兰氏阴性无芽胞杆菌，最适宜温度35℃，约0.5um×1.5um，可产生菌毛，菌落光滑，有光泽边缘整齐白灰色或淡黄色。
2.2.3.2生化反应麦芽糖、丙二酸盐枸椽酸盐及DNA试验呈阳性，氧化酶阴性反应。
2.2.3.3血清凝集试验用35℃培养18-20小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌10×108ml，与嗜麦芽假单胞菌免疫诊断血清(效价2560-5210)做定量凝集试验，充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价应不低于原血清效价之半。
2.2.3.4毒力试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌2×107/ml、1×107/ml、5×106/ml、2.5×106/mlt等浓度菌液，腹腔注射体重14-16g小鼠，每个浓度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天，计算LD50。一个LD50含菌数应不低于5×106。
2.2.3.5毒性试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物混悬于生理氯化钠溶液内，60℃加温2小时(或其他方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，稀释成每1ml含菌4.0×109、2.0×109、及1.0×109、共3浓度，每个浓度菌悬液0.5ml腹腔注射体重15-18g小鼠15只，观察3天，注射1.0×109至2.0×109个死菌体的小鼠应全部生存。
2.2.3.6免疫力试验用终浓度不超过1.1±0.10％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使其含菌2.0×109ml。选体重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射1次.共注射3次，末次免疫后7-10天，用3个LD50的毒菌攻击。同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小鼠死亡数应不低于80％，免疫组小鼠保护率应不低于70％。
2.2.3.7抗原性试验选体重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力试验用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价。2/3家兔血清凝集价应不低于1∶2560。
2.2.4菌种传代及保存2.2.4.1菌种应冻干保存于2-8℃，主种子批自启开后传代不得超过6次。
2.2.4.2生产前应检查菌种的全部特性，合格后方可用于生产。
2.3原液制备2.3.1生产用种子将工作种子批菌种启开后，接种于营养琼脂或其他适宜培养基，置35-36℃培养，一般不超过18小时，传代不得超过5代，由此制备适宜数量的生产用工作种子，用于生产。
2.3.2生产用培养基用PH7.2-7.4的营养琼脂或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏原物质。
2.3.3菌种接种和培养采用克氏瓶涂种法，置35℃培养18-20小时，在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌剂的原液放置20-26℃ 14-16天离心洗涤后保存于2-8℃。
2.3.4收获和杀菌培养结束后，于采集的培养物中加入适量PBS至甲醛终浓度不超过1％，加杀菌剂的原液放置20-26℃ 14-16天离心洗涤后保存于2-8℃。
2.3.5无菌试验取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基和马丁培养基及普通琼脂斜面各3管。置35℃培养5天，如有本菌生长，重新杀菌后加倍量复试一次，如有杂菌生长应废弃。
2.4原液检定按3.1项进行。
2.5半成品配制可用单批或多批检定合格的原液合并，用PBS稀释加入3.0％右旋糖酐，经除菌过滤，加入原液使每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
2.6半成品检定按3.2项进行。
2.7分批按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。
2.8分装、冻干按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。
2.9规格本品规格为每小瓶2ml，含菌1.8×109-2.2×109，内含右旋糖酐50mg。
2.10包装按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。
3检定3.1原液检定3.1.1细菌形态应正常3.1.2无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.1.3浓度测定按“中国药品生物制品检定所细菌浊度标准”进行测定。
3.1.4原液保存原液浓度应不高于1.0×1011/ml，保存于2-8℃。
原夜自采集杀菌之日起至制剂稀释时，不得少于2个月，保存期自采集杀菌之日起不超过6个月。
3.2半成品检定3.2.1无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.2.2制剂浓度每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
3.3成品检定3.3.1鉴别试验与相应高效价血清进行凝集试验，应呈强凝集反应。
3.3.2外观为白色冻干粉针剂、溶解后不应含有摇不散的凝块或异物。
3.3.3化学检定按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
3.3.3.1PH值为6.4-7.4。
3.3.3.2游离甲醛应小于0.06g/L。
3.3.3.3右旋糖酐按现行《中国药典》进行。含30g/L。
3.3.4无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行3.3.5异常毒性试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》进行。小鼠注射0.5ml，豚鼠注射1.5ml。
3.3.6浓底测定按“中国药品生物制品检定所细菌浊度标准”进行浓度测定，每小瓶2ml含菌应为2.0×109，误差不得超过10％。
3.3.7菌型及纯菌染色镜检至少观察10个视野，应为革兰氏阴性短小无芽胞杆菌，不应有杂菌。
3.3.8抑瘤试验取体重为18-20g的BALB/c小鼠腹腔接种S180细胞，5天后取小鼠腹水瘤细胞，台酚兰染色并计数，配制细胞浓度为2.5×106/ml的细胞液，按5.0×105(0.2ml)鼠的剂量腹股沟皮下接种18-20g的BALB/c小鼠(植瘤)至少30只，随机分为治疗与对照两组，治疗组在植瘤后隔日腋部皮下注射本品0.5ml/鼠，共注射8次，对照组注射等量无菌生理氯化钠溶液，末次注射后5天，处死小鼠，取瘤并称重，计算制剂的抑瘤率，计算公式如下。
抑瘤率超过50％，方为合格。
4保存、运输及有效期于2-8℃避光保存和运输，自效力检定合格之日起有效期为3年。
使用说明组成和性状本品系用嗜麦芽假单胞菌经培养杀菌后稀释至一定浓义制备而成，成品外观白色。
规格本品规格为每小瓶2ml，含菌2.0×109。
质量标准本品依据《中国生物制品规程》生产和检定，质量符合要求。
药理作用本菌株是病患者分离的嗜麦芽假单胞菌，本菌在目前所有致病性假单胞菌中毒力最强，毒性最小和免疫力最好的假单胞菌，动物试验证明；对动物免疫系统有明显提高机体免疫作用，激活吞噬细胞功能和产生高效特异性抗体，以及对肿瘤有明显的抑制作用。
适应症接种后能改善机体免疫状况，可用于治疗嗜麦芽假单胞菌感染和恶性肿瘤患者的辅助治疗，降低本病的发病率和死亡率。
用法与剂量用无菌注射用水2ml溶解，上臂皮下注射，隔日注射1次，10次为1个疗程，第1次注射1ml，以后每次注射双臂皮下各1ml。儿童减半。
嗜麦芽假单胞多糖制剂、疫苗及制造方法Repuirements for Ps.maltrophilia Typhoid Vaccine1定义、组成及用途本品系用嗜麦芽假单胞菌经培养的提纯精制的多糖制成，用于住院病人预防和治疗住院获得性嗜芽单胞和其他绿脓假单胞菌感染，以及恶性肿瘤的辅助治疗。
2制造2.1基本要求2.1.1设施与生产质量管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。
2.1.2原料及辅料应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅料质控标准》的要求，未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。
2.1.3生产用水生产用水源应符合国家饮用水标准纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。
2.1.4生产用器具直接用于生产的金属或玻璃器具，必须严格清洗并作去热原质处理和灭菌处理。
2.1.5生产及检定用动物小鼠、豚鼠应符合清洁级标准。
2.2菌种2.2.1菌种名称及来源制造多糖疫苗用的菌种(嗜麦芽假单胞菌)及检定用的诊断血清，应经国家药品管理当局批准，并由国家药品检定机构或国家指定单位分发。
2.2.2种子批的建立生产用菌种应采用种子批系统。原始种子的比应验明其记录、历史、来源和生物特性。从原始种子批传代、扩增后冻干保存的为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。
2.2.3种子批的检定检定菌种可用PH7.2-7.4肉汤琼脂或其他适宜培养基。
2.2.3.1形态及培养特征将待检的菌种接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，35-37℃培养16-20小时，涂片镜检应为革兰氏阴性杆菌，菌形整齐。在普通琼脂平板上应为圆形、中等大小、无色半透明、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落。
2.2.3.2生化反应待检的菌中氧化酶阴性，麦芽糖阳性，L精氨酸水解，液化明胶。用Viek法国梅里埃全自动生化系统鉴定，确认为嗜麦芽假单胞菌(99％ Sgenotl opomonas maltophilia)。
2.2.3.3血清学特性用35-37℃培养16-20小时活的培养物与嗜麦芽假单胞菌血清做玻片凝集试验，应有强凝集(+++)，与对照血清不凝集或仅有较弱凝集。
用上述培养物，以PBS稀释成含菌6.0×108/ml制成经100℃ 30分钟加热杀菌或用终浓度为0.5％(ml/ml)甲醛溶液杀菌处理的菌液(亦可用活菌)，分别与嗜芽假单胞血清(用甲醛杀菌或活菌菌液)血清(用加热杀菌菌液)作定量凝集效价应不低于血清原效价之半。
2.3原液制备2.3.1生产用种子启开工作种批菌种，接种于改良半综合培养基或其他适家养基，35-37℃培养，一般不超过20小时。可使用固体或液体培养基传代，由此制备数量适宜的生产用工作种子，但传代不得超过5代。
2.3.2生产用培养基生产嗜麦芽假单胞菌多糖疫苗用改良半综合培养基或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基不应含有能加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成份，也不能含有对人体有害或其他过敏原物质。
2.3.3菌种接种和培养采用培养罐液体培养，于培养基中接种菌后，在培养过程中及杀菌前取样进行细菌浓度测定及纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发出污染杂菌，应废弃。
2.3.4收获和杀菌培养物于对数生期后期、静止期前期收获，一般培养8-12小时为宜(根据菌种接种量及所用培养种类而异)。加入甲醛溶液杀菌，期最终浓度为0.5％-2.0％(ml/ml)。
2.3.5提纯和精制2.3.5.1去核酸杀菌完成后，离心去菌体收集上清液，加入十六烷基三甲溴化铵，充分混匀，形成沉淀放置适当时间离心，收集沉淀物。用蒸馏水溶解沉淀，并加入适量1mol./L氯化钠(或2mol./L氯化钙)溶液，摇动或搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％(ml/ml)，冷库静置1-3小时或过夜，离心去沉淀，收集澄清的上清液。
2.3.5.2沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％(ml/ml)，充分振摇，使多糖沉淀，离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥，即为多糖制品，保存于-20℃以下，待进一步提纯。
2.3.5.3多糖的的精制将精制品溶解小于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达5-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml 1/10饱和醋酸钠溶液)提取3-5次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，必要时或有条件时也可用其他方法去除内毒素活性。再加入乙醇至最终浓度为75％-80％(ml/ml)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用无热原质蒸馏水溶解，经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取过程应尽量在15℃以下进行。提纯多糖应保存于-20℃以下。
2.3.5.4再制提纯多糖的蛋白，核酸含量及其他指标若达不到要求，可再制一次。
2.4原液检定按3.1项进行
2.5原液保存原液应保存于-20℃以下，自收菌之日起有效期为5年。
2.6半成品配制可用单批或多批多糖合并，在无菌条件下，用无热原PH6.5-7.5PBS稀释，每人用剂量含多糖应不低于30ug。
2.7半成品检定按3.2项进行2.8分批按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品分批规程》进行。
2.9分装按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品分装规程》进行。
2.10规格本品规格为每瓶5ml、1ml或0.5ml；每人用剂量0.5ml，含嗜麦芽假单胞菌多糖应不低于30ug。
2.11包装按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品包装规程》进行。
3检定3.1原液检定3.1.1化学检定按《中国生物制品规格》年版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
3.1.1.1固体总量测定每批多糖应按干烤法测定固体总量，计算干重。
3.1.1.2蛋白质含量每批提纯多糖的蛋白质含量应小于10mg/g，按Lowry法测定，用牛血清白蛋白作对照。
3.1.1.3核酸含量每批提纯多糖的核酸含量应小于20mg/g，用紫外分光度法测定，核酸在260nm波长处的吸收系数(E1cm1％)为200。
3.1.1.4O-乙酰基含量每批提纯多糖的O-乙酰基含量应不低于2mmol/g，按Hestrin法测定。
3.1.1.5分子大小测定每批提纯多糖的分子大小应用琼脂糖CL-4B凝胶过滤法测定。KD值在0.25以前的洗脱液多糖回收率应在50％以上。
3.1.2特异性测定每批提纯多糖应采用琼脂扩散试验方法进行血清学特异性试验，嗜芽假单胞菌多糖与嗜麦芽假单胞菌特异性血清48小时内形成明显沉淀线，与对照血清不形成沉淀线。
3.2半成品检定无菌试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.3成品检定3.3.1鉴别试验每批疫苗至少取1瓶进行鉴别试验，按3.1.2项进行。
3.3.2外观应为无色透明液体，无异物。
3.3.3化学检定按《中国生物制品规程》年版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
3.3.3.1PH值为6.5-7.5。
3.3.3.2防腐剂含量如加苯酚防腐剂，其含量为2.5-5.0g/L。
3.3.4无菌试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.3.5异常毒性试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行。
3.3.6热原质试验按《中国生物制品规程》年版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行，家兔注射量为0.025ug/kg体重。
3.3.7多糖含量测定每批疫苗应检查多糖含量，采用火箭电泳法测定，每人用剂量多糖含量应不低于30ug。
4保存、运输及效期于2-8℃避光保存和运输，自稀释之日起有效期为2年。
5使用说明组成和性状本品系用嗜芽假单胞菌经培养后提纯精制的多糖稀释制成，为无色透明液体，不含有异物或凝块。
规格本品规格为每瓶5ml、1ml或0.5ml；每人用剂量0.5ml，含嗜麦芽假单胞菌多糖应不低于30ug。
质量标准本品依据《中国生物制品规格》年版生产和检定，质量符合要求。
作用和用途本疫苗接种后，可使机体产生体液免疫应答。用于预防和治疗嗜麦芽假单胞菌和其他绿脓假单胞菌感染。
接种对象重点用于住院病人预防和治疗住院获得性嗜麦芽假单胞菌和其他绿脓假单胞菌感染。
用法与剂量(1)途径上臂外侧三角肌经消毒后肌内注射。
(2)剂量每人0.5ml.
(3)免疫次数预防用1-2次，治疗用5-6次。
禁忌有下列情况者，不得使用本疫苗(1)发热、严重心脏病、高血压、肝、肾脏病及活动性结核。
(2)孕妇、有经及哺乳期妇女。
(3)有过敏反应病史者。
(实施例1)菌种名称及来源制造嗜麦芽假单胞菌种 经国家药品管管当局批准，由国家药品检定机构或国家指定的单位保管和分发。
种子批的建立生产用菌种应采用种子批系统。从主种子批制备工作种子批。工作种子批用于生产。种子批菌种检定形态及培养检定将待检菌种接种于PH7.2-7.4的肉汤琼肠、马丁琼脂或其他适宜培养基，应为革兰氏阴性无芽胞杆菌，最适宜温度35℃，约0.5цm×15цm，可产生菌毛，菌落光滑，有光泽边缘整齐白灰色或淡黄色。
生化反应丙二酸盐枸椽酸盐及DNA试验呈阳性，氧化酶阴性反应。
血清凝集试验用35℃培养18-20小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌10×108ml，与嗜麦芽假单胞菌免疫诊断血清(效价2560-5120)做定量凝集试验，充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价就不低于原血清效价之半。
毒力试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌2×107ml、1×107ml、5×106ml、2.5×106ml等浓度菌液，腹腔注射体重14-10g小鼠，每个浓度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天，计算LD50。一个LD50含菌数应不低于5×106。
毒性试验用35℃培养18-20小时的琼脂培养物悬于生理氯化钠溶液内，60℃加温2小时(或其他方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，稀释成每1ml含菌4.0×109、2.0×109及1.0×109共3浓度，每个浓度菌悬液0.5ml腹腔注射体重15-18g小鼠15只，观察3天，注射1.0×109至2.0×109个死菌休的小鼠应全部生存。
免疫力试验用终浓度不超过1.1％±0.10％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使其含菌2.0×109ml。选体重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫后7-10天，用3个LD50的毒菌攻击。同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小鼠至少10只作对照，分别于腹腔注射3个LD50毒菌，观察3天，对照组小鼠死亡数应不低于80％，免疫组小鼠保护率应不低于70％。
抗原性试验选体重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力度验用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价。2/3家兔血清凝集价应不低于1∶2560。生产前应检查菌种的全部特性生产用种子将工作种子批菌种启开后，接种于营养琼脂或其他适宜培养基，置35-36℃培养，一般不超过18小时。
菌种接种和培养采用克氏瓶涂种法，置35℃培养18-20小时，在培养过种中及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检。
收获和杀菌培养结束后，于采集的培养物中加入适量PBS至甲醛终浓度不超过1％，加杀菌剂的原液放置20-26℃，14-16天离心洗涤后保存于2-8℃。
单批或多批检定合格的原液合并，用PBS稀释加入3.0％右旋糖酐，经除菌过滤，加入原液使每2ml含菌1.8×109-2.2×109。
原液检定细菌形态应正常，无杂菌。
原液自采集杀菌之日起至制剂稀释时，不得少于2个月，保存期采集杀菌之日起不超过6个月。
制剂浓度每2ml含菌1.8×109-2.2×109。或所需不同浓度和各种制型。
浓度测定按“中国药品生物制品检定所细菌浊度标准”进行浓度测定，每小瓶2ml含菌应为2.×109，误左不得超过10％。
抑瘤试验取体重为18-20gBALB/C小鼠腹腔接种S180细胞，5天后取小鼠腹水瘤细胞，台酚兰染色并计数，配制细胞浓度为2.5×106/ml的细胞液，按5.0×105(0.2ml)/鼠的剂量腹股沟皮下接种18-20g的BALB/C小鼠(植瘤)至少30只，随机分为治疗与对照两组，治疗组在植瘤后隔日腋部皮下注射本品0.5ml/鼠，共注射8次，对照组注射等量无菌生理氯化钠溶液，末次注射后5天，处死小鼠，取瘤并称重，计算制剂的抑瘤北，计算公式如下。
抑瘤率超过50％，方可合格。
(实施例2)菌种名称及来源制造多糖疫苗用的菌种(嗜麦芽假单胞菌)及检定用的诊断血清，应经国家药品管理当局批准，并由国家药品检定机构或国家指定单位分发。
生产用菌种应采用种子批系统。扩增后冻干保存的为主种子批。从主种子批制备工作种子批。
工作种子批用于生产。
种子批的检定检定菌种可用PH7.2-7.4的肉汤琼脂基或其他适宜培养基。
形态及培养特征将待检的菌种接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，35-37℃培养16-20小时，涂片镜检应为革针阴性杆菌，菌形整齐。在普通琼脂平板上应为圆形、中等大小、无色透明、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落。
生化反应待检的菌种氧化酶阴性，麦芽糖阳性，L精氨酸水解，液化明胶。用Vilek法国梅里埃全自动生化系统鉴定，确认为嗜麦芽假单胞菌(99％ Stenotl ophomonas maltophilia)。
血清学特性用35-37℃培养16-20小时活的培养物与嗜麦芽假单胞菌血清做玻片凝集试验，应有强凝集(+++)，与对照血清不凝集或仅有车水马龙弱凝集。
用上述培养物，以PBS稀释成含菌6.0×108/ml制成经100℃ 30分钟加热杀菌或用终浓度为0.5％(ml/ml)甲醛溶液杀菌处理的菌液(亦右用活菌)，分别与嗜芽假单胞菌血清(用甲醛杀菌或活菌菌液)血清(用加热杀菌菌液)作定量凝集试验。充分混匀后，放37℃过夜以肉眼观察结果，凝集(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价不低于血清原效价之半。
生产用种子启开工作种子批菌种，接种于改良半综合培养基或其他适宜养基，35-37℃培养，一般不超过20小时，可使用固体或液体培养基传代，由此制备数量适宜的生产用工作种子，但传代不进超过5代。
生产用培养基生产嗜芽假单胞菌多糖疫苗用改良半综合培养基或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基不应含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分，也不能含有对人体有害或其他过敏原物质。
菌种接种和培养采用罐液体培养，于培养基中接中接种菌种后，在培养过程中及杀菌前取样进行细菌浓度测定及纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
收获和杀菌培养物于对数生长期后期、静止期前期收获，一般培养8-12小时为宜(根据菌种接种量及所用培养基种类而异)。加入甲醛溶液杀菌，其最终浓度为0.5％-2.0％(ml/ml)。
提纯和精制去核酸杀菌完成后，离心去菌体收集上清液，加入十六烷基三甲溴化铵，充分混匀，形成沉淀放置适当时间离心，收集沉淀物。用蒸馏水溶解沉淀，并加入适量lmol/L氯化钠(或2mol/L)溶液，摇动或撑拌1小时，使多糖与十六烷基三甲溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％(ml/ml)，冷库静置1-3小时或过夜，离心去沉淀，收集澄清的上清液。
沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％(ml/ml)，充分振摇，使多糖沉淀，离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥，即为多糖制品，保存于-20℃以下，待进一步提纯。
多糖的精制将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达5-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml 1/10饱和醋酸钠溶液)提取3-5次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，必要时或有条件时也可用其他方法去除内毒素活性。再加入乙醇至最终浓度为75％-80％(ml/ml)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用无热原质蒸馏水溶解，经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取进程应尽量在15℃以下进行。提纯多糖保存于-20℃以下。
原液应保存于-20℃以下，自收菌之日起有效期为5年。
可用单批或多批多糖合并，在无菌条件下，用无热原PH6.5-7.5PBS稀释，每人剂量含多糖应不低于30ug。
化学检定每批多糖应按干烤法则定固体总量，计算干重。
蛋白质含量每批提纯多糖的蛋白质含量应小于10mg/g，按Lowry法测定，用牛血清白蛋白作对照。
核酸含量每批提纯多糖的核酸含量应小于20mg/g，用紫外分光度法测定，核酸在260nm波长处的吸收系数(E1cm1％)为200。
O-乙酰基含量每批提纯多糖的O-乙酰基含量应不低于2mmol/g，按Hestrin法测定。
每批提纯多糖的分子大小应用琼脂糖CL-4B凝胶过滤法测定。KD值在0.25以前的洗脱液多糖回收率应在50％以上。
特异性测定每批提纯多糖应采用琼脂扩散试验方法进行血清学特异性试验，嗜芽假单胞菌多糖与嗜芽假单胞菌特异性血清48小时内形成明显沉淀线，与对照血清不形成沉淀线。
防腐剂含量如加苯酚防腐剂，其含量为2.5-5.0g/L。
多糖含量测定每批疫苗应检查多糖含量，采用火箭电泳法测定，每人用剂量多糖含量不低于30Ug。
权利要求
1.本发明涉及一种嗜麦芽假单胞菌制剂疫苗及其制造方法，其特征是由嗜麦芽假单胞菌制造嗜麦芽假单胞菌制剂疫苗，同时加入乳糖或甘露醇、右旋糖酐组合成产品，作医药用途。
2.根据权利要求1嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗产品、其特征是一种嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗和嗜麦芽假单胞菌多糖或多糖蛋白制剂疫苗，包括液体注射剂、冻干粉针剂、气雾剂、栓剂或含服片剂等常用剂型。
3.根据权利要求1嗜麦芽假胞菌制剂、疫苗的制造方法、其特征是通过嗜麦芽假单胞菌固体培养，控制在35-38℃恒温培养16-20小时、在70-100℃、30-60分钟灭菌或0.5-0.6甲醛灭活，于0.8-1.1％甲醛溶液中控温36-37℃，脱毒7天，最后制成嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗产品。
4.根据权利要求1-3嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗的制造方法，其特征是通过采用培养罐液体培养8-10小时，用甲醛溶液灭菌，其最终浓度为0.5-2.0％(ml/ml)，经过去核酸处理，用十六烷基溴化铵或其他适宜沉淀剂沉淀，然后用冷酚提取，氯化钙或其他适宜的溶液透析，得嗜麦芽假单胞菌精制提纯多糖，由此进一步组合成产品，本方法同时可用于制造炭疽菌疫苗和其他微生物多糖制剂、疫苗。
5.根据权利要求1-2嗜麦芽假单胞菌制剂、疫苗产品的用途，其特征是用于防治嗜麦芽假单胞菌和绿脓假单胞菌感染以及治疗腹水癌和血癌等。
全文摘要
本发明公开一种对嗜麦芽假单胞菌(又称嗜麦芽窄食单胞菌)和绿脓假单胞菌以及恶性肿瘤患者提高体液免疫和细胞免疫的生物制品，其特征是由嗜麦芽假单胞菌制备而成，嗜麦芽假单胞菌制剂(疫苗)和嗜麦芽假单胞菌多糖制剂(疫苗)产品它可以被制备成各种常用的免疫制剂或免疫调节剂型，本发明药物具有预防和治疗嗜麦芽假胞菌和绿脓假单胞菌感染以及治疗腹水癌、血癌的特殊效果。
文档编号A61P31/04GK1781552SQ20041005242
公开日2006年6月7日 申请日期2004年11月30日 优先权日2004年11月30日
发明者余国华 申请人:余国华
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