一种中药制剂及其制备方法和质量控制方法
专利名称：一种中药制剂及其制备方法和质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂及其制备方法，特别是涉及一种益母草总生物碱制剂及其制备方法，属中药领域。
背景技术：
益母草及其提取物在中药领域有着广阔的用途，各种制剂也层出不穷，其中对益母草总生物碱的研究最为集中。但由于诸多技术问题无法解决，至今没有一个制剂所使用的益母草总生物碱的纯度可达80％。
随着研究的不断深入，益母草及其总生物碱的医药用途更被市场所追捧，但由于纯度的限制，益母草及其总生物碱一直未能制成静脉注射剂等技术含量较高的制剂，限制了这一药物在更广阔领域的应用。因而，对益母草及其总生物碱的深度开发，是临床和市场的迫切需要。
本发明人多年来一直进行益母草制剂的研究，曾在专利申请02117432.6和03100594.2中公开了部分技术，即将益母草药材采用水提醇沉，过阳离子交换树脂柱，水洗除杂，酸洗收集有效部位，酸液用碱综合，干燥后乙醇提取脱盐的方法制备益母草总生物碱有效部位提取物。按此方法制备的益母草总生物碱提取物，其中的总生物碱量可达到50％～60％，可以实现生物碱的富集，但无法满足制备高纯度中药注射剂，尤其是静脉用注射剂的要求，故又在前期研究的基础上，做了进一步的探索。
发明内容
本发明目的在于提供一种高纯度益母草总生物碱的制剂，该目的是通过如下过程实现的。
首先是制备中间产物，即纯度高于80％的益母草总生物碱提取物。工艺如下取益母草饮片，加水煎煮2-3次，每次加水8-14倍量，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为75％-85％，冷藏静置18-36小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％-1％的活性炭煮沸20-40分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用1％-25％盐酸洗脱，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％-1％活性炭煮沸脱色2-4次，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总生物碱提取物。
经优选后的工艺过程取益母草饮片，加水煎煮二次，第一次加12倍量水，第二次加9倍量水，各煎煮1.5小时，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以80％乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％的活性炭煮沸30分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-6，弃去；再用1％-7％盐酸洗脱，优选为4％的盐酸，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％活性炭煮沸脱色至溶液无色，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总生物碱提取物。
按现行版《中国药典》对以上提取物进行含量测定，可以证明其益母草总碱的纯度达到80％以上，最高可超过90％。
以上工艺过程，大部分是采用发明人以前的研究结论，另有三点是发明人最新的研究成果，且对总生物碱纯度的提高起到了关键作用，这两点是提高醇沉浓度、活性炭除杂和提高提取生物碱的醇浓度。其中活性炭除杂技术的应用在本发明中有尤为突出的优势，采用活性炭既可以除掉色素等杂质提高纯度，又可以吸附热原，但多数高纯度制剂由于所含成分被活性炭吸附，所以在制备制剂的过程中一般不用或仅用极低浓度的活性炭。恰恰是这一观点，阻碍了多数精制技术的进步。本发明人在经过细致研究后，摒弃传统看法，在过柱前先用相对高浓度活性炭除杂，减小了杂质干扰，提高了树脂利用率，同时有效成分未受损失，达到了去粗取精的目的。
以下实验例进一步说明发明人的主要研究结论。
实验例1不同醇沉方法对益母草总生物碱纯化程度的影响试验方法取验证试验所剩余的浓缩液，各取50ml药液，醇沉使醇浓度分别达到70％、75％、80％，冷藏静置12小时，过滤，回收乙醇，药液浓缩至1∶2。另取一份药液先醇沉达70％，回收乙醇后的水液再加入醇使含醇量达80％，冷藏静置12小时，上清液回收乙醇浓缩至1∶2(相当于每1ml含2g生药)。分别精密移取浓缩液各1ml，测定总生物碱的含量，另精密量取10ml蒸干测定得膏率。结果见表1。
表1 不同浓度醇沉除杂效果的比较
从实验中可以看出，70％醇沉和75％醇沉效果相当，去除沉淀＝13.3-7.61＝5.8，除杂达45％左右，而80％醇沉效果和二次醇沉效果更好，但是二次醇沉的乙醇用量较大，能源消耗也大，成本过高，因此一次醇沉至80％即可。
实验例2提取液脱色的研究用乙醇提取后，仍有很深颜色，为除掉所含的色素杂质，试验了以下四种方法。
1)乙酸乙酯萃取法取半成品0.1g，加入注射用水溶解，用乙酸乙酯20ml萃取。
2)活性炭脱色取半成品0.1g，加入注射用水50ml溶解，加入1g活性炭，沸水浴煮沸10min，滤过。
3)Al2O3柱脱色取半成品0.1mg，用水10ml搅溶上氧化铝柱(2g，d＝1.0cm，100～200目，湿法)，用水50ml洗脱。
4)聚酰胺柱脱色取半成品0.1mg，用水10ml搅溶上聚酰胺柱(2g，d＝1.0cm，30～60目，湿法)，用水50ml洗脱。
结果见表2。
表2 不同脱色方式的作用结果表
由结果可知，以活性炭脱色法处理，既可以除掉其中的色素，活性炭又可以吸附热原，因此确定以活性炭吸附法进行脱色。
实验例3上柱前活性炭精制对样品上柱洗脱的影响试验比较上柱前精制与否对树脂柱上样量的影响，结果见表3。
表3 活性炭精制对上样量的影响结果表
上柱前采用活性炭进行精制可有效提高上柱的载样量，节约树脂，提高纯度。
试验例4不同浓度乙醇提取对脱盐的影响益母草经过水提取、醇沉精制、活性炭精制、上柱、得到了纯度较高的益母草总生物碱提取物，由于制备过程中引入较多的盐，且由于益母草总生物碱在不同浓度的乙醇中溶解度良好，故采用乙醇进行提取脱盐，试验比较不同浓度乙醇的提取效果，结果见表4。
表4 不同浓度乙醇的提取优选结果表
试验结果表明，提高乙醇的浓度可有效提高总生物碱的纯度。
实验例5活性炭吸附对有效成分纯度的影响试验比较不同活性炭用量对脱色次数的要求有效部位富集程度的影响。结果见表5。
表5 不同活性炭用量的影响结果表
由以上结果可知，以0.5％-1％的活性炭脱色可有效提高总生物碱纯度，脱色2-4次即可，优选为3次。
经过以上工艺过程制得的益母草总生物碱的纯度可达到80％以上，按目前现行药典的规定，可以用于制备高纯度制剂，如静脉注射剂。发明人进行了如下研究取益母草总生物碱提取物，加注射用水稀释，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，并以注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液和洗涤液，加亚硫酸氢钠0.1-0.3g，加氯化钠5-7g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH至适宜人体注射，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总生物碱注射剂。
优选工艺取益母草总生物碱提取物，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以200ml注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加0.2g亚硫酸氢钠，加注射用氯化钠6g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH值为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以0.11um微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，即得益母草总生物碱注射剂。
这里主要是进行了注射剂的研究。其他如片剂、胶囊剂、洗剂、滴丸剂等常规剂型的制备，只要应用了本发明所提供的提取精制工艺或由该工艺制成的提取物，均应在本发明的保护范围之内。
另外，从以上发明内容中可以看出，在本发明的研究过程中，质量控制方法是本发明得以实现的必要辅助手段，且该质量控制方法本身也有较高的技术含量，因而也应属本发明的保护范围。具体方法分为定性鉴别和含量测定两部分，分别叙述如下定性鉴别取注射剂1ml，加乙醇25ml，混匀，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点。
含量测定a、总生物碱的测定对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品25mg，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备 精密量取本发明注射剂2ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法取A、B、C、D四个25ml量瓶，分别精密吸取如下溶液A精密量取对照品溶液10ml；B精密量取供试品溶液10ml；C取0.1mol/L盐酸溶液20ml；D精密量取供试品溶液10ml；向A、B、C三个量瓶中各精密加入新制的2％硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；向D量瓶中加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；将上述四个量瓶置冰水浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法试验，在520nm波长处分别测定吸收度，A、B、C、D的测定值分别记为A对照品、A供试品I、A空白试剂、A供试品II，代入“总生物碱含量＝(A空白试剂-A供试品)×W对照品×125/(A空白试剂-A对照品)”中计算样品中总生物碱的含量，其中A供试品＝A供试品I-A供试品II；比色操作应在30分钟内完成；b、盐酸水苏碱的测定色谱条件与系统适用性试验 Waters Spheri sorb 5um SCX阳离子交换树脂柱4.6×250mm；15mmol/L磷酸二氢钾溶液，其中含有0.04％三乙胺和0.15％磷酸，作为流动相；柱温25℃；检测波长为192nm，理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于5000；对照品溶液制备 精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；供试品溶液的制备 精密量取本发明注射剂1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
以上方法也可以用于益母草总生物碱提取物的质量检查，均能有效地控制本发明产品的质量。
本发明还有一点突出贡献，就是将如此高纯度的益母草总生物碱用于脑血管疾病的治疗。以往只有益母草精提物在该领域应用，但都未明确主要药用成分是什么，现在发明人通过实验证实了益母草总生物碱在脑血管疾病治疗领域的重要作用。以下为动物药效学实验例实验例6益母草总碱注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用试验材料1、药物与试剂受试药益母草总碱注射液 批号20031101提供单位北京凯瑞创新医药科技有限公司含量40mg/ml溶剂生理盐水性状无色透明液体储存室温保存用药剂量大鼠受试剂量为16、8、4mg/kg。临床人拟用剂量为120-240mg/人/日，按120mg/人/日计算，大鼠受试剂量16、8、4mg/kg分别为临床人用量(1.71mg/kg)的9.36、4.68、2.34倍。
配药方法取益母草总碱注射液40mg/ml1份加生理盐水1份，浓度为20mg/ml，备用。
高剂量组(16mg/kg)，取益母草总碱注射液20mg/ml1份加生理盐水1份，浓度为10mg/ml，静脉注射体积为0.16ml/100g体重。
中剂量组(8mg/kg)，取益母草总碱注射液20mg/ml1份加生理盐水3份，浓度为5mg/ml，静脉注射体积为0.16ml/100g体重。
低剂量组(4mg/kg)取益母草总碱注射液40mg/ml1份加生理盐水7份，浓度为2.5mg/ml，静脉注射体积为0.16ml/100g体重。
阳性对照药血塞通注射液批号030101生产单位中国昆明兴中制药有限责任公司规格250mg/5ml临床人用量200-400mg，静脉注射，一日1次用药剂量20mg/kg，配药方法，取50mg/ml血塞通注射液原液1份，加生理盐水1份，浓度为25mg/ml，静脉注射体积为0.08ml/100g体重。
试剂12500μ/ml肝素注射液上海生物化学制药厂，批号990407。
试剂盒蛋白定量(考马斯亮兰法)试剂盒，批号20050325；MDA试剂盒，批号20050322；SOD试剂盒，批号20050321；GSH试剂，批号20050330；CAT可见光试剂盒，批号20050330；LDH试剂盒，批号20050330；LD试剂盒，批号20050330；GSH-PX试剂盒，批号20050321；ATP酶试剂盒，批号20050309；NO试剂盒，批号20050325，以上试剂均由南京建成生物工程研究所提供。
2、动物
Wistar大鼠，72只，雄性，体重260-300g。由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器聚乙稀管(内经1mm，2mm)，动脉夹，丝线(4#、7#)，手术器械等。
电子分析天平，JUPITER S2-160A型，日本KYOTO产品。
电热恒温水温箱HH.W21.Cu600，上海跃进医疗器械厂生产。
722型分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。
方法与结果1、分组及给药将动物随机均匀分为6组(即假手术组，模型组、血塞通20mg/kg组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组(简称益母草总碱注射液高剂量组、益母草总碱注射液中剂量组、益母草总碱注射液低剂量组)。各组动物于缺血即刻于舌静脉给药，6小时后再给药一次。假手术组与模型组给予等量的生理盐水。
2、方法手术过程大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，分离右动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA和CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于距ECA与ICA分叉处约0.5cm的颈总动脉处作一切口，插入一端涂有石蜡的尼龙线(0.285mm)，插入深度为1.85±0.5mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留线头至略有阻力以实现大脑中动脉再灌注。在缺血3小时和再灌注0.5小时内用电灯维持大鼠肛温在35-36℃左右。假手术与其他模型鼠一样分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，但只结扎右侧颈总动脉CCA。
神经症状评分神经病学检查评分参照Zea Longa 5分制评分标准表6、Zea Longa5分制评分标准
脑梗塞范围测定动物于缺血3小时再灌注21小时后断头，迅速置于冰盘上取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，后将大脑均匀切成5片放入盛有TTC的瓶中，并将放入37℃孵箱孵育30min，孵育后将其转入10％福尔马林溶液固定。非缺血部分染成玟红色，缺血部位呈白色。脑组织固定后仔细将缺血部分分开并称重，按以下公式确定脑梗塞范围脑梗塞范围(％)＝梗塞区重量/全脑重量×100％组织生化指标测定脑组织生化指标测定包括超氧化歧化酶(SOD)、过氧化脂质(PLO)、乳酸(LD)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷光甘肽(GSH)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮(NO)、Na+-K+-ATPase、Ca2+-My2+-ATPase。
试剂盒蛋白定量(考马斯亮兰法)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
检测方法用10％脑匀浆，4000rpm离心10min，取上清10μl，按CAT测定试剂盒说明和测定CAT含量；分别取上清20μl，按LD、LDH测定试剂盒说明和测定LD和LDH含量；分别取30μl，按SOD、GSH测定试剂盒说明和测定SOD和GSH含量；取上清100μl，按MDA测定试剂盒说明和测定MDA含量；取上清200μl，按GSH-PX测定试剂盒说明和测定GSH-PX含量；取上清500μl，按NO测定试剂盒说明和测定NO含量；用10％脑匀浆用生理盐水稀释成2％脑匀浆，4000rpm离心10min，上清200μl，按Na+-K+-ATPase测定试剂盒说明和测定Na+-K+-ATPase含量；上清500μl，按Ca2+-My2+-ATPase测定试剂盒说明和测定Ca2+-My2+-ATPase含量。
3、结果上述试验结果用X±SD表示，统计学采用组间比较t检验。
(1)对缺血再灌注大鼠神经症状的影响益母草总碱注射液对缺血再灌注大鼠神经症状试验结果见表7。
表7、对缺血再灌注大鼠神经症状的影响(X±SD)
结果显示，假手术组动物无行为异常改变，而模型组12只大鼠均出现偏瘫样症状，主要表现为不能完全伸展健侧前爪、向健侧转圈、向健侧倾倒。益母草总碱注射液组16、8、4mg/kg组在再灌注21小时后均可改善大鼠神经症状，其中16、8mg/kg组统计差别明显(P＜0.01-0.05)。
(2)对缺血再灌注大鼠脑梗范围的影响对缺血再灌注大鼠脑梗范围试验结果见表8。
表8、对缺血再灌注大鼠脑梗范围的影响(X±SD)
试验结果显示，手术后1天，假手术组未见脑组织异常改变，模型组、给药组大鼠均有不同程度梗塞灶，益母草总碱注射液16、8mg/kg组的大鼠梗塞程度明显减轻，与模型组比较差异显著(P＜0.01-0.05)。
(3)对缺血再灌注损伤大鼠脑组织生化指标的影响缺血性脑损伤是多种病理机制交互作用的结果，在诸多损伤因素中，脑细胞能量衰竭被认为是首先发生的重要环节；能量衰竭后无氧糖酵解增加，产生大量的乳酸，引起组织的酸中毒；脑缺血后脑组织能量代谢异常，线粒体内电子传递矢调，致使氧分子接受单个电子生成氧自由基，同时黄嘌呤氧化酶(XO)系统被激活，XO在将ATP的降解产物次黄嘌呤转化为黄嘌呤的同时，产生大量氧自由基，另外超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等自由基清除系统被大量消耗也造成缺血后脑组织自由基的堆积。本研究采用大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察益母草总碱注射液对脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织酸中毒、能量代谢及自由基代谢的影响。对缺血再灌注损伤大鼠脑组织生化指标试验结果见表9-12。
取上清10μl，按CAT测定试剂盒说明和测定CAT含量；分别取上清20μl，按LD、LDH测定试剂盒说明和测定LD和LDH含量；分别取30μl，按SOD、GSH测定试剂盒说明和测定SOD和GSH含量；取上清100μl，按MDA测定试剂盒说明和测定MDA含量；取上清200μl，按GSH-PX测定试剂盒说明和测定GSH-PX含量；取上清500μl，按NO测定试剂盒说明和测定NO含量。
用10％脑匀浆用生理盐水稀释成2％脑匀浆，4000rpm离心10min，上清200μl，按Na+-K+-ATPase测定试剂盒说明和测定Na+-K+-ATPase含量；上清500μl，按Ca2+-My2+-ATPase测定试剂盒说明和测定Ca2+-My2+-ATPase含量。
表9、总碱注射液对缺血再灌注大鼠CAT和MDA含量的影响的影响(X±SD)
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01表10、总碱注射液对缺血再灌注大鼠SOD和LDH活性的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
表11、总碱注射液对缺血再灌注大鼠LD和GSH含量的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
表12、总碱注射液对缺血再灌注大鼠GST-PX和NO含量的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01.
结果显示，大鼠经大脑中动脉缺血再灌后，其LD、LDH、SOD、MDA、GSH、GSH-PX、NO、CAT均有明显变化，模型组大鼠LDH、LD、MDA、NO、含量明显高于假手术组，SOD、GSH、GSH-PX、CAT明显低于假假手术组组(P＜0.05)，益母草总碱注射液16、8mg/kg可明显升高缺血再灌侧大脑的SOD、LDH、GSH、GSH-PX、CAT含量，降低MDA、NO含量(P＜0.05)。提示本药保护脑组织的作用，与改善脑组织酸中毒和抗自由基损伤有关。
益母草总碱注射液对缺血再灌注大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2+-My2+-ATPase的含量见表13。
表13、总碱注射液对缺血再灌注大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2+-My2+-ATPase的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示，大鼠经大脑中动脉缺血再灌后，其Na+-K+-ATPas和Ca2+-My2+-ATPase均明显低于假手术组(P＜0.05)，益毒草总硷注射液16、8mg/kg可明显升高缺血再灌侧大脑的Na+-K+-ATPas和Ca2+-My2+-ATPase的活性(P＜0.05-0.01)。提示本药对缺血再灌注脑损伤大鼠保护作用与改善能量代谢有关。
实验例7益母草总碱注射液对大脑中动脉血栓模型(MCAT)大鼠的保护作用。
试验材料1、药物与试剂受试药及试剂同实验例6。
药物配制同实验例6。
试剂FeCI3(A.R.)，批号20020128，广东山头市西陇化工厂生产，用1mol/L盐酸配制；红四氮唑(TTC)，A.R.，北京化学试剂公司生产，批号04040414。
2、动物Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重180-220g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器AO光学显微镱，美国产品；愠温水浴，HH.W21.Cu600，上海跃进医疗器械厂；电子天平，JUPITER S2 160A型，日本生产。
方法与给药1、分组及给药实验动物随机分为6组，即假手术组、MCAT模型组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、血塞通注射液16mg/kg组。造模前预防给药两天(ip)，每天一次；造模后给药(ip)一次。
2、方法大鼠腹腔注射3％异戊巴比妥0.1ml/100g麻醉。按Tamura[4]等方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨和颞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％三氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组大鼠除不滴加三氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
脑梗塞范围测定大鼠造模24小时后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4℃以下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染料中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光温孵30min，再取出，置于甲醛中避光保存。经染色后非缺血区为玟瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占总脑重量的百分比作为脑梗塞范围。
脑组织梗塞范围抑制率＝(模型组脑梗塞范围-给药组脑梗塞范围)/模型组脑梗塞范围×100％。
大鼠脑组织形态学观察大鼠造模24小时后，断头取脑，10％甲醛固定，病理切片，H.E.染色，进行病理组织学检查，比较组间形态学改变差异。
3、结果试验结果进行组间比较，t检验。
脑组织梗塞范围MCAT大鼠脑组织梗塞范围的影响结果见表14。
表14、总碱注射液对MCAT大鼠脑组织梗塞范围的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示，术后24小时，除假手术组未见异常改变外，血栓模型组大鼠及各给药组大鼠均有不同程度梗塞灶。益母草总碱注射液可明显减少梗塞程度，与模型组比较有显著差异(P＜0.05-0.01)，并呈现出一定的量效关系。
大体形态
假手术组大鼠大脑整体未见明显变化。模型组总体上大脑体积增加，可见在大脑中动脉供血区存在明显梗死灶。各治疗组大鼠大脑总体有回降的趋势，但组间的区别不明显。
组织病变性质假手术组HE染色光镜观察大脑组织结构完整，神经元排列整齐、规则；神经元胞浆丰富，核仁明显；神经胶质细胞核仁清晰，胞浆透亮或淡染，神经元、神经胶质细胞、小血管、毛细血管周围间隙极小，无明显水肿。
模型组大鼠大脑皮质区可见明显的椭圆形梗死灶，包括分子层、颗粒层、锥体细胞层直到扣带回神经纤维束。筛状软化灶内神经细胞消失或有少量固缩核残留；大部分胶质细胞消失，可见残留少量小胶质细胞和浸润的中性粒细胞的细胞核；中心部位神经纤维溶解而周边部位发现脱髓鞘；梗死灶内无明显出血、无明显水肿。外周的过渡区内从相对正常状态过渡到软化灶病变逐渐加重，在软化灶上下两端出现神经元细胞水肿(即胞浆肿张淡染，胞核偏位)及其周围的卫星现象(少突胶质细胞增生)，坏死(胞浆浓缩，枋固缩或核碎裂)及其胞浆的噬神经现象(小胶质细胞和中性神经和颗粒神经细胞，其他类型的神经元不容易区别；该过渡区内有轻度充血、水肿和出血，存在小胶曾生和中性粒细胞浸润，神经纤维出现不完全溶解。在软化灶的脑软膜侧充血、水肿较为严重；有少数存活的颗粒神经细胞的残留。而在软化灶的扣带侧出血、充血、水肿十分严重，小胶质细胞增生活跃甚至出现胶质小结；增生胶质细胞肥大。胞浆呈现泡沫变化(显示了吞噬功能的增强)。
血塞通、益母草总碱注射液各剂量组病变性质与模型组相同。充血、出血、水肿、胶质细胞增生和中性粒细胞浸润比模型组减轻。梗死范围缩小。
实验例8益母草总碱注射液对双侧颈总动脉结扎大鼠(CCAO)脑毛细血管通透性的影响双侧颈总动脉结扎(CCAO)是一种不完全缺血模型，当脑血流量降低到一定程度，出现脑缺血早期病理改变--血管壁受损，通透性加强，加速水分内流而导致脑水肿。用此模型可观察药物对脑毛细血管通透性的影响。
试验材料1、药物与试剂受试药、阳性药同实验例6。
伊文思兰，进口分装，上海化学试剂供应站经销，批号821102。
2、动物SD大鼠60只，雌雄兼用，体重190～210g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器722型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品。
方法与结果1、分组与给药将大鼠随机分为6组，即假手术组、模型组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、血塞通注射液20mg/kg组。腹腔注射给药三次，每日一次，末次给药腹腔注射一日剂量的一半，半小时后造模，造模后舌下静脉给药另一半剂量，假手术组、模型组给予等量的生理盐水(0.8ml/100g体重/日)。
2、方法实验用大鼠，以10％水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，分离双侧颈总动脉并埋线、结扎，结扎后舌下静脉注入2.5％伊文思兰(Evans blue，EB)生理盐水溶液0.1ml/100g体重。
术后6小时断头取脑，剔除小脑及脑干，将脑组织称重后置于5ml甲酰胺中，37℃水浴24小时后取上清液，在722分光光度计上比色，波长620nm，记录OD值。
3、结果将所得OD值代入标准曲线回归方程，计算EB量，再除以脑组织湿重求得每克脑组织湿重所含EB的量。试验结果组间比较，进行t检验，结果见表15。
表15、总碱注射液对Wistar大鼠血脑屏障通透性的影响
结果显示，模型组大鼠脑组织中伊文思兰(EB)含量明显高于假手术组，给药组(EB)含量明显低于模型组。说明双侧颈总动脉结扎缺血6小时，可使脑血管对EB通透性明显加大；益母草总碱注射液可使缺血造成的血管通透性增加明显减轻(P＜0.01)。
实验例9益母草总碱注射液对急性血瘀大鼠血液流变学的影响试验材料1、药物与试剂受试药、阳性药同实验例6。
红细胞变形试剂北京市世帝科学仪器公司提供，批号0009。盐酸肾上腺素注射液，1mg/ml，北京永康制药厂生产，批号000526。肝素，140μ/mg，北京双旋微生物培养基制品厂生产，批号980428。
2、动物Wistar大鼠，雄性，体重230～250g，60只，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器RBC变形/聚集测试仪，型号LG-B-190，北京市世帝科学仪器公司产品；血粘度仪，型号R-80，北京市世帝科学仪器公司产品；400R低温离心机，德国Heraeus产品。
方法与结果1、分组与给药将大鼠随机分为6组，即对照组、模型组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、血塞通注射液20mg/kg组。腹腔注射预防给药3次，每日一次，末次给药后1小时造模，次日腹腔注射一日剂量的一半，半小时后舌下静脉给药另一半剂量，给药后15min取血，假手术组、模型组给予等量的生理盐水(0.8ml/100g体重)。
2、方法大鼠于首次给药后1h，皮下注射肾上腺素0.1ml/100g体重(0.1mg/kg)，共2次，间隔4h，中间(前后各间隔2h)将大鼠浸入冰水内(4℃)5min，当天继续给药。次日晨末次给药后1h，将大鼠以25％乌拉坦1.5g/kg腹腔注射麻醉，颈总动脉插管放血，肝素(20u/ml血)抗凝。
血粘度的测定取抗凝血2ml以2000转离心8min，其上清液即为血浆，取0.8ml血浆用血粘度仪测试高切100s-1时的血浆粘度，结果进行组间比较，进行t检验，结果见表16。
表16、总碱注射液对急性血阏大鼠全血粘度的影响
结果显示益母草总碱注射液高、中剂量能明显降低全血比粘度，与模型对照比较差别显著(P＜0.01-0.05)，提示该药降低全血比粘度可能是达到改善血液流变学作用原因之一。
实验例10益母草总碱注射液溶栓作用(血清药理)试验材料1、药物与试剂受试药同实验例6。
阳性对照药尿激酶广东天普生化医药股份有限公司产品，为白色粉末，批号20020302。受试剂量为5万单位/kg。
2、动物Wistar大鼠50只，雄性，体重250-270g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器SHZ-22型水浴箱振荡器，江苏太仓医疗器械厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本滓岛仪器公司产品；Df-206型鼓风干燥箱，北京西域医疗器械厂产品。
方法与结果1、分组及给药实验分为5组，即对照组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、尿激酶1万单位/kg组。腹腔注射给药2次，假手术组、模型组给予等量的生理盐水(0.8ml/100g体重)。每三次给药时腹腔注射每日剂量的一半，另一半舌下静脉注射给药，给药半小时后经颈动脉取血。静置半小时。2500转/分离心，15分钟，取血清1ml备用。
2、方法取250g体重雄性大鼠1只，经颈总动脉放血至一米长，直径3mm的塑料管中，夹闭两端，垂直放置24h后取出血块，精密称取约50mg的血块，放入以备制好的1ml含药血清中，37℃水浴24h后取出血块称重(大于原血栓重的，按原血栓重计算)，计算相对溶栓率。
相对溶栓率(％)＝(溶前血块湿重-溶后血块湿重)/溶前血块湿重×100％3、结果将溶栓率进行组间比较，进行t检验，见表17。
表17、益母草总碱注射液体外溶栓作用
结果显示益母草总碱注射液高剂量组具有一定的溶栓作用，中、低剂量溶栓作用较弱。尿激酶组有较的溶栓作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1取益母草饮片，加水煎煮2次，每次加8倍量水，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至相对密度为60℃时测为1.16的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.7％的活性炭煮沸20分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用2％盐酸洗脱，以10％硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.7％活性炭煮沸脱色2次，加注射用水调整含量，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌入输液瓶，热压灭菌，得益母草总生物碱提取液取益母草总生物碱提取液，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以注射用水200ml洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加亚硫酸氢钠0.1g，加氯化钠5g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总生物碱注射液。
实施例2取益母草饮片，加水煎煮3次，每次加水14倍量，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至相对密度为60℃时测为1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加1％的活性炭煮沸40分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用20％盐酸洗脱，以10％硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用1％活性炭煮沸脱色2次，加注射用水调整含量，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌入输液瓶，热压灭菌，得益母草总生物碱提取液；取益母草总生物碱提取液，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以注射用水200ml洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加亚硫酸氢钠0.3g，加氯化钠6g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总生物碱注射液。
实施例3定性鉴别取注射剂或总生物碱提取液1ml，加乙醇25ml，混匀，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点。
实施例4含量测定总碱含量的测定对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品25mg，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备 精密量取实施例3中注射剂2ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法取A、B、C、D四个25ml量瓶，分别精密吸取如下溶液A精密量取对照品溶液10ml；B精密量取供试品溶液10ml；C取0.1mol/L盐酸溶液20ml；D精密量取供试品溶液10ml；向A、B、C三个量瓶中各精密加入新制的2％硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；向D量瓶中加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；将上述四个量瓶置冰水浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法试验，在520nm波长处分别测定吸收度，A、B、C、D的测定值分别记为A对照品、A供试品I、A空白试剂、A供试品II，代入“总生物碱含量＝(A空白试剂-A供试品)×W对照品×125/(A空白试剂-A对照品)”中计算样品中总生物碱的含量，其中A供试品＝A供试品I-A供试品II；比色操作应在30分钟内完成。
本品每10ml含总生物碱以盐酸水苏碱(C7H13NO2·HCl)计，应为108～132mg。
盐酸水苏碱含量的测定色谱条件与系统适用性试验 Waters Spherisorb 5um SCX阳离子交换树脂柱4.6×250mm；15mmol/L磷酸二氢钾溶液，其中含有0.04％三乙胺和0.15％磷酸，作为流动相；柱温25℃；检测波长为192nm，理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于5000；对照品溶液制备 精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；供试品溶液的制备 精密量取实施例3中注射剂1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每10ml含盐酸水苏碱(C7H13NO2·HCl)应为90～110mg。
权利要求
1.一种中药制剂，该制剂的主要药用物质为益母草总碱提取物，其特征在于该益母草总碱提取物中的益母草总生物碱的含量不低于80％。
2.如权利要求1所述的中药制剂，其特征在于其益母草总碱提取物中的益母草总生物碱的含量不低于80％且不高于90％。
3.如权利要求2所述的中药制剂，其特征在于其益母草总碱提取物中的益母草总生物碱的含量不低于80％且不高于85％。
4.如权利要求1、2或3所述的中药制剂，其特征在于可以是片剂、胶囊剂、滴丸剂、软胶囊剂、洗剂、注射剂中的任一种。
5.如权利要求4所述的中药制剂的制备方法，其特征在于取益母草饮片，加水煎煮2-3次，每次加水8-14倍量，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为75％-85％，冷藏静置18-36小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％-1％的活性炭煮沸20-40分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用1％-25％盐酸洗脱，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％-1％活性炭煮沸脱色2-4次，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总碱提取物；将此提取物根据需要进一步加工制成所需剂型。
6.如权利要求5所述中药制剂的制备方法，其特征在于取益母草饮片，加水煎煮二次，第一次加12倍量水，第二次加9倍量水，各煎煮1.5小时，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以80％乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％的活性炭煮沸30分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-6，弃去；再用1％-7％盐酸洗脱，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％活性炭煮沸脱色3次，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总碱提取物；将此提取物根据需要进一步加工制成所需剂型。
7.如权利要求6所述中药制剂的制备方法，其特征在于洗脱生物碱所用盐酸的浓度优选为4％。
8.如权利要求7所述中药制剂的制备方法，其特征在于其中的注射剂的制备方法如下取益母草总碱提取物，加注射用水稀释，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，并以注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液和洗涤液，加亚硫酸氢钠0.1-0.3g，加氯化钠5-7g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH至适宜人体注射，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总碱注射剂。
9.如权利要求8所述中药制剂的制备方法，其特征在于其中的注射剂的制备方法如下取益母草总碱提取物，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以200ml注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加0.2g亚硫酸氢钠，加注射用氯化钠6g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH值为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以0.11um微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，即得益母草总碱注射剂。
10.如权利要求4所述注射剂的质量控制方法，其特征在于其中的定性鉴别方法如下取注射剂1ml，加乙醇25ml，混匀，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点。
11.如权利要求10所述的注射剂的质量控制方法，其特征在于其中的含量测定方法可以是如下的任一种或二种的组合a、总生物碱的测定对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品25mg，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备精密量取本发明注射剂2ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。测定法取A、B、C、D四个25ml量瓶，分别精密吸取如下溶液A精密量取对照品溶液10ml；B精密量取供试品溶液10ml；C取0.1mol/L盐酸溶液20ml；D精密量取供试品溶液10ml；向A、B、C三个量瓶中各精密加入新制的2％硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；向D量瓶中加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；将上述四个量瓶置冰水浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法试验，在520nm波长处分别测定吸收度，A、B、C、D的测定值分别记为A对照品、A供试品I、A空白试剂、A供试品II，代入“总生物碱含量＝(A空白试剂-A供试品)×W对照品×125/(A空白试剂-A对照品)”中计算样品中总生物碱的含量，其中A供试品＝A供试品I-A供试品II；比色操作应在30分钟内完成；b、盐酸水苏碱的测定色谱条件与系统适用性试验Waters Spherisorb 5um SCX阳离子交换树脂柱4.6×250mm；15mmol/L磷酸二氢钾溶液，其中含有0.04％三乙胺和0.15％磷酸，作为流动相；柱温25℃；检测波长为192nm，理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于5000；对照品溶液制备精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；供试品溶液的制备精密量取本发明注射剂1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
12.如权利要求1、2或3所述中药制剂在制备用于治疗脑血管疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种以益母草总生物碱为主要药用成分的中药制剂，其中益母草总生物碱的纯度达到80％以上。该益母草总生物碱的提取方法为取益母草饮片，加水煎煮，煎液滤过，浓缩为清膏，醇觉，滤过，沉淀以乙醇洗涤，加活性炭煮沸除杂，过强酸性阳离子交换树脂以去离子水冲洗；再用4％盐酸洗脱，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6～7，滤过，滤液浓缩至析出大量固体，减压干燥，干燥品加乙醇提取生物碱至完全，所得生物碱加用水溶解，用活性炭脱色至溶液无色，以微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即得益母草总生物碱提取液。应用此提取液，可以制成多种剂型。
文档编号A61P9/00GK1883549SQ20051020034
公开日2006年12月27日 申请日期2005年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者高淑英 申请人:北京凯瑞创新医药科技有限公司
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂及其制备方法，特别是涉及一种益母草总生物碱制剂及其制备方法，属中药领域。
背景技术：
益母草及其提取物在中药领域有着广阔的用途，各种制剂也层出不穷，其中对益母草总生物碱的研究最为集中。但由于诸多技术问题无法解决，至今没有一个制剂所使用的益母草总生物碱的纯度可达80％。
随着研究的不断深入，益母草及其总生物碱的医药用途更被市场所追捧，但由于纯度的限制，益母草及其总生物碱一直未能制成静脉注射剂等技术含量较高的制剂，限制了这一药物在更广阔领域的应用。因而，对益母草及其总生物碱的深度开发，是临床和市场的迫切需要。
本发明人多年来一直进行益母草制剂的研究，曾在专利申请02117432.6和03100594.2中公开了部分技术，即将益母草药材采用水提醇沉，过阳离子交换树脂柱，水洗除杂，酸洗收集有效部位，酸液用碱综合，干燥后乙醇提取脱盐的方法制备益母草总生物碱有效部位提取物。按此方法制备的益母草总生物碱提取物，其中的总生物碱量可达到50％～60％，可以实现生物碱的富集，但无法满足制备高纯度中药注射剂，尤其是静脉用注射剂的要求，故又在前期研究的基础上，做了进一步的探索。
发明内容
本发明目的在于提供一种高纯度益母草总生物碱的制剂，该目的是通过如下过程实现的。
首先是制备中间产物，即纯度高于80％的益母草总生物碱提取物。工艺如下取益母草饮片，加水煎煮2-3次，每次加水8-14倍量，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为75％-85％，冷藏静置18-36小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％-1％的活性炭煮沸20-40分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用1％-25％盐酸洗脱，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％-1％活性炭煮沸脱色2-4次，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总生物碱提取物。
经优选后的工艺过程取益母草饮片，加水煎煮二次，第一次加12倍量水，第二次加9倍量水，各煎煮1.5小时，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以80％乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％的活性炭煮沸30分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-6，弃去；再用1％-7％盐酸洗脱，优选为4％的盐酸，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％活性炭煮沸脱色至溶液无色，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总生物碱提取物。
按现行版《中国药典》对以上提取物进行含量测定，可以证明其益母草总碱的纯度达到80％以上，最高可超过90％。
以上工艺过程，大部分是采用发明人以前的研究结论，另有三点是发明人最新的研究成果，且对总生物碱纯度的提高起到了关键作用，这两点是提高醇沉浓度、活性炭除杂和提高提取生物碱的醇浓度。其中活性炭除杂技术的应用在本发明中有尤为突出的优势，采用活性炭既可以除掉色素等杂质提高纯度，又可以吸附热原，但多数高纯度制剂由于所含成分被活性炭吸附，所以在制备制剂的过程中一般不用或仅用极低浓度的活性炭。恰恰是这一观点，阻碍了多数精制技术的进步。本发明人在经过细致研究后，摒弃传统看法，在过柱前先用相对高浓度活性炭除杂，减小了杂质干扰，提高了树脂利用率，同时有效成分未受损失，达到了去粗取精的目的。
以下实验例进一步说明发明人的主要研究结论。
实验例1不同醇沉方法对益母草总生物碱纯化程度的影响试验方法取验证试验所剩余的浓缩液，各取50ml药液，醇沉使醇浓度分别达到70％、75％、80％，冷藏静置12小时，过滤，回收乙醇，药液浓缩至1∶2。另取一份药液先醇沉达70％，回收乙醇后的水液再加入醇使含醇量达80％，冷藏静置12小时，上清液回收乙醇浓缩至1∶2(相当于每1ml含2g生药)。分别精密移取浓缩液各1ml，测定总生物碱的含量，另精密量取10ml蒸干测定得膏率。结果见表1。
表1 不同浓度醇沉除杂效果的比较
从实验中可以看出，70％醇沉和75％醇沉效果相当，去除沉淀＝13.3-7.61＝5.8，除杂达45％左右，而80％醇沉效果和二次醇沉效果更好，但是二次醇沉的乙醇用量较大，能源消耗也大，成本过高，因此一次醇沉至80％即可。
实验例2提取液脱色的研究用乙醇提取后，仍有很深颜色，为除掉所含的色素杂质，试验了以下四种方法。
1)乙酸乙酯萃取法取半成品0.1g，加入注射用水溶解，用乙酸乙酯20ml萃取。
2)活性炭脱色取半成品0.1g，加入注射用水50ml溶解，加入1g活性炭，沸水浴煮沸10min，滤过。
3)Al2O3柱脱色取半成品0.1mg，用水10ml搅溶上氧化铝柱(2g，d＝1.0cm，100～200目，湿法)，用水50ml洗脱。
4)聚酰胺柱脱色取半成品0.1mg，用水10ml搅溶上聚酰胺柱(2g，d＝1.0cm，30～60目，湿法)，用水50ml洗脱。
结果见表2。
表2 不同脱色方式的作用结果表
由结果可知，以活性炭脱色法处理，既可以除掉其中的色素，活性炭又可以吸附热原，因此确定以活性炭吸附法进行脱色。
实验例3上柱前活性炭精制对样品上柱洗脱的影响试验比较上柱前精制与否对树脂柱上样量的影响，结果见表3。
表3 活性炭精制对上样量的影响结果表
上柱前采用活性炭进行精制可有效提高上柱的载样量，节约树脂，提高纯度。
试验例4不同浓度乙醇提取对脱盐的影响益母草经过水提取、醇沉精制、活性炭精制、上柱、得到了纯度较高的益母草总生物碱提取物，由于制备过程中引入较多的盐，且由于益母草总生物碱在不同浓度的乙醇中溶解度良好，故采用乙醇进行提取脱盐，试验比较不同浓度乙醇的提取效果，结果见表4。
表4 不同浓度乙醇的提取优选结果表
试验结果表明，提高乙醇的浓度可有效提高总生物碱的纯度。
实验例5活性炭吸附对有效成分纯度的影响试验比较不同活性炭用量对脱色次数的要求有效部位富集程度的影响。结果见表5。
表5 不同活性炭用量的影响结果表
由以上结果可知，以0.5％-1％的活性炭脱色可有效提高总生物碱纯度，脱色2-4次即可，优选为3次。
经过以上工艺过程制得的益母草总生物碱的纯度可达到80％以上，按目前现行药典的规定，可以用于制备高纯度制剂，如静脉注射剂。发明人进行了如下研究取益母草总生物碱提取物，加注射用水稀释，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，并以注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液和洗涤液，加亚硫酸氢钠0.1-0.3g，加氯化钠5-7g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH至适宜人体注射，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总生物碱注射剂。
优选工艺取益母草总生物碱提取物，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以200ml注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加0.2g亚硫酸氢钠，加注射用氯化钠6g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH值为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以0.11um微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，即得益母草总生物碱注射剂。
这里主要是进行了注射剂的研究。其他如片剂、胶囊剂、洗剂、滴丸剂等常规剂型的制备，只要应用了本发明所提供的提取精制工艺或由该工艺制成的提取物，均应在本发明的保护范围之内。
另外，从以上发明内容中可以看出，在本发明的研究过程中，质量控制方法是本发明得以实现的必要辅助手段，且该质量控制方法本身也有较高的技术含量，因而也应属本发明的保护范围。具体方法分为定性鉴别和含量测定两部分，分别叙述如下定性鉴别取注射剂1ml，加乙醇25ml，混匀，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点。
含量测定a、总生物碱的测定对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品25mg，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备 精密量取本发明注射剂2ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法取A、B、C、D四个25ml量瓶，分别精密吸取如下溶液A精密量取对照品溶液10ml；B精密量取供试品溶液10ml；C取0.1mol/L盐酸溶液20ml；D精密量取供试品溶液10ml；向A、B、C三个量瓶中各精密加入新制的2％硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；向D量瓶中加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；将上述四个量瓶置冰水浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法试验，在520nm波长处分别测定吸收度，A、B、C、D的测定值分别记为A对照品、A供试品I、A空白试剂、A供试品II，代入“总生物碱含量＝(A空白试剂-A供试品)×W对照品×125/(A空白试剂-A对照品)”中计算样品中总生物碱的含量，其中A供试品＝A供试品I-A供试品II；比色操作应在30分钟内完成；b、盐酸水苏碱的测定色谱条件与系统适用性试验 Waters Spheri sorb 5um SCX阳离子交换树脂柱4.6×250mm；15mmol/L磷酸二氢钾溶液，其中含有0.04％三乙胺和0.15％磷酸，作为流动相；柱温25℃；检测波长为192nm，理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于5000；对照品溶液制备 精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；供试品溶液的制备 精密量取本发明注射剂1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
以上方法也可以用于益母草总生物碱提取物的质量检查，均能有效地控制本发明产品的质量。
本发明还有一点突出贡献，就是将如此高纯度的益母草总生物碱用于脑血管疾病的治疗。以往只有益母草精提物在该领域应用，但都未明确主要药用成分是什么，现在发明人通过实验证实了益母草总生物碱在脑血管疾病治疗领域的重要作用。以下为动物药效学实验例实验例6益母草总碱注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用试验材料1、药物与试剂受试药益母草总碱注射液 批号20031101提供单位北京凯瑞创新医药科技有限公司含量40mg/ml溶剂生理盐水性状无色透明液体储存室温保存用药剂量大鼠受试剂量为16、8、4mg/kg。临床人拟用剂量为120-240mg/人/日，按120mg/人/日计算，大鼠受试剂量16、8、4mg/kg分别为临床人用量(1.71mg/kg)的9.36、4.68、2.34倍。
配药方法取益母草总碱注射液40mg/ml1份加生理盐水1份，浓度为20mg/ml，备用。
高剂量组(16mg/kg)，取益母草总碱注射液20mg/ml1份加生理盐水1份，浓度为10mg/ml，静脉注射体积为0.16ml/100g体重。
中剂量组(8mg/kg)，取益母草总碱注射液20mg/ml1份加生理盐水3份，浓度为5mg/ml，静脉注射体积为0.16ml/100g体重。
低剂量组(4mg/kg)取益母草总碱注射液40mg/ml1份加生理盐水7份，浓度为2.5mg/ml，静脉注射体积为0.16ml/100g体重。
阳性对照药血塞通注射液批号030101生产单位中国昆明兴中制药有限责任公司规格250mg/5ml临床人用量200-400mg，静脉注射，一日1次用药剂量20mg/kg，配药方法，取50mg/ml血塞通注射液原液1份，加生理盐水1份，浓度为25mg/ml，静脉注射体积为0.08ml/100g体重。
试剂12500μ/ml肝素注射液上海生物化学制药厂，批号990407。
试剂盒蛋白定量(考马斯亮兰法)试剂盒，批号20050325；MDA试剂盒，批号20050322；SOD试剂盒，批号20050321；GSH试剂，批号20050330；CAT可见光试剂盒，批号20050330；LDH试剂盒，批号20050330；LD试剂盒，批号20050330；GSH-PX试剂盒，批号20050321；ATP酶试剂盒，批号20050309；NO试剂盒，批号20050325，以上试剂均由南京建成生物工程研究所提供。
2、动物
Wistar大鼠，72只，雄性，体重260-300g。由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器聚乙稀管(内经1mm，2mm)，动脉夹，丝线(4#、7#)，手术器械等。
电子分析天平，JUPITER S2-160A型，日本KYOTO产品。
电热恒温水温箱HH.W21.Cu600，上海跃进医疗器械厂生产。
722型分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。
方法与结果1、分组及给药将动物随机均匀分为6组(即假手术组，模型组、血塞通20mg/kg组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组(简称益母草总碱注射液高剂量组、益母草总碱注射液中剂量组、益母草总碱注射液低剂量组)。各组动物于缺血即刻于舌静脉给药，6小时后再给药一次。假手术组与模型组给予等量的生理盐水。
2、方法手术过程大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，分离右动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA和CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于距ECA与ICA分叉处约0.5cm的颈总动脉处作一切口，插入一端涂有石蜡的尼龙线(0.285mm)，插入深度为1.85±0.5mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留线头至略有阻力以实现大脑中动脉再灌注。在缺血3小时和再灌注0.5小时内用电灯维持大鼠肛温在35-36℃左右。假手术与其他模型鼠一样分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，但只结扎右侧颈总动脉CCA。
神经症状评分神经病学检查评分参照Zea Longa 5分制评分标准表6、Zea Longa5分制评分标准
脑梗塞范围测定动物于缺血3小时再灌注21小时后断头，迅速置于冰盘上取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，后将大脑均匀切成5片放入盛有TTC的瓶中，并将放入37℃孵箱孵育30min，孵育后将其转入10％福尔马林溶液固定。非缺血部分染成玟红色，缺血部位呈白色。脑组织固定后仔细将缺血部分分开并称重，按以下公式确定脑梗塞范围脑梗塞范围(％)＝梗塞区重量/全脑重量×100％组织生化指标测定脑组织生化指标测定包括超氧化歧化酶(SOD)、过氧化脂质(PLO)、乳酸(LD)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷光甘肽(GSH)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮(NO)、Na+-K+-ATPase、Ca2+-My2+-ATPase。
试剂盒蛋白定量(考马斯亮兰法)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
检测方法用10％脑匀浆，4000rpm离心10min，取上清10μl，按CAT测定试剂盒说明和测定CAT含量；分别取上清20μl，按LD、LDH测定试剂盒说明和测定LD和LDH含量；分别取30μl，按SOD、GSH测定试剂盒说明和测定SOD和GSH含量；取上清100μl，按MDA测定试剂盒说明和测定MDA含量；取上清200μl，按GSH-PX测定试剂盒说明和测定GSH-PX含量；取上清500μl，按NO测定试剂盒说明和测定NO含量；用10％脑匀浆用生理盐水稀释成2％脑匀浆，4000rpm离心10min，上清200μl，按Na+-K+-ATPase测定试剂盒说明和测定Na+-K+-ATPase含量；上清500μl，按Ca2+-My2+-ATPase测定试剂盒说明和测定Ca2+-My2+-ATPase含量。
3、结果上述试验结果用X±SD表示，统计学采用组间比较t检验。
(1)对缺血再灌注大鼠神经症状的影响益母草总碱注射液对缺血再灌注大鼠神经症状试验结果见表7。
表7、对缺血再灌注大鼠神经症状的影响(X±SD)
结果显示，假手术组动物无行为异常改变，而模型组12只大鼠均出现偏瘫样症状，主要表现为不能完全伸展健侧前爪、向健侧转圈、向健侧倾倒。益母草总碱注射液组16、8、4mg/kg组在再灌注21小时后均可改善大鼠神经症状，其中16、8mg/kg组统计差别明显(P＜0.01-0.05)。
(2)对缺血再灌注大鼠脑梗范围的影响对缺血再灌注大鼠脑梗范围试验结果见表8。
表8、对缺血再灌注大鼠脑梗范围的影响(X±SD)
试验结果显示，手术后1天，假手术组未见脑组织异常改变，模型组、给药组大鼠均有不同程度梗塞灶，益母草总碱注射液16、8mg/kg组的大鼠梗塞程度明显减轻，与模型组比较差异显著(P＜0.01-0.05)。
(3)对缺血再灌注损伤大鼠脑组织生化指标的影响缺血性脑损伤是多种病理机制交互作用的结果，在诸多损伤因素中，脑细胞能量衰竭被认为是首先发生的重要环节；能量衰竭后无氧糖酵解增加，产生大量的乳酸，引起组织的酸中毒；脑缺血后脑组织能量代谢异常，线粒体内电子传递矢调，致使氧分子接受单个电子生成氧自由基，同时黄嘌呤氧化酶(XO)系统被激活，XO在将ATP的降解产物次黄嘌呤转化为黄嘌呤的同时，产生大量氧自由基，另外超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等自由基清除系统被大量消耗也造成缺血后脑组织自由基的堆积。本研究采用大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察益母草总碱注射液对脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织酸中毒、能量代谢及自由基代谢的影响。对缺血再灌注损伤大鼠脑组织生化指标试验结果见表9-12。
取上清10μl，按CAT测定试剂盒说明和测定CAT含量；分别取上清20μl，按LD、LDH测定试剂盒说明和测定LD和LDH含量；分别取30μl，按SOD、GSH测定试剂盒说明和测定SOD和GSH含量；取上清100μl，按MDA测定试剂盒说明和测定MDA含量；取上清200μl，按GSH-PX测定试剂盒说明和测定GSH-PX含量；取上清500μl，按NO测定试剂盒说明和测定NO含量。
用10％脑匀浆用生理盐水稀释成2％脑匀浆，4000rpm离心10min，上清200μl，按Na+-K+-ATPase测定试剂盒说明和测定Na+-K+-ATPase含量；上清500μl，按Ca2+-My2+-ATPase测定试剂盒说明和测定Ca2+-My2+-ATPase含量。
表9、总碱注射液对缺血再灌注大鼠CAT和MDA含量的影响的影响(X±SD)
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01表10、总碱注射液对缺血再灌注大鼠SOD和LDH活性的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
表11、总碱注射液对缺血再灌注大鼠LD和GSH含量的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
表12、总碱注射液对缺血再灌注大鼠GST-PX和NO含量的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01.
结果显示，大鼠经大脑中动脉缺血再灌后，其LD、LDH、SOD、MDA、GSH、GSH-PX、NO、CAT均有明显变化，模型组大鼠LDH、LD、MDA、NO、含量明显高于假手术组，SOD、GSH、GSH-PX、CAT明显低于假假手术组组(P＜0.05)，益母草总碱注射液16、8mg/kg可明显升高缺血再灌侧大脑的SOD、LDH、GSH、GSH-PX、CAT含量，降低MDA、NO含量(P＜0.05)。提示本药保护脑组织的作用，与改善脑组织酸中毒和抗自由基损伤有关。
益母草总碱注射液对缺血再灌注大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2+-My2+-ATPase的含量见表13。
表13、总碱注射液对缺血再灌注大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2+-My2+-ATPase的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示，大鼠经大脑中动脉缺血再灌后，其Na+-K+-ATPas和Ca2+-My2+-ATPase均明显低于假手术组(P＜0.05)，益毒草总硷注射液16、8mg/kg可明显升高缺血再灌侧大脑的Na+-K+-ATPas和Ca2+-My2+-ATPase的活性(P＜0.05-0.01)。提示本药对缺血再灌注脑损伤大鼠保护作用与改善能量代谢有关。
实验例7益母草总碱注射液对大脑中动脉血栓模型(MCAT)大鼠的保护作用。
试验材料1、药物与试剂受试药及试剂同实验例6。
药物配制同实验例6。
试剂FeCI3(A.R.)，批号20020128，广东山头市西陇化工厂生产，用1mol/L盐酸配制；红四氮唑(TTC)，A.R.，北京化学试剂公司生产，批号04040414。
2、动物Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重180-220g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器AO光学显微镱，美国产品；愠温水浴，HH.W21.Cu600，上海跃进医疗器械厂；电子天平，JUPITER S2 160A型，日本生产。
方法与给药1、分组及给药实验动物随机分为6组，即假手术组、MCAT模型组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、血塞通注射液16mg/kg组。造模前预防给药两天(ip)，每天一次；造模后给药(ip)一次。
2、方法大鼠腹腔注射3％异戊巴比妥0.1ml/100g麻醉。按Tamura[4]等方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨和颞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％三氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组大鼠除不滴加三氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
脑梗塞范围测定大鼠造模24小时后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4℃以下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染料中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光温孵30min，再取出，置于甲醛中避光保存。经染色后非缺血区为玟瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占总脑重量的百分比作为脑梗塞范围。
脑组织梗塞范围抑制率＝(模型组脑梗塞范围-给药组脑梗塞范围)/模型组脑梗塞范围×100％。
大鼠脑组织形态学观察大鼠造模24小时后，断头取脑，10％甲醛固定，病理切片，H.E.染色，进行病理组织学检查，比较组间形态学改变差异。
3、结果试验结果进行组间比较，t检验。
脑组织梗塞范围MCAT大鼠脑组织梗塞范围的影响结果见表14。
表14、总碱注射液对MCAT大鼠脑组织梗塞范围的影响(X±SD)
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示，术后24小时，除假手术组未见异常改变外，血栓模型组大鼠及各给药组大鼠均有不同程度梗塞灶。益母草总碱注射液可明显减少梗塞程度，与模型组比较有显著差异(P＜0.05-0.01)，并呈现出一定的量效关系。
大体形态
假手术组大鼠大脑整体未见明显变化。模型组总体上大脑体积增加，可见在大脑中动脉供血区存在明显梗死灶。各治疗组大鼠大脑总体有回降的趋势，但组间的区别不明显。
组织病变性质假手术组HE染色光镜观察大脑组织结构完整，神经元排列整齐、规则；神经元胞浆丰富，核仁明显；神经胶质细胞核仁清晰，胞浆透亮或淡染，神经元、神经胶质细胞、小血管、毛细血管周围间隙极小，无明显水肿。
模型组大鼠大脑皮质区可见明显的椭圆形梗死灶，包括分子层、颗粒层、锥体细胞层直到扣带回神经纤维束。筛状软化灶内神经细胞消失或有少量固缩核残留；大部分胶质细胞消失，可见残留少量小胶质细胞和浸润的中性粒细胞的细胞核；中心部位神经纤维溶解而周边部位发现脱髓鞘；梗死灶内无明显出血、无明显水肿。外周的过渡区内从相对正常状态过渡到软化灶病变逐渐加重，在软化灶上下两端出现神经元细胞水肿(即胞浆肿张淡染，胞核偏位)及其周围的卫星现象(少突胶质细胞增生)，坏死(胞浆浓缩，枋固缩或核碎裂)及其胞浆的噬神经现象(小胶质细胞和中性神经和颗粒神经细胞，其他类型的神经元不容易区别；该过渡区内有轻度充血、水肿和出血，存在小胶曾生和中性粒细胞浸润，神经纤维出现不完全溶解。在软化灶的脑软膜侧充血、水肿较为严重；有少数存活的颗粒神经细胞的残留。而在软化灶的扣带侧出血、充血、水肿十分严重，小胶质细胞增生活跃甚至出现胶质小结；增生胶质细胞肥大。胞浆呈现泡沫变化(显示了吞噬功能的增强)。
血塞通、益母草总碱注射液各剂量组病变性质与模型组相同。充血、出血、水肿、胶质细胞增生和中性粒细胞浸润比模型组减轻。梗死范围缩小。
实验例8益母草总碱注射液对双侧颈总动脉结扎大鼠(CCAO)脑毛细血管通透性的影响双侧颈总动脉结扎(CCAO)是一种不完全缺血模型，当脑血流量降低到一定程度，出现脑缺血早期病理改变--血管壁受损，通透性加强，加速水分内流而导致脑水肿。用此模型可观察药物对脑毛细血管通透性的影响。
试验材料1、药物与试剂受试药、阳性药同实验例6。
伊文思兰，进口分装，上海化学试剂供应站经销，批号821102。
2、动物SD大鼠60只，雌雄兼用，体重190～210g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器722型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品。
方法与结果1、分组与给药将大鼠随机分为6组，即假手术组、模型组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、血塞通注射液20mg/kg组。腹腔注射给药三次，每日一次，末次给药腹腔注射一日剂量的一半，半小时后造模，造模后舌下静脉给药另一半剂量，假手术组、模型组给予等量的生理盐水(0.8ml/100g体重/日)。
2、方法实验用大鼠，以10％水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，分离双侧颈总动脉并埋线、结扎，结扎后舌下静脉注入2.5％伊文思兰(Evans blue，EB)生理盐水溶液0.1ml/100g体重。
术后6小时断头取脑，剔除小脑及脑干，将脑组织称重后置于5ml甲酰胺中，37℃水浴24小时后取上清液，在722分光光度计上比色，波长620nm，记录OD值。
3、结果将所得OD值代入标准曲线回归方程，计算EB量，再除以脑组织湿重求得每克脑组织湿重所含EB的量。试验结果组间比较，进行t检验，结果见表15。
表15、总碱注射液对Wistar大鼠血脑屏障通透性的影响
结果显示，模型组大鼠脑组织中伊文思兰(EB)含量明显高于假手术组，给药组(EB)含量明显低于模型组。说明双侧颈总动脉结扎缺血6小时，可使脑血管对EB通透性明显加大；益母草总碱注射液可使缺血造成的血管通透性增加明显减轻(P＜0.01)。
实验例9益母草总碱注射液对急性血瘀大鼠血液流变学的影响试验材料1、药物与试剂受试药、阳性药同实验例6。
红细胞变形试剂北京市世帝科学仪器公司提供，批号0009。盐酸肾上腺素注射液，1mg/ml，北京永康制药厂生产，批号000526。肝素，140μ/mg，北京双旋微生物培养基制品厂生产，批号980428。
2、动物Wistar大鼠，雄性，体重230～250g，60只，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器RBC变形/聚集测试仪，型号LG-B-190，北京市世帝科学仪器公司产品；血粘度仪，型号R-80，北京市世帝科学仪器公司产品；400R低温离心机，德国Heraeus产品。
方法与结果1、分组与给药将大鼠随机分为6组，即对照组、模型组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、血塞通注射液20mg/kg组。腹腔注射预防给药3次，每日一次，末次给药后1小时造模，次日腹腔注射一日剂量的一半，半小时后舌下静脉给药另一半剂量，给药后15min取血，假手术组、模型组给予等量的生理盐水(0.8ml/100g体重)。
2、方法大鼠于首次给药后1h，皮下注射肾上腺素0.1ml/100g体重(0.1mg/kg)，共2次，间隔4h，中间(前后各间隔2h)将大鼠浸入冰水内(4℃)5min，当天继续给药。次日晨末次给药后1h，将大鼠以25％乌拉坦1.5g/kg腹腔注射麻醉，颈总动脉插管放血，肝素(20u/ml血)抗凝。
血粘度的测定取抗凝血2ml以2000转离心8min，其上清液即为血浆，取0.8ml血浆用血粘度仪测试高切100s-1时的血浆粘度，结果进行组间比较，进行t检验，结果见表16。
表16、总碱注射液对急性血阏大鼠全血粘度的影响
结果显示益母草总碱注射液高、中剂量能明显降低全血比粘度，与模型对照比较差别显著(P＜0.01-0.05)，提示该药降低全血比粘度可能是达到改善血液流变学作用原因之一。
实验例10益母草总碱注射液溶栓作用(血清药理)试验材料1、药物与试剂受试药同实验例6。
阳性对照药尿激酶广东天普生化医药股份有限公司产品，为白色粉末，批号20020302。受试剂量为5万单位/kg。
2、动物Wistar大鼠50只，雄性，体重250-270g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-(军)2002-001，动物房饲养，动物设施条件认可证号SYXK-(军)2002-001。
3、仪器SHZ-22型水浴箱振荡器，江苏太仓医疗器械厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本滓岛仪器公司产品；Df-206型鼓风干燥箱，北京西域医疗器械厂产品。
方法与结果1、分组及给药实验分为5组，即对照组、益母草总碱注射液16、8、4mg/kg组、尿激酶1万单位/kg组。腹腔注射给药2次，假手术组、模型组给予等量的生理盐水(0.8ml/100g体重)。每三次给药时腹腔注射每日剂量的一半，另一半舌下静脉注射给药，给药半小时后经颈动脉取血。静置半小时。2500转/分离心，15分钟，取血清1ml备用。
2、方法取250g体重雄性大鼠1只，经颈总动脉放血至一米长，直径3mm的塑料管中，夹闭两端，垂直放置24h后取出血块，精密称取约50mg的血块，放入以备制好的1ml含药血清中，37℃水浴24h后取出血块称重(大于原血栓重的，按原血栓重计算)，计算相对溶栓率。
相对溶栓率(％)＝(溶前血块湿重-溶后血块湿重)/溶前血块湿重×100％3、结果将溶栓率进行组间比较，进行t检验，见表17。
表17、益母草总碱注射液体外溶栓作用
结果显示益母草总碱注射液高剂量组具有一定的溶栓作用，中、低剂量溶栓作用较弱。尿激酶组有较的溶栓作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1取益母草饮片，加水煎煮2次，每次加8倍量水，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至相对密度为60℃时测为1.16的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.7％的活性炭煮沸20分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用2％盐酸洗脱，以10％硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.7％活性炭煮沸脱色2次，加注射用水调整含量，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌入输液瓶，热压灭菌，得益母草总生物碱提取液取益母草总生物碱提取液，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以注射用水200ml洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加亚硫酸氢钠0.1g，加氯化钠5g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总生物碱注射液。
实施例2取益母草饮片，加水煎煮3次，每次加水14倍量，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至相对密度为60℃时测为1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加1％的活性炭煮沸40分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用20％盐酸洗脱，以10％硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用1％活性炭煮沸脱色2次，加注射用水调整含量，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌入输液瓶，热压灭菌，得益母草总生物碱提取液；取益母草总生物碱提取液，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以注射用水200ml洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加亚硫酸氢钠0.3g，加氯化钠6g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总生物碱注射液。
实施例3定性鉴别取注射剂或总生物碱提取液1ml，加乙醇25ml，混匀，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点。
实施例4含量测定总碱含量的测定对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品25mg，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备 精密量取实施例3中注射剂2ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法取A、B、C、D四个25ml量瓶，分别精密吸取如下溶液A精密量取对照品溶液10ml；B精密量取供试品溶液10ml；C取0.1mol/L盐酸溶液20ml；D精密量取供试品溶液10ml；向A、B、C三个量瓶中各精密加入新制的2％硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；向D量瓶中加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；将上述四个量瓶置冰水浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法试验，在520nm波长处分别测定吸收度，A、B、C、D的测定值分别记为A对照品、A供试品I、A空白试剂、A供试品II，代入“总生物碱含量＝(A空白试剂-A供试品)×W对照品×125/(A空白试剂-A对照品)”中计算样品中总生物碱的含量，其中A供试品＝A供试品I-A供试品II；比色操作应在30分钟内完成。
本品每10ml含总生物碱以盐酸水苏碱(C7H13NO2·HCl)计，应为108～132mg。
盐酸水苏碱含量的测定色谱条件与系统适用性试验 Waters Spherisorb 5um SCX阳离子交换树脂柱4.6×250mm；15mmol/L磷酸二氢钾溶液，其中含有0.04％三乙胺和0.15％磷酸，作为流动相；柱温25℃；检测波长为192nm，理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于5000；对照品溶液制备 精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；供试品溶液的制备 精密量取实施例3中注射剂1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每10ml含盐酸水苏碱(C7H13NO2·HCl)应为90～110mg。
权利要求
1.一种中药制剂，该制剂的主要药用物质为益母草总碱提取物，其特征在于该益母草总碱提取物中的益母草总生物碱的含量不低于80％。
2.如权利要求1所述的中药制剂，其特征在于其益母草总碱提取物中的益母草总生物碱的含量不低于80％且不高于90％。
3.如权利要求2所述的中药制剂，其特征在于其益母草总碱提取物中的益母草总生物碱的含量不低于80％且不高于85％。
4.如权利要求1、2或3所述的中药制剂，其特征在于可以是片剂、胶囊剂、滴丸剂、软胶囊剂、洗剂、注射剂中的任一种。
5.如权利要求4所述的中药制剂的制备方法，其特征在于取益母草饮片，加水煎煮2-3次，每次加水8-14倍量，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为75％-85％，冷藏静置18-36小时，滤过，沉淀以相同浓度乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％-1％的活性炭煮沸20-40分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-7，弃去；再用1％-25％盐酸洗脱，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％-1％活性炭煮沸脱色2-4次，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总碱提取物；将此提取物根据需要进一步加工制成所需剂型。
6.如权利要求5所述中药制剂的制备方法，其特征在于取益母草饮片，加水煎煮二次，第一次加12倍量水，第二次加9倍量水，各煎煮1.5小时，合并煎液，过120目筛，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.16-1.20的清膏，加入乙醇使含醇量为80％，冷藏静置24小时，滤过，沉淀以80％乙醇洗涤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，并加水调整至每1ml含2g生药，加0.5％的活性炭煮沸30分钟，滤过，取滤液加于已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱上，加完药液后，以去离子水继续冲洗，至水洗脱液pH5-6，弃去；再用1％-7％盐酸洗脱，至生物碱洗脱完全，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6-7，滤过，滤液减压浓缩，至析出大量固体，干燥；取干燥品加95％-100％乙醇提取生物碱至完全，滤过，滤液减压回收乙醇，干燥，干燥品用适量相同浓度乙醇溶解，滤过，滤液减压回收乙醇，加注射用水使溶解，用0.5％活性炭煮沸脱色3次，以孔径为0.22um的微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，得益母草总碱提取物；将此提取物根据需要进一步加工制成所需剂型。
7.如权利要求6所述中药制剂的制备方法，其特征在于洗脱生物碱所用盐酸的浓度优选为4％。
8.如权利要求7所述中药制剂的制备方法，其特征在于其中的注射剂的制备方法如下取益母草总碱提取物，加注射用水稀释，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，并以注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液和洗涤液，加亚硫酸氢钠0.1-0.3g，加氯化钠5-7g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH至适宜人体注射，以孔径为0.11um的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得益母草总碱注射剂。
9.如权利要求8所述中药制剂的制备方法，其特征在于其中的注射剂的制备方法如下取益母草总碱提取物，加注射用水500ml，混匀，用分子截留量为5000的中空纤维超滤，以200ml注射用水洗涤超滤系统，合并超滤液及洗涤液，混合均匀，加0.2g亚硫酸氢钠，加注射用氯化钠6g，用饱和的氢氧化钠溶液调整pH值为6.5，加注射用水至1000ml，混匀，以0.11um微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，即得益母草总碱注射剂。
10.如权利要求4所述注射剂的质量控制方法，其特征在于其中的定性鉴别方法如下取注射剂1ml，加乙醇25ml，混匀，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点。
11.如权利要求10所述的注射剂的质量控制方法，其特征在于其中的含量测定方法可以是如下的任一种或二种的组合a、总生物碱的测定对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品25mg，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备精密量取本发明注射剂2ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。测定法取A、B、C、D四个25ml量瓶，分别精密吸取如下溶液A精密量取对照品溶液10ml；B精密量取供试品溶液10ml；C取0.1mol/L盐酸溶液20ml；D精密量取供试品溶液10ml；向A、B、C三个量瓶中各精密加入新制的2％硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；向D量瓶中加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；将上述四个量瓶置冰水浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法试验，在520nm波长处分别测定吸收度，A、B、C、D的测定值分别记为A对照品、A供试品I、A空白试剂、A供试品II，代入“总生物碱含量＝(A空白试剂-A供试品)×W对照品×125/(A空白试剂-A对照品)”中计算样品中总生物碱的含量，其中A供试品＝A供试品I-A供试品II；比色操作应在30分钟内完成；b、盐酸水苏碱的测定色谱条件与系统适用性试验Waters Spherisorb 5um SCX阳离子交换树脂柱4.6×250mm；15mmol/L磷酸二氢钾溶液，其中含有0.04％三乙胺和0.15％磷酸，作为流动相；柱温25℃；检测波长为192nm，理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于5000；对照品溶液制备精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；供试品溶液的制备精密量取本发明注射剂1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
12.如权利要求1、2或3所述中药制剂在制备用于治疗脑血管疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种以益母草总生物碱为主要药用成分的中药制剂，其中益母草总生物碱的纯度达到80％以上。该益母草总生物碱的提取方法为取益母草饮片，加水煎煮，煎液滤过，浓缩为清膏，醇觉，滤过，沉淀以乙醇洗涤，加活性炭煮沸除杂，过强酸性阳离子交换树脂以去离子水冲洗；再用4％盐酸洗脱，收集洗脱液，加氢氧化钠调pH6～7，滤过，滤液浓缩至析出大量固体，减压干燥，干燥品加乙醇提取生物碱至完全，所得生物碱加用水溶解，用活性炭脱色至溶液无色，以微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即得益母草总生物碱提取液。应用此提取液，可以制成多种剂型。
文档编号A61P9/00GK1883549SQ20051020034
公开日2006年12月27日 申请日期2005年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者高淑英 申请人:北京凯瑞创新医药科技有限公司
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