小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法
专利名称：小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及动物血液制品领域，更具体的说，涉及小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法。
背景技术：
从小牛血液中提取的“小牛血去蛋白提取物”(protein-free calf bloodextract)是一种小分子的生物活性物质，含小分子多肽、氨基酸、核苷酸、酮酸等物质。其主要药理作用是增强细胞对氧和葡萄糖的摄取、利用，促进ATP的合成，促进营养物质的运送，促进组织的复原和再生。可用于治疗脑代谢紊乱和脑供血不全的病人，也可广泛用于治疗各种病因引起的角膜溃疡、皮肤溃疡和损伤、褥疮以及整容、整形和矫形等外科手术后的修复和再生，具有非常广泛的临床用途。
瑞士素高(Solco)公司的素高捷疗系列产品(眼膏、软膏、口腔膏和注射液)及奥地利的爱维治注射液均已从八十年代中期开始进口我国，在临床上广泛应用，在大部分地区被列入公费医疗的品种。目前，国内有几家在生产小牛血去蛋白提取物注射液，但是尚无厂家生产小牛血去蛋白提取物眼膏。况且，受欧洲疯牛病的影响，我国已限制进口牛源性药品，目前市场上很难买到牛源性进口产品(包括素高捷疗眼膏)。
我国有丰富的自然资源，牛血原料来源广泛，未受疯牛病影响，研制小牛血去蛋白提取物及其眼膏可以利用国内资源，替代进口，节约外汇，同时提高国内厂家生化药物及制剂的研究能力和国际竞争力，具有广泛而深远的意义。
发明内容
本发明提供了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，它包括下述步骤(1)采集小牛血液，离心得红细胞；(2)加水、冻溶，破坏红细胞膜，释放出内容物；(3)离心，得到去除部分大分子量蛋白质的上清液；(4)对上清液进行巴氏消毒，灭活牛血中的病毒；(5)超滤，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物中间体；(6)纳滤脱盐；(7)反渗透浓缩；(8)医用活性炭脱色，得小牛血去蛋白提取物。
在上述的制备方法中，在上述的制备方法中，步骤(1)中所述的小牛优选为1～6月大的经检疫合格的健康奶牛，所述的离心优选为2000～4000转/分钟，10～20分钟。
在上述的制备方法中，步骤(2)中所述的加水的优选量为红细胞体积的2～6倍，所述的冻溶的温度优选为-20～-10℃，冻溶的时间优选为20～30小时。
在上述的制备方法中，步骤(3)中所述的离心优选为10000～15000转/分钟，20～30分钟。
在上述的制备方法中，步骤(4)中所述的巴氏消毒优选是，在无菌条件下，将上清液在50～70℃恒温加热6～15小时。
在上述的制备方法中，步骤(5)中所述的超滤优选分两步第一步超滤使用的滤膜的截留分子量为5～10万道尔顿，第二步超滤使用的滤膜的截留分子量为0.5～1.5万道尔顿。
在上述的制备方法中，步骤(6)中所述的纳滤使用的膜优选为对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺膜。
在上述的制备方法中，步骤(7)所述的反渗透浓缩使用的膜优选为对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺膜。
在上述的制备方法中，步骤(8)中所述的活性炭脱色条件优选为，脱色浓度为5～10g/L，脱色温度90～110℃，脱色时间为10～60分钟。
本发明还提供了一种含有小牛血去蛋白提取物的眼膏，其制备原料包括下述重量百分比的原料10～40％的权利要求1-9中任意一项的方法制备的小牛血去蛋白提取物，0.5～1.5％的羧甲基纤维素钠，2～10％的甘油、0.04～0.1％的尼泊金乙酯。
本发明提供的方法及其产品的优点是(1)本方法是从红细胞中提取活性成份，同等条件下比从血清中提取活性成份的生物活性高56倍；其中呼吸活力(QO2)为6.30μl·O2/mg·h，刺激指数(SI)为5.40，同进口的素高捷疗眼膏成分一致，具有相同的药效作用和生物活性。动物药效学实验表明，本发明的眼膏对各种病因引起的角膜溃疡、术后修复有显著疗效，且用药安全，无任何刺激性。
(2)牛血中可能存在病毒，潜在的病毒会对人体造成或多或少的伤害，本方法采用巴氏消毒连同膜过滤的方法灭活牛血中常见的病毒。离心后的上清液先进行巴氏消毒，再经超滤、纳滤和反渗透等膜过滤方法，进一步保证牛血中的病毒灭活方法的完整性和有效性。本方法中病毒灭活方法验证的结果表明加入指示病毒(牛腹泻病毒)作阳性对照，经巴氏消毒、超滤、纳滤和反渗透方法处理后，结果呈阴性，可以有效地去除和灭活指示病毒。
(3)本方法超滤过程中先采用截留分子量为5～10万道尔顿的滤膜超滤，滤去大分子量蛋白质，避免第二步超滤时堵膜；再采用截留分子量为0.5～1.5万道尔顿的滤膜超滤，得到的小牛血去蛋白提取物的分子量小于1.5万道尔顿，既最大限度地保留了生物活性成份，又避免了大分子量抗原的免疫反应。
(4)本方法中采用对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺纳滤膜对中间体进行纳滤脱盐，脱去小牛血去蛋白提取物中的部分生理盐，使眼膏的渗透压控制在人眼的耐受范围内。与传统的电渗析脱盐方法相比较，电渗析脱盐损失有效成分多达29％，而本方法只损失6％的有效成分，最大限度地保留了有效成分。
(5)本方法中采用对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺反渗透膜进行浓缩，只有水和少量离子能通过，有效成分几乎被截留，无明显损失，浓缩倍数可高达60～100倍，作用时间短，方便快捷，有效成份的生物活性无明显损失。
(6)本方法中采用医用活性炭进行脱色。医用活性炭颗粒小，比表面积大，有效吸附本品中的杂质色素，使原料液在贮存过程中保持性质稳定。而且对有效成分的吸附较小，最大限度地保留了有效成分的生物活性。
(7)小牛血去蛋白提取物眼膏采用水凝胶型基质，维持药物的稳定性，使药物与眼球充分结合、缓慢释放、作用持久，且使用方便，用药安全，无局部刺激性。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1小牛血去蛋白提取物的制备(1)制备红细胞取不锈钢桶，预先加入3.8％的枸缘酸钠10L作为抗凝剂，无菌条件下采集1～6个月大的新鲜小牛血液100L，缓慢搅拌，以防血液凝固。采集后的血液以3000转/分钟离心20分钟，轻轻倒去上清。加入等量的生理盐水，混匀，3000转/分钟离心15分钟，弃上清，同法洗涤3次，收集沉淀的红细胞40L。
(2)破碎红细胞按1∶5加入去离子水200L到红细胞中，搅拌均匀，置于-20℃冰箱速冻过夜。次日取出，于40℃水浴中快速升温融解，破坏红细胞膜，释放内容物，共得溶液240L。
(3)去除大分子量蛋白质于14000转/分钟离心30分钟，去除部分大分子量蛋白质，收集上清液，约235L。
(4)巴氏消毒在无菌条件下，将上述上清液保存在60℃条件下恒温加热10小时，进行巴氏消毒。
(5)超滤在无菌条件下，将巴氏消毒后的溶液先用截留分子量为10万道尔顿的滤膜超滤5小时，滤出液再用截留分子量为0.8万道尔顿的滤膜超滤6小时，收集滤出液，得淡黄色澄清溶液190L，即为小牛血去蛋白提取物中间体。
(6)纳滤脱盐用对一价阳离子截留率达88％的芳香聚酰胺纳滤膜对中间体溶液进行纳滤脱盐，循环7.5小时，得脱盐后溶液101L。
(7)反渗透浓缩用对一价阳离子截留率达98％芳香聚酰胺反渗透膜对纳滤脱盐后的溶液进行反渗透浓缩，循环12小时，得小牛血去蛋白提取物浓缩液20L。
(8)将上述浓缩液用医用活性炭进行脱色，活性炭的脱色浓度为8g/L，在温度为105℃条件下，脱色40分钟。过滤去除医用活性炭，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物，体积为19L。整个制备方法过程中有效成分浓缩了12.6倍。
实施例2小牛血去蛋白提取物眼膏的制备(1)按表1所示的配方准备原料；表1、原料配方
(2)配制眼膏基质取10L的容器，称取甘油250g，加入羧甲基纤维素钠60g，用玻棒搅拌，分散均匀，加入尼泊金乙酯5g，加入去离子水约3000g，搅拌均匀，置于高压灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，取出，冷却，备用。
(3)加入原料无菌条件下向基质中加入小牛血去蛋白提取物1500g，再加去离子水至总重为5000g，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，分装至铝管中，5g/支，共得978支小牛血去蛋白提取物眼膏。
实施例3小牛血去蛋白提取物眼膏的生物活性和质量研究(1)生物活性测定本品为细胞呼吸激活剂，能促进细胞对氧的摄取和利用。通过WARBURG微量呼吸检压仪测定其在豚鼠肝细胞中促进细胞呼吸的活力，由耗氧增加量计算其生物活性。测定小牛血去蛋白提取物眼膏三批样品的生物活性，结果见表2。
表2、小牛血去蛋白提取物眼膏的生物活性检测结果
(2)质量研究本品与素高捷疗眼膏的质量数据比较结果见表3。
表3、小牛血去蛋白提取物眼膏(批号为20011107)与素高捷疗眼膏(批号为869703)的质量数据比较
实施例4小牛血去蛋白提取物眼膏的药效学实验治疗外伤性角膜炎实验选用健康家兔24只，体重2.5-3.4kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组(局部滴用眼膏的空白基质)、Solcoseryl组(局部滴用Solcoseryl)和小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组(分别局部滴用小牛血去蛋白提取物眼膏临床用浓度和1/2浓度)。各家兔实验前一日，双眼用0.5％的卡因局部麻醉后，用手术刀均匀刮除角膜上皮后滴0.25％氯霉素眼液，每日二次。实验当日，各家兔双眼均滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤面积，若有遗漏应补充，以达整个角膜100％损伤。然后根据不同组别和剂量进行给药(同时每日滴0.25％氯霉素滴眼液防止感染)。每日用药4次，连续5天。每日应滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤的愈合情况，随时记录。末次给药后取双眼角膜送病理学检查，以观察角膜上皮修复情况。结果进行统计学处理后列于表4。
家兔角膜上皮损伤范围(1)0无上皮损伤(即不着色)；1+角膜上皮损伤在25％以内；2+角膜上皮损伤在26％-50％之间；3+角膜上皮损伤在51％-75％之间；4+角膜上皮缺损大于75％。
表4、小牛血去蛋白提取物眼膏对家兔外伤性角膜炎的影响
表4结果提示给药后第一天，模型对照组角膜损伤面积在70-80％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在50-60％作用；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在40-50％和60-70％左右；给药后第二天，模型对照组角膜损伤面积在65-75％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在40-50％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在30％和50-60％左右；其中小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组13号右眼愈合；给药后第三天，模型对照组角膜损伤面积在55-70％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在30-40％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在20％和40-55％左右；其中小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组又有16号右眼愈合；给药后第四天，模型对照组角膜损伤面积在50-60％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积小于25％；小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组的角膜损伤基本愈合；小牛血去蛋白提取物眼膏低剂量组角膜损伤面积在40％左右。
治疗病毒性角膜炎实验选用健康家兔24只，体重2.5-3.4kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组(局部滴用眼膏的空白基质)、Solcoseryl组(局部滴用Solcoseryl)和小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组(分别局部滴用小牛血去蛋白提取物眼膏临床用浓度和1/2浓度)。各家兔实验前一日，双眼用0.5％的卡因局部麻醉后，用手术刀均匀刮除角膜上皮后滴单纯疱疹I型病毒(HSV-I)两滴。实验当日，各家兔双眼均滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤面积，若有遗漏应补充，以达整个角膜100％损伤。然后根据不同组别和剂量进行给药(同时每日滴0.25％氯霉素滴眼液防止感染)。每日用药4次，连续5天。每日应滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤的愈合情况，随时记录。末次给药后取双眼角膜送病理学检查，以观察角膜上皮修复情况。结果进行统计学处理后列于表5。(家兔角膜上皮损伤范围平分同上)。
表5、小牛血去蛋白提取物眼膏对家兔病毒性角膜炎的影响
表5结果提示给药后第一天，模型对照组角膜损伤面积在90％以上；Solcoseryl组角膜损伤面积在70-80％作用；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在65-75％和70-80％左右；给药后第二天，模型对照组角膜损伤面积在80％以上；Solcoseryl组角膜损伤面积在60-70％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在50-60％和60-70％左右；给药后第三天，模型对照组角膜损伤面积在65-80％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在50-60％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在30-40％和60-65％左右；给药后第四天，模型对照组角膜损伤面积在70％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积小于40-50％；小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组的角膜损伤面积在30％以下(有个别愈合)；小牛血去蛋白提取物眼膏低剂量组角膜损伤面积在50％以上。
药效学实验结果小牛血去蛋白提取物眼膏给家兔外伤性角膜炎和病毒性角膜炎滴眼，有明显促进角膜上皮愈合作用，与模型对照组比较有显著性差异，其作用优于阳性对照药(素高捷疗眼膏)，在促进外伤性角膜炎上皮愈合的时间上，有提前愈合的趋势；从促进角膜上皮愈合的疗效看，对外伤性角膜炎的作用强于病毒性角膜炎。
小牛血去蛋白提取物眼膏的临床适应症应为治疗各种病因引起的角膜炎和角膜溃疡，促进角膜上皮愈合和组织修复。
实施例5小牛血去蛋白提取物眼膏的安全性实验小牛血去蛋白提取物病毒灭活方法验证小牛血去蛋白提取物中间体经过巴氏消毒和超滤、纳滤、反渗透等膜过滤方法处理后，应不含大分子量物质(包括病毒和大分子抗原)。为检测巴氏消毒和膜过滤等方法对病毒的灭活效果，以牛腹泻病毒为指示病毒，加到巴氏消毒前的样品中。含指示病毒的样品经60℃条件下加热10小时，再经截留分子量为8000道尔顿的超滤膜超滤，接着用对一价阳离子截留率达88％的芳香聚酰胺纳滤膜纳滤脱盐，最后用对一价阳离子截留率达98％芳香聚酰胺反渗透膜反渗透浓缩，收集最终样品进行病毒检测，结果为阴性，不含牛腹泻病毒。具体方法如下1.材料和设备1.1牛肾原代细胞用新鲜健康的新生牛肾制备的原代细胞。
1.2阳性对照牛腹泻病毒(BA)株，由中国兽药监察所购进。作为指示病毒加到小牛血样品中，作为阳性对照。
1.3其它材料小牛血去蛋白提取物中间体，显微镜等有关实验用品。
2.实验方法2.1细胞株敏感性测定牛肾细胞长满单层按1∶2传代，将细胞接种到96孔板上，培养细胞浓度为104个/ml，每孔0.1ml，37℃ 1～2小时后，牛腹泻病毒稀释10-1～10-6，分别接种到经上述培养的细胞板中，每孔0.1ml，设立阴性对照，72～96小时镜下观察结果。
2.2直接病变法将经敏感性测定的细胞代次细胞接种到96孔培养板，细胞浓度为104个/ml，每孔0.1ml，37℃ 1～2小时后分别加入等量的待检样品(小牛血去蛋白提取物中间体)。同时接种含指示病毒(牛腹泻病毒)的小牛血去蛋白提取物样品的稀释液至经上述培养的细胞中，每孔0.1ml，为阳性对照。设立阴性对照。72～96小时镜下观察细胞病变结果。
3.结果判定细胞感染病毒后出现病变反应，故而细胞出现不同程度的脱落。上述实验结果用5％的结晶紫染色液染色后判定结果，染色方法按常规。
4结果含指示病毒的小牛血去蛋白提取物样品呈阳性，待检样品(小牛血去蛋白提取物)呈阴性。因此，对于小牛血去蛋白提取物而言，先经巴氏消毒，再用超滤、纳滤、反渗透等膜过滤方法处理，四种方法联合使用可以有效地去除和灭活指示病毒。
实施例6小牛血去蛋白提取物眼膏的安全性实验本实验观察了小牛血去蛋白提取物眼膏(临床用药浓度)对家兔眼的刺激性实验。具体方法如下健康家兔4只(体重2-3kg)，雌雄不限，1次/天，连续一周右眼结囊内滴入受试物(小牛血去蛋白提取物眼膏)0.1g，左眼滴入小牛血去蛋白提取物眼膏的空白基质0.1g，做对照，给药后闭合眼睛8min。记录1至14天内眼的局部反应情况。眼刺激反应评分见表6。
表6、眼刺激反应评分眼刺激反应分值角膜混浊(以最致密部位为准)
无混浊 0散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1半透明区易分辨，虹膜模糊不清2出现灰白色透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清3角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认 4虹膜正常0皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应1出血，肉眼可见坏死，对光无反应(或出现其中一种反应) 2结膜充血(指睑结膜、球结膜部位)血管正常0血管充血呈鲜红色1血管充血呈深红色，血管不易分辨 2弥漫性充血呈紫红色 3水肿无水肿 0轻微水肿(包括瞬膜) 1明显水肿，伴有部分眼睑外翻 2水肿至眼睑近半闭合 3水肿至眼睑超半闭合 4分泌物无分泌物0本实验观察了小牛血去蛋白提取物眼膏(临床用药浓度)对家兔眼的刺激性。结果表明，小牛血去蛋白提取物眼膏连续给药7天，未见对家兔眼有刺激性反应，4只家兔给药后均无异常反应，本眼膏用药安全。
权利要求
1.一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，它包括下述步骤(1)采集小牛血液，离心得红细胞；(2)加水、冻溶，破坏红细胞膜，释放出内容物；(3)离心，得到去除部分大分子量蛋白质的上清液；(4)对上清液进行巴氏消毒，灭活牛血中的病毒；(5)超滤，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物中间体；(6)纳滤脱盐；(7)反渗透浓缩；(8)医用活性炭脱色，得小牛血去蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的离心为2000～4000转/分钟，10～20分钟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的加水的量为红细胞体积的2～6倍，所述的冻溶的温度为-20～-10℃，冻溶的时间为20～30小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心为10000～15000转/分钟，20～30分钟。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的巴氏消毒是，在无菌条件下，将上清液在50～70℃恒温加热6～15小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的超滤分两步第一步超滤使用的滤膜的截留分子量为5～10万道尔顿，第二步超滤使用的滤膜的截留分子量为0.5～1.5万道尔顿。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的纳滤使用的膜为对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺膜。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述的反渗透浓缩使用的膜为对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺膜。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中所述的活性炭脱色条件为，脱色浓度为5～10g/L，脱色温度90～110℃，脱色时间为10～60分钟。
10.一种含有小牛血去蛋白提取物的眼膏，其特征在于，其制备原料包括下述重量百分比的原料10～40％的权利要求1-9中任意一项的方法制备的小牛血去蛋白提取物，0.5～1.5％的羧甲基纤维素钠，2～10％的甘油、0.04～0.1％的尼泊金乙酯。
全文摘要
本发明公开了小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法。小牛血去蛋白提取物的制备方法包括采集小牛血液，分离出红细胞，加水溶涨，破坏红细胞膜释放内容物，巴氏消毒，超滤浓缩，得到小牛血去蛋白提取物中间体；再经纳滤脱盐，反渗透浓缩，活性炭脱色，得到小牛血去蛋白提取物；加入适量的赋性剂，稳定剂，即得小牛血去蛋白提取物眼膏。本制备方法采用超滤、纳滤和反渗透等先进的生物纯化技术，可以减少有效成分的损失，最大限度地保留其生物活性。本品眼膏可以有效地治疗各种病因所致的角膜炎、角膜溃疡、角膜和结膜变质性变化等眼部疾病，促进组织的复原和再生。
文档编号A61K9/06GK1586499SQ20041006265
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年7月8日
发明者杨中强, 张国辉, 李兆羿 申请人:合肥兆峰科大药业有限公司
技术领域：
本发明涉及动物血液制品领域，更具体的说，涉及小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法。
背景技术：
从小牛血液中提取的“小牛血去蛋白提取物”(protein-free calf bloodextract)是一种小分子的生物活性物质，含小分子多肽、氨基酸、核苷酸、酮酸等物质。其主要药理作用是增强细胞对氧和葡萄糖的摄取、利用，促进ATP的合成，促进营养物质的运送，促进组织的复原和再生。可用于治疗脑代谢紊乱和脑供血不全的病人，也可广泛用于治疗各种病因引起的角膜溃疡、皮肤溃疡和损伤、褥疮以及整容、整形和矫形等外科手术后的修复和再生，具有非常广泛的临床用途。
瑞士素高(Solco)公司的素高捷疗系列产品(眼膏、软膏、口腔膏和注射液)及奥地利的爱维治注射液均已从八十年代中期开始进口我国，在临床上广泛应用，在大部分地区被列入公费医疗的品种。目前，国内有几家在生产小牛血去蛋白提取物注射液，但是尚无厂家生产小牛血去蛋白提取物眼膏。况且，受欧洲疯牛病的影响，我国已限制进口牛源性药品，目前市场上很难买到牛源性进口产品(包括素高捷疗眼膏)。
我国有丰富的自然资源，牛血原料来源广泛，未受疯牛病影响，研制小牛血去蛋白提取物及其眼膏可以利用国内资源，替代进口，节约外汇，同时提高国内厂家生化药物及制剂的研究能力和国际竞争力，具有广泛而深远的意义。
发明内容
本发明提供了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，它包括下述步骤(1)采集小牛血液，离心得红细胞；(2)加水、冻溶，破坏红细胞膜，释放出内容物；(3)离心，得到去除部分大分子量蛋白质的上清液；(4)对上清液进行巴氏消毒，灭活牛血中的病毒；(5)超滤，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物中间体；(6)纳滤脱盐；(7)反渗透浓缩；(8)医用活性炭脱色，得小牛血去蛋白提取物。
在上述的制备方法中，在上述的制备方法中，步骤(1)中所述的小牛优选为1～6月大的经检疫合格的健康奶牛，所述的离心优选为2000～4000转/分钟，10～20分钟。
在上述的制备方法中，步骤(2)中所述的加水的优选量为红细胞体积的2～6倍，所述的冻溶的温度优选为-20～-10℃，冻溶的时间优选为20～30小时。
在上述的制备方法中，步骤(3)中所述的离心优选为10000～15000转/分钟，20～30分钟。
在上述的制备方法中，步骤(4)中所述的巴氏消毒优选是，在无菌条件下，将上清液在50～70℃恒温加热6～15小时。
在上述的制备方法中，步骤(5)中所述的超滤优选分两步第一步超滤使用的滤膜的截留分子量为5～10万道尔顿，第二步超滤使用的滤膜的截留分子量为0.5～1.5万道尔顿。
在上述的制备方法中，步骤(6)中所述的纳滤使用的膜优选为对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺膜。
在上述的制备方法中，步骤(7)所述的反渗透浓缩使用的膜优选为对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺膜。
在上述的制备方法中，步骤(8)中所述的活性炭脱色条件优选为，脱色浓度为5～10g/L，脱色温度90～110℃，脱色时间为10～60分钟。
本发明还提供了一种含有小牛血去蛋白提取物的眼膏，其制备原料包括下述重量百分比的原料10～40％的权利要求1-9中任意一项的方法制备的小牛血去蛋白提取物，0.5～1.5％的羧甲基纤维素钠，2～10％的甘油、0.04～0.1％的尼泊金乙酯。
本发明提供的方法及其产品的优点是(1)本方法是从红细胞中提取活性成份，同等条件下比从血清中提取活性成份的生物活性高56倍；其中呼吸活力(QO2)为6.30μl·O2/mg·h，刺激指数(SI)为5.40，同进口的素高捷疗眼膏成分一致，具有相同的药效作用和生物活性。动物药效学实验表明，本发明的眼膏对各种病因引起的角膜溃疡、术后修复有显著疗效，且用药安全，无任何刺激性。
(2)牛血中可能存在病毒，潜在的病毒会对人体造成或多或少的伤害，本方法采用巴氏消毒连同膜过滤的方法灭活牛血中常见的病毒。离心后的上清液先进行巴氏消毒，再经超滤、纳滤和反渗透等膜过滤方法，进一步保证牛血中的病毒灭活方法的完整性和有效性。本方法中病毒灭活方法验证的结果表明加入指示病毒(牛腹泻病毒)作阳性对照，经巴氏消毒、超滤、纳滤和反渗透方法处理后，结果呈阴性，可以有效地去除和灭活指示病毒。
(3)本方法超滤过程中先采用截留分子量为5～10万道尔顿的滤膜超滤，滤去大分子量蛋白质，避免第二步超滤时堵膜；再采用截留分子量为0.5～1.5万道尔顿的滤膜超滤，得到的小牛血去蛋白提取物的分子量小于1.5万道尔顿，既最大限度地保留了生物活性成份，又避免了大分子量抗原的免疫反应。
(4)本方法中采用对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺纳滤膜对中间体进行纳滤脱盐，脱去小牛血去蛋白提取物中的部分生理盐，使眼膏的渗透压控制在人眼的耐受范围内。与传统的电渗析脱盐方法相比较，电渗析脱盐损失有效成分多达29％，而本方法只损失6％的有效成分，最大限度地保留了有效成分。
(5)本方法中采用对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺反渗透膜进行浓缩，只有水和少量离子能通过，有效成分几乎被截留，无明显损失，浓缩倍数可高达60～100倍，作用时间短，方便快捷，有效成份的生物活性无明显损失。
(6)本方法中采用医用活性炭进行脱色。医用活性炭颗粒小，比表面积大，有效吸附本品中的杂质色素，使原料液在贮存过程中保持性质稳定。而且对有效成分的吸附较小，最大限度地保留了有效成分的生物活性。
(7)小牛血去蛋白提取物眼膏采用水凝胶型基质，维持药物的稳定性，使药物与眼球充分结合、缓慢释放、作用持久，且使用方便，用药安全，无局部刺激性。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1小牛血去蛋白提取物的制备(1)制备红细胞取不锈钢桶，预先加入3.8％的枸缘酸钠10L作为抗凝剂，无菌条件下采集1～6个月大的新鲜小牛血液100L，缓慢搅拌，以防血液凝固。采集后的血液以3000转/分钟离心20分钟，轻轻倒去上清。加入等量的生理盐水，混匀，3000转/分钟离心15分钟，弃上清，同法洗涤3次，收集沉淀的红细胞40L。
(2)破碎红细胞按1∶5加入去离子水200L到红细胞中，搅拌均匀，置于-20℃冰箱速冻过夜。次日取出，于40℃水浴中快速升温融解，破坏红细胞膜，释放内容物，共得溶液240L。
(3)去除大分子量蛋白质于14000转/分钟离心30分钟，去除部分大分子量蛋白质，收集上清液，约235L。
(4)巴氏消毒在无菌条件下，将上述上清液保存在60℃条件下恒温加热10小时，进行巴氏消毒。
(5)超滤在无菌条件下，将巴氏消毒后的溶液先用截留分子量为10万道尔顿的滤膜超滤5小时，滤出液再用截留分子量为0.8万道尔顿的滤膜超滤6小时，收集滤出液，得淡黄色澄清溶液190L，即为小牛血去蛋白提取物中间体。
(6)纳滤脱盐用对一价阳离子截留率达88％的芳香聚酰胺纳滤膜对中间体溶液进行纳滤脱盐，循环7.5小时，得脱盐后溶液101L。
(7)反渗透浓缩用对一价阳离子截留率达98％芳香聚酰胺反渗透膜对纳滤脱盐后的溶液进行反渗透浓缩，循环12小时，得小牛血去蛋白提取物浓缩液20L。
(8)将上述浓缩液用医用活性炭进行脱色，活性炭的脱色浓度为8g/L，在温度为105℃条件下，脱色40分钟。过滤去除医用活性炭，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物，体积为19L。整个制备方法过程中有效成分浓缩了12.6倍。
实施例2小牛血去蛋白提取物眼膏的制备(1)按表1所示的配方准备原料；表1、原料配方
(2)配制眼膏基质取10L的容器，称取甘油250g，加入羧甲基纤维素钠60g，用玻棒搅拌，分散均匀，加入尼泊金乙酯5g，加入去离子水约3000g，搅拌均匀，置于高压灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，取出，冷却，备用。
(3)加入原料无菌条件下向基质中加入小牛血去蛋白提取物1500g，再加去离子水至总重为5000g，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，分装至铝管中，5g/支，共得978支小牛血去蛋白提取物眼膏。
实施例3小牛血去蛋白提取物眼膏的生物活性和质量研究(1)生物活性测定本品为细胞呼吸激活剂，能促进细胞对氧的摄取和利用。通过WARBURG微量呼吸检压仪测定其在豚鼠肝细胞中促进细胞呼吸的活力，由耗氧增加量计算其生物活性。测定小牛血去蛋白提取物眼膏三批样品的生物活性，结果见表2。
表2、小牛血去蛋白提取物眼膏的生物活性检测结果
(2)质量研究本品与素高捷疗眼膏的质量数据比较结果见表3。
表3、小牛血去蛋白提取物眼膏(批号为20011107)与素高捷疗眼膏(批号为869703)的质量数据比较
实施例4小牛血去蛋白提取物眼膏的药效学实验治疗外伤性角膜炎实验选用健康家兔24只，体重2.5-3.4kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组(局部滴用眼膏的空白基质)、Solcoseryl组(局部滴用Solcoseryl)和小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组(分别局部滴用小牛血去蛋白提取物眼膏临床用浓度和1/2浓度)。各家兔实验前一日，双眼用0.5％的卡因局部麻醉后，用手术刀均匀刮除角膜上皮后滴0.25％氯霉素眼液，每日二次。实验当日，各家兔双眼均滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤面积，若有遗漏应补充，以达整个角膜100％损伤。然后根据不同组别和剂量进行给药(同时每日滴0.25％氯霉素滴眼液防止感染)。每日用药4次，连续5天。每日应滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤的愈合情况，随时记录。末次给药后取双眼角膜送病理学检查，以观察角膜上皮修复情况。结果进行统计学处理后列于表4。
家兔角膜上皮损伤范围(1)0无上皮损伤(即不着色)；1+角膜上皮损伤在25％以内；2+角膜上皮损伤在26％-50％之间；3+角膜上皮损伤在51％-75％之间；4+角膜上皮缺损大于75％。
表4、小牛血去蛋白提取物眼膏对家兔外伤性角膜炎的影响
表4结果提示给药后第一天，模型对照组角膜损伤面积在70-80％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在50-60％作用；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在40-50％和60-70％左右；给药后第二天，模型对照组角膜损伤面积在65-75％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在40-50％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在30％和50-60％左右；其中小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组13号右眼愈合；给药后第三天，模型对照组角膜损伤面积在55-70％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在30-40％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在20％和40-55％左右；其中小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组又有16号右眼愈合；给药后第四天，模型对照组角膜损伤面积在50-60％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积小于25％；小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组的角膜损伤基本愈合；小牛血去蛋白提取物眼膏低剂量组角膜损伤面积在40％左右。
治疗病毒性角膜炎实验选用健康家兔24只，体重2.5-3.4kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组(局部滴用眼膏的空白基质)、Solcoseryl组(局部滴用Solcoseryl)和小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组(分别局部滴用小牛血去蛋白提取物眼膏临床用浓度和1/2浓度)。各家兔实验前一日，双眼用0.5％的卡因局部麻醉后，用手术刀均匀刮除角膜上皮后滴单纯疱疹I型病毒(HSV-I)两滴。实验当日，各家兔双眼均滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤面积，若有遗漏应补充，以达整个角膜100％损伤。然后根据不同组别和剂量进行给药(同时每日滴0.25％氯霉素滴眼液防止感染)。每日用药4次，连续5天。每日应滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤的愈合情况，随时记录。末次给药后取双眼角膜送病理学检查，以观察角膜上皮修复情况。结果进行统计学处理后列于表5。(家兔角膜上皮损伤范围平分同上)。
表5、小牛血去蛋白提取物眼膏对家兔病毒性角膜炎的影响
表5结果提示给药后第一天，模型对照组角膜损伤面积在90％以上；Solcoseryl组角膜损伤面积在70-80％作用；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在65-75％和70-80％左右；给药后第二天，模型对照组角膜损伤面积在80％以上；Solcoseryl组角膜损伤面积在60-70％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在50-60％和60-70％左右；给药后第三天，模型对照组角膜损伤面积在65-80％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在50-60％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在30-40％和60-65％左右；给药后第四天，模型对照组角膜损伤面积在70％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积小于40-50％；小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组的角膜损伤面积在30％以下(有个别愈合)；小牛血去蛋白提取物眼膏低剂量组角膜损伤面积在50％以上。
药效学实验结果小牛血去蛋白提取物眼膏给家兔外伤性角膜炎和病毒性角膜炎滴眼，有明显促进角膜上皮愈合作用，与模型对照组比较有显著性差异，其作用优于阳性对照药(素高捷疗眼膏)，在促进外伤性角膜炎上皮愈合的时间上，有提前愈合的趋势；从促进角膜上皮愈合的疗效看，对外伤性角膜炎的作用强于病毒性角膜炎。
小牛血去蛋白提取物眼膏的临床适应症应为治疗各种病因引起的角膜炎和角膜溃疡，促进角膜上皮愈合和组织修复。
实施例5小牛血去蛋白提取物眼膏的安全性实验小牛血去蛋白提取物病毒灭活方法验证小牛血去蛋白提取物中间体经过巴氏消毒和超滤、纳滤、反渗透等膜过滤方法处理后，应不含大分子量物质(包括病毒和大分子抗原)。为检测巴氏消毒和膜过滤等方法对病毒的灭活效果，以牛腹泻病毒为指示病毒，加到巴氏消毒前的样品中。含指示病毒的样品经60℃条件下加热10小时，再经截留分子量为8000道尔顿的超滤膜超滤，接着用对一价阳离子截留率达88％的芳香聚酰胺纳滤膜纳滤脱盐，最后用对一价阳离子截留率达98％芳香聚酰胺反渗透膜反渗透浓缩，收集最终样品进行病毒检测，结果为阴性，不含牛腹泻病毒。具体方法如下1.材料和设备1.1牛肾原代细胞用新鲜健康的新生牛肾制备的原代细胞。
1.2阳性对照牛腹泻病毒(BA)株，由中国兽药监察所购进。作为指示病毒加到小牛血样品中，作为阳性对照。
1.3其它材料小牛血去蛋白提取物中间体，显微镜等有关实验用品。
2.实验方法2.1细胞株敏感性测定牛肾细胞长满单层按1∶2传代，将细胞接种到96孔板上，培养细胞浓度为104个/ml，每孔0.1ml，37℃ 1～2小时后，牛腹泻病毒稀释10-1～10-6，分别接种到经上述培养的细胞板中，每孔0.1ml，设立阴性对照，72～96小时镜下观察结果。
2.2直接病变法将经敏感性测定的细胞代次细胞接种到96孔培养板，细胞浓度为104个/ml，每孔0.1ml，37℃ 1～2小时后分别加入等量的待检样品(小牛血去蛋白提取物中间体)。同时接种含指示病毒(牛腹泻病毒)的小牛血去蛋白提取物样品的稀释液至经上述培养的细胞中，每孔0.1ml，为阳性对照。设立阴性对照。72～96小时镜下观察细胞病变结果。
3.结果判定细胞感染病毒后出现病变反应，故而细胞出现不同程度的脱落。上述实验结果用5％的结晶紫染色液染色后判定结果，染色方法按常规。
4结果含指示病毒的小牛血去蛋白提取物样品呈阳性，待检样品(小牛血去蛋白提取物)呈阴性。因此，对于小牛血去蛋白提取物而言，先经巴氏消毒，再用超滤、纳滤、反渗透等膜过滤方法处理，四种方法联合使用可以有效地去除和灭活指示病毒。
实施例6小牛血去蛋白提取物眼膏的安全性实验本实验观察了小牛血去蛋白提取物眼膏(临床用药浓度)对家兔眼的刺激性实验。具体方法如下健康家兔4只(体重2-3kg)，雌雄不限，1次/天，连续一周右眼结囊内滴入受试物(小牛血去蛋白提取物眼膏)0.1g，左眼滴入小牛血去蛋白提取物眼膏的空白基质0.1g，做对照，给药后闭合眼睛8min。记录1至14天内眼的局部反应情况。眼刺激反应评分见表6。
表6、眼刺激反应评分眼刺激反应分值角膜混浊(以最致密部位为准)
无混浊 0散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1半透明区易分辨，虹膜模糊不清2出现灰白色透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清3角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认 4虹膜正常0皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应1出血，肉眼可见坏死，对光无反应(或出现其中一种反应) 2结膜充血(指睑结膜、球结膜部位)血管正常0血管充血呈鲜红色1血管充血呈深红色，血管不易分辨 2弥漫性充血呈紫红色 3水肿无水肿 0轻微水肿(包括瞬膜) 1明显水肿，伴有部分眼睑外翻 2水肿至眼睑近半闭合 3水肿至眼睑超半闭合 4分泌物无分泌物0本实验观察了小牛血去蛋白提取物眼膏(临床用药浓度)对家兔眼的刺激性。结果表明，小牛血去蛋白提取物眼膏连续给药7天，未见对家兔眼有刺激性反应，4只家兔给药后均无异常反应，本眼膏用药安全。
权利要求
1.一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，它包括下述步骤(1)采集小牛血液，离心得红细胞；(2)加水、冻溶，破坏红细胞膜，释放出内容物；(3)离心，得到去除部分大分子量蛋白质的上清液；(4)对上清液进行巴氏消毒，灭活牛血中的病毒；(5)超滤，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物中间体；(6)纳滤脱盐；(7)反渗透浓缩；(8)医用活性炭脱色，得小牛血去蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的离心为2000～4000转/分钟，10～20分钟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的加水的量为红细胞体积的2～6倍，所述的冻溶的温度为-20～-10℃，冻溶的时间为20～30小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心为10000～15000转/分钟，20～30分钟。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的巴氏消毒是，在无菌条件下，将上清液在50～70℃恒温加热6～15小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的超滤分两步第一步超滤使用的滤膜的截留分子量为5～10万道尔顿，第二步超滤使用的滤膜的截留分子量为0.5～1.5万道尔顿。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的纳滤使用的膜为对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺膜。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述的反渗透浓缩使用的膜为对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺膜。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中所述的活性炭脱色条件为，脱色浓度为5～10g/L，脱色温度90～110℃，脱色时间为10～60分钟。
10.一种含有小牛血去蛋白提取物的眼膏，其特征在于，其制备原料包括下述重量百分比的原料10～40％的权利要求1-9中任意一项的方法制备的小牛血去蛋白提取物，0.5～1.5％的羧甲基纤维素钠，2～10％的甘油、0.04～0.1％的尼泊金乙酯。
全文摘要
本发明公开了小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法。小牛血去蛋白提取物的制备方法包括采集小牛血液，分离出红细胞，加水溶涨，破坏红细胞膜释放内容物，巴氏消毒，超滤浓缩，得到小牛血去蛋白提取物中间体；再经纳滤脱盐，反渗透浓缩，活性炭脱色，得到小牛血去蛋白提取物；加入适量的赋性剂，稳定剂，即得小牛血去蛋白提取物眼膏。本制备方法采用超滤、纳滤和反渗透等先进的生物纯化技术，可以减少有效成分的损失，最大限度地保留其生物活性。本品眼膏可以有效地治疗各种病因所致的角膜炎、角膜溃疡、角膜和结膜变质性变化等眼部疾病，促进组织的复原和再生。
文档编号A61K9/06GK1586499SQ20041006265
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年7月8日
发明者杨中强, 张国辉, 李兆羿 申请人:合肥兆峰科大药业有限公司
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