一种具有治疗肝病功能的组合物及其制备方法
专利名称：一种具有治疗肝病功能的组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及药用组合物领域，更具体的说，涉及一种具有治疗肝病功能的组合物及其制备方法。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染性肝病。全世界已有20多亿人口被感染，约3.5亿人成为慢性HBV感染者。慢性携带者易于发生肝硬化与肝癌，全世界每年有100余万患者死于肝病，其中1/3在中国。另外，HBV携带者的母亲可以通过垂直传播给婴儿，婴儿时期感染HBV者，90％以上受染成为慢性HBsAg携带者，影响下一代的健康，危害极大。
1989年，李求是博士受中国科协委托承担“新型免疫调节剂研制”的课题，根据天人合一的思想和拟态理论，参考了大量中医药古籍及现代医药学文献，在神经-内分泌-免疫网络理论指导下，运用现代免疫药理学筛选方法，寻找兼具保肝、抗炎、抗乙型肝炎病毒和免疫调节活性的药物。研究结果证明，Y与L经过适当工艺处理，并合理配比，临床效果满意，终形成本发明。
发明内容
本发明提供了一种组合物，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。
本发明还提供了上述组合物的制备方法，它包括下述步骤(1)选取合格的药材Y和L，压碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，将其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，将其制成干粉II；(4)将干粉I与干粉II混合均匀，按照常规工艺制成药物制剂。
在上述的组合物的制备方法中，步骤(2)中的Y粉与步骤(3)中的L粉的重量比范围优选为1∶10～10∶1。
本发明还提供了上述组合物在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为慢性乙型肝炎、脂肪肝或肝硬化。
本发明还提供了Y和L在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为慢性乙型肝炎、脂肪肝或肝硬化。
本发明的组合物的功能主治为清热解毒，化湿利肝，保肝降酶，抑制乙肝病毒。用于治疗慢性乙型肝炎，热毒内蕴，湿浊互阻者。
本发明的组合物中Y性甘寒、无毒、归肺、胃、心经，具有清热解毒，凉散风热作用。Y含绿原酸及异绿原酸，它有广泛的抗微生物作用，对多种细菌、病毒有抑制作用，同时又具有加强防卫机能的功效，Y的煎剂稀释至1∶1280，仍能促进白细胞的吞唾功能，近代研究表明，Y对免疫系统有调节作用。L性甘寒、无毒、归心、胃经，它具有清热解毒作用。L中含有多糖，多糖具有抗炎、增强免疫、护肝等作用，所以绿原酸及L多糖为本发明的组合物中的活性成分。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是这些实施例不以任何方式限制本实施例1 提取工艺药材的粉碎Y(药材应检验合格)称量后经80℃烘烤1h，乘热压碎成粗粉，得率约95％。L(药材应检验合格)用碾压机压碎成粗粉，筛去100目以下的细粉，得率约95％。
Y粗粉，加10倍量75％乙醇，浸泡20min，回流2h，滤过，沥干，得醇提液I与药渣，药渣加8倍75％乙醇，回流0.5h，滤过，沥干，得醇提液II与药渣，弃药渣合并醇提液I、II，减压回收乙醇成相对密度约为1.08(70℃)的浓液，过滤，喷雾干燥，得干粉I(Y提取物)。
L粗粉，加水10倍，搅拌15min，室温浸泡3h，吸取上清液，将清液在60℃下减压浓缩成相对密度约为1.02～1.03(60℃)的浓液，过滤，喷雾干燥，得干粉II(L提取物)。
将干粉I与干粉II混合均匀，干法制粒(过10目筛)，颗粒装胶囊(0号空心胶囊)，铝塑包装，得成品。
实施例2 有效组分的确立与鉴定有效组分的确立(1)绿原酸在对药材性质的文献查阅和对组合物全面分析后，确立了Y中的绿原酸为活性成分中的指标成分，其理由有以下几点a、绿原酸具有广泛的生物活性，例如抗病毒、抗炎、调节免疫等，与本制剂功能主治的作用相吻合。
b、绿原酸在Y中含量较高，一般在2-3％左右。
c、绿原酸用高效液相法检测，方法成熟，被药典收载，且药典附有对照品，经预试，L的提取成分与绿原酸无干扰。
d、绿原酸易溶于乙醇，提取容易。
(2)多糖L的主要成分为碳水化合物，约占59％，其次为蛋白质，约占22％，其中氨基酸较全面，有17种以上。L中脂肪很少，仅占0.8％，此外，还有少量的无机元素，需要特别指出的是，经预试，L中含有3-4％的多糖，该多糖是一类活性物质，近代研究表明，多糖不但能够治疗因机体免疫系统严重损伤所致的肿瘤，还能治疗因多种免疫缺损所致的慢性病，例如慢性肝炎等。
有效组分的鉴别(1)绿原酸的定性鉴别方法2000版药典中Y中“鉴别”项(药典法)供试品的制备取Y提取液的喷粉5g，溶于50ml甲醇中，必要时过滤即得。
结果与对照品相同位置处(Rf＝0.49)显示兰色荧光斑点。
结论提取物中绿原酸呈阳性反应。
(2)多糖的鉴别与测定由于多糖为一类无定形粉末，结构多变，无标准品可对照。因此，采用水浸液与费林试剂及碘液、碘化钾一碘试液等来鉴别L中的多糖。结果显示，L中含有多糖。
多糖的含量测定方法参照2000版药典(一)中“玉竹”的含量测定，该法中由于加入硫酸后溶液温度超过40℃，故改为在100℃水浴中保温30min。
实施例3 LY的急性毒性试验在预备试验中，小鼠灌服大剂量LY亦不致死，不能测出半数致死量，故采用最大给药量试验。
1.受试药物LY，由北京万赛生物医药技术发展有限公司提供。批号030313。实验用胶囊内容物为淡褐色粉未，临用前加蒸馏水，配制成0.2g/ml的混悬液，供灌胃用。
剂量取LY内容物，配制成0.2g/ml浓度的溶液供小鼠灌胃，一日内分三次给药，间隔4h，每次灌胃0.3ml/10g，总量0.9ml/10g，即18g/kg，人临床拟用量为0.1g/kg。此剂量为临床人拟用量的180倍。
2.实验动物ICR小鼠20只，18～21g，雌雄各半，由中国药科大学实验动物中心提供，合格证SCXK(苏)2002-0011号。
3.试验方法与结果小鼠空腹12h称重，每鼠igLY颗粒18/kg体重(0.2g/ml～0.9ml/10g)，一日内分3次ig给完，间隔4h，观察7日。
小鼠给药当日，行动缓慢，进食减少。次日恢复食量，活动、大便均正常。观察7日未见死亡。第8日空腹12h称重，体重变化见表1。
表1 小鼠急性毒性试验体重变化给药前体重 第8日体重性别鼠数增长率(％)(g，X±SD) (g，X±SD)♂ 1020.9±1.10 26.1±1.60*** 25.17♀ 1020.3±1.49 22.8±1.23*** 12.71t检验，与给药前比，***P＜0.01由表1可见，小鼠灌服LY内容物，体重正常增长。
4.小结在小鼠急性毒性试验中，采用最大给药量法，igLY内容物18g/kg体重，为临床人用量的180倍。给药后观察7日，未出现死亡及明显中毒反应，体重正常增长。
实施例4 LY的长期毒性试验1.受试药物LY由北京万赛生物医药技术发展有限公司提供，批号030314、030315。动物实验用胶囊内容物，为淡褐色粉未，临用前加适量蒸馏水，配制成0.125g/ml、0.25g/ml浓度的溶液供灌胃用，灌胃体积为低剂量组ig 0.125g/ml的溶液2ml/100g、中剂量组ig 0.25g/ml的溶液2ml/100g，由于药物浓度增加后，ig困难，因此高剂量组ig 0.25g/ml的溶液3ml/100g。每三天配一次，配好后冰箱保存。
剂量LY临床拟用量为每日0.1g/kg。按动物与人等效剂量折算，大鼠治疗量约为0.8g/kg体重，长毒试验用高、中、低剂量设置为7.5g/kg体重、5.0g/kg体重和2.5g/kg体重，高剂量相当于临床人用量的约75倍，低剂量约为药效高剂量的2倍。
2.实验动物SD大鼠160只，雌雄各半，雌鼠体重70～86g，雄鼠70～86g，由中国药科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏)2002-0011号。称重后随机分为4组对照组及高、中、低剂量给药组。每组40只，雌雄各20只，分笼喂养，每笼5只。饲养室温度20±2℃，相对湿度70±5％。具有排风、通气、恒温设备，自然光照。饲料用全价颗粒饲料，饮水用清洁自来水，放饮水瓶内自由饮用，每日更换。
3.试验方法3.1给药均口服给药，容积低、中剂量为2ml/100g，高剂量组为3ml/100g，对照组ig清洁自来水2ml/100g，3个剂量给药组分别灌服LY内容物2.5g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg，此剂量相当于生药量为23.1g/kg、46.2g/kg、69.3g/kg。连续给药六个月，上午8:00～10:00给药，给药结束后投放饲料。每周称重1次，按体重变化调整给药量。上述给药方案的依据是(1)给药途径灌胃给药，与临床口服用药一致。
(2)剂量高剂量相当于拟用临床剂量的约75倍。
(3)给药周期6个月。根据《中药新药药理毒理研究的技术要求》的规定，动物给药周期为临床用药周期的3～4倍，符合长毒试验给药周期的规定。
3.2观察与检测给药期间，每日观察动物一般状况，每周称重1次，记录体重变化。给药3个月后，各组取雌雄各5只大鼠，进行各项指标检测，包括称重，取血供血液学检验和血清生化检验，摘取主要脏器，作脏器系数测定和病理学检验。各组余下雌雄各15只大鼠，继续给药，给药6个月后，再次每组取雌雄各10只大鼠，同上法检测各项指标。余下每组雌雄各5只，作恢复期观察四周。恢复期观察结束后，同上法检测各项指标。
4.试验结果按检测指标，分别统计，报告于下。
4.1体重及一般状况(1)给药期间及恢复期，各组动物均无死亡。
(2)动物进食、饮水、大、小便均正常，外观、行为、体征亦无异常表现。
(3)各组动物体重均持续、稳定增长，并以给药组与空白对照组比较，作显著性检验(t检验)。结果见表2、表3。
表2 雄性大鼠长期毒性试验体重变化(X±SD)时间空白对照高剂量 中剂量 低剂量给药后 N＝205.1983.1±4.04 82.2±2.68 81.8±2.76 81.2±2.765.26100.9±3.46 95.6±5.89** 95.0±6.04**96.4±4.89**6.2 153.9±6.60 140.8±10.84** 137.8±15.28** 137.6±12.75**6.9 204.2±9.42 180.9±13.70** 182.1±16.13** 176.2±19.50**6.16245.4±18.18221.3±15.35** 223.5±20.31** 218.9±23.46**6.23262.9±17.54256.1±19.69 253.0±26.16250.9±28.696.30290.9±25.02288.9±18.42 283.1±31.27285.2±32.667.7 314.8±19.84316.0±21.23 307.7±35.77324.6±34.477.14343.6±19.50349.8±21.55 343.7±44.64355.5±38.197.21368.9±17.30370.7±22.00 362.8±47.99372.8±40.087.28398.6±16.24411.0±18.64*395.5±53.91401.2±41.68.4 414.6±20.74434.5±20.34** 416.7±55.10412.8±43.19三个月 N＝15后8.11 446.3±27.00 467.2±27.26*460.9±56.09448.9±55.288.18 469.7±32.08 489.5±30.00 476.5±60.32466.0±56.368.25 486.9±36.57 502.1±37.18 494.8±64.30485.2±54.119.1502.0±40.10 514.7±41.30 506.8±70.25496.1±52.829.8510.2±43.07 524.7±41.12 514.3±67.82507.2±53.12
9.15 520.1±46.50536.4±39.57524.8±65.70520.7±54.559.22 536.8±45.00553.3±35.47538.7±67.36533.6±53.909.29 561.3±44.69575.0±45.88558.2±74.36549.1±56.1110.6 576.2±44.62583.9±45.17578.2±72.38560.5±55.2810.13580.8±46.25596.3±54.33585.4±72.87564.3±62.6210.20599.5±49.31610.3±56.44599.0±76.23579.7±61.2410.27599.1±46.93593.2±58.87601.4±77.84586.9±64.0411.3 600.4±47.28596.8±58.31600.6±78.39590.1±61.1511.10609.7±51.41620.1±57.40605.4±82.74602.1±64.30恢复期 N＝511.17595.0±69.22581.4±26.73573.2±82.07573.4±55.9911.24603.8±68.21595.0±26.31584.8±85.37578.2±57.0412.1 624.8±73.56609.8±28.95603.6±92.62583.6±56.6312.8 647.6±82.76643.2±31.66618.0±74.08591.0±55.99t检验(下同)，与对照组比较，*P＜0.05，**p＜0.01表3 雌性大鼠长期毒性试验体重变化(X±SD)时间 空白对照高剂量 中剂量 低剂量给药后 N＝205.19 83.8±3.79 84.1±3.58 81.6±2.64* 86.0±6.645.26 98.5±4.89 99.4±8.68 92.2±4.25** 97.7±8.496.2 143.6±9.77 135.9±10.92* 132.3±8.36**136.1±13.656.9 176.9±11.79167.3±10.00** 169.7±11.02 180.3±35.786.16 195.1±9.97 188.2±12.19193.4±12.74 196.1±11.756.23 205.4±12.93208.2±10.56216.8±14.33*212.2±12.076.30 225.2±12.69230.1±10.62240.4±15.07** 231.5±16.897.7 240.8±12.58245.0±12.77259.3±19.13** 247.6±20.567.14 251.4±11.82266.4±12.08** 276.6±22.45** 266.0±21.64*7.21 261.3±15.32273.4±13.60* 287.7±25.30** 276.4±23.92*7.28 273.9±20.35286.6±14.50* 299.1±28.17** 290.6±22.21*8.4 280.2±20.49291.0±23.85304.7±29.26** 298.0±19.65*三个月 N＝15后8.11 292.3±26.51297.2±25.81308.1±34.73 306.9±23.498.18 296.7±26.61300.8±26.66313.7±37.38 314.0±24.578.25 302.1±28.24305.9±27.89319.2±38.88 320.3±23.299.1 308.9±29.37313.3±29.89323.7±40.46 328.5±25.819.8 316.5±29.11320.6±29.99334.0±42.96 337.1±26.259.15 323.8±30.42329.5±30.88342.7±44.62 344.9±26.919.22 331.4±28.45339.3±29.84352.5±44.66 353.6±29.42*9.29 345.3±29.74350.5±29.56367.7±42.41 361.5±34.0710.6 356.7±31.19360.7±23.59379.1±41.19 375.1±40.0210.13360.5±31.89365.6±20.84389.6±57.41 388.1±47.8610.20363.6±32.73370.2±20.56385.1±46.39 384.2±39.4710.27364.1±33.66371.0±22.22383.0±39.23 383.0±41.7411.3 367.7±33.41376.6±22.64388.9±39.20 388.9±41.2411.10364.5±32.90371.3±22.88384.0±41.13 385.7±44.29
恢复期 N＝511.17 363.2±39.52358.2±26.56376.2±48.28343.4±39.6111.24 366.4±42.88363.2±28.89379.0±49.84349.0±38.9112.1369.4±44.81371.8±30.95383.6±51.38358.8±37.0112.8372.6±45.76378.8±31.23392.8±58.41365.6±37.48t检验，与对照组比较，*P＜0.05，**p＜0.01由表2、表3可见，给药组与对照组动物体重均明显增长，给药组雄性动物在给药后第2、第3、第4和第5周体重与空白对照组比较有显著差异；雌性动物高剂量组第3、第4和中剂量组第1、第2、第3周与空白对照组有显著差异，分析原因可能是由于给药容积过大，使动物的正常摄食量减少所致。但基本在5周后即恢复正常，而且雌性动物在6周后还显示出体重增长显著大于空白对照组。三个月后动物体重增长速度给药组与空白组基本一致。以上结果表明，LY长期口服对实验动物体重变化无明显影响。
4.2血液学检验大鼠股动脉取血，以玻片法作凝血时间(CT)测定。以Coulter-T450自动血液检测仪(美国产)及其配套试剂作血液白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)计数、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、淋巴细胞相对计数(LY％)、淋巴细胞绝对计数(LY#)的测定。结果见表4～表9。
表4 雄性大鼠长毒试验给药三个月后血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量 WBC RBC HGB HCT PLT LY％ LY# CT别 (g/kg(109/ (1012/ (g/L)(％)(109/ (％) (109/L (s))L) L) L) )对 510.307.48± 14.9040.64 888.60 71.48 7.30± 29.00照 ±2.20 0.27 ±0.75 ±1.61 ± ±3.74 1.13 ±7.4869.98L 5 7.5 9.94±8.09± 14.0043.34 1003.0 67.78 7.55± 34.60Y4.16 0.54 ±1.91 ±2.40 ± ±16.4 3.98 ±6.47205.25 5.0 12.287.64± 14.0640.60 855.40 82.26 10.1± 29.60±4.83 0.54 ±0.98 ±2.26 ± ± 4.01 ±5.0394.913.36**5 2.5 7.70±7.78± 14.6442.40 819.80 79.10 6.20± 26.803.10 0.38 ±1.49 ±0.98 ± ± 2.82 ±5.8178.555.66*t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01
表5 雌性大鼠长毒试验给药三个月后血常规检测结果(X±SD)组 n剂量WBC RBC HGB HCT PLT LY％LY#CT别 (g/kg (109/(1012/ (g/L)(％) (109/ (％)(109/L(s)) L)L) L) )对 56.36± 7.78± 15.4441.58845.80 81.30 5.14± 29.80照 1.39 0.35 ±0.85 ±1.90 ±±2.49 1.12 ±4.8260.26LY 57.5 10.60 6.86± 13.7638.82986.60 82.18 8.74± 36.60± 0.13**±±± ±2.66 2.29* ±10.062.59* 0.57** 1.33*89.37*55.0 9.34± 6.90± 14.1037.44750.686.10 8.04±27.002.12* 0.43**±±± ± 1.77* ±2.350.59*2.09*104.52.99*52.5 5.90± 7.66± 16.0842.62857.40 83.18 4.92± 33.800.85 0.29 ±0.94 ±1.52 ± ±6.91 0.88 ±8.0497.93t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表6 雄性大鼠长毒试验给药六个月后血常规检测结果(X±SD)组别 n剂量 WBC RBC HGB HCT PLT LY％ LY# CT(g/k (109(1012(g/L)(％)(109(％) (109/(s)g) /L) /L) /L)L)对照 10 14.38 7.58 14.2840.26797.1 64.76 9.31 77.40± ±± ±0±± ± ±3.450.47 0.74 1.83 107.1 6.56 2.34 31.87LY107.5 13.48 7.19 13.4939.16716.7 72.60 9.82 110.9± ±± ±0±± ± 0±5.880.56 0.77*2.15 131.1 10.10 4.70 40.78105.0 14.12 7.56 14.1839.74823.3 65.33 9.35 54.20± ±± ±0±± ± ±4.440.96 1.46 4.29 133.5 6.85 3.60 28.57102.5 16.91 7.07 13.0737.79785.3 64.05 10.95 86.80± ±± ±0±± ± ±4.560.24*1.57*2.29*152.9 9.08 3.62 24.30*t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表7 雌性大鼠长毒试验给药六个月后血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量 WBC RBCHGB HCT PLT LY％ LY# CT别 (g/kg)(109/L (1012/ (g/L) (％) (109/L (％) (109/L)(s)) L))对 10 11.52 6.96± 14.06 39.98774.20 70.70 8.31± 65.30照 ±4.030.42 ±6.48 ±1.58 ±±7.04 3.63±105.9 33.01
LY 10 7.5 9.45± 6.67± 13.2537.58724.6070.576.67± 88.802.080.84 ±1.04 ±± ±6.101.59±2.99*185.7 35.6210 5.0 9.48± 6.09± 12.5834.83693.0067.806.58± 72.503.080.48**±±± ±7.092.87±0.92** 2.95** 130.5 40.0710 2.5 9.29± 7.04± 14.0740.12752.6062.635.92± 96.001.960.58 ±0.96 ±2.82 ± ± 1.71±165.2 11.5043.00t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表8 雄性大鼠长毒试验恢复期结束血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量WBCRBCHGB HCT PLT LY％LY#CT别 (g/kg) (109/L) (1012/L) (g/L) (％)(109/L) (％)(109/L) (s)对 5 13.92± 7.98±14.5838.28 576.80± 61.94 8.60±34.80照 2.01 0.73 ±± 70.22 ± 1.69 ±0.21 2.09 8.30 4.44LY 5 7.5 14.58± 7.93±15.1840.06 508.40± 65.94 9.18±34.203.29 0.38 ±± 64.17 ± 2.61 ±0.45 1.09 3.85 1.305 5.0 14.24± 7.11±12.9634.48 573.00± 67.42 9.48±34.605.49 2.00 ±± 204.89± 3.56 ±3.59 9.90 2.00 5.035 2.5 16.66± 7.98±14.9039.32 615.20± 72.30 12.28± 31.604.93 0.66 ±± 94.60 ± 4.80 ±0.95 3.20 7.68 5.37t检验，与对照组比，未标记者P＞0.05表9 雌性大鼠长毒试验恢复期结束血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量WBCRBCHGB HCT PLTLY％ LY#CT别 (g/kg) (109/L) (1012/L) (g/L) (％) (109/L) (％) (109/L) (s)对 5 11.24± 6.62± 13.6634.68570.80±68.65 7.68± 34.00照 2.83 0.60 ±± 92.28 ± 2.31 ±0.85 2.329.35 2.55LY 5 7.5 9.34±6.70± 13.6434.98397.40±74.60 6.96± 32.601.75 1.25 ±± 39.85**± 1.55 ±2.20 6.413.99 2.705 5.0 11.36± 7.40± 14.5038.86498.80±72.32 8.38± 32.804.62 0.56 ±± 85.69 ± 4.12 ±0.63 2.40* 7.63 3.495 2.5 9.26±7.04± 13.8836.00566.80± 70.24 6.46±32.002.59 0.43 ±± 93.57 ± 1.87 ±0.65 2.622.07 3.46t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01
由表4～表9可见，给药三个月后，雄性动物的中、低剂量组的LY％出现显著增加(分别增加15.08％和10.66％)；雌性大鼠的高、中剂量组白细胞显著增加、红细胞、血红蛋白出现降低，但上述变化值均在正常范围内波动，所以无临床意义。给药组的其他各项血液学指标与对照组相比均未见明显差异。给药六个月后雄性动物低剂量及雌性动物中剂量组红细胞、血红蛋白出现降低，但其他两个剂量组未见明显改变，其他指标与对照组相比未见明显差异，并且所有变化值均在正常范围内波动[3]。停药后恢复期检测结果中，雄性动物各项指标给药组与空白组均无显著差异，雌性动物高剂量组PLT显著降低，中剂量组HCT有明显升高，这些变化都属散在的个别的变化。其他各项指标与空白对照组相比，均未有显著性差异。
4.3血液生化检验大鼠股动脉取血，37℃水浴放置30min，3000rpm离心10min，分离血清，以RA-XT全自动生化仪，测定丙氨酸氨基转化酶(ALT)，天门冬氨酸氨基转化酶(AST)，碱性磷酸酶(ALP)，尿素氮(BUN)，总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，血糖(GLU)，总胆红素(TB)，肌酐(CR)和总胆固醇(TCHO)。结果见表10～表15。
BUN批准文号URUV-0400，试剂批号01-1428，法国医杰公司；Cr批准文号国药准字(1999)D-58号，试剂批号320361，中生北控；GLU批准文号(93)卫药准字D-25-11号，试剂批号240491，中生北控；AST批准文号(95)卫药准字D-20(2)号，试剂批号020171，中生北控；ALT批准文号(93)卫药准字D-37-4号，试剂批号011151，中生北控；TP批准文号(93)卫药准字D-41号，试剂批号260041，中生北控；ALB批准文号(93)卫药准字D-53-5号，试剂批号250201，中生北控；ALP批准文号国药准字(1999)D-27(1)号，国药准字(1999)D-27(2)号，试剂批号27091，浙江东瓯；CHO试剂批号040206，上海名典T-BIL批准文号BILI-0600，试剂批号145136，法国医杰公司。
表10 雄性大鼠长毒试验给药三个月后血液生化测定(X±SD)
剂量 TPALBTB ALT AST组别 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L) (u/L) (u/L)对照 556.02± 31.64±1.48±152.20± 201.60±4.31 2.23 0.60 76.68 77.53LY5 7.5 63.86± 33.20±0.82±192.00± 232.00±5.27* 2.47 0.53 63.45 39.015 5.0 60.88± 33.24±1.52±137.00± 223.20±4.08 2.11 0.69 74.38 65.955 2.5 62.06± 32.58±0.58±177.40± 255.00±3.10* 1.50 0.45 89.17 43.15剂量 ALPGLU BUN CRCHO组别 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L) (nmol/L)对照 5101.80±3.36± 8.42±59.68±3.25±15.72 1.37 1.09 20.96 0.73LY5 7.5 103.40±3.30± 9.59±78.12±3.83±24.35 0.48 0.72 21.23 0.435 5.0 98.00± 3.68± 8.80±54.64±3.57±22.67 1.60 2.72 13.99 0.745 2.5 102.00±2.94± 8.49±109.50± 3.52±19.60 0.59 0.81 27.25*1.08t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表11 雌性大鼠长毒试验给药三个月后血液生化测定(X±SD)剂量 TP ALBTB ALTAST组别 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)对照 5 60.02± 33.06± 0.66± 202.20±206.40±2.04 1.29 0.4361.95 25.46LY 57.5 59.76± 33.28± 1.62± 182.80±176.80±1.84 0.80 0.5059.57 21.0455.0 61.16± 33.10± 1.28± 211.20±222.80±3.65 2.00 1.1266.61 31.8052.5 61.38± 31.90± 17.02±182.40±202.20±2.62* 3.23 36.33 49.37 39.39剂量 ALPGLUBUN CR CHO组别 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L)(umol/L) (nmol/L)对照 5 110.20± 3.96± 8.61± 66.00± 3.31±16.18 1.24 0.7817.14 0.49LY 57.5 101.40± 3.59± 9.67± 81.52± 3.51±20.66 0.98 2.2336.10 0.375 5.0 113.40± 3.37± 10.01±77.32± 3.23±26.90 0.91 0.5626.25 0.185 2.5 86.20± 2.99± 7.98± 95.94± 3.27±16.96 0.35 2.1648.71 0.97
t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表12 雄性大鼠长毒试验给药六个月后血液生化测定(X±SD)剂量TPALBTB ALTAST组别 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)对照 10 64.94±33.08± 1.04± 202.50±249.60±6.54 2.28 0.4458.66 58.48LY 10 7.5 65.76±35.54± 0.81± 189.70±259.50±2.76 1.37 0.5680.12 61.1810 5.0 62.56±34.20± 1.60± 226.70±244.50±6.48 2.09 1.8950.38 50.9210 2.5 60.60±34.05± 0.92± 155.30±229.10±8.27 2.36 0.5842.54 48.32剂量ALP GLUBUN CR CHO组别 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L)(umol/L) (nmol/L)对照 10 116.40± 2.54± 8.41± 74.90± 3.79±19.76 0.66 1.4333.89 0.51LY10 7.5 118.70± 2.94± 9.87± 66.17± 3.79±32.34 0.98 1.53* 23.97 0.5910 5.0 104.00± 3.20± 9.24± 77.56± 3.58±17.80 1.16 1.8611.66 0.5210 2.5 118.40± 3.12± 9.03± 70.83± 3.66±24.86 1.08 1.2012.88 0.56t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表13 雌性大鼠长毒试验给药六个月后血液生化测定(X±SD)剂量 TPALB TB ALT AST组别 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umo l/L)(u/L) (u/L)对照 1063.03± 33.27±0.98±179.10± 239.60±5.21 2.070.44 52.58 64.90LY 10 7.5 66.19± 34.56±22.05± 180.40± 208.60±3.05 2.4965.3559.53 58.7210 5.0 63.01± 33.87±1.18±178.80± 231.50±3.49 1.680.91 47.21 49.4010 2.5 58.68± 32.18±1.15±190.70± 190.80±3.16 1.140.66 68.94 46.02剂量 ALP GLU BUN CR CHO(g/kg) (u/L) (nmol/L)(nmol/L) (umol/L)(nmol/L)组别 n对照 10109.00± 2.23± 8.83±92.90±3.44±17.78 0.791.68 26.06 0.52LY 10 7.5 107.10± 3.14± 9.62±79.03±3.78±
38.450.63* 1.17 26.64 0.4310 5.0 114.50± 1.62± 9.73± 68.01± 3.52±16.340.65 1.76 16.08 0.5210 2.5 109.70± 3.86± 8.58± 68.60± 3.64±29.891.08* 1.68 20.35 0.98t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表14 雄性大鼠长毒试验恢复期末血液生化测定(X±SD)剂量 TPALBTB ALT AST组别 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L) (u/L) (u/L)56.76±31.82± 0.96±223.40± 301.00±对照 52.10 0.68 0.61 27.13 218.547.5 60.42±33.16± 0.84±214.60± 222.40±LY 52.29* 1.94 0.62 85.16 60.785.0 61.94±33.80± 0.90±193.20± 302.80±52.15**1.64 0.41 52.12 68.722.5 60.12±33.38± 0.98±205.60± 202.80±53.68 1.57 0.54 61.00 56.86剂量 ALP GLUBUN CR CHO组别 n(g/kg)(u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L)(nmol/L)86.20±4.19± 8.17±64.10±3.12±对照 530.19 1.10 0.91 26.65 0.417.5 97.60±3.08± 8.81±63.58±3.47±LY 519.62 1.20 0.61 14.98 0.825.0 151.20± 3.02± 9.56±78.58± 3.33±531.25*0.86 1.27 29.07 0.482.5 109.40± 3.11± 8.95±77.98± 3.18±521.29 1.00 1.39 10.94 0.52t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01表15 雌性大鼠长毒试验恢复期末血液生化测定(X±SD)剂量TP ALB TB ALT AST组别 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)57.96± 33.80±1.30± 171.60± 200.00±对照 510.05 0.940.6162.14 25.857.5 57.26± 31.28±1.38± 176.60± 189.80±LY54.46 2.25* 0.6146.11 25.045.0 61.92± 33.16±1.32± 165.80± 217.20±53.58 1.900.5345.54 39.612.5 59.10± 32.88±1.24± 180.60± 193.00±52.79 1.410.9559.36 25.62
剂量 ALP GLUBUNCR CHO组别 n(g/kg)(u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L)(nmol/L)96.40±3.23± 8.18±83.52±3.70±对照 515.49 1.61 0.95 15.93 0.507.5 132.40± 2.94± 8.37±82.50±3.17±LY525.26* 0.77 2.64 36.16 0.235.0 91.00±3.09± 7.99±84.56±3.38±516.57 0.20 0.55 37.00 0.622.5 100.20± 3.82± 8.27±81.22±3.42±514.13 0.73 1.25 25.58 0.57t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05由表10～表15可见，在给药三个月的中期检测中，雄性动物高、低剂量组的总蛋白有显著升高(空白对照组为56.02±4.31，高剂量组为63.86±5.27，p＜0.05；低剂量组为62.06±3.10，p＜0.05)，雌性动物低剂量组的总蛋白也表现显著升高(空白对照组为60.02±2.04，低剂量组为61.38±2.62，p＜0.05)，但其他剂量组均未见显著改变。其余指标与空白对照组比较，统计均无显著差异。
给药六个月后雄性动物的高剂量组的尿素氮指标有显著升高(空白对照组为8.41±1.43，高剂量组为9.78±1.53，p＜0.05)，雌性动物的高、低剂量组血糖值与空白对照组比较有显著升高(空白对照组为2.23±0.79，高剂量为3.14±0.63，p＜0.05；低剂量为3.86±1.08，p＜0.01)，其余指标与空白对照组比较均未见显著差异。
恢复期的检测中雄性动物高、中剂量组总蛋白有显著升高(空白对照组为56.76±2.10，高剂量组为60.42±2.29，p＜0.05；中剂量组为61.94±2.15，p＜0.01)，雌性动物高剂量组白蛋白与空白对照组比较有显著下降(空白对照组为33.80±0.94，高剂量组为31.28±2.25，p＜0.05)，另外，雌性高剂量和雄性中剂量的碱性磷酸酶与空白对照组比较也有显著升高(雌性空白组为96.40±15.49，雌性高剂量组为132.40±25.26，p＜0.05；雄性空白组为86.20±30.19，雄性中剂量为151.2±31.25，p＜0.05)，其余指标均未见显著改变。
但以上这些变化值均在正常范围内波动，且无剂量相关性，故无临床意义。
4.4主要脏器系数测定大鼠处死后，立即分离摘取主要脏器，电子天平称重，计算脏器重量系数
脏器系数(g/kg)＝脏器重量(g)/体重(kg)。结果见表16～表21。
表16 雄性大鼠长毒试验给药三个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑心肝 脾肺(g/kg)4.34± 2.77± 23.01± 3.61± 4.62±对照 50.31 0.27 1.67 0.45 0.457.5 4.28± 2.95± 24.01± 3.31± 5.92±LY50.31 0.38 3.42 0.21 2.305.0 3.98± 2.66± 21.65± 3.44± 6.17±50.30 0.31 3.09 1.12 2.262.5 4.21± 2.72± 20.97± 2.69± 4.41±50.16 0.21 2.24 0.91 0.79剂量组别 n 肾肾上腺 甲状腺 胸腺 睾丸 前列腺(g/kg)5.86± 0.145± 0.060±1.421± 11.63± 1.56±对照 50.19 0.029 0.020 0.534 1.22 0.527.5 5.53± 0.161± 0.071±1.007± 10.33± 1.35±LY50.57 0.025 0.018 0.226 3.30 0.335.0 5.79± 0.150± 0.065±1.104± 7.73± 1.10±50.42 0.016 0.017 0.538 3.16* 0.332.5 5.55± 0.188± 0.061±1.135± 9.92± 1.10±50.34 0.024 0.023 0.353 2.06 0.28t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表17 雌性大鼠长毒试验给药三个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑 心 肝 脾肺(g/kg)3.95±1.98± 16.36±2.82± 3.72±对照 50.29 0.17 2.500.81 0.467.5 4.03±2.34± 19.63±2.85± 4.46±LY50.26 0.20 1.990.93 0.315.0 3.90±2.24± 16.90±2.72± 3.80±50.24 0.22 1.350.84 0.442.5 3.86±2.12± 15.98±2.31± 3.19±50.35 0.14 0.730.42 0.74剂量组别 n 肾 肾上腺 甲状腺 胸腺 卵巢 子宫(g/kg)4.14±0.237± 0.066± 1.015± 0.333± 1.18±对照 50.50 0.082 0.029 0.108 0.048 0.35LY5 7.5 4.22±0.217± 0.071± 1.275± 0.442± 1.60±
0.20 0.037 0.019 0.363 0.075 0.585.04.69± 0.197± 0.069± 1.085± 0.456± 1.47±50.37 0.026 0.026 0.066 0.106 0.582.54.20± 0.196± 0.057± 0.994± 0.326± 1.18±50.22 0.042 0.020 0.125 0.063 0.24t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05表18 雄性大鼠长毒试验给药六个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑 心 肝 脾 肺(g/kg)3.53±3.02± 21.99± 2.53±5.70±对照 100.30 0.33 3.10 0.80 0.597.5 3.43±2.72± 22.01± 2.67±5.33±LY 100.31 0.52 1.53 0.72 1.465.0 3.27±3.21± 21.80± 2.50±5.90±100.50 0.34 1.90 0.59 1.782.5 3.39±3.24± 22.13± 2.41±5.54±100.39 0.28 1.40 0.39 0.66剂量组别 n肾 肾上腺 甲状腺 胸腺 睾丸 前列腺(g/kg)5.58±0.148± 0.070± 0.626± 9.99± 1.62±对照 100.48 0.037 0.016 0.186 1.92 0.347.5 5.51±0.125± 0.074± 0.586± 10.09± 1.38±LY100.50 0.026 0.019 0.290 1.38 0.355.0 5.69±0.132± 0.066± 0.653± 10.58± 1.44±100.33 0.025 0.020 0.265 1.45 0.382.5 5.83±0.177± 0.078± 0.576± 10.73± 1.55±100.49 0.034 0.022 0.172 0.84 0.14t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05表19 雌性大鼠长毒试验给药六个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑心肝 脾肺(g/kg)5.23± 3.07± 24.96± 2.46± 7.88±对照 100.89 0.44 2.85 0.47 1.987.55.18± 3.04± 23.65± 3.13± 6.76±LY100.43 0.21 1.97 0.97 2.525.04.95± 3.13± 24.63± 2.93± 6.51±100.47 0.27 1.49 0.53 0.912.54.86± 3.27± 23.86± 2.75± 6.94±100.40 0.38 2.75 0.73 1.65
剂量组别 n肾肾上腺 甲状腺 胸腺 卵巢 子宫(g/kg) 5.80± 0.309± 0.120±1.046± 0.550± 3.43±对照 100.46 0.062 0.043 0.291 0.059 1.627.5 6.07± 0.265± 0.089±0.974± 0.587± 2.78±LY100.52 0.046 0.022 0.180 0.135 1.405.0 6.04± 0.294± 0.092±0.997± 0.476± 2.31±100.44 0.053 0.013 0.324 0.101 0.802.5 6.15± 0.307± 0.090±0.841± 0.526± 2.35±100.42 0.065 0.019 0.294 0.127 0.56t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05表20 雄性大鼠长毒试验恢复期末脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n脑心肝 脾肺(g/kg)3.20± 3.38± 21.96± 1.91± 5.06±对照 50.70 0.53 0.58 0.58 0.697.5 3.39± 2.84± 23.41± 2.47± 4.84±LY50.28 0.54 1.23* 0.53 0.605.0 3.15± 2.92± 23.02± 2.51± 5.32±50.49 0.69 6.37 0.36 1.082.5 3.57± 3.05± 21.60± 2.46± 5.88±50.47 0.24 3.40 0.56 0.86剂量组别 n 肾肾上腺 甲状腺 胸腺 睾丸 前列腺(g/kg)6.00± 0.124± 0.067± 0.465± 9.78± 1.82±对照 50.64 0.019 0.022 0.154 1.56 0.657.55.82± 0.187± 0.072± 0.621± 9.98± 1.84±LY 50.76 0.117 0.014 0.278 0.88 0.555.05.77± 0.144± 0.070± 0.775± 10.88± 1.44±51.63 0.065 0.043 0.330 1.07 0.452.55.87± 0.131± 0.072± 0.579± 9.73± 1.13±50.73 0.008 0.048 0.307 3.59 0.28t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表21 雌性大鼠长毒试验恢复期末脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑心肝 脾肺(g/kg)5.11± 3.20± 23.70± 2.67± 6.96±对照 50.54 0.39 2.35 0.63 1.637.55.21± 3.02± 23.62± 2.93± 6.19±LY50.47 0.28 2.47 0.83 0.86
5.0 4.82± 3.07±23.53± 2.44± 7.72±50.55 0.14 1.89 0.44 3.482.5 5.41± 3.23±21.93± 2.32± 6.55±50.71 0.45 1.84 0.50 0.67剂量组别 n 肾肾上腺 甲状腺 胸腺 卵巢 子宫(g/kg)6.82± 0.266± 0.121±0.897±0.553± 2.23±对照 50.84 0.043 0.051 0.207 0.173 0.577.56.11± 0.275± 0.085±1.048±0.525± 2.62±LY50.73 0.060 0.021 0.318 0.112 1.035.06.21± 0.260± 0.097±1.224±0.511± 2.23±50.39 0.054 0.005 0.445 0.050 0.252.56.03± 0.296± 0.085±0.870±0.590± 3.13±50.73 0.046 0.039 0.270 0.068 0.81t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05由表16～表21可见，各给药组动物的脏器系数与正常动物相近，与空白对照比较，均无显著差异。
4.5主要脏器的病理检验大鼠处死后，立即分离主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、甲状腺、淋巴结、胸腺、肾上腺、胃、十二指肠、膀胱、睾丸、附睾、前列腺或卵巢、子宫，肉眼观察均无明显病变，以福尔马林固定，送病理组织学检查。病理报告表明，给药组各鼠的内脏组织学与对照组相比较，检查结果基本相同，未见明显毒性所致的病理学改变。
5.结语本实验是在LY原料药的药效学试验和小鼠急性毒性试验的基础上，进行大鼠长期毒性试验。
实验用SD大鼠160只，3个给药组ig LY内容物2.5g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg，相当于生药量为116g/kg、232g/kg、348g/kg。连续六个月。动物来源、数量、给药途径、剂量、周期等均符合新药长期毒性试验的规定。
给药期间，各组大鼠均未死亡，体重正常增长，给药中期、给药结束及恢复期末经血液学检验、生化检验、脏器系数测定及病理组织学检验，各项指标基本正常。以上结果表明，LY长期口服，对实验动物未出现明显毒性反应。
实施例5 LY的药效学试验1.实验材料1.1实验动物ICR小鼠、SD大鼠，由中国药科大学实验动物中心提供。合格证SCXK(苏)2002-0011号。
麻鸭采用重庆麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭(购于重庆市沙坪坝区虎溪镇大田堡村牌坊合作社孵化场)经腹腔接种0.1mlDHBV DNA阳性病毒血清。接种1周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记的DHBV DNA探针经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养至3周龄作为实验动物。
1.2药物及试剂LY，由北京万赛生物医药技术发展有限公司提供。批号030313。实验用胶囊内容物，为淡褐色粉未，临用前以蒸馏水配制成浓度为25mg(胶囊内容物)/ml、50mg/ml、100mg/ml的溶液供小鼠ig用，ig量为0.2ml/10g体重。
垂盆草冲剂(保肝阳性药)，主要成分为垂盆草，功能清利湿热，有降低谷丙转氨酶作用，临床用于急性肝炎、迁移性肝炎及慢性肝炎的治疗。巢湖正大药业有限公司生产，ZZ-3168-皖药准字(2001)第Z000925号，批号021010。临床人用量一次10g，一日2～3次，按成人体重60g/kg计算，人用量即0.5g/kg，小鼠用量取5g/kg，大鼠用量取4g/kg。临用前以蒸馏水配制成浓度为0.25g/ml的溶液供小鼠ig用，大鼠ig配制成0.20g/ml溶液，ig量均为0.2ml/10g体重。
抗乙肝阳性对照药物拉米夫定(批号B038238，葛兰素威康英国行动有限公司生产)压碎后自制成5mg/粒的胶囊。
芸芝多糖胶囊，功能主治增强免疫功能，用于慢性乙型肝炎、肝癌及老年免疫功能低下者。江苏晨牌药业有限公司生产，苏卫药准字(1994)第361204号。临床人用量一日3～6粒，每粒0.5g，即成人剂量为40mg/kg，小鼠用量为400mg/kg，临用前以蒸馏水配制成2mg/ml的溶液供小鼠ig用。
阿斯匹林，阿斯特拉(无锡)制药有限公司，苏卫药准字(1985)第343401号，批号200201021号。
二甲苯，南京化学试剂厂，批号990305。营养琼脂，江苏省卫生防疫站微生物试剂厂，批号020425。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒，批号20030106。测试原理为ALT在37℃及pH7.4条件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸，反应30min后加入2，4-二硝基苯肼盐酸溶液，即中止反应，同时2，4-二硝基苯肼与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色，于505nm处测吸光度，计算酶活力。天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒，批号20030106。测试原理为天门冬氨酸氨基转移酶能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸转移氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸在反应过程中可自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸和2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色，比色后求得酶的活力单位。白蛋白测试盒(溴甲酚绿比色法)，批号20030718，利用白蛋白具有与阴离子染料结合的特性，在酸性溶液中溴甲酚绿与白蛋白结合后，由黄色变成绿色，绿色的深浅与白蛋白的深度成正比。总蛋白测试盒(双缩脲法)，批号20030630，利用蛋白质分子中的肽键与碱性酮溶液作用，形成紫色复合物，于波长540nm处测吸光度，计算总蛋白含量。羟脯氨酸测试盒，批号20030910。均购自南京建成生物工程研究所。
四氯化碳(CCl4)，分析纯，南京化学试剂一厂。鲁花牌纯正花生油，莱阳鲁花浓香花生油有限公司。配制临用前配制成一定浓度的花生油溶液，置于密封瓶内，搅拌6小时以上。
D-半乳糖胺(D-GalN)，分析纯，重庆医科大学，生产批号030215。配制临用前以注射用生理盐水配制成0.8％的溶液，冷藏备用。
注射用环磷酰胺(CY)，沪卫药准字(1995)第012034号，上海华联制药公司。印度墨汁，北京市西中化工厂，批号0030619，临用前以生理盐水稀释成1∶4的溶液静脉注射用。
羊血，购自江宁县卫生防疫站，临用时用生理盐水洗涤三次，每次2000rpm离心5min，弃去上清液，用生理盐水以3∶5(V/V)稀释。
都氏液，自配，碳酸氢钠1.0g，氰化钾0.05g，高铁氢化钾0.2g，蒸馏水配至1000ml。
2.实验方法与结果2.1 LY对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响取健康小鼠60只，雄性，体重18～22g，随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，阳性药组，LY低、中、高剂量组。正常对照组和模型对照组动物每天ig等容积蒸馏水，阳性药组给以5g/kg垂盆草冲剂，LY低、中、高剂量分别给予0.5、1.0、2.0g/kg剂量的药物，ig体积均为0.2ml/10g，连续给药一周，未次给药后除正常对照组动物以外，其余每组动物均ip 0.1％CCl4花生油溶液0.1ml/10g体重，ip后禁食16h，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒所示方法测定血清中AST、ALT含量。取血完毕后，摘取全部肝脏，福尔马林固定，取肝小叶部位肝组织作病理检查。AST、ALT以x±SD表示，组间差异采用Student’s t-test检验。结果见表22。
表22 LY对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响(x±SD)组别剂量(g/kg) N AST(U) ALT(U)正常对照 10 13.07±6.69*** 11.92±9.98***模型对照 10 79.20±35.2684.45±39.80垂盆草 510 45.64±24.98** 34.11±24.98***LY低剂 0.5 10 51.60±12.06** 49.57±41.51*LY中剂量1.0 10 47.14±12.35** 27.24±15.41***LY高剂量2.0 10 35.16±18.84*** 28.70±8.51***与模型对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表22可见， LY三个剂量组均能显著降低CCl4所致小鼠急性肝损伤血清中的AST的含量，中、高剂量组能显著降低ALT的含量。表明LY能减轻CCl4对小鼠肝脏的损伤，对肝脏有保护作用。
病理组织检查结果表明CCl4能引起小鼠的肝细胞呈不同程度的细胞坏死，炎细胞浸润。LY给药组与模型对照组相比，肝细胞的破坏程度明显减轻，偶见有少量脂肪变性及局灶性的炎性浸润。结果见表23。
表23 LY对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察动物数 炎性浸润 细胞坏死组别无局灶弥漫 无 点状 灶状正常对照10 100 0 10 00模型对 10 6 3 1 244垂盆草 10 8 2 0 334LY低剂量10 9 1 0 343LY中剂量10 8 2 0 811LY高剂量10 10 0 0 622
2.2 LY对D-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响取健康小鼠60只，雄性，18～22g，随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，阳性药组，LY低、中、高剂量组。正常对照组和模型对照组动物每天ig等容积蒸馏水，阳性药组给以5g/kg垂盆草冲剂，LY低、中、高剂量分别给予0.5、1.0、2.0g/kg剂量的药物，ig体积均为0.2ml/10g，连续给药一周，未次给药后除正常对照组动物以外，其余每组动物均ip D-半乳糖胺800mg/kg体重，ip后禁食16h，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒所示方法测定血清中AST、ALT含量。取血完毕后，摘取全部肝脏，福尔马林固定，取肝小叶部位肝组织作病理检查。结果见表24。
表24 LY对D-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg)N AST(U) ALT(U)正常对照 1051.21±42.91*** 20.15±9.52***模型对照 10121.38±28.58 150.76±69.84垂盆草 5 1060.60±1.49*** 98.38±35.03*LY低剂量 0.5 1089.21±9.32** 99.52±59.64*LY中剂量 1.0 1049.19±9.52*** 70.15±26.09***LY高剂量 2.0 1045.80±32.55** 42.39±34.90***与模型对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表24可见，LY三个剂量组均能显著降低D-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤血清中的AST的含量，中、高剂量组能显著降低ALT的含量。
病理组织检查表明，D-半乳糖胺引起小鼠肝小叶结构破坏，肝组织呈不同程度的坏死，有局灶性或弥漫性的炎性浸润，汇管区增大，肝细胞有明显的脂肪变性。给药组与模型组相比，肝组织的破坏呈不同程度的减轻，脂肪变减轻。表明LY可保护肝细胞，减轻D-半乳糖胺对肝脏的破坏。结果见表25。
表25 LY对D-半乳糖胺所致急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察动物数 炎性浸润 细胞坏死组别无 局灶弥漫 无 点状 灶状正常对照10 10 0010 00模型对照10 073226垂盆草 10 010 0334LY低剂量10 172037LY中剂量10 073217LY高剂量10 6313432.3 LY对CCl4所致大鼠慢性肝损伤的影响慢性肝损伤模型的制备及分组取健康雄性大鼠，180～220g，测定造模前各项生化指标，除6只大鼠作为正常对照组外，其余64只大鼠ig 50％CCl4花生油溶液10ml/kg，每周二次，连续10周。造型6周时，眼眶取血，分离血清，测定血清AST、ALT的含量，按血清ALT含量，将大鼠分为5组模型对照组(16只)、垂盆草颗粒组(12只)，LY低(12只)、中(12只)、高剂量组(12只)，按表中剂量给药，每天1次，连续给药4周后，末次给药后24h，摘眼球取血，3000rpm离心10min，分离血清，测定AST、ALT、总蛋白、白蛋白的含量。另取受试大鼠的肝脏，称重，计算肝脏系数，称取肝小叶部位的肝脏1g，按试剂盒所示方法，测定肝组织中羟脯氨酸含量。
病理学检查取肝左叶固定，石蜡包埋，包埋肝组织切成5μm的石蜡切片，HE染色，显微镜下观察组织学变化，并将肝纤维化分为0～4级，0级无纤维化；I级纤维结缔组织仅局限于汇管区或汇管区扩大，有向小叶发展的倾向；II级纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3并有I级同样的改变；III级纤维结缔组织进入肝小叶达中央静脉周围；IV级纤维结缔组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成，并有III级同样的改变。
表26 LY对CCl4所致大鼠慢性肝损伤的影响表26.1 慢性肝损伤大鼠造模型前各项生化指标(x±SD)组别 剂量 动物数 ALT AST 总蛋白 白蛋白 A/G(g/kg)(U) (U) (g/L) (g/L)试验前 试验后正常对照 6 6 59.78± 98.94± 65.32±30.13±0.87±26.52 29.654.912.160.11模型空白 16 1454.10± 92.40± 64.07±30.30±0.92±20.03 21.325.052.080.17垂盆草组 4 12 8 54.36± 85.74± 65.88±31.36±0.94±9.18 14.855.372.360.20LY低剂量 0.3 12 8 59.98± 97.86± 64.98±29.76±0.87±17.14 17.925.532.590.18LY中剂量 0.6 12 1153.71± 91.33± 64.15±30.76±0.94±14.85 19.273.211.790.18LY高剂量 1.2 12 1052.19± 83.04± 63.91±32.73±1.07±14.73 14.254.061.040.17t检验，与正常对照组比较，均无显著性差异表26.2 慢性肝损伤大鼠造模六周后各项生化指标的变化(x±SD)组别 剂量 动物数 ALTAST 总蛋白 白蛋白 A/G(g/kg)试验 试验 (U)(U) (g/L) (g/L)前 后正常对照6 646.35± 102.80± 75.57±32.85±0.77±8.51 8.96 3.452.960.12
模型空白 16 14 205.85± 217.82± 77.04±36.16±0.89±54.32***25.05***3.55* 3.28** 0.13**垂盆草组 4 12 8 196.08± 218.96± 77.84±37.37±0.94±45.21***16.77***3.00*△ 3.95**△0.21*△△ △LY低剂量 0.3 12 8 212.81± 215.12± 76.41±35.96±0.90±65.12***51.97***2.96*△ 3.67*△ 0.17*△△ △LY中剂量 0.6 12 11 222.76± 228.18± 79.33±37.32±0.90±51.50***28.99***4.69*△ 5.33**△0.18*△△ △LY高剂量 1.2 12 10 226.13±224.53± 78.96±37.57±0.94±22.11***10.52***5.71*△ 3.45**△0.23*△△ △t检验，与正常对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01；与模型对照组比较，△p＞0.05表26.3 LY对CCl4所致慢性肝损伤的大鼠生化指标的影响(x±SD)组别 剂量动物数 ALT AST 总蛋白 白蛋白 A/G(g/kg) 试验 试验 (U) (U) (g/L)(g/L)前后正常对照 6 640.38± 104.16± 72.04±23.69± 0.50±17.40***28.75***5.17* 4.81* 0.13*模型空白 16 14323.08± 301.00± 73.20±23.73± 0.50±154.40 104.11 7.715.70 0.16垂盆草组 4 12 8 47.59±101.50± 76.44±27.61± 0.57±10.90***19.35***3.15* 2.72* 0.10*LY低剂量 0.3 12 8 38.60±80.55± 77.42±29.38± 0.61±11.30***18.54***7.89* 4.83** 0.09*LY中剂量 0.6 12 1150.93±96.46± 76.36±25.42± 0.53±8.53*** 28.03***7.07* 4.67* 0.13*LY高剂量 1.2 12 1055.38±93.52± 79.37±24.75± 0.46±23.38***36.32***5.10** 4.95* 0.13*t检验，与模型空白组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01表26.4 LY对CCl4所致慢性肝损伤大鼠肝羟脯氨酸含量及肝脏系数的影响(x±SD)组别 剂量动物数 肝脏系数 羟脯氨酸(g/kg) 试验前 试验后正常对照 6 6 39.22±3.52***1.899±1.51*模型空白 16 1446.98±5.45 4.056±3.69垂盆草组 4 12 8 43.89±5.73* 1.696±1.14*LY低剂量 0.3 12 8 44.60±3.78* 3.469±4.58*LY中剂量 0.6 12 1144.37±6.23* 1.101±0.26**LY高剂量 1.2 12 1046.33±7.19* 1.045±0.40**t检验，与模型空白组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01
由表26.2可见，CCl4造型后，大鼠血清中ALT、AST含量显著增加，用药后由表26.3和26.4可见，LY对CCl4所致大鼠慢性肝损伤血清ALT、AST的含量，与模型组比较存在显著性差异(p＜0.01)。对血清TP、ALB、A/G的影响不大。中、高剂量能显著降低CCl4慢性肝损伤大鼠肝脏羟脯氨酸(P＜0.05)，而低剂量组则无显著性差异(P＞0.05)。
病理组织检查结果表明模型组大鼠肝组织正常结构破坏，并有较明显的纤维隔形成，肝索排列紊乱，肝细胞明显肿胀变性，肝小叶结构破坏，纤维结缔组织增生，假小叶形成。中央静脉周围有少量坏死的肝细胞，并伴有中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞浸润。汇管区由于结缔组织增生而变宽。LY组与模型组相比，肝细胞变性程度明显减轻，纤维结缔组织明显减少，未见明显假小叶形成，汇管区结缔组织增生不明显。结果见表26.5。
表26.5 LY对CCl4所致慢性肝损伤大鼠肝脏病理组织学观察组别 N炎性浸润 脂肪变性 坏死纤维化无 局弥无轻中重 无 点 灶 片 桥 0III III灶漫 度度度状 状 状 接 级 级 级 级正常对照 66 0 0 6 0 0 0600060000模型空白 14 3 110 3 2 7 211 20102390垂盆草组 80 8 0 2 5 1 0700102510LY低剂量 80 8 0 0 8 0 0800000800LY中剂量 11 4 7 0 1 7 3 010 00107400LY高剂量 10 1 8 1 1 7 2 08002073002.4 LY对琼脂所致大鼠肉芽肿的影响健康SD雄性大鼠61只，230～270g，随机分为6组，阳性对照组除垂盆草外，增设一组西药对照阿斯匹林组。按表中所示剂量给药，给药前每只大鼠背部皮下注射2％灭菌琼脂2ml/只，随后给药，每天一次，连续10天，第11天处死大鼠，剥离出琼脂肉芽肿块，电子天平称取湿重，称重后将肉芽肿在60℃下烘干6h，取出称取干重。结果见表27。
表27 LY对琼脂所致大鼠肉芽肿的影响(x±SD)组别剂量(g/kg)N肉芽肿湿重(mg) 肉芽肿干重(mg)空白对照 11 895.6±216.3 132.6±44.6阿斯匹林0.04 10 471.9±81.2*** 62.4±14.2***垂盆草 5 10 756.2±247.1* 131.3±64.8*LY低剂量0.3 10 747.8±122.9* 104.2±29.7*LY中剂量0.6 10 756.4±375.8* 101.0±57.4*LY高剂量1.2 10 594.6±172.8***54.0±25.9***
与空白对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表27可见，LY三个剂量组对琼脂所引起的肉芽肿重量均有减轻，高剂量组统计有显著意义。
2.5对鸭乙型肝炎病毒作用2.5.1实验方法将感染阳性鸭77只随机分为5组(1)病毒对照组(16只)用淀粉胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为500mg/只。
(2)阳性药物对照组(15只)用拉米夫定胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为50mg/kg.d。
(3)LY小剂量组(16只)每日口腔灌喂1次，剂量为80mg/kg.d。
(4)LY中剂量组(14只)每日口腔灌喂1次，剂量为300mg/kg.d。
(5)LY大剂量组(16只)每日口腔灌喂1次，剂量为600mg/kg.d。
实验用药时间为28天，停药观察7天。观察指标如下(1)血清DHBV DNA改变情况于用药前、用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。采用斑点杂交法[5]，用罗氏(Roche)公司的地高辛标记试剂盒(Cat.No.1745832)制备DHBV DNA探针统一检测，用Vuego Scan(Brisa-620ST)扫描仪进行膜片扫描；用the Discovery SeriesQuantity One软件对斑点进行定量分析，斑点值为volume(volume＝intensity×mm2)。统计学采用SPSS10.0配对t检验法(F检验)处理。
(2)血清DHBsAg改变情况于用药前、用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。将用药前后的血清统一对比检测，采用ELISA快速法[7]、酶标阅读仪(Bio-TEK公司)490nm读取0.D值。统计学采用SPSS软件，配对t检验。
(3)实验结束各组肝脏病理(HE染色)检测于停药7天分别剖杀各组实验动物，各取肝右叶边缘小块肝组织固定于10％甲醛溶液，石腊切片，用HE染色，病理检查。
2.5.2实验结果(1)LY对乙肝鸭血清中DHBV DNA滴度的影响
表28 LY对乙肝鸭血清中DHBV DNA滴度的影响表28.1 各组别DHBV DNA差值情况比较(X±S)组别 用药7d 用药14d 用药21d 用药28d 停药7d-2.837± 239.187± 394.2352± 221.3484± 169.2754±淀粉胶襄154.2299306.7377 371.3968 317.8262 588.2919-246.6639±-131.9997± -142.5544± -224.6403±39.3333±拉米夫定106.08* 139.2033*91.6785* 154.6765* 279.4168-74.7257± 70.6732± 40.4474±-110.7338±-157.80623LY大剂量202.848 320.8429 184.8002* 157.2606* ±249.7785-46.4791± 96.9446± 65.5759±-134.5066±-100.2533±LY中剂量193.9633252.6191 294.2348* 219.7854* 248.872546.9233± 225.1608±159.677±-92.7258± -46.9878±LY小剂量126.4668191.1758 212.2943* 166.7057* 194.0589与淀粉胶襄组比较，*P＜0.05，(SPSS10.0 F检验)表28.2 各组别DHBV DNA差率情况(X±S)组别 用药7d 用药14d 用药21d 用药28d 停药7d-0.0123± 0.1375± 0.2266± 0.1298± 0.0968±淀粉胶襄0.0859 0.17350.21270.18510.3484-0.1296± -0.0700±-0.0740± -0.1141±0.03484±拉米夫定0.05392* 0.07187* 0.04725* 0.0709* 0.1569-0.0401± 0.03381± 0.01899±-0.0563±-0.0729±LY大剂量0.1029 0.17150.1024* 0.08316* 0.1136-0.0177± 0.05554± 0.04449±-0.0614±-0.0434±LY中剂量0.09655 0.12450.1515* 0.1049* 0.11420.02355± 0.1115± 0.07923± -0.0429±-0.0203±LY小剂量0.06201 0.09875 0.1063* 0.08468* 0.09601与淀粉胶襄组比较，*P＜0.05，(SPSS10.0 F检验)由表28.1、表28.2可知a.拉米夫定组用药7天后开始出现血清DHBV DNA滴度降低，与淀粉胶囊组比较有显著性差异；b.LY大、中、小剂量组分别于21天开始出现血清DHBV DNA滴度降低，与淀粉胶囊组比较有显著性差异；c.LY大、中、小剂量组与拉米夫定组用药期间均有血清DHBV DNA滴度降低，但LY组较拉米夫定组起效时间晚。
表28.3 对乙肝鸭血清中DHBV DNA反跳的影响-差值、差率比较(X±S)差值 差率组别用药28d 停药7d 用药28d 停约7d221.3484± 169.2754±淀粉胶襄 0.1298±0.18510.0968±0.3484317.8262 588.2919
-224.6403± 39.3333±0.03484±拉米夫定-0.1141±0.0709154.6765 279.4168* 0.1569*-110.7338± -157.80623± -0.0563±LY大剂量 -0.0729±0.1136157.2606 249.77850.08316-134.5066± -100.2533±LY中剂量-0.0614±0.1049 -0.0434±0.1142219.7854 248.8725-92.7258±-46.9878± -0.0429±-0.0203±LY小剂量166.7057 194.05890.08468 0.09601各组自身用药、停药前后比较，*P＜0.05，(SPSS10.0 F检验)由表28.3可知a.拉米夫定组停药7天后，开始出现血清DHBV DNA滴度反跳，与停药前比较有显著性差异；b.LY大、中、小剂量组停药7天后，未出现血清DHBV DNA滴度反跳，与停药前比较无显著性差异；c.LY大、中、小剂量组较拉米夫定组停药7天，血清DHBV DNA滴度变化不明显，未见明显反跳。
(2)LY对乙肝鸭血清DHBsAgO.D的影响病毒对照组(淀粉胶囊)、阳性药物对照组(拉米夫定)及LY各剂量组用药后28天，血清DHBsAgO.D值均无明显降低。见表29。
表29 LY对乙肝鸭血清DHBsAgO.D的影响(x±SD)组别用药前 用药7天用药14天 用药21天 用药28天 停药7天0.273±0.265± 0.414± 0.377± 0.273± 0.226±淀粉胶囊组0.097 0.088 0.1360.1350.0790.1030.324±0.295± 0.362± 0.302± 0.287± 0.262±拉米夫定组0.114 0.156 0.1410.1170.1100.1490.264±0.238± 0.336± 0.338± 0.297± 0.219±LY大剂量0.169 0.172 0.2320.2450.2040.1200.229±0.246± 0.333± 0.330± 0.257± 0.212±LY中剂量0.064 0.073 0.1170.1200.0860.0810.222±0.237± 0.377± 0.391± 0.243± 0.214±LY小剂量0.091 0.110 0.1510.1960.0810.177注上表所列为各组DHBsAgO.D值平均数及标准差，统计学采用配对t检验，为各组不同时间DHBsAgO.D值与同组用药前DHBsAgO.D值的比较。
(3)肝脏HE染色病理检查结果
各组肝组织结构基本正常，均有较轻程度肝细胞浊肿变性；嗜酸变性少；部分组织有肝细胞点状坏死现象，这些病理表现用药组与对照组无明显差异；汇管区、小叶间隔有轻～中度炎症细胞浸润，淀粉胶囊组炎症细胞浸润程度(中度)较其余各组(轻度)略重。
2.6 LY对小鼠免疫功能的影响2.6.1 LY对正常小鼠免疫功能的影响[3]2.6.1.1对正常小鼠免疫器官的影响取健康小鼠50只，雌性，体重12～16g，随机分为五组，分别为空白对照组，芸芝多糖0.4g/kg对照组，LY0.5g/kg、1.0g/kg和2.0g/kg剂量组，连续给药7天，末次给药后，动物处死，摘取胸腺、脾脏，称重，并计算脏器系数(脏器重量(mg)与体重(g)之比)。结果见表30。
表30 LY对正常小鼠免疫器官重量的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg) N胸腺指数 脾指数空白对照 10 4.503±0.826 5.526±0.946芸芝多糖 0.410 4.485±1.203* 5.672±1.360*LY 0.510 4.656±0.817* 5.031±1.417*LY 1.010 4.443±0.619* 5.283±1.382*LY 2.010 4.350±1.026* 6.882±4.040*与空白对照组比较，*p＞0.05。
由表30可见，LY对正常小鼠免疫器官的重量未见明显影响。
2.6.1.2对非特异性免疫功能的影响——碳粒廓清法[3]雄性小鼠50只，体重18～22g，分组，给药同上，未次给药后各鼠尾静脉注射经稀释后的印度墨汁0.1ml/10g，于2min(t1)、10min(t2)眼球静脉丛取血20μl，加入到0.1％Na2CO3溶液2ml中，摇匀，于640nm波长下比色，测定t1和t2时的吸光度，分别为OD1、OD2。取血完后，将小鼠放血处死，摘取肝、脾，称重，按下列公式计算廓清指数K和吞噬指数α。结果见表31。
K＝(lgOD1-lgOD2)/(T1-T2)α＝W*K1/3/(WLS)公式中OD为血中各时间点的吸光度，T为时间，W为体重，WLS为肝脾合重。
表31 LY对正常小鼠碳粒廓清速率的影响(x±SD)组别 剂量(mg/kg)N K α
空白对照 10 0.0393±0.0236 5.027±1.098芸芝多糖0.410 0.0450±0.0180*5.667±0.785*LY 0.510 0.0360±0.0196*5.349±1.027*LY 1.010 0.0310±0.0080*4.836±0.714*LY 2.010 0.0365±0.0129*5.276±0.995*与空白对照组比较，*p＞0.05。
由表31可见，LY对正常小鼠碳粒廓清速率未见明显影响。
2.6.1.3对特异性体液免疫功能的影响——血清溶血素测定法[3]雌性小鼠50只，体重18～22g，分组，给药同上，连续给药7天，给药第三天，每鼠腹腔注射3∶5(V/V)的绵羊红细胞(SRBC)0.2ml/只进行免疫，给药结束后小鼠眼静脉丛取血，分离血清，将血清以生理盐水500倍稀释供测定。反应管内加入1ml血清，10％SRBC 0.5ml，10％补体1ml，置37℃恒温水浴中保温30min，然后移至冰浴中终止反应，离心后取上清液1ml，加都氏液3ml，摇匀，放置10min，于540nm波长处比色读取吸光度。测定SRBC半数溶血值取10％SRBC 0.25ml加都氏试剂至4ml，比色读取吸光度值。计算血清HC50＝样品的吸光度值/SRBC半数溶血值×稀释倍数。结果见表32。
表32 LY对小鼠溶血素生成的影响(x±SD)组别 剂量(mg/kg) NHC50空白对照 10 480.8±94.04芸芝多糖 0.4 10 627.6±146.7**LY 0.5 10 496.7±116.8*LY 1.0 10 489.9±121.6*LY 2.0 10 494.9±134.8*与空白对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05由表32可见，LY对正常小鼠的溶血素水平无明显影响。
2.6.2对免疫低下小鼠免疫功能的影响2.6.2.1对CY所造成免疫低下小鼠免疫器官的影响[4]小鼠68只，雌性，体重18～22g，随机分为六组，分别为空白对照组，模型对照组，阳性药组，LY高、中、低三个剂量组，连续给药7天。采用CY造成免疫低下模型，除空白对照组外，其余每组小鼠从第五天开始每天ip CY 50mg/kg体重，连续三天造模。第八天，动物处死，摘取胸腺、脾脏、称重，并计算脏器系数。结果见表33。
表33 LY对免疫低下小鼠免疫器官重量的影响(x±SD)
组别剂量(g/kg) N 胸腺指数 脾指数空白对照184.11±0.93***4.58±1.14***模型对照(CY)0.05102.58±1.06 2.77±0.72芸芝多糖+CY 0.4+0.05103.45±0.66** 2.68±0.55*LY+CY 0.5+0.05102.45±0.45* 2.84±0.55*LY+CY 1.0+0.05103.32±0.35** 3.28±0.86*LY+CY 2.0+0.05103.05±0.80* 3.04±0.75*与CY对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01。
由表33可见，LY使免疫低下小鼠的免疫器官的降低有所减轻，中剂量组对胸腺指数的降低的保护作用统计有显著意义。
2.6.2.2对非特异性免疫功能的影响——碳粒廓清法[4]小鼠67只，雄性，体重18～22g，按表8所示进行分组给药、免疫低下造模同上，第八天各鼠尾静脉注射经稀释后的印度墨汁0.1ml/10g，于2min(t1)、10min(t2)眼球静脉丛取血20l，加入到0.1％Na2CO3溶液2ml中，摇匀，于640nm波长下比色，测定t1和t2时的吸光度，分别为OD1、OD2。取血完后，将小鼠放血处死，摘取肝、脾，称重，计算廓清指数K和吞噬指数α。结果见表34。
表34 LY对免疫低下小鼠碳粒廓清速率的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg) N K α空白对照 170.02836±0.0098*4.786±0.586**模型对照(CY) 0.05100.02577±0.0064 4.221±0.736芸芝多糖+CY0.4+0.05100.03529±0.0122** 5.264±0.898**LY+CY 0.5+0.05100.02250±0.0045*4.406±0.534*LY+CY 1.0+0.05100.03274±0.0096*4.898±0.831*LY+CY 2.0+0.05100.02950±0.0093*5.288±0.737**与CY对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05。
由表34可见，LY高剂量组能显著增加免疫低下模型小鼠的吞噬指数。
2.6.2.3对特异性体液免疫功能的影响——血清溶血素测定法[3，4]小鼠65只，雌性，体重18～22g，按表14所示进行分组给药，给药第五天起，第天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，1次/d，连续三天，造成免疫低下模型，给药第三天，每鼠腹腔注射3∶5的SRBC 0.2ml/只进行免疫，连续给药7天，第八天小鼠眼静脉丛取血，分离血清，将血清以生理盐水500倍稀释供测定。反应管内加入1ml血清，10％SRBC 0.5ml，10％补体1ml，置37恒温水浴中保温30min，然后移至冰浴中终止反应，离心后取上清液1ml，加都氏液3ml，摇匀，放置10min，于540nm波长处比色读取吸光度。测定SRBC半数溶血值取10％SRBC 0.25ml加都氏试剂至4ml，比色读取吸光度值。计算血清HC50＝样品的吸光度值/SRBC半数溶血值×稀释倍数。结果见表35。
表35 LY对免疫低下小鼠溶血素生成的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg) N HC50空白对照 15345.4±64.8***模型对照(CY) 0.0510212.3±53.2芸芝多糖+CY 0.4+0.0510324.7±77.9***LY+CY0.5+0.0510286.9±82.7**LY+CY1.0+0.0510317.7±102.2***LY+CY2.0+0.0510322.6±96.7***与CY对照组比较，***p＜0.01，**p＜0.05由表35可见，LY三个剂量组均可提高免疫低下小鼠的血清溶血素水平。
3.结论受试药物LY能显著降低CCl4和D-半乳糖胺所引起的小鼠血清ALT、AST含量的增高；LY能明显抑制CCl4所引起的慢性肝损伤大鼠血清ALT、AST含量的增高，能降低肝损伤大鼠肝脏中羟脯氨酸的含量；LY对正常小鼠的免疫功能无明显影响，对CY所造成的免疫低下小鼠的体液免疫功能有一定的增强作用，对免疫低下小鼠的免疫器官系数的降低也有减轻作用；高剂量LY对琼脂引起的大鼠肉芽肿的抑制作用有显著的统计意义。
用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效的治疗药物，已为国内外学者所应用[9]。1-3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象[10]，因此，应用1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行LY抗病毒疗效的考核，期望筛选出有抗乙型肝炎病毒作用的药物。并用对乙型肝炎病毒有明显抑制作用的核苷酸类似物拉米夫定作为阳性药物对照。
本次动物试验结果表明LY大、中、小剂量组和阳性药物对照拉米夫定组用药28天，鸭血清中的DHBV DNA滴度降低有显著意义，其中拉米夫定组在停药7天后鸭血清中DHBV DNA有明显反跳，而LY大、中、小剂量组在停药7天后鸭血清中的DHBVDNA未出现反跳，说明LY具有抑制鸭乙型肝炎病毒作用且停药后无反跳。此外，各试验组血清中DHBsAg均无明显的降低，说明LY对鸭乙型肝炎病毒表面抗原抑制作用不明显。
由于鸭乙型肝炎动物模型自身的特点，1-3日龄雏鸭免疫系统发育不完善，在感染DHBV后，仅出现单纯的病毒携带状态，肝脏组织病变轻微，肝功能无明显异常[1，2]。的实验结果发现LY各剂量组肝组织病理检测与对照组无明显差异，可说明连续用药1个月LY对肝组织无明显毒性损害。
以上实验表明，LY具有保肝、抗炎、抑制鸭乙型肝炎病毒、增强免疫低下小鼠免疫功能及等作用。
权利要求
1.一种组合物，其特征在于，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。
2.权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，它包括下述步骤(1)选取合格的药材Y和L，压碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，将其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，将其制成干粉II；(4)将干粉I与干粉II混合均匀，按照常规工艺制成口服药物制剂。
3.如权利要求2所述的组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的Y粉与步骤(3)中的L粉按照常规工艺制成口服药物制剂。
4.权利要求1所述的组合物在制备治疗急、慢性乙型肝炎携带者的药物中的应用。
5.权利要求1所述的组合物在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。
6.权利要求1所述的组合物在制备治疗肝硬化的药物中的应用。
7.Y和L在制备治疗急、慢性乙型肝炎携带者的药物中的应用。
8.Y和L在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。
9.Y和L在制备治疗肝硬化的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种组合物，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。本发明还提供了上述组合物的制备方法，它包括下述步骤(1)选取合格的药材Y和L，压碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，将其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，将其制成干粉II；(4)将干粉I与干粉II混合均匀，按照常规工艺制成固体药物制剂。本发明还提供了上述组合物在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为急、慢性乙型肝炎携带者、脂肪肝或肝硬化。本发明还提供了Y和L在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为急、慢性乙型肝炎携带者、脂肪肝或肝硬化。
文档编号A61P1/00GK1586536SQ200410062800
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者李求是 申请人:北京万赛生物医药技术发展有限公司
技术领域：
本发明涉及药用组合物领域，更具体的说，涉及一种具有治疗肝病功能的组合物及其制备方法。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染性肝病。全世界已有20多亿人口被感染，约3.5亿人成为慢性HBV感染者。慢性携带者易于发生肝硬化与肝癌，全世界每年有100余万患者死于肝病，其中1/3在中国。另外，HBV携带者的母亲可以通过垂直传播给婴儿，婴儿时期感染HBV者，90％以上受染成为慢性HBsAg携带者，影响下一代的健康，危害极大。
1989年，李求是博士受中国科协委托承担“新型免疫调节剂研制”的课题，根据天人合一的思想和拟态理论，参考了大量中医药古籍及现代医药学文献，在神经-内分泌-免疫网络理论指导下，运用现代免疫药理学筛选方法，寻找兼具保肝、抗炎、抗乙型肝炎病毒和免疫调节活性的药物。研究结果证明，Y与L经过适当工艺处理，并合理配比，临床效果满意，终形成本发明。
发明内容
本发明提供了一种组合物，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。
本发明还提供了上述组合物的制备方法，它包括下述步骤(1)选取合格的药材Y和L，压碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，将其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，将其制成干粉II；(4)将干粉I与干粉II混合均匀，按照常规工艺制成药物制剂。
在上述的组合物的制备方法中，步骤(2)中的Y粉与步骤(3)中的L粉的重量比范围优选为1∶10～10∶1。
本发明还提供了上述组合物在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为慢性乙型肝炎、脂肪肝或肝硬化。
本发明还提供了Y和L在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为慢性乙型肝炎、脂肪肝或肝硬化。
本发明的组合物的功能主治为清热解毒，化湿利肝，保肝降酶，抑制乙肝病毒。用于治疗慢性乙型肝炎，热毒内蕴，湿浊互阻者。
本发明的组合物中Y性甘寒、无毒、归肺、胃、心经，具有清热解毒，凉散风热作用。Y含绿原酸及异绿原酸，它有广泛的抗微生物作用，对多种细菌、病毒有抑制作用，同时又具有加强防卫机能的功效，Y的煎剂稀释至1∶1280，仍能促进白细胞的吞唾功能，近代研究表明，Y对免疫系统有调节作用。L性甘寒、无毒、归心、胃经，它具有清热解毒作用。L中含有多糖，多糖具有抗炎、增强免疫、护肝等作用，所以绿原酸及L多糖为本发明的组合物中的活性成分。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是这些实施例不以任何方式限制本实施例1 提取工艺药材的粉碎Y(药材应检验合格)称量后经80℃烘烤1h，乘热压碎成粗粉，得率约95％。L(药材应检验合格)用碾压机压碎成粗粉，筛去100目以下的细粉，得率约95％。
Y粗粉，加10倍量75％乙醇，浸泡20min，回流2h，滤过，沥干，得醇提液I与药渣，药渣加8倍75％乙醇，回流0.5h，滤过，沥干，得醇提液II与药渣，弃药渣合并醇提液I、II，减压回收乙醇成相对密度约为1.08(70℃)的浓液，过滤，喷雾干燥，得干粉I(Y提取物)。
L粗粉，加水10倍，搅拌15min，室温浸泡3h，吸取上清液，将清液在60℃下减压浓缩成相对密度约为1.02～1.03(60℃)的浓液，过滤，喷雾干燥，得干粉II(L提取物)。
将干粉I与干粉II混合均匀，干法制粒(过10目筛)，颗粒装胶囊(0号空心胶囊)，铝塑包装，得成品。
实施例2 有效组分的确立与鉴定有效组分的确立(1)绿原酸在对药材性质的文献查阅和对组合物全面分析后，确立了Y中的绿原酸为活性成分中的指标成分，其理由有以下几点a、绿原酸具有广泛的生物活性，例如抗病毒、抗炎、调节免疫等，与本制剂功能主治的作用相吻合。
b、绿原酸在Y中含量较高，一般在2-3％左右。
c、绿原酸用高效液相法检测，方法成熟，被药典收载，且药典附有对照品，经预试，L的提取成分与绿原酸无干扰。
d、绿原酸易溶于乙醇，提取容易。
(2)多糖L的主要成分为碳水化合物，约占59％，其次为蛋白质，约占22％，其中氨基酸较全面，有17种以上。L中脂肪很少，仅占0.8％，此外，还有少量的无机元素，需要特别指出的是，经预试，L中含有3-4％的多糖，该多糖是一类活性物质，近代研究表明，多糖不但能够治疗因机体免疫系统严重损伤所致的肿瘤，还能治疗因多种免疫缺损所致的慢性病，例如慢性肝炎等。
有效组分的鉴别(1)绿原酸的定性鉴别方法2000版药典中Y中“鉴别”项(药典法)供试品的制备取Y提取液的喷粉5g，溶于50ml甲醇中，必要时过滤即得。
结果与对照品相同位置处(Rf＝0.49)显示兰色荧光斑点。
结论提取物中绿原酸呈阳性反应。
(2)多糖的鉴别与测定由于多糖为一类无定形粉末，结构多变，无标准品可对照。因此，采用水浸液与费林试剂及碘液、碘化钾一碘试液等来鉴别L中的多糖。结果显示，L中含有多糖。
多糖的含量测定方法参照2000版药典(一)中“玉竹”的含量测定，该法中由于加入硫酸后溶液温度超过40℃，故改为在100℃水浴中保温30min。
实施例3 LY的急性毒性试验在预备试验中，小鼠灌服大剂量LY亦不致死，不能测出半数致死量，故采用最大给药量试验。
1.受试药物LY，由北京万赛生物医药技术发展有限公司提供。批号030313。实验用胶囊内容物为淡褐色粉未，临用前加蒸馏水，配制成0.2g/ml的混悬液，供灌胃用。
剂量取LY内容物，配制成0.2g/ml浓度的溶液供小鼠灌胃，一日内分三次给药，间隔4h，每次灌胃0.3ml/10g，总量0.9ml/10g，即18g/kg，人临床拟用量为0.1g/kg。此剂量为临床人拟用量的180倍。
2.实验动物ICR小鼠20只，18～21g，雌雄各半，由中国药科大学实验动物中心提供，合格证SCXK(苏)2002-0011号。
3.试验方法与结果小鼠空腹12h称重，每鼠igLY颗粒18/kg体重(0.2g/ml～0.9ml/10g)，一日内分3次ig给完，间隔4h，观察7日。
小鼠给药当日，行动缓慢，进食减少。次日恢复食量，活动、大便均正常。观察7日未见死亡。第8日空腹12h称重，体重变化见表1。
表1 小鼠急性毒性试验体重变化给药前体重 第8日体重性别鼠数增长率(％)(g，X±SD) (g，X±SD)♂ 1020.9±1.10 26.1±1.60*** 25.17♀ 1020.3±1.49 22.8±1.23*** 12.71t检验，与给药前比，***P＜0.01由表1可见，小鼠灌服LY内容物，体重正常增长。
4.小结在小鼠急性毒性试验中，采用最大给药量法，igLY内容物18g/kg体重，为临床人用量的180倍。给药后观察7日，未出现死亡及明显中毒反应，体重正常增长。
实施例4 LY的长期毒性试验1.受试药物LY由北京万赛生物医药技术发展有限公司提供，批号030314、030315。动物实验用胶囊内容物，为淡褐色粉未，临用前加适量蒸馏水，配制成0.125g/ml、0.25g/ml浓度的溶液供灌胃用，灌胃体积为低剂量组ig 0.125g/ml的溶液2ml/100g、中剂量组ig 0.25g/ml的溶液2ml/100g，由于药物浓度增加后，ig困难，因此高剂量组ig 0.25g/ml的溶液3ml/100g。每三天配一次，配好后冰箱保存。
剂量LY临床拟用量为每日0.1g/kg。按动物与人等效剂量折算，大鼠治疗量约为0.8g/kg体重，长毒试验用高、中、低剂量设置为7.5g/kg体重、5.0g/kg体重和2.5g/kg体重，高剂量相当于临床人用量的约75倍，低剂量约为药效高剂量的2倍。
2.实验动物SD大鼠160只，雌雄各半，雌鼠体重70～86g，雄鼠70～86g，由中国药科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏)2002-0011号。称重后随机分为4组对照组及高、中、低剂量给药组。每组40只，雌雄各20只，分笼喂养，每笼5只。饲养室温度20±2℃，相对湿度70±5％。具有排风、通气、恒温设备，自然光照。饲料用全价颗粒饲料，饮水用清洁自来水，放饮水瓶内自由饮用，每日更换。
3.试验方法3.1给药均口服给药，容积低、中剂量为2ml/100g，高剂量组为3ml/100g，对照组ig清洁自来水2ml/100g，3个剂量给药组分别灌服LY内容物2.5g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg，此剂量相当于生药量为23.1g/kg、46.2g/kg、69.3g/kg。连续给药六个月，上午8:00～10:00给药，给药结束后投放饲料。每周称重1次，按体重变化调整给药量。上述给药方案的依据是(1)给药途径灌胃给药，与临床口服用药一致。
(2)剂量高剂量相当于拟用临床剂量的约75倍。
(3)给药周期6个月。根据《中药新药药理毒理研究的技术要求》的规定，动物给药周期为临床用药周期的3～4倍，符合长毒试验给药周期的规定。
3.2观察与检测给药期间，每日观察动物一般状况，每周称重1次，记录体重变化。给药3个月后，各组取雌雄各5只大鼠，进行各项指标检测，包括称重，取血供血液学检验和血清生化检验，摘取主要脏器，作脏器系数测定和病理学检验。各组余下雌雄各15只大鼠，继续给药，给药6个月后，再次每组取雌雄各10只大鼠，同上法检测各项指标。余下每组雌雄各5只，作恢复期观察四周。恢复期观察结束后，同上法检测各项指标。
4.试验结果按检测指标，分别统计，报告于下。
4.1体重及一般状况(1)给药期间及恢复期，各组动物均无死亡。
(2)动物进食、饮水、大、小便均正常，外观、行为、体征亦无异常表现。
(3)各组动物体重均持续、稳定增长，并以给药组与空白对照组比较，作显著性检验(t检验)。结果见表2、表3。
表2 雄性大鼠长期毒性试验体重变化(X±SD)时间空白对照高剂量 中剂量 低剂量给药后 N＝205.1983.1±4.04 82.2±2.68 81.8±2.76 81.2±2.765.26100.9±3.46 95.6±5.89** 95.0±6.04**96.4±4.89**6.2 153.9±6.60 140.8±10.84** 137.8±15.28** 137.6±12.75**6.9 204.2±9.42 180.9±13.70** 182.1±16.13** 176.2±19.50**6.16245.4±18.18221.3±15.35** 223.5±20.31** 218.9±23.46**6.23262.9±17.54256.1±19.69 253.0±26.16250.9±28.696.30290.9±25.02288.9±18.42 283.1±31.27285.2±32.667.7 314.8±19.84316.0±21.23 307.7±35.77324.6±34.477.14343.6±19.50349.8±21.55 343.7±44.64355.5±38.197.21368.9±17.30370.7±22.00 362.8±47.99372.8±40.087.28398.6±16.24411.0±18.64*395.5±53.91401.2±41.68.4 414.6±20.74434.5±20.34** 416.7±55.10412.8±43.19三个月 N＝15后8.11 446.3±27.00 467.2±27.26*460.9±56.09448.9±55.288.18 469.7±32.08 489.5±30.00 476.5±60.32466.0±56.368.25 486.9±36.57 502.1±37.18 494.8±64.30485.2±54.119.1502.0±40.10 514.7±41.30 506.8±70.25496.1±52.829.8510.2±43.07 524.7±41.12 514.3±67.82507.2±53.12
9.15 520.1±46.50536.4±39.57524.8±65.70520.7±54.559.22 536.8±45.00553.3±35.47538.7±67.36533.6±53.909.29 561.3±44.69575.0±45.88558.2±74.36549.1±56.1110.6 576.2±44.62583.9±45.17578.2±72.38560.5±55.2810.13580.8±46.25596.3±54.33585.4±72.87564.3±62.6210.20599.5±49.31610.3±56.44599.0±76.23579.7±61.2410.27599.1±46.93593.2±58.87601.4±77.84586.9±64.0411.3 600.4±47.28596.8±58.31600.6±78.39590.1±61.1511.10609.7±51.41620.1±57.40605.4±82.74602.1±64.30恢复期 N＝511.17595.0±69.22581.4±26.73573.2±82.07573.4±55.9911.24603.8±68.21595.0±26.31584.8±85.37578.2±57.0412.1 624.8±73.56609.8±28.95603.6±92.62583.6±56.6312.8 647.6±82.76643.2±31.66618.0±74.08591.0±55.99t检验(下同)，与对照组比较，*P＜0.05，**p＜0.01表3 雌性大鼠长期毒性试验体重变化(X±SD)时间 空白对照高剂量 中剂量 低剂量给药后 N＝205.19 83.8±3.79 84.1±3.58 81.6±2.64* 86.0±6.645.26 98.5±4.89 99.4±8.68 92.2±4.25** 97.7±8.496.2 143.6±9.77 135.9±10.92* 132.3±8.36**136.1±13.656.9 176.9±11.79167.3±10.00** 169.7±11.02 180.3±35.786.16 195.1±9.97 188.2±12.19193.4±12.74 196.1±11.756.23 205.4±12.93208.2±10.56216.8±14.33*212.2±12.076.30 225.2±12.69230.1±10.62240.4±15.07** 231.5±16.897.7 240.8±12.58245.0±12.77259.3±19.13** 247.6±20.567.14 251.4±11.82266.4±12.08** 276.6±22.45** 266.0±21.64*7.21 261.3±15.32273.4±13.60* 287.7±25.30** 276.4±23.92*7.28 273.9±20.35286.6±14.50* 299.1±28.17** 290.6±22.21*8.4 280.2±20.49291.0±23.85304.7±29.26** 298.0±19.65*三个月 N＝15后8.11 292.3±26.51297.2±25.81308.1±34.73 306.9±23.498.18 296.7±26.61300.8±26.66313.7±37.38 314.0±24.578.25 302.1±28.24305.9±27.89319.2±38.88 320.3±23.299.1 308.9±29.37313.3±29.89323.7±40.46 328.5±25.819.8 316.5±29.11320.6±29.99334.0±42.96 337.1±26.259.15 323.8±30.42329.5±30.88342.7±44.62 344.9±26.919.22 331.4±28.45339.3±29.84352.5±44.66 353.6±29.42*9.29 345.3±29.74350.5±29.56367.7±42.41 361.5±34.0710.6 356.7±31.19360.7±23.59379.1±41.19 375.1±40.0210.13360.5±31.89365.6±20.84389.6±57.41 388.1±47.8610.20363.6±32.73370.2±20.56385.1±46.39 384.2±39.4710.27364.1±33.66371.0±22.22383.0±39.23 383.0±41.7411.3 367.7±33.41376.6±22.64388.9±39.20 388.9±41.2411.10364.5±32.90371.3±22.88384.0±41.13 385.7±44.29
恢复期 N＝511.17 363.2±39.52358.2±26.56376.2±48.28343.4±39.6111.24 366.4±42.88363.2±28.89379.0±49.84349.0±38.9112.1369.4±44.81371.8±30.95383.6±51.38358.8±37.0112.8372.6±45.76378.8±31.23392.8±58.41365.6±37.48t检验，与对照组比较，*P＜0.05，**p＜0.01由表2、表3可见，给药组与对照组动物体重均明显增长，给药组雄性动物在给药后第2、第3、第4和第5周体重与空白对照组比较有显著差异；雌性动物高剂量组第3、第4和中剂量组第1、第2、第3周与空白对照组有显著差异，分析原因可能是由于给药容积过大，使动物的正常摄食量减少所致。但基本在5周后即恢复正常，而且雌性动物在6周后还显示出体重增长显著大于空白对照组。三个月后动物体重增长速度给药组与空白组基本一致。以上结果表明，LY长期口服对实验动物体重变化无明显影响。
4.2血液学检验大鼠股动脉取血，以玻片法作凝血时间(CT)测定。以Coulter-T450自动血液检测仪(美国产)及其配套试剂作血液白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)计数、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、淋巴细胞相对计数(LY％)、淋巴细胞绝对计数(LY#)的测定。结果见表4～表9。
表4 雄性大鼠长毒试验给药三个月后血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量 WBC RBC HGB HCT PLT LY％ LY# CT别 (g/kg(109/ (1012/ (g/L)(％)(109/ (％) (109/L (s))L) L) L) )对 510.307.48± 14.9040.64 888.60 71.48 7.30± 29.00照 ±2.20 0.27 ±0.75 ±1.61 ± ±3.74 1.13 ±7.4869.98L 5 7.5 9.94±8.09± 14.0043.34 1003.0 67.78 7.55± 34.60Y4.16 0.54 ±1.91 ±2.40 ± ±16.4 3.98 ±6.47205.25 5.0 12.287.64± 14.0640.60 855.40 82.26 10.1± 29.60±4.83 0.54 ±0.98 ±2.26 ± ± 4.01 ±5.0394.913.36**5 2.5 7.70±7.78± 14.6442.40 819.80 79.10 6.20± 26.803.10 0.38 ±1.49 ±0.98 ± ± 2.82 ±5.8178.555.66*t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01
表5 雌性大鼠长毒试验给药三个月后血常规检测结果(X±SD)组 n剂量WBC RBC HGB HCT PLT LY％LY#CT别 (g/kg (109/(1012/ (g/L)(％) (109/ (％)(109/L(s)) L)L) L) )对 56.36± 7.78± 15.4441.58845.80 81.30 5.14± 29.80照 1.39 0.35 ±0.85 ±1.90 ±±2.49 1.12 ±4.8260.26LY 57.5 10.60 6.86± 13.7638.82986.60 82.18 8.74± 36.60± 0.13**±±± ±2.66 2.29* ±10.062.59* 0.57** 1.33*89.37*55.0 9.34± 6.90± 14.1037.44750.686.10 8.04±27.002.12* 0.43**±±± ± 1.77* ±2.350.59*2.09*104.52.99*52.5 5.90± 7.66± 16.0842.62857.40 83.18 4.92± 33.800.85 0.29 ±0.94 ±1.52 ± ±6.91 0.88 ±8.0497.93t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表6 雄性大鼠长毒试验给药六个月后血常规检测结果(X±SD)组别 n剂量 WBC RBC HGB HCT PLT LY％ LY# CT(g/k (109(1012(g/L)(％)(109(％) (109/(s)g) /L) /L) /L)L)对照 10 14.38 7.58 14.2840.26797.1 64.76 9.31 77.40± ±± ±0±± ± ±3.450.47 0.74 1.83 107.1 6.56 2.34 31.87LY107.5 13.48 7.19 13.4939.16716.7 72.60 9.82 110.9± ±± ±0±± ± 0±5.880.56 0.77*2.15 131.1 10.10 4.70 40.78105.0 14.12 7.56 14.1839.74823.3 65.33 9.35 54.20± ±± ±0±± ± ±4.440.96 1.46 4.29 133.5 6.85 3.60 28.57102.5 16.91 7.07 13.0737.79785.3 64.05 10.95 86.80± ±± ±0±± ± ±4.560.24*1.57*2.29*152.9 9.08 3.62 24.30*t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表7 雌性大鼠长毒试验给药六个月后血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量 WBC RBCHGB HCT PLT LY％ LY# CT别 (g/kg)(109/L (1012/ (g/L) (％) (109/L (％) (109/L)(s)) L))对 10 11.52 6.96± 14.06 39.98774.20 70.70 8.31± 65.30照 ±4.030.42 ±6.48 ±1.58 ±±7.04 3.63±105.9 33.01
LY 10 7.5 9.45± 6.67± 13.2537.58724.6070.576.67± 88.802.080.84 ±1.04 ±± ±6.101.59±2.99*185.7 35.6210 5.0 9.48± 6.09± 12.5834.83693.0067.806.58± 72.503.080.48**±±± ±7.092.87±0.92** 2.95** 130.5 40.0710 2.5 9.29± 7.04± 14.0740.12752.6062.635.92± 96.001.960.58 ±0.96 ±2.82 ± ± 1.71±165.2 11.5043.00t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表8 雄性大鼠长毒试验恢复期结束血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量WBCRBCHGB HCT PLT LY％LY#CT别 (g/kg) (109/L) (1012/L) (g/L) (％)(109/L) (％)(109/L) (s)对 5 13.92± 7.98±14.5838.28 576.80± 61.94 8.60±34.80照 2.01 0.73 ±± 70.22 ± 1.69 ±0.21 2.09 8.30 4.44LY 5 7.5 14.58± 7.93±15.1840.06 508.40± 65.94 9.18±34.203.29 0.38 ±± 64.17 ± 2.61 ±0.45 1.09 3.85 1.305 5.0 14.24± 7.11±12.9634.48 573.00± 67.42 9.48±34.605.49 2.00 ±± 204.89± 3.56 ±3.59 9.90 2.00 5.035 2.5 16.66± 7.98±14.9039.32 615.20± 72.30 12.28± 31.604.93 0.66 ±± 94.60 ± 4.80 ±0.95 3.20 7.68 5.37t检验，与对照组比，未标记者P＞0.05表9 雌性大鼠长毒试验恢复期结束血常规检测结果(X±SD)组 n 剂量WBCRBCHGB HCT PLTLY％ LY#CT别 (g/kg) (109/L) (1012/L) (g/L) (％) (109/L) (％) (109/L) (s)对 5 11.24± 6.62± 13.6634.68570.80±68.65 7.68± 34.00照 2.83 0.60 ±± 92.28 ± 2.31 ±0.85 2.329.35 2.55LY 5 7.5 9.34±6.70± 13.6434.98397.40±74.60 6.96± 32.601.75 1.25 ±± 39.85**± 1.55 ±2.20 6.413.99 2.705 5.0 11.36± 7.40± 14.5038.86498.80±72.32 8.38± 32.804.62 0.56 ±± 85.69 ± 4.12 ±0.63 2.40* 7.63 3.495 2.5 9.26±7.04± 13.8836.00566.80± 70.24 6.46±32.002.59 0.43 ±± 93.57 ± 1.87 ±0.65 2.622.07 3.46t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01
由表4～表9可见，给药三个月后，雄性动物的中、低剂量组的LY％出现显著增加(分别增加15.08％和10.66％)；雌性大鼠的高、中剂量组白细胞显著增加、红细胞、血红蛋白出现降低，但上述变化值均在正常范围内波动，所以无临床意义。给药组的其他各项血液学指标与对照组相比均未见明显差异。给药六个月后雄性动物低剂量及雌性动物中剂量组红细胞、血红蛋白出现降低，但其他两个剂量组未见明显改变，其他指标与对照组相比未见明显差异，并且所有变化值均在正常范围内波动[3]。停药后恢复期检测结果中，雄性动物各项指标给药组与空白组均无显著差异，雌性动物高剂量组PLT显著降低，中剂量组HCT有明显升高，这些变化都属散在的个别的变化。其他各项指标与空白对照组相比，均未有显著性差异。
4.3血液生化检验大鼠股动脉取血，37℃水浴放置30min，3000rpm离心10min，分离血清，以RA-XT全自动生化仪，测定丙氨酸氨基转化酶(ALT)，天门冬氨酸氨基转化酶(AST)，碱性磷酸酶(ALP)，尿素氮(BUN)，总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，血糖(GLU)，总胆红素(TB)，肌酐(CR)和总胆固醇(TCHO)。结果见表10～表15。
BUN批准文号URUV-0400，试剂批号01-1428，法国医杰公司；Cr批准文号国药准字(1999)D-58号，试剂批号320361，中生北控；GLU批准文号(93)卫药准字D-25-11号，试剂批号240491，中生北控；AST批准文号(95)卫药准字D-20(2)号，试剂批号020171，中生北控；ALT批准文号(93)卫药准字D-37-4号，试剂批号011151，中生北控；TP批准文号(93)卫药准字D-41号，试剂批号260041，中生北控；ALB批准文号(93)卫药准字D-53-5号，试剂批号250201，中生北控；ALP批准文号国药准字(1999)D-27(1)号，国药准字(1999)D-27(2)号，试剂批号27091，浙江东瓯；CHO试剂批号040206，上海名典T-BIL批准文号BILI-0600，试剂批号145136，法国医杰公司。
表10 雄性大鼠长毒试验给药三个月后血液生化测定(X±SD)
剂量 TPALBTB ALT AST组别 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L) (u/L) (u/L)对照 556.02± 31.64±1.48±152.20± 201.60±4.31 2.23 0.60 76.68 77.53LY5 7.5 63.86± 33.20±0.82±192.00± 232.00±5.27* 2.47 0.53 63.45 39.015 5.0 60.88± 33.24±1.52±137.00± 223.20±4.08 2.11 0.69 74.38 65.955 2.5 62.06± 32.58±0.58±177.40± 255.00±3.10* 1.50 0.45 89.17 43.15剂量 ALPGLU BUN CRCHO组别 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L) (nmol/L)对照 5101.80±3.36± 8.42±59.68±3.25±15.72 1.37 1.09 20.96 0.73LY5 7.5 103.40±3.30± 9.59±78.12±3.83±24.35 0.48 0.72 21.23 0.435 5.0 98.00± 3.68± 8.80±54.64±3.57±22.67 1.60 2.72 13.99 0.745 2.5 102.00±2.94± 8.49±109.50± 3.52±19.60 0.59 0.81 27.25*1.08t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表11 雌性大鼠长毒试验给药三个月后血液生化测定(X±SD)剂量 TP ALBTB ALTAST组别 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)对照 5 60.02± 33.06± 0.66± 202.20±206.40±2.04 1.29 0.4361.95 25.46LY 57.5 59.76± 33.28± 1.62± 182.80±176.80±1.84 0.80 0.5059.57 21.0455.0 61.16± 33.10± 1.28± 211.20±222.80±3.65 2.00 1.1266.61 31.8052.5 61.38± 31.90± 17.02±182.40±202.20±2.62* 3.23 36.33 49.37 39.39剂量 ALPGLUBUN CR CHO组别 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L)(umol/L) (nmol/L)对照 5 110.20± 3.96± 8.61± 66.00± 3.31±16.18 1.24 0.7817.14 0.49LY 57.5 101.40± 3.59± 9.67± 81.52± 3.51±20.66 0.98 2.2336.10 0.375 5.0 113.40± 3.37± 10.01±77.32± 3.23±26.90 0.91 0.5626.25 0.185 2.5 86.20± 2.99± 7.98± 95.94± 3.27±16.96 0.35 2.1648.71 0.97
t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表12 雄性大鼠长毒试验给药六个月后血液生化测定(X±SD)剂量TPALBTB ALTAST组别 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)对照 10 64.94±33.08± 1.04± 202.50±249.60±6.54 2.28 0.4458.66 58.48LY 10 7.5 65.76±35.54± 0.81± 189.70±259.50±2.76 1.37 0.5680.12 61.1810 5.0 62.56±34.20± 1.60± 226.70±244.50±6.48 2.09 1.8950.38 50.9210 2.5 60.60±34.05± 0.92± 155.30±229.10±8.27 2.36 0.5842.54 48.32剂量ALP GLUBUN CR CHO组别 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L)(umol/L) (nmol/L)对照 10 116.40± 2.54± 8.41± 74.90± 3.79±19.76 0.66 1.4333.89 0.51LY10 7.5 118.70± 2.94± 9.87± 66.17± 3.79±32.34 0.98 1.53* 23.97 0.5910 5.0 104.00± 3.20± 9.24± 77.56± 3.58±17.80 1.16 1.8611.66 0.5210 2.5 118.40± 3.12± 9.03± 70.83± 3.66±24.86 1.08 1.2012.88 0.56t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表13 雌性大鼠长毒试验给药六个月后血液生化测定(X±SD)剂量 TPALB TB ALT AST组别 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umo l/L)(u/L) (u/L)对照 1063.03± 33.27±0.98±179.10± 239.60±5.21 2.070.44 52.58 64.90LY 10 7.5 66.19± 34.56±22.05± 180.40± 208.60±3.05 2.4965.3559.53 58.7210 5.0 63.01± 33.87±1.18±178.80± 231.50±3.49 1.680.91 47.21 49.4010 2.5 58.68± 32.18±1.15±190.70± 190.80±3.16 1.140.66 68.94 46.02剂量 ALP GLU BUN CR CHO(g/kg) (u/L) (nmol/L)(nmol/L) (umol/L)(nmol/L)组别 n对照 10109.00± 2.23± 8.83±92.90±3.44±17.78 0.791.68 26.06 0.52LY 10 7.5 107.10± 3.14± 9.62±79.03±3.78±
38.450.63* 1.17 26.64 0.4310 5.0 114.50± 1.62± 9.73± 68.01± 3.52±16.340.65 1.76 16.08 0.5210 2.5 109.70± 3.86± 8.58± 68.60± 3.64±29.891.08* 1.68 20.35 0.98t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表14 雄性大鼠长毒试验恢复期末血液生化测定(X±SD)剂量 TPALBTB ALT AST组别 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L) (u/L) (u/L)56.76±31.82± 0.96±223.40± 301.00±对照 52.10 0.68 0.61 27.13 218.547.5 60.42±33.16± 0.84±214.60± 222.40±LY 52.29* 1.94 0.62 85.16 60.785.0 61.94±33.80± 0.90±193.20± 302.80±52.15**1.64 0.41 52.12 68.722.5 60.12±33.38± 0.98±205.60± 202.80±53.68 1.57 0.54 61.00 56.86剂量 ALP GLUBUN CR CHO组别 n(g/kg)(u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L)(nmol/L)86.20±4.19± 8.17±64.10±3.12±对照 530.19 1.10 0.91 26.65 0.417.5 97.60±3.08± 8.81±63.58±3.47±LY 519.62 1.20 0.61 14.98 0.825.0 151.20± 3.02± 9.56±78.58± 3.33±531.25*0.86 1.27 29.07 0.482.5 109.40± 3.11± 8.95±77.98± 3.18±521.29 1.00 1.39 10.94 0.52t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01表15 雌性大鼠长毒试验恢复期末血液生化测定(X±SD)剂量TP ALB TB ALT AST组别 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)57.96± 33.80±1.30± 171.60± 200.00±对照 510.05 0.940.6162.14 25.857.5 57.26± 31.28±1.38± 176.60± 189.80±LY54.46 2.25* 0.6146.11 25.045.0 61.92± 33.16±1.32± 165.80± 217.20±53.58 1.900.5345.54 39.612.5 59.10± 32.88±1.24± 180.60± 193.00±52.79 1.410.9559.36 25.62
剂量 ALP GLUBUNCR CHO组别 n(g/kg)(u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L)(nmol/L)96.40±3.23± 8.18±83.52±3.70±对照 515.49 1.61 0.95 15.93 0.507.5 132.40± 2.94± 8.37±82.50±3.17±LY525.26* 0.77 2.64 36.16 0.235.0 91.00±3.09± 7.99±84.56±3.38±516.57 0.20 0.55 37.00 0.622.5 100.20± 3.82± 8.27±81.22±3.42±514.13 0.73 1.25 25.58 0.57t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05由表10～表15可见，在给药三个月的中期检测中，雄性动物高、低剂量组的总蛋白有显著升高(空白对照组为56.02±4.31，高剂量组为63.86±5.27，p＜0.05；低剂量组为62.06±3.10，p＜0.05)，雌性动物低剂量组的总蛋白也表现显著升高(空白对照组为60.02±2.04，低剂量组为61.38±2.62，p＜0.05)，但其他剂量组均未见显著改变。其余指标与空白对照组比较，统计均无显著差异。
给药六个月后雄性动物的高剂量组的尿素氮指标有显著升高(空白对照组为8.41±1.43，高剂量组为9.78±1.53，p＜0.05)，雌性动物的高、低剂量组血糖值与空白对照组比较有显著升高(空白对照组为2.23±0.79，高剂量为3.14±0.63，p＜0.05；低剂量为3.86±1.08，p＜0.01)，其余指标与空白对照组比较均未见显著差异。
恢复期的检测中雄性动物高、中剂量组总蛋白有显著升高(空白对照组为56.76±2.10，高剂量组为60.42±2.29，p＜0.05；中剂量组为61.94±2.15，p＜0.01)，雌性动物高剂量组白蛋白与空白对照组比较有显著下降(空白对照组为33.80±0.94，高剂量组为31.28±2.25，p＜0.05)，另外，雌性高剂量和雄性中剂量的碱性磷酸酶与空白对照组比较也有显著升高(雌性空白组为96.40±15.49，雌性高剂量组为132.40±25.26，p＜0.05；雄性空白组为86.20±30.19，雄性中剂量为151.2±31.25，p＜0.05)，其余指标均未见显著改变。
但以上这些变化值均在正常范围内波动，且无剂量相关性，故无临床意义。
4.4主要脏器系数测定大鼠处死后，立即分离摘取主要脏器，电子天平称重，计算脏器重量系数
脏器系数(g/kg)＝脏器重量(g)/体重(kg)。结果见表16～表21。
表16 雄性大鼠长毒试验给药三个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑心肝 脾肺(g/kg)4.34± 2.77± 23.01± 3.61± 4.62±对照 50.31 0.27 1.67 0.45 0.457.5 4.28± 2.95± 24.01± 3.31± 5.92±LY50.31 0.38 3.42 0.21 2.305.0 3.98± 2.66± 21.65± 3.44± 6.17±50.30 0.31 3.09 1.12 2.262.5 4.21± 2.72± 20.97± 2.69± 4.41±50.16 0.21 2.24 0.91 0.79剂量组别 n 肾肾上腺 甲状腺 胸腺 睾丸 前列腺(g/kg)5.86± 0.145± 0.060±1.421± 11.63± 1.56±对照 50.19 0.029 0.020 0.534 1.22 0.527.5 5.53± 0.161± 0.071±1.007± 10.33± 1.35±LY50.57 0.025 0.018 0.226 3.30 0.335.0 5.79± 0.150± 0.065±1.104± 7.73± 1.10±50.42 0.016 0.017 0.538 3.16* 0.332.5 5.55± 0.188± 0.061±1.135± 9.92± 1.10±50.34 0.024 0.023 0.353 2.06 0.28t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表17 雌性大鼠长毒试验给药三个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑 心 肝 脾肺(g/kg)3.95±1.98± 16.36±2.82± 3.72±对照 50.29 0.17 2.500.81 0.467.5 4.03±2.34± 19.63±2.85± 4.46±LY50.26 0.20 1.990.93 0.315.0 3.90±2.24± 16.90±2.72± 3.80±50.24 0.22 1.350.84 0.442.5 3.86±2.12± 15.98±2.31± 3.19±50.35 0.14 0.730.42 0.74剂量组别 n 肾 肾上腺 甲状腺 胸腺 卵巢 子宫(g/kg)4.14±0.237± 0.066± 1.015± 0.333± 1.18±对照 50.50 0.082 0.029 0.108 0.048 0.35LY5 7.5 4.22±0.217± 0.071± 1.275± 0.442± 1.60±
0.20 0.037 0.019 0.363 0.075 0.585.04.69± 0.197± 0.069± 1.085± 0.456± 1.47±50.37 0.026 0.026 0.066 0.106 0.582.54.20± 0.196± 0.057± 0.994± 0.326± 1.18±50.22 0.042 0.020 0.125 0.063 0.24t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05表18 雄性大鼠长毒试验给药六个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑 心 肝 脾 肺(g/kg)3.53±3.02± 21.99± 2.53±5.70±对照 100.30 0.33 3.10 0.80 0.597.5 3.43±2.72± 22.01± 2.67±5.33±LY 100.31 0.52 1.53 0.72 1.465.0 3.27±3.21± 21.80± 2.50±5.90±100.50 0.34 1.90 0.59 1.782.5 3.39±3.24± 22.13± 2.41±5.54±100.39 0.28 1.40 0.39 0.66剂量组别 n肾 肾上腺 甲状腺 胸腺 睾丸 前列腺(g/kg)5.58±0.148± 0.070± 0.626± 9.99± 1.62±对照 100.48 0.037 0.016 0.186 1.92 0.347.5 5.51±0.125± 0.074± 0.586± 10.09± 1.38±LY100.50 0.026 0.019 0.290 1.38 0.355.0 5.69±0.132± 0.066± 0.653± 10.58± 1.44±100.33 0.025 0.020 0.265 1.45 0.382.5 5.83±0.177± 0.078± 0.576± 10.73± 1.55±100.49 0.034 0.022 0.172 0.84 0.14t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05表19 雌性大鼠长毒试验给药六个月后脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑心肝 脾肺(g/kg)5.23± 3.07± 24.96± 2.46± 7.88±对照 100.89 0.44 2.85 0.47 1.987.55.18± 3.04± 23.65± 3.13± 6.76±LY100.43 0.21 1.97 0.97 2.525.04.95± 3.13± 24.63± 2.93± 6.51±100.47 0.27 1.49 0.53 0.912.54.86± 3.27± 23.86± 2.75± 6.94±100.40 0.38 2.75 0.73 1.65
剂量组别 n肾肾上腺 甲状腺 胸腺 卵巢 子宫(g/kg) 5.80± 0.309± 0.120±1.046± 0.550± 3.43±对照 100.46 0.062 0.043 0.291 0.059 1.627.5 6.07± 0.265± 0.089±0.974± 0.587± 2.78±LY100.52 0.046 0.022 0.180 0.135 1.405.0 6.04± 0.294± 0.092±0.997± 0.476± 2.31±100.44 0.053 0.013 0.324 0.101 0.802.5 6.15± 0.307± 0.090±0.841± 0.526± 2.35±100.42 0.065 0.019 0.294 0.127 0.56t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05表20 雄性大鼠长毒试验恢复期末脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n脑心肝 脾肺(g/kg)3.20± 3.38± 21.96± 1.91± 5.06±对照 50.70 0.53 0.58 0.58 0.697.5 3.39± 2.84± 23.41± 2.47± 4.84±LY50.28 0.54 1.23* 0.53 0.605.0 3.15± 2.92± 23.02± 2.51± 5.32±50.49 0.69 6.37 0.36 1.082.5 3.57± 3.05± 21.60± 2.46± 5.88±50.47 0.24 3.40 0.56 0.86剂量组别 n 肾肾上腺 甲状腺 胸腺 睾丸 前列腺(g/kg)6.00± 0.124± 0.067± 0.465± 9.78± 1.82±对照 50.64 0.019 0.022 0.154 1.56 0.657.55.82± 0.187± 0.072± 0.621± 9.98± 1.84±LY 50.76 0.117 0.014 0.278 0.88 0.555.05.77± 0.144± 0.070± 0.775± 10.88± 1.44±51.63 0.065 0.043 0.330 1.07 0.452.55.87± 0.131± 0.072± 0.579± 9.73± 1.13±50.73 0.008 0.048 0.307 3.59 0.28t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05，*P＜0.05表21 雌性大鼠长毒试验恢复期末脏器系数测定(mg/g，X±SD)剂量组别 n 脑心肝 脾肺(g/kg)5.11± 3.20± 23.70± 2.67± 6.96±对照 50.54 0.39 2.35 0.63 1.637.55.21± 3.02± 23.62± 2.93± 6.19±LY50.47 0.28 2.47 0.83 0.86
5.0 4.82± 3.07±23.53± 2.44± 7.72±50.55 0.14 1.89 0.44 3.482.5 5.41± 3.23±21.93± 2.32± 6.55±50.71 0.45 1.84 0.50 0.67剂量组别 n 肾肾上腺 甲状腺 胸腺 卵巢 子宫(g/kg)6.82± 0.266± 0.121±0.897±0.553± 2.23±对照 50.84 0.043 0.051 0.207 0.173 0.577.56.11± 0.275± 0.085±1.048±0.525± 2.62±LY50.73 0.060 0.021 0.318 0.112 1.035.06.21± 0.260± 0.097±1.224±0.511± 2.23±50.39 0.054 0.005 0.445 0.050 0.252.56.03± 0.296± 0.085±0.870±0.590± 3.13±50.73 0.046 0.039 0.270 0.068 0.81t检验，与对照组比较，未标记者P＞0.05由表16～表21可见，各给药组动物的脏器系数与正常动物相近，与空白对照比较，均无显著差异。
4.5主要脏器的病理检验大鼠处死后，立即分离主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、甲状腺、淋巴结、胸腺、肾上腺、胃、十二指肠、膀胱、睾丸、附睾、前列腺或卵巢、子宫，肉眼观察均无明显病变，以福尔马林固定，送病理组织学检查。病理报告表明，给药组各鼠的内脏组织学与对照组相比较，检查结果基本相同，未见明显毒性所致的病理学改变。
5.结语本实验是在LY原料药的药效学试验和小鼠急性毒性试验的基础上，进行大鼠长期毒性试验。
实验用SD大鼠160只，3个给药组ig LY内容物2.5g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg，相当于生药量为116g/kg、232g/kg、348g/kg。连续六个月。动物来源、数量、给药途径、剂量、周期等均符合新药长期毒性试验的规定。
给药期间，各组大鼠均未死亡，体重正常增长，给药中期、给药结束及恢复期末经血液学检验、生化检验、脏器系数测定及病理组织学检验，各项指标基本正常。以上结果表明，LY长期口服，对实验动物未出现明显毒性反应。
实施例5 LY的药效学试验1.实验材料1.1实验动物ICR小鼠、SD大鼠，由中国药科大学实验动物中心提供。合格证SCXK(苏)2002-0011号。
麻鸭采用重庆麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭(购于重庆市沙坪坝区虎溪镇大田堡村牌坊合作社孵化场)经腹腔接种0.1mlDHBV DNA阳性病毒血清。接种1周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记的DHBV DNA探针经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养至3周龄作为实验动物。
1.2药物及试剂LY，由北京万赛生物医药技术发展有限公司提供。批号030313。实验用胶囊内容物，为淡褐色粉未，临用前以蒸馏水配制成浓度为25mg(胶囊内容物)/ml、50mg/ml、100mg/ml的溶液供小鼠ig用，ig量为0.2ml/10g体重。
垂盆草冲剂(保肝阳性药)，主要成分为垂盆草，功能清利湿热，有降低谷丙转氨酶作用，临床用于急性肝炎、迁移性肝炎及慢性肝炎的治疗。巢湖正大药业有限公司生产，ZZ-3168-皖药准字(2001)第Z000925号，批号021010。临床人用量一次10g，一日2～3次，按成人体重60g/kg计算，人用量即0.5g/kg，小鼠用量取5g/kg，大鼠用量取4g/kg。临用前以蒸馏水配制成浓度为0.25g/ml的溶液供小鼠ig用，大鼠ig配制成0.20g/ml溶液，ig量均为0.2ml/10g体重。
抗乙肝阳性对照药物拉米夫定(批号B038238，葛兰素威康英国行动有限公司生产)压碎后自制成5mg/粒的胶囊。
芸芝多糖胶囊，功能主治增强免疫功能，用于慢性乙型肝炎、肝癌及老年免疫功能低下者。江苏晨牌药业有限公司生产，苏卫药准字(1994)第361204号。临床人用量一日3～6粒，每粒0.5g，即成人剂量为40mg/kg，小鼠用量为400mg/kg，临用前以蒸馏水配制成2mg/ml的溶液供小鼠ig用。
阿斯匹林，阿斯特拉(无锡)制药有限公司，苏卫药准字(1985)第343401号，批号200201021号。
二甲苯，南京化学试剂厂，批号990305。营养琼脂，江苏省卫生防疫站微生物试剂厂，批号020425。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒，批号20030106。测试原理为ALT在37℃及pH7.4条件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸，反应30min后加入2，4-二硝基苯肼盐酸溶液，即中止反应，同时2，4-二硝基苯肼与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色，于505nm处测吸光度，计算酶活力。天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒，批号20030106。测试原理为天门冬氨酸氨基转移酶能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸转移氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸在反应过程中可自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸和2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色，比色后求得酶的活力单位。白蛋白测试盒(溴甲酚绿比色法)，批号20030718，利用白蛋白具有与阴离子染料结合的特性，在酸性溶液中溴甲酚绿与白蛋白结合后，由黄色变成绿色，绿色的深浅与白蛋白的深度成正比。总蛋白测试盒(双缩脲法)，批号20030630，利用蛋白质分子中的肽键与碱性酮溶液作用，形成紫色复合物，于波长540nm处测吸光度，计算总蛋白含量。羟脯氨酸测试盒，批号20030910。均购自南京建成生物工程研究所。
四氯化碳(CCl4)，分析纯，南京化学试剂一厂。鲁花牌纯正花生油，莱阳鲁花浓香花生油有限公司。配制临用前配制成一定浓度的花生油溶液，置于密封瓶内，搅拌6小时以上。
D-半乳糖胺(D-GalN)，分析纯，重庆医科大学，生产批号030215。配制临用前以注射用生理盐水配制成0.8％的溶液，冷藏备用。
注射用环磷酰胺(CY)，沪卫药准字(1995)第012034号，上海华联制药公司。印度墨汁，北京市西中化工厂，批号0030619，临用前以生理盐水稀释成1∶4的溶液静脉注射用。
羊血，购自江宁县卫生防疫站，临用时用生理盐水洗涤三次，每次2000rpm离心5min，弃去上清液，用生理盐水以3∶5(V/V)稀释。
都氏液，自配，碳酸氢钠1.0g，氰化钾0.05g，高铁氢化钾0.2g，蒸馏水配至1000ml。
2.实验方法与结果2.1 LY对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响取健康小鼠60只，雄性，体重18～22g，随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，阳性药组，LY低、中、高剂量组。正常对照组和模型对照组动物每天ig等容积蒸馏水，阳性药组给以5g/kg垂盆草冲剂，LY低、中、高剂量分别给予0.5、1.0、2.0g/kg剂量的药物，ig体积均为0.2ml/10g，连续给药一周，未次给药后除正常对照组动物以外，其余每组动物均ip 0.1％CCl4花生油溶液0.1ml/10g体重，ip后禁食16h，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒所示方法测定血清中AST、ALT含量。取血完毕后，摘取全部肝脏，福尔马林固定，取肝小叶部位肝组织作病理检查。AST、ALT以x±SD表示，组间差异采用Student’s t-test检验。结果见表22。
表22 LY对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响(x±SD)组别剂量(g/kg) N AST(U) ALT(U)正常对照 10 13.07±6.69*** 11.92±9.98***模型对照 10 79.20±35.2684.45±39.80垂盆草 510 45.64±24.98** 34.11±24.98***LY低剂 0.5 10 51.60±12.06** 49.57±41.51*LY中剂量1.0 10 47.14±12.35** 27.24±15.41***LY高剂量2.0 10 35.16±18.84*** 28.70±8.51***与模型对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表22可见， LY三个剂量组均能显著降低CCl4所致小鼠急性肝损伤血清中的AST的含量，中、高剂量组能显著降低ALT的含量。表明LY能减轻CCl4对小鼠肝脏的损伤，对肝脏有保护作用。
病理组织检查结果表明CCl4能引起小鼠的肝细胞呈不同程度的细胞坏死，炎细胞浸润。LY给药组与模型对照组相比，肝细胞的破坏程度明显减轻，偶见有少量脂肪变性及局灶性的炎性浸润。结果见表23。
表23 LY对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察动物数 炎性浸润 细胞坏死组别无局灶弥漫 无 点状 灶状正常对照10 100 0 10 00模型对 10 6 3 1 244垂盆草 10 8 2 0 334LY低剂量10 9 1 0 343LY中剂量10 8 2 0 811LY高剂量10 10 0 0 622
2.2 LY对D-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响取健康小鼠60只，雄性，18～22g，随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，阳性药组，LY低、中、高剂量组。正常对照组和模型对照组动物每天ig等容积蒸馏水，阳性药组给以5g/kg垂盆草冲剂，LY低、中、高剂量分别给予0.5、1.0、2.0g/kg剂量的药物，ig体积均为0.2ml/10g，连续给药一周，未次给药后除正常对照组动物以外，其余每组动物均ip D-半乳糖胺800mg/kg体重，ip后禁食16h，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒所示方法测定血清中AST、ALT含量。取血完毕后，摘取全部肝脏，福尔马林固定，取肝小叶部位肝组织作病理检查。结果见表24。
表24 LY对D-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg)N AST(U) ALT(U)正常对照 1051.21±42.91*** 20.15±9.52***模型对照 10121.38±28.58 150.76±69.84垂盆草 5 1060.60±1.49*** 98.38±35.03*LY低剂量 0.5 1089.21±9.32** 99.52±59.64*LY中剂量 1.0 1049.19±9.52*** 70.15±26.09***LY高剂量 2.0 1045.80±32.55** 42.39±34.90***与模型对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表24可见，LY三个剂量组均能显著降低D-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤血清中的AST的含量，中、高剂量组能显著降低ALT的含量。
病理组织检查表明，D-半乳糖胺引起小鼠肝小叶结构破坏，肝组织呈不同程度的坏死，有局灶性或弥漫性的炎性浸润，汇管区增大，肝细胞有明显的脂肪变性。给药组与模型组相比，肝组织的破坏呈不同程度的减轻，脂肪变减轻。表明LY可保护肝细胞，减轻D-半乳糖胺对肝脏的破坏。结果见表25。
表25 LY对D-半乳糖胺所致急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察动物数 炎性浸润 细胞坏死组别无 局灶弥漫 无 点状 灶状正常对照10 10 0010 00模型对照10 073226垂盆草 10 010 0334LY低剂量10 172037LY中剂量10 073217LY高剂量10 6313432.3 LY对CCl4所致大鼠慢性肝损伤的影响慢性肝损伤模型的制备及分组取健康雄性大鼠，180～220g，测定造模前各项生化指标，除6只大鼠作为正常对照组外，其余64只大鼠ig 50％CCl4花生油溶液10ml/kg，每周二次，连续10周。造型6周时，眼眶取血，分离血清，测定血清AST、ALT的含量，按血清ALT含量，将大鼠分为5组模型对照组(16只)、垂盆草颗粒组(12只)，LY低(12只)、中(12只)、高剂量组(12只)，按表中剂量给药，每天1次，连续给药4周后，末次给药后24h，摘眼球取血，3000rpm离心10min，分离血清，测定AST、ALT、总蛋白、白蛋白的含量。另取受试大鼠的肝脏，称重，计算肝脏系数，称取肝小叶部位的肝脏1g，按试剂盒所示方法，测定肝组织中羟脯氨酸含量。
病理学检查取肝左叶固定，石蜡包埋，包埋肝组织切成5μm的石蜡切片，HE染色，显微镜下观察组织学变化，并将肝纤维化分为0～4级，0级无纤维化；I级纤维结缔组织仅局限于汇管区或汇管区扩大，有向小叶发展的倾向；II级纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3并有I级同样的改变；III级纤维结缔组织进入肝小叶达中央静脉周围；IV级纤维结缔组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成，并有III级同样的改变。
表26 LY对CCl4所致大鼠慢性肝损伤的影响表26.1 慢性肝损伤大鼠造模型前各项生化指标(x±SD)组别 剂量 动物数 ALT AST 总蛋白 白蛋白 A/G(g/kg)(U) (U) (g/L) (g/L)试验前 试验后正常对照 6 6 59.78± 98.94± 65.32±30.13±0.87±26.52 29.654.912.160.11模型空白 16 1454.10± 92.40± 64.07±30.30±0.92±20.03 21.325.052.080.17垂盆草组 4 12 8 54.36± 85.74± 65.88±31.36±0.94±9.18 14.855.372.360.20LY低剂量 0.3 12 8 59.98± 97.86± 64.98±29.76±0.87±17.14 17.925.532.590.18LY中剂量 0.6 12 1153.71± 91.33± 64.15±30.76±0.94±14.85 19.273.211.790.18LY高剂量 1.2 12 1052.19± 83.04± 63.91±32.73±1.07±14.73 14.254.061.040.17t检验，与正常对照组比较，均无显著性差异表26.2 慢性肝损伤大鼠造模六周后各项生化指标的变化(x±SD)组别 剂量 动物数 ALTAST 总蛋白 白蛋白 A/G(g/kg)试验 试验 (U)(U) (g/L) (g/L)前 后正常对照6 646.35± 102.80± 75.57±32.85±0.77±8.51 8.96 3.452.960.12
模型空白 16 14 205.85± 217.82± 77.04±36.16±0.89±54.32***25.05***3.55* 3.28** 0.13**垂盆草组 4 12 8 196.08± 218.96± 77.84±37.37±0.94±45.21***16.77***3.00*△ 3.95**△0.21*△△ △LY低剂量 0.3 12 8 212.81± 215.12± 76.41±35.96±0.90±65.12***51.97***2.96*△ 3.67*△ 0.17*△△ △LY中剂量 0.6 12 11 222.76± 228.18± 79.33±37.32±0.90±51.50***28.99***4.69*△ 5.33**△0.18*△△ △LY高剂量 1.2 12 10 226.13±224.53± 78.96±37.57±0.94±22.11***10.52***5.71*△ 3.45**△0.23*△△ △t检验，与正常对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01；与模型对照组比较，△p＞0.05表26.3 LY对CCl4所致慢性肝损伤的大鼠生化指标的影响(x±SD)组别 剂量动物数 ALT AST 总蛋白 白蛋白 A/G(g/kg) 试验 试验 (U) (U) (g/L)(g/L)前后正常对照 6 640.38± 104.16± 72.04±23.69± 0.50±17.40***28.75***5.17* 4.81* 0.13*模型空白 16 14323.08± 301.00± 73.20±23.73± 0.50±154.40 104.11 7.715.70 0.16垂盆草组 4 12 8 47.59±101.50± 76.44±27.61± 0.57±10.90***19.35***3.15* 2.72* 0.10*LY低剂量 0.3 12 8 38.60±80.55± 77.42±29.38± 0.61±11.30***18.54***7.89* 4.83** 0.09*LY中剂量 0.6 12 1150.93±96.46± 76.36±25.42± 0.53±8.53*** 28.03***7.07* 4.67* 0.13*LY高剂量 1.2 12 1055.38±93.52± 79.37±24.75± 0.46±23.38***36.32***5.10** 4.95* 0.13*t检验，与模型空白组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01表26.4 LY对CCl4所致慢性肝损伤大鼠肝羟脯氨酸含量及肝脏系数的影响(x±SD)组别 剂量动物数 肝脏系数 羟脯氨酸(g/kg) 试验前 试验后正常对照 6 6 39.22±3.52***1.899±1.51*模型空白 16 1446.98±5.45 4.056±3.69垂盆草组 4 12 8 43.89±5.73* 1.696±1.14*LY低剂量 0.3 12 8 44.60±3.78* 3.469±4.58*LY中剂量 0.6 12 1144.37±6.23* 1.101±0.26**LY高剂量 1.2 12 1046.33±7.19* 1.045±0.40**t检验，与模型空白组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01
由表26.2可见，CCl4造型后，大鼠血清中ALT、AST含量显著增加，用药后由表26.3和26.4可见，LY对CCl4所致大鼠慢性肝损伤血清ALT、AST的含量，与模型组比较存在显著性差异(p＜0.01)。对血清TP、ALB、A/G的影响不大。中、高剂量能显著降低CCl4慢性肝损伤大鼠肝脏羟脯氨酸(P＜0.05)，而低剂量组则无显著性差异(P＞0.05)。
病理组织检查结果表明模型组大鼠肝组织正常结构破坏，并有较明显的纤维隔形成，肝索排列紊乱，肝细胞明显肿胀变性，肝小叶结构破坏，纤维结缔组织增生，假小叶形成。中央静脉周围有少量坏死的肝细胞，并伴有中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞浸润。汇管区由于结缔组织增生而变宽。LY组与模型组相比，肝细胞变性程度明显减轻，纤维结缔组织明显减少，未见明显假小叶形成，汇管区结缔组织增生不明显。结果见表26.5。
表26.5 LY对CCl4所致慢性肝损伤大鼠肝脏病理组织学观察组别 N炎性浸润 脂肪变性 坏死纤维化无 局弥无轻中重 无 点 灶 片 桥 0III III灶漫 度度度状 状 状 接 级 级 级 级正常对照 66 0 0 6 0 0 0600060000模型空白 14 3 110 3 2 7 211 20102390垂盆草组 80 8 0 2 5 1 0700102510LY低剂量 80 8 0 0 8 0 0800000800LY中剂量 11 4 7 0 1 7 3 010 00107400LY高剂量 10 1 8 1 1 7 2 08002073002.4 LY对琼脂所致大鼠肉芽肿的影响健康SD雄性大鼠61只，230～270g，随机分为6组，阳性对照组除垂盆草外，增设一组西药对照阿斯匹林组。按表中所示剂量给药，给药前每只大鼠背部皮下注射2％灭菌琼脂2ml/只，随后给药，每天一次，连续10天，第11天处死大鼠，剥离出琼脂肉芽肿块，电子天平称取湿重，称重后将肉芽肿在60℃下烘干6h，取出称取干重。结果见表27。
表27 LY对琼脂所致大鼠肉芽肿的影响(x±SD)组别剂量(g/kg)N肉芽肿湿重(mg) 肉芽肿干重(mg)空白对照 11 895.6±216.3 132.6±44.6阿斯匹林0.04 10 471.9±81.2*** 62.4±14.2***垂盆草 5 10 756.2±247.1* 131.3±64.8*LY低剂量0.3 10 747.8±122.9* 104.2±29.7*LY中剂量0.6 10 756.4±375.8* 101.0±57.4*LY高剂量1.2 10 594.6±172.8***54.0±25.9***
与空白对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表27可见，LY三个剂量组对琼脂所引起的肉芽肿重量均有减轻，高剂量组统计有显著意义。
2.5对鸭乙型肝炎病毒作用2.5.1实验方法将感染阳性鸭77只随机分为5组(1)病毒对照组(16只)用淀粉胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为500mg/只。
(2)阳性药物对照组(15只)用拉米夫定胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为50mg/kg.d。
(3)LY小剂量组(16只)每日口腔灌喂1次，剂量为80mg/kg.d。
(4)LY中剂量组(14只)每日口腔灌喂1次，剂量为300mg/kg.d。
(5)LY大剂量组(16只)每日口腔灌喂1次，剂量为600mg/kg.d。
实验用药时间为28天，停药观察7天。观察指标如下(1)血清DHBV DNA改变情况于用药前、用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。采用斑点杂交法[5]，用罗氏(Roche)公司的地高辛标记试剂盒(Cat.No.1745832)制备DHBV DNA探针统一检测，用Vuego Scan(Brisa-620ST)扫描仪进行膜片扫描；用the Discovery SeriesQuantity One软件对斑点进行定量分析，斑点值为volume(volume＝intensity×mm2)。统计学采用SPSS10.0配对t检验法(F检验)处理。
(2)血清DHBsAg改变情况于用药前、用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。将用药前后的血清统一对比检测，采用ELISA快速法[7]、酶标阅读仪(Bio-TEK公司)490nm读取0.D值。统计学采用SPSS软件，配对t检验。
(3)实验结束各组肝脏病理(HE染色)检测于停药7天分别剖杀各组实验动物，各取肝右叶边缘小块肝组织固定于10％甲醛溶液，石腊切片，用HE染色，病理检查。
2.5.2实验结果(1)LY对乙肝鸭血清中DHBV DNA滴度的影响
表28 LY对乙肝鸭血清中DHBV DNA滴度的影响表28.1 各组别DHBV DNA差值情况比较(X±S)组别 用药7d 用药14d 用药21d 用药28d 停药7d-2.837± 239.187± 394.2352± 221.3484± 169.2754±淀粉胶襄154.2299306.7377 371.3968 317.8262 588.2919-246.6639±-131.9997± -142.5544± -224.6403±39.3333±拉米夫定106.08* 139.2033*91.6785* 154.6765* 279.4168-74.7257± 70.6732± 40.4474±-110.7338±-157.80623LY大剂量202.848 320.8429 184.8002* 157.2606* ±249.7785-46.4791± 96.9446± 65.5759±-134.5066±-100.2533±LY中剂量193.9633252.6191 294.2348* 219.7854* 248.872546.9233± 225.1608±159.677±-92.7258± -46.9878±LY小剂量126.4668191.1758 212.2943* 166.7057* 194.0589与淀粉胶襄组比较，*P＜0.05，(SPSS10.0 F检验)表28.2 各组别DHBV DNA差率情况(X±S)组别 用药7d 用药14d 用药21d 用药28d 停药7d-0.0123± 0.1375± 0.2266± 0.1298± 0.0968±淀粉胶襄0.0859 0.17350.21270.18510.3484-0.1296± -0.0700±-0.0740± -0.1141±0.03484±拉米夫定0.05392* 0.07187* 0.04725* 0.0709* 0.1569-0.0401± 0.03381± 0.01899±-0.0563±-0.0729±LY大剂量0.1029 0.17150.1024* 0.08316* 0.1136-0.0177± 0.05554± 0.04449±-0.0614±-0.0434±LY中剂量0.09655 0.12450.1515* 0.1049* 0.11420.02355± 0.1115± 0.07923± -0.0429±-0.0203±LY小剂量0.06201 0.09875 0.1063* 0.08468* 0.09601与淀粉胶襄组比较，*P＜0.05，(SPSS10.0 F检验)由表28.1、表28.2可知a.拉米夫定组用药7天后开始出现血清DHBV DNA滴度降低，与淀粉胶囊组比较有显著性差异；b.LY大、中、小剂量组分别于21天开始出现血清DHBV DNA滴度降低，与淀粉胶囊组比较有显著性差异；c.LY大、中、小剂量组与拉米夫定组用药期间均有血清DHBV DNA滴度降低，但LY组较拉米夫定组起效时间晚。
表28.3 对乙肝鸭血清中DHBV DNA反跳的影响-差值、差率比较(X±S)差值 差率组别用药28d 停药7d 用药28d 停约7d221.3484± 169.2754±淀粉胶襄 0.1298±0.18510.0968±0.3484317.8262 588.2919
-224.6403± 39.3333±0.03484±拉米夫定-0.1141±0.0709154.6765 279.4168* 0.1569*-110.7338± -157.80623± -0.0563±LY大剂量 -0.0729±0.1136157.2606 249.77850.08316-134.5066± -100.2533±LY中剂量-0.0614±0.1049 -0.0434±0.1142219.7854 248.8725-92.7258±-46.9878± -0.0429±-0.0203±LY小剂量166.7057 194.05890.08468 0.09601各组自身用药、停药前后比较，*P＜0.05，(SPSS10.0 F检验)由表28.3可知a.拉米夫定组停药7天后，开始出现血清DHBV DNA滴度反跳，与停药前比较有显著性差异；b.LY大、中、小剂量组停药7天后，未出现血清DHBV DNA滴度反跳，与停药前比较无显著性差异；c.LY大、中、小剂量组较拉米夫定组停药7天，血清DHBV DNA滴度变化不明显，未见明显反跳。
(2)LY对乙肝鸭血清DHBsAgO.D的影响病毒对照组(淀粉胶囊)、阳性药物对照组(拉米夫定)及LY各剂量组用药后28天，血清DHBsAgO.D值均无明显降低。见表29。
表29 LY对乙肝鸭血清DHBsAgO.D的影响(x±SD)组别用药前 用药7天用药14天 用药21天 用药28天 停药7天0.273±0.265± 0.414± 0.377± 0.273± 0.226±淀粉胶囊组0.097 0.088 0.1360.1350.0790.1030.324±0.295± 0.362± 0.302± 0.287± 0.262±拉米夫定组0.114 0.156 0.1410.1170.1100.1490.264±0.238± 0.336± 0.338± 0.297± 0.219±LY大剂量0.169 0.172 0.2320.2450.2040.1200.229±0.246± 0.333± 0.330± 0.257± 0.212±LY中剂量0.064 0.073 0.1170.1200.0860.0810.222±0.237± 0.377± 0.391± 0.243± 0.214±LY小剂量0.091 0.110 0.1510.1960.0810.177注上表所列为各组DHBsAgO.D值平均数及标准差，统计学采用配对t检验，为各组不同时间DHBsAgO.D值与同组用药前DHBsAgO.D值的比较。
(3)肝脏HE染色病理检查结果
各组肝组织结构基本正常，均有较轻程度肝细胞浊肿变性；嗜酸变性少；部分组织有肝细胞点状坏死现象，这些病理表现用药组与对照组无明显差异；汇管区、小叶间隔有轻～中度炎症细胞浸润，淀粉胶囊组炎症细胞浸润程度(中度)较其余各组(轻度)略重。
2.6 LY对小鼠免疫功能的影响2.6.1 LY对正常小鼠免疫功能的影响[3]2.6.1.1对正常小鼠免疫器官的影响取健康小鼠50只，雌性，体重12～16g，随机分为五组，分别为空白对照组，芸芝多糖0.4g/kg对照组，LY0.5g/kg、1.0g/kg和2.0g/kg剂量组，连续给药7天，末次给药后，动物处死，摘取胸腺、脾脏，称重，并计算脏器系数(脏器重量(mg)与体重(g)之比)。结果见表30。
表30 LY对正常小鼠免疫器官重量的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg) N胸腺指数 脾指数空白对照 10 4.503±0.826 5.526±0.946芸芝多糖 0.410 4.485±1.203* 5.672±1.360*LY 0.510 4.656±0.817* 5.031±1.417*LY 1.010 4.443±0.619* 5.283±1.382*LY 2.010 4.350±1.026* 6.882±4.040*与空白对照组比较，*p＞0.05。
由表30可见，LY对正常小鼠免疫器官的重量未见明显影响。
2.6.1.2对非特异性免疫功能的影响——碳粒廓清法[3]雄性小鼠50只，体重18～22g，分组，给药同上，未次给药后各鼠尾静脉注射经稀释后的印度墨汁0.1ml/10g，于2min(t1)、10min(t2)眼球静脉丛取血20μl，加入到0.1％Na2CO3溶液2ml中，摇匀，于640nm波长下比色，测定t1和t2时的吸光度，分别为OD1、OD2。取血完后，将小鼠放血处死，摘取肝、脾，称重，按下列公式计算廓清指数K和吞噬指数α。结果见表31。
K＝(lgOD1-lgOD2)/(T1-T2)α＝W*K1/3/(WLS)公式中OD为血中各时间点的吸光度，T为时间，W为体重，WLS为肝脾合重。
表31 LY对正常小鼠碳粒廓清速率的影响(x±SD)组别 剂量(mg/kg)N K α
空白对照 10 0.0393±0.0236 5.027±1.098芸芝多糖0.410 0.0450±0.0180*5.667±0.785*LY 0.510 0.0360±0.0196*5.349±1.027*LY 1.010 0.0310±0.0080*4.836±0.714*LY 2.010 0.0365±0.0129*5.276±0.995*与空白对照组比较，*p＞0.05。
由表31可见，LY对正常小鼠碳粒廓清速率未见明显影响。
2.6.1.3对特异性体液免疫功能的影响——血清溶血素测定法[3]雌性小鼠50只，体重18～22g，分组，给药同上，连续给药7天，给药第三天，每鼠腹腔注射3∶5(V/V)的绵羊红细胞(SRBC)0.2ml/只进行免疫，给药结束后小鼠眼静脉丛取血，分离血清，将血清以生理盐水500倍稀释供测定。反应管内加入1ml血清，10％SRBC 0.5ml，10％补体1ml，置37℃恒温水浴中保温30min，然后移至冰浴中终止反应，离心后取上清液1ml，加都氏液3ml，摇匀，放置10min，于540nm波长处比色读取吸光度。测定SRBC半数溶血值取10％SRBC 0.25ml加都氏试剂至4ml，比色读取吸光度值。计算血清HC50＝样品的吸光度值/SRBC半数溶血值×稀释倍数。结果见表32。
表32 LY对小鼠溶血素生成的影响(x±SD)组别 剂量(mg/kg) NHC50空白对照 10 480.8±94.04芸芝多糖 0.4 10 627.6±146.7**LY 0.5 10 496.7±116.8*LY 1.0 10 489.9±121.6*LY 2.0 10 494.9±134.8*与空白对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05由表32可见，LY对正常小鼠的溶血素水平无明显影响。
2.6.2对免疫低下小鼠免疫功能的影响2.6.2.1对CY所造成免疫低下小鼠免疫器官的影响[4]小鼠68只，雌性，体重18～22g，随机分为六组，分别为空白对照组，模型对照组，阳性药组，LY高、中、低三个剂量组，连续给药7天。采用CY造成免疫低下模型，除空白对照组外，其余每组小鼠从第五天开始每天ip CY 50mg/kg体重，连续三天造模。第八天，动物处死，摘取胸腺、脾脏、称重，并计算脏器系数。结果见表33。
表33 LY对免疫低下小鼠免疫器官重量的影响(x±SD)
组别剂量(g/kg) N 胸腺指数 脾指数空白对照184.11±0.93***4.58±1.14***模型对照(CY)0.05102.58±1.06 2.77±0.72芸芝多糖+CY 0.4+0.05103.45±0.66** 2.68±0.55*LY+CY 0.5+0.05102.45±0.45* 2.84±0.55*LY+CY 1.0+0.05103.32±0.35** 3.28±0.86*LY+CY 2.0+0.05103.05±0.80* 3.04±0.75*与CY对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01。
由表33可见，LY使免疫低下小鼠的免疫器官的降低有所减轻，中剂量组对胸腺指数的降低的保护作用统计有显著意义。
2.6.2.2对非特异性免疫功能的影响——碳粒廓清法[4]小鼠67只，雄性，体重18～22g，按表8所示进行分组给药、免疫低下造模同上，第八天各鼠尾静脉注射经稀释后的印度墨汁0.1ml/10g，于2min(t1)、10min(t2)眼球静脉丛取血20l，加入到0.1％Na2CO3溶液2ml中，摇匀，于640nm波长下比色，测定t1和t2时的吸光度，分别为OD1、OD2。取血完后，将小鼠放血处死，摘取肝、脾，称重，计算廓清指数K和吞噬指数α。结果见表34。
表34 LY对免疫低下小鼠碳粒廓清速率的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg) N K α空白对照 170.02836±0.0098*4.786±0.586**模型对照(CY) 0.05100.02577±0.0064 4.221±0.736芸芝多糖+CY0.4+0.05100.03529±0.0122** 5.264±0.898**LY+CY 0.5+0.05100.02250±0.0045*4.406±0.534*LY+CY 1.0+0.05100.03274±0.0096*4.898±0.831*LY+CY 2.0+0.05100.02950±0.0093*5.288±0.737**与CY对照组比较，*p＞0.05，**p＜0.05。
由表34可见，LY高剂量组能显著增加免疫低下模型小鼠的吞噬指数。
2.6.2.3对特异性体液免疫功能的影响——血清溶血素测定法[3，4]小鼠65只，雌性，体重18～22g，按表14所示进行分组给药，给药第五天起，第天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，1次/d，连续三天，造成免疫低下模型，给药第三天，每鼠腹腔注射3∶5的SRBC 0.2ml/只进行免疫，连续给药7天，第八天小鼠眼静脉丛取血，分离血清，将血清以生理盐水500倍稀释供测定。反应管内加入1ml血清，10％SRBC 0.5ml，10％补体1ml，置37恒温水浴中保温30min，然后移至冰浴中终止反应，离心后取上清液1ml，加都氏液3ml，摇匀，放置10min，于540nm波长处比色读取吸光度。测定SRBC半数溶血值取10％SRBC 0.25ml加都氏试剂至4ml，比色读取吸光度值。计算血清HC50＝样品的吸光度值/SRBC半数溶血值×稀释倍数。结果见表35。
表35 LY对免疫低下小鼠溶血素生成的影响(x±SD)组别 剂量(g/kg) N HC50空白对照 15345.4±64.8***模型对照(CY) 0.0510212.3±53.2芸芝多糖+CY 0.4+0.0510324.7±77.9***LY+CY0.5+0.0510286.9±82.7**LY+CY1.0+0.0510317.7±102.2***LY+CY2.0+0.0510322.6±96.7***与CY对照组比较，***p＜0.01，**p＜0.05由表35可见，LY三个剂量组均可提高免疫低下小鼠的血清溶血素水平。
3.结论受试药物LY能显著降低CCl4和D-半乳糖胺所引起的小鼠血清ALT、AST含量的增高；LY能明显抑制CCl4所引起的慢性肝损伤大鼠血清ALT、AST含量的增高，能降低肝损伤大鼠肝脏中羟脯氨酸的含量；LY对正常小鼠的免疫功能无明显影响，对CY所造成的免疫低下小鼠的体液免疫功能有一定的增强作用，对免疫低下小鼠的免疫器官系数的降低也有减轻作用；高剂量LY对琼脂引起的大鼠肉芽肿的抑制作用有显著的统计意义。
用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效的治疗药物，已为国内外学者所应用[9]。1-3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象[10]，因此，应用1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行LY抗病毒疗效的考核，期望筛选出有抗乙型肝炎病毒作用的药物。并用对乙型肝炎病毒有明显抑制作用的核苷酸类似物拉米夫定作为阳性药物对照。
本次动物试验结果表明LY大、中、小剂量组和阳性药物对照拉米夫定组用药28天，鸭血清中的DHBV DNA滴度降低有显著意义，其中拉米夫定组在停药7天后鸭血清中DHBV DNA有明显反跳，而LY大、中、小剂量组在停药7天后鸭血清中的DHBVDNA未出现反跳，说明LY具有抑制鸭乙型肝炎病毒作用且停药后无反跳。此外，各试验组血清中DHBsAg均无明显的降低，说明LY对鸭乙型肝炎病毒表面抗原抑制作用不明显。
由于鸭乙型肝炎动物模型自身的特点，1-3日龄雏鸭免疫系统发育不完善，在感染DHBV后，仅出现单纯的病毒携带状态，肝脏组织病变轻微，肝功能无明显异常[1，2]。的实验结果发现LY各剂量组肝组织病理检测与对照组无明显差异，可说明连续用药1个月LY对肝组织无明显毒性损害。
以上实验表明，LY具有保肝、抗炎、抑制鸭乙型肝炎病毒、增强免疫低下小鼠免疫功能及等作用。
权利要求
1.一种组合物，其特征在于，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。
2.权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，它包括下述步骤(1)选取合格的药材Y和L，压碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，将其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，将其制成干粉II；(4)将干粉I与干粉II混合均匀，按照常规工艺制成口服药物制剂。
3.如权利要求2所述的组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的Y粉与步骤(3)中的L粉按照常规工艺制成口服药物制剂。
4.权利要求1所述的组合物在制备治疗急、慢性乙型肝炎携带者的药物中的应用。
5.权利要求1所述的组合物在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。
6.权利要求1所述的组合物在制备治疗肝硬化的药物中的应用。
7.Y和L在制备治疗急、慢性乙型肝炎携带者的药物中的应用。
8.Y和L在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。
9.Y和L在制备治疗肝硬化的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种组合物，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。本发明还提供了上述组合物的制备方法，它包括下述步骤(1)选取合格的药材Y和L，压碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，将其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，将其制成干粉II；(4)将干粉I与干粉II混合均匀，按照常规工艺制成固体药物制剂。本发明还提供了上述组合物在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为急、慢性乙型肝炎携带者、脂肪肝或肝硬化。本发明还提供了Y和L在制备治疗肝病的药物中的应用，所述的肝病优选为急、慢性乙型肝炎携带者、脂肪肝或肝硬化。
文档编号A61P1/00GK1586536SQ200410062800
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者李求是 申请人:北京万赛生物医药技术发展有限公司
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