核苷酸类似物的制作方法
专利名称：核苷酸类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及膦酰甲氧基核苷酸类似物的前体药物及其制备方法，本发明还涉及含有上述前体药物的药物组合物及其制备方法。
膦酰甲氧基核苷酸类似物是一类已知的抗病毒化合物，9-[2-(磷酰甲氧基)乙基]腺苷(简称PMEA)和9-[(R)-2-(磷酰甲氧基)丙基]腺苷(简称PMPA)是该类化合物中已经用于临床抗病毒治疗的两个例子。由于膦酰甲氧基核苷酸类似物中所含的膦酸根影响人体对其的吸收，一般需要将膦酰甲氧基核苷酸类似物转化成亲脂性的前体药物来提高它的生物利用度。例如最近被FDA批准用于乙型肝炎治疗的阿得福韦和用于艾滋病治疗的泰诺福韦分别是膦酰甲氧基核苷酸类似物PMEA和PMPA的亲脂性前药。阿得福韦和泰诺福韦在体内都可以被代谢成有抗病毒作用的母体药物，但前药的亲脂性部分的代谢产物没有治疗作用。
齐墩果酸是从天然产物中提取的五环三萜类化合物，主要存在于夏枯草、怀牛膝、连翘、木犀科齐墩果、龙胆科青叶胆，女贞等植物中。它具有护肝降酶、抗炎、提高免疫功能等药理作用，最新的研究还发现齐墩果酸具有很强的抗HIV活性。另外，齐墩果酸还具有促进药物透皮吸收的作用。在临床上，齐墩果酸主要用于治疗急性黄疸型肝炎、慢性迁延型与活动型肝炎。
临床上治疗慢性乙型肝炎主要有抗病毒和保肝这两种方法，但目前还没有同时具备上述两种功能的药物。
发明内容
本发明提供下式(Ia)所示的化合物及其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物 其中R＝H，Me；R1＝C1-C18烷基该类化合物的合成路线如下式所示具体步骤为
1.齐墩果酸和有机醇在脱水剂的作用下可以形成齐墩果酸的酯(I)，反应可以用相应的有机醇作溶剂或者是有机醇和卤代烷或DMF形成的混合溶液作为溶剂，反应温度一般在室温到溶剂回流的温度范围内，脱水剂为DCC。齐墩果酸的甲酯还可以通过齐墩果酸与重氮甲烷反应来制备。
2.齐墩果酸酯(I)和氯甲酸氯甲酯在有机碱的存在下反应得到中间体(II)，反应溶剂选用卤代烷，乙酸乙酯，乙腈或DMF，有机碱选用吡啶或三乙胺，反应温度在-20℃到室温之间。
3.中间体(II)与膦酰甲氧基核苷酸类似物PMEA或PMPA在有机碱的作用下反应得到化合物(Ia)。反应的溶剂选自DMF或N-甲基吡咯烷酮，有机碱优选三乙胺，反应温度在室温到150℃之间。
齐墩果酸有很强的亲脂性而膦酰甲氧基核苷酸类似物具有很强的亲水性。将齐墩果酸和膦酰甲氧基核苷酸类似物通过碳酸酯键连接成一个分子之后，大大增加了膦酰甲氧基核苷酸类似物的亲脂性并且中和了膦酸根上的负电荷，从而方便膦酰甲氧基核苷酸类似物透过生物膜，增加生物体的吸收。
体外和动物实验显示本发明提供的化合物(Ia)毒性很低，并具有抗艾滋病毒和乙型肝炎病毒的活性。化合物(Ia)在小鼠的肠匀浆中比较稳定但可以被小鼠的肝脏匀浆快速地代谢为膦酰甲氧基核苷酸类似物，说明化合物(Ia)在消化道吸收的过程中是相对稳定的而在吸收到体内之后可以迅速地转化为母体药物，因此化合物(Ia)可以用作膦酰甲氧基核苷酸类似物的前体药物。同时，本发明提供的化合物(Ia)在体内代谢后还能产生齐墩果酸，具有保护肝脏的功能，从而同一种药物具备了抗病毒和保护肝脏的多重功效。
本发明的第二个方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有化合物(Ia)或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物以及一种或多种药物上可接受的载体，可选择性地含有其他治疗或预防成分。
药物组合物可以通过任何已知的方式给药，包括口服；肌肉，皮下和静脉注射；通过口腔，舌下，鼻，直肠和阴道的局部给药等方式。
适合于口服的药物组合物可以是固体制剂如片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，也可以是液体制剂如乳液，悬浮液，溶液等。口服的片剂，胶囊剂可含有常规的赋型剂如粘合剂，润滑剂，崩解剂，填充剂或润湿剂。口服的固体制剂还可以制成缓释剂型。液体制剂还可以是脂质体的悬浮液。
具体实施方法实施例1-6为化合物(1a)的合成方法实施例1
在2000ml圆底烧瓶中加入45.0g齐墩果酸，300ml乙醚，在室温下加入重氮甲烷溶液直到固体悬浮物全部溶解并且溶液呈现淡黄色。加入少量乙酸至溶液黄色消失，减压蒸馏抽干溶剂，得到白色固体。滤液过硅胶柱层析(乙酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得40.0g白色固体，即为所得化合物1。
1HNMR(CDCl3)δ0.71(s，3H)；0.77(s，3H)；0.895(s，6H)；0.92(s，3H)；0.98(s，3H)；1.12(s，3H)；2.85(d，J＝12.8Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；3.625(s，3H)；5.29(t，1H)。
实施例2 将40.0g化合物1溶解于300ml CH2Cl2，加入11ml吡啶后冰浴搅拌，在氮气保护下加入12ml氯甲酸氯甲酯。反应液颜色变黄并不断加深，最后成紫红色。有白色固体生成。5小时后撤去冰浴，停止搅拌。抽滤，除去滤渣，滤液用1％HCl水溶液(350ml)洗。有机层用KHCO3溶液洗直到PH值至中性后再用水洗(3×350ml)。
有机层旋干后用硅胶柱层析分离提纯(乙酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得29.6g白色固体化合物2。
1HNMR(CDCl3)δ0.72(s，3H)；0.875(s，3H)；0.90(s，3H)；0.93(s，9H)；1.13(s，3H)；2.86(d，J＝10.4Hz，1H)；3.625(s，3H)；4.423(dd，J＝5.2，10.4Hz，1H)；5.285(s，1H)；5.74(s，2H)
实施例3 在通N2气保护下，将0.5gPMEA溶于0.5ml三己胺(TEA)和2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合溶液中，70℃加热搅拌1hr使PMEA溶解。
加入4.5g化合物2，再加2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮。加热搅拌，温度控制在70℃。反应7hr。持续通N2气。
将反应液溶于少量CH2Cl2后水洗，减压蒸馏抽干溶剂，得到糖浆样物质。该糖浆样物质经硅胶柱层析(甲醇和二氯甲烷的混合溶液为流动相，硅胶230-400目)分离得到800mg化合物3。
1HNMR(CDCl3)0.758(s，6H)；0.837(s，6H)；0.862(s，6H)；0.906(s，6H)；0.924(s，6H)；0.932(s，6H)；1.158(s，6H)；2.86(d，J＝10.4Hz，2H)；3.625(s，6H)；3.88(d，J＝7.6Hz，2H)；3.94(t，J＝4.8Hz，2H)；4.4(m，4H)；5.285(s，2H)；5.68(m，4H)；5.82(br，2H)；7.9(s，1H)；8.35(s，1H)UV(乙醇)λmax＝258.5nm(ε＝18730)
实施例4 取45.0g齐墩果酸，加入一2000ml圆底烧瓶中。用300mlCH2Cl2和600ml无水乙醇(过量)控制温度60-70℃加热回流溶解。待齐墩果酸全溶后加入26.7g二环己基碳酰亚胺(DCC)加热回流过夜。
加入6ml己酸除去多余DCC。减压蒸馏抽干溶剂，得到白色固体。再用少量CH2Cl2溶解，有白色不溶性固体。过滤，滤渣用少量CH2Cl2洗，滤液过硅胶柱层析(己酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得32.0g白色固体，即为所得化合物4。
1HNMR(CDCl3)；δ0.73(s，3H)；0.77(s，3H)；0.895(s，6H)；0.92(s，3H)；0.98(s，3H)；1.13(s，3H)；1.249(s，6H)；2.85(dd，J＝4，13.2Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；4.08(m，2H)；5.286(s，1H)。
实施例5 用250ml CH2Cl2溶解32.0g化合物4，加入9ml吡啶，在烧瓶中加一搅拌子后冰浴搅拌，待烧瓶内外温度平衡后加入9.2ml氯甲酸氯甲酯。可见反应液颜色由黄色不断加深，有白色固体生成。
5小时后撤去冰浴，停止搅拌。
抽滤，得白色滤渣并伴有少量棕灰色椭圆形颗粒。除去滤渣，滤液用1％HCl水溶液(350ml)洗。有机层用KHCO3溶液调PH值至中性。分取有机层，水洗(3×350ml)。
有机层抽干后过硅胶柱层析(乙酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得25.6g白色固体，即为化合物5。
1HNMR(CDCl3)δ0.739(s，3H)；0.875(s，3H)；0.901(s，3H)；0.934(s，6H)；1.135(s，3H)；2.86(d，J＝10.4Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；4.085(m，2H)；4.423(dd，J＝5.2，10.4Hz)；5.29(s，1H)；5.74(s，2H)。
实施例6 在通N2气的环境下，将0.3gPMEA溶于0.5ml三己胺(TEA)和1.5ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合溶液中，70℃加热搅拌1hr使PMEA溶解。
加入3.2g化合物2，再加2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮。加热搅拌，温度控制在70℃。反应7hr。持续通N2气。
将反应液溶于少量CH2Cl2后减压蒸馏抽干溶剂，得到糖浆样物质。湿法装柱，过硅胶柱层析分离反应产物(甲醇和二氯甲烷的混合溶液为流动相，硅胶230-400目)得到450mg化合物6。
1HNMR(CDCl3)δ0.747(s，6H)；0.829(s，6H)；0.862(s，6H)；0.901(s，6H)；0.924(s，6H)；0.965(s，6H)；1.158(s，6H)；2.88(d，J＝10.4Hz，2H)；3.88(d，J＝7.6Hz，2H)；3.94(t，J＝4.8Hz，2H)；4.09(m，4H)；4.4(m，4H)；5.285(s，2H)；5.68(m，4H)；5.79(br，2H)；7.91(s，1H)；8.32(s，1H)UV(乙醇)λmax＝259nm(ε＝17380)实施例7动物的急性毒性试验取7900毫克化合物3溶于50毫升含有0.5％吐温暖80的20％乙醇水溶液中。昆明种小鼠随即分成5组，每组10只，雌雄各半。禁食14小时后，通过1次尾静脉注射给药0.5毫升，给药后的动物自由进食饮水，置于18-22℃的环境中观察7d。每天记录动物中毒症状及死亡数。用Bliss法计算LD50及95％可信限。测得化合物在小鼠中的静注LD50为619毫克/公斤。
实施例8体外抗HBV活性实验2.2.15细胞(自HepG2细胞转染而来，分泌HBsAg，HBeAg)，用DMEM培养液(GIBCO)，培养液加10％胎牛血清，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，G418 380mg/L(GIBCO)，0.3g/L谷氨酰氨，用2.38g/L Hepes调pH至6.8.用0.6g/L胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成3×107/L，每孔0.1mL/于96孔板，2天后换用含药培养液，化合物3分别稀释成11，3.7，1.2，0.4，0.137和0.045μM，每个浓度加4孔，同时设不含药物对照组；每3天换新鲜含药培养液共4次，与细胞作用12天后，换出的细胞上清液-20℃保存待检，并收集细胞提取核心颗粒HBV DNA。应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV DNA，结果列于表1中表1 化合物3在细胞培养中抑制HBV病毒复制的效果对比
实施例9体外生物稳定性实验新鲜小鼠肝脏用组织匀浆器匀浆后在4℃9000g离心20分钟后取上清液备用。
小鼠的肠匀浆可用类似的方法制备。
2毫克化合物3溶于5毫升的DMSO中配成溶液备用。
500微升小鼠肝脏匀浆和肠匀浆在37℃培养5分钟后加入化合物3的DMSO溶液12.5微升，混匀后放置在37℃每分钟振荡100次进行培养，第1，30和60分钟分别取50微升样品，用含0.1％的三氟醋酸的乙腈中止反应，离心分离后取上清液直接用HPLC分析化合物3的含量，根据浓度变化曲线计算化合物3在肝脏匀浆和肠匀浆中的半衰期。结果发现化合物3在肠匀浆中的半衰期是32.5小时，在肝脏匀浆中的半衰期是3.5小时，说明化合物3在小鼠肠中足够稳定，在消化道吸收的过程中主要以前体药物的形式存在，而小鼠肝脏可以很快地将化合物3代谢成母体药物。
实施例10对小鼠CCl4急性肝损伤的作用SR小鼠50只，18-22克，雌性，随机分为5组，每组10只，除正常对照组，各组腹腔注射CCl4 140mg/kg，随后实验组经口灌胃给予化合物346mg/kg.d、140mg/kg.d、460mg/kg.d，模型对照组和正常对照均给予同体积蒸馏水，连续灌胃给药5天，于最末一次给药后15小时，断头处死动物，取血测定血清谷丙转氨酶(SGPT)，检测结果列于表2中，同时取肝脏进行病理组织检查。
表2
病理切片观察表明，与模型对照组比较，各给药组肝小叶水样变性和浊肿现象均明显较轻，肝细胞亦未出现点状坏死和肝硬化现象；中央静脉边缘较为紧密，肝细胞多呈放射状排列，肝细胞索基本上较清楚，细胞分界较清楚，表明化合物3对CCl4引起的肝损伤有一定的保护作用。
实施例11片剂的制备制剂配方1毫克/片化合物3 250毫克微晶纤维素 25毫克湿玉米淀粉 35毫克聚维酮 15毫克硬脂酸镁5毫克330毫克制剂配方2毫克/片化合物3 250毫克淀粉甘醇酸钠30毫克聚维酮 15毫克硬脂酸镁5毫克300毫克以上制剂通过用聚维酮溶液湿法造粒后加入硬脂酸镁压片得到。
权利要求
1.下式(Ia)所示的化合物及其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物 其中R＝H，Me；R1＝C1-C18烷基
2.式(Ia)所示的化合物或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物在制备药物组合物中的应用。
3.一种药物组合物，它包括治疗人类HIV感染或HBV感染有效量的式(Ia)所示的化合物或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，所述的药物组合物是适合于口服的。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，所述的药物组合物是片剂。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，所述的药物组合物是胶囊剂。
7.一种制备以式(Ia)所示的化合物或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物为有效成分的药物组合物的方法，该方法包括将所说的有效成分与一种或多种药学上可接受的载体混合。
8.一种制备式(Ia)所示的化合物的方法，包括使膦酰甲氧基核苷酸类似物与式(II)所示的中间体反应，其中L为离去基团。
全文摘要
本发明提供了一些含有五环三萜类化合物的膦酰甲氧基核苷酸类似物的前体药物及其制备方法。这些前体药物具有抗艾滋病毒和乙型肝炎病毒的活性和保护肝脏的功能，可以用于制备药物组合物。
文档编号A61P1/00GK1796393SQ20041006588
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者袁建栋 申请人:博瑞生物医药技术(苏州)有限公司
技术领域：
本发明涉及膦酰甲氧基核苷酸类似物的前体药物及其制备方法，本发明还涉及含有上述前体药物的药物组合物及其制备方法。
膦酰甲氧基核苷酸类似物是一类已知的抗病毒化合物，9-[2-(磷酰甲氧基)乙基]腺苷(简称PMEA)和9-[(R)-2-(磷酰甲氧基)丙基]腺苷(简称PMPA)是该类化合物中已经用于临床抗病毒治疗的两个例子。由于膦酰甲氧基核苷酸类似物中所含的膦酸根影响人体对其的吸收，一般需要将膦酰甲氧基核苷酸类似物转化成亲脂性的前体药物来提高它的生物利用度。例如最近被FDA批准用于乙型肝炎治疗的阿得福韦和用于艾滋病治疗的泰诺福韦分别是膦酰甲氧基核苷酸类似物PMEA和PMPA的亲脂性前药。阿得福韦和泰诺福韦在体内都可以被代谢成有抗病毒作用的母体药物，但前药的亲脂性部分的代谢产物没有治疗作用。
齐墩果酸是从天然产物中提取的五环三萜类化合物，主要存在于夏枯草、怀牛膝、连翘、木犀科齐墩果、龙胆科青叶胆，女贞等植物中。它具有护肝降酶、抗炎、提高免疫功能等药理作用，最新的研究还发现齐墩果酸具有很强的抗HIV活性。另外，齐墩果酸还具有促进药物透皮吸收的作用。在临床上，齐墩果酸主要用于治疗急性黄疸型肝炎、慢性迁延型与活动型肝炎。
临床上治疗慢性乙型肝炎主要有抗病毒和保肝这两种方法，但目前还没有同时具备上述两种功能的药物。
发明内容
本发明提供下式(Ia)所示的化合物及其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物 其中R＝H，Me；R1＝C1-C18烷基该类化合物的合成路线如下式所示具体步骤为
1.齐墩果酸和有机醇在脱水剂的作用下可以形成齐墩果酸的酯(I)，反应可以用相应的有机醇作溶剂或者是有机醇和卤代烷或DMF形成的混合溶液作为溶剂，反应温度一般在室温到溶剂回流的温度范围内，脱水剂为DCC。齐墩果酸的甲酯还可以通过齐墩果酸与重氮甲烷反应来制备。
2.齐墩果酸酯(I)和氯甲酸氯甲酯在有机碱的存在下反应得到中间体(II)，反应溶剂选用卤代烷，乙酸乙酯，乙腈或DMF，有机碱选用吡啶或三乙胺，反应温度在-20℃到室温之间。
3.中间体(II)与膦酰甲氧基核苷酸类似物PMEA或PMPA在有机碱的作用下反应得到化合物(Ia)。反应的溶剂选自DMF或N-甲基吡咯烷酮，有机碱优选三乙胺，反应温度在室温到150℃之间。
齐墩果酸有很强的亲脂性而膦酰甲氧基核苷酸类似物具有很强的亲水性。将齐墩果酸和膦酰甲氧基核苷酸类似物通过碳酸酯键连接成一个分子之后，大大增加了膦酰甲氧基核苷酸类似物的亲脂性并且中和了膦酸根上的负电荷，从而方便膦酰甲氧基核苷酸类似物透过生物膜，增加生物体的吸收。
体外和动物实验显示本发明提供的化合物(Ia)毒性很低，并具有抗艾滋病毒和乙型肝炎病毒的活性。化合物(Ia)在小鼠的肠匀浆中比较稳定但可以被小鼠的肝脏匀浆快速地代谢为膦酰甲氧基核苷酸类似物，说明化合物(Ia)在消化道吸收的过程中是相对稳定的而在吸收到体内之后可以迅速地转化为母体药物，因此化合物(Ia)可以用作膦酰甲氧基核苷酸类似物的前体药物。同时，本发明提供的化合物(Ia)在体内代谢后还能产生齐墩果酸，具有保护肝脏的功能，从而同一种药物具备了抗病毒和保护肝脏的多重功效。
本发明的第二个方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有化合物(Ia)或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物以及一种或多种药物上可接受的载体，可选择性地含有其他治疗或预防成分。
药物组合物可以通过任何已知的方式给药，包括口服；肌肉，皮下和静脉注射；通过口腔，舌下，鼻，直肠和阴道的局部给药等方式。
适合于口服的药物组合物可以是固体制剂如片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，也可以是液体制剂如乳液，悬浮液，溶液等。口服的片剂，胶囊剂可含有常规的赋型剂如粘合剂，润滑剂，崩解剂，填充剂或润湿剂。口服的固体制剂还可以制成缓释剂型。液体制剂还可以是脂质体的悬浮液。
具体实施方法实施例1-6为化合物(1a)的合成方法实施例1
在2000ml圆底烧瓶中加入45.0g齐墩果酸，300ml乙醚，在室温下加入重氮甲烷溶液直到固体悬浮物全部溶解并且溶液呈现淡黄色。加入少量乙酸至溶液黄色消失，减压蒸馏抽干溶剂，得到白色固体。滤液过硅胶柱层析(乙酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得40.0g白色固体，即为所得化合物1。
1HNMR(CDCl3)δ0.71(s，3H)；0.77(s，3H)；0.895(s，6H)；0.92(s，3H)；0.98(s，3H)；1.12(s，3H)；2.85(d，J＝12.8Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；3.625(s，3H)；5.29(t，1H)。
实施例2 将40.0g化合物1溶解于300ml CH2Cl2，加入11ml吡啶后冰浴搅拌，在氮气保护下加入12ml氯甲酸氯甲酯。反应液颜色变黄并不断加深，最后成紫红色。有白色固体生成。5小时后撤去冰浴，停止搅拌。抽滤，除去滤渣，滤液用1％HCl水溶液(350ml)洗。有机层用KHCO3溶液洗直到PH值至中性后再用水洗(3×350ml)。
有机层旋干后用硅胶柱层析分离提纯(乙酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得29.6g白色固体化合物2。
1HNMR(CDCl3)δ0.72(s，3H)；0.875(s，3H)；0.90(s，3H)；0.93(s，9H)；1.13(s，3H)；2.86(d，J＝10.4Hz，1H)；3.625(s，3H)；4.423(dd，J＝5.2，10.4Hz，1H)；5.285(s，1H)；5.74(s，2H)
实施例3 在通N2气保护下，将0.5gPMEA溶于0.5ml三己胺(TEA)和2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合溶液中，70℃加热搅拌1hr使PMEA溶解。
加入4.5g化合物2，再加2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮。加热搅拌，温度控制在70℃。反应7hr。持续通N2气。
将反应液溶于少量CH2Cl2后水洗，减压蒸馏抽干溶剂，得到糖浆样物质。该糖浆样物质经硅胶柱层析(甲醇和二氯甲烷的混合溶液为流动相，硅胶230-400目)分离得到800mg化合物3。
1HNMR(CDCl3)0.758(s，6H)；0.837(s，6H)；0.862(s，6H)；0.906(s，6H)；0.924(s，6H)；0.932(s，6H)；1.158(s，6H)；2.86(d，J＝10.4Hz，2H)；3.625(s，6H)；3.88(d，J＝7.6Hz，2H)；3.94(t，J＝4.8Hz，2H)；4.4(m，4H)；5.285(s，2H)；5.68(m，4H)；5.82(br，2H)；7.9(s，1H)；8.35(s，1H)UV(乙醇)λmax＝258.5nm(ε＝18730)
实施例4 取45.0g齐墩果酸，加入一2000ml圆底烧瓶中。用300mlCH2Cl2和600ml无水乙醇(过量)控制温度60-70℃加热回流溶解。待齐墩果酸全溶后加入26.7g二环己基碳酰亚胺(DCC)加热回流过夜。
加入6ml己酸除去多余DCC。减压蒸馏抽干溶剂，得到白色固体。再用少量CH2Cl2溶解，有白色不溶性固体。过滤，滤渣用少量CH2Cl2洗，滤液过硅胶柱层析(己酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得32.0g白色固体，即为所得化合物4。
1HNMR(CDCl3)；δ0.73(s，3H)；0.77(s，3H)；0.895(s，6H)；0.92(s，3H)；0.98(s，3H)；1.13(s，3H)；1.249(s，6H)；2.85(dd，J＝4，13.2Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；4.08(m，2H)；5.286(s，1H)。
实施例5 用250ml CH2Cl2溶解32.0g化合物4，加入9ml吡啶，在烧瓶中加一搅拌子后冰浴搅拌，待烧瓶内外温度平衡后加入9.2ml氯甲酸氯甲酯。可见反应液颜色由黄色不断加深，有白色固体生成。
5小时后撤去冰浴，停止搅拌。
抽滤，得白色滤渣并伴有少量棕灰色椭圆形颗粒。除去滤渣，滤液用1％HCl水溶液(350ml)洗。有机层用KHCO3溶液调PH值至中性。分取有机层，水洗(3×350ml)。
有机层抽干后过硅胶柱层析(乙酸己酯和正己烷混合溶剂为流动相)。得25.6g白色固体，即为化合物5。
1HNMR(CDCl3)δ0.739(s，3H)；0.875(s，3H)；0.901(s，3H)；0.934(s，6H)；1.135(s，3H)；2.86(d，J＝10.4Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；4.085(m，2H)；4.423(dd，J＝5.2，10.4Hz)；5.29(s，1H)；5.74(s，2H)。
实施例6 在通N2气的环境下，将0.3gPMEA溶于0.5ml三己胺(TEA)和1.5ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合溶液中，70℃加热搅拌1hr使PMEA溶解。
加入3.2g化合物2，再加2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮。加热搅拌，温度控制在70℃。反应7hr。持续通N2气。
将反应液溶于少量CH2Cl2后减压蒸馏抽干溶剂，得到糖浆样物质。湿法装柱，过硅胶柱层析分离反应产物(甲醇和二氯甲烷的混合溶液为流动相，硅胶230-400目)得到450mg化合物6。
1HNMR(CDCl3)δ0.747(s，6H)；0.829(s，6H)；0.862(s，6H)；0.901(s，6H)；0.924(s，6H)；0.965(s，6H)；1.158(s，6H)；2.88(d，J＝10.4Hz，2H)；3.88(d，J＝7.6Hz，2H)；3.94(t，J＝4.8Hz，2H)；4.09(m，4H)；4.4(m，4H)；5.285(s，2H)；5.68(m，4H)；5.79(br，2H)；7.91(s，1H)；8.32(s，1H)UV(乙醇)λmax＝259nm(ε＝17380)实施例7动物的急性毒性试验取7900毫克化合物3溶于50毫升含有0.5％吐温暖80的20％乙醇水溶液中。昆明种小鼠随即分成5组，每组10只，雌雄各半。禁食14小时后，通过1次尾静脉注射给药0.5毫升，给药后的动物自由进食饮水，置于18-22℃的环境中观察7d。每天记录动物中毒症状及死亡数。用Bliss法计算LD50及95％可信限。测得化合物在小鼠中的静注LD50为619毫克/公斤。
实施例8体外抗HBV活性实验2.2.15细胞(自HepG2细胞转染而来，分泌HBsAg，HBeAg)，用DMEM培养液(GIBCO)，培养液加10％胎牛血清，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，G418 380mg/L(GIBCO)，0.3g/L谷氨酰氨，用2.38g/L Hepes调pH至6.8.用0.6g/L胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成3×107/L，每孔0.1mL/于96孔板，2天后换用含药培养液，化合物3分别稀释成11，3.7，1.2，0.4，0.137和0.045μM，每个浓度加4孔，同时设不含药物对照组；每3天换新鲜含药培养液共4次，与细胞作用12天后，换出的细胞上清液-20℃保存待检，并收集细胞提取核心颗粒HBV DNA。应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV DNA，结果列于表1中表1 化合物3在细胞培养中抑制HBV病毒复制的效果对比
实施例9体外生物稳定性实验新鲜小鼠肝脏用组织匀浆器匀浆后在4℃9000g离心20分钟后取上清液备用。
小鼠的肠匀浆可用类似的方法制备。
2毫克化合物3溶于5毫升的DMSO中配成溶液备用。
500微升小鼠肝脏匀浆和肠匀浆在37℃培养5分钟后加入化合物3的DMSO溶液12.5微升，混匀后放置在37℃每分钟振荡100次进行培养，第1，30和60分钟分别取50微升样品，用含0.1％的三氟醋酸的乙腈中止反应，离心分离后取上清液直接用HPLC分析化合物3的含量，根据浓度变化曲线计算化合物3在肝脏匀浆和肠匀浆中的半衰期。结果发现化合物3在肠匀浆中的半衰期是32.5小时，在肝脏匀浆中的半衰期是3.5小时，说明化合物3在小鼠肠中足够稳定，在消化道吸收的过程中主要以前体药物的形式存在，而小鼠肝脏可以很快地将化合物3代谢成母体药物。
实施例10对小鼠CCl4急性肝损伤的作用SR小鼠50只，18-22克，雌性，随机分为5组，每组10只，除正常对照组，各组腹腔注射CCl4 140mg/kg，随后实验组经口灌胃给予化合物346mg/kg.d、140mg/kg.d、460mg/kg.d，模型对照组和正常对照均给予同体积蒸馏水，连续灌胃给药5天，于最末一次给药后15小时，断头处死动物，取血测定血清谷丙转氨酶(SGPT)，检测结果列于表2中，同时取肝脏进行病理组织检查。
表2
病理切片观察表明，与模型对照组比较，各给药组肝小叶水样变性和浊肿现象均明显较轻，肝细胞亦未出现点状坏死和肝硬化现象；中央静脉边缘较为紧密，肝细胞多呈放射状排列，肝细胞索基本上较清楚，细胞分界较清楚，表明化合物3对CCl4引起的肝损伤有一定的保护作用。
实施例11片剂的制备制剂配方1毫克/片化合物3 250毫克微晶纤维素 25毫克湿玉米淀粉 35毫克聚维酮 15毫克硬脂酸镁5毫克330毫克制剂配方2毫克/片化合物3 250毫克淀粉甘醇酸钠30毫克聚维酮 15毫克硬脂酸镁5毫克300毫克以上制剂通过用聚维酮溶液湿法造粒后加入硬脂酸镁压片得到。
权利要求
1.下式(Ia)所示的化合物及其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物 其中R＝H，Me；R1＝C1-C18烷基
2.式(Ia)所示的化合物或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物在制备药物组合物中的应用。
3.一种药物组合物，它包括治疗人类HIV感染或HBV感染有效量的式(Ia)所示的化合物或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，所述的药物组合物是适合于口服的。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，所述的药物组合物是片剂。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，所述的药物组合物是胶囊剂。
7.一种制备以式(Ia)所示的化合物或其盐，水合物，互变异构体和溶剂合物为有效成分的药物组合物的方法，该方法包括将所说的有效成分与一种或多种药学上可接受的载体混合。
8.一种制备式(Ia)所示的化合物的方法，包括使膦酰甲氧基核苷酸类似物与式(II)所示的中间体反应，其中L为离去基团。
全文摘要
本发明提供了一些含有五环三萜类化合物的膦酰甲氧基核苷酸类似物的前体药物及其制备方法。这些前体药物具有抗艾滋病毒和乙型肝炎病毒的活性和保护肝脏的功能，可以用于制备药物组合物。
文档编号A61P1/00GK1796393SQ20041006588
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者袁建栋 申请人:博瑞生物医药技术(苏州)有限公司
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