黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法及其制剂的制作方法
专利名称：黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及中国药典收载的一种中药复方黄连、吴茱萸的有效成份提取方法及其提取物的应用，特别是从中药复方中提取总生物碱的方法。
背景技术：
黄连、吴茱萸总生物碱对于急慢性胃炎、肠炎、胃溃疡等疾病有较好的疗效。但黄连、吴茱萸药物的生产过程中，对于原料药的提取是采用水煎提取法(或直接粉碎制成成品药)，该方法得到的提取物是浸膏，这种提取物纯度低，吸湿性强，制剂制备困难，制剂质量较差，服用量大。已有在公开号为CN 1431014A的发明专申请中，公开了一种黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法，该方法为将黄连、吴茱萸固定配方粉料加入5～10倍0.5～5％的盐酸甲醇作为提取溶剂，回流提取，药渣用水提取，合并以上两提取液，回收甲醇后提取物过中性氧化铝柱，浓缩后提取物再用乙醇提取，得黄连、吴茱萸总生物碱。但这一方法的运用，总生物碱提取得率和脂溶性生物碱转移率都较低。同时，在这项技术中，只用酸沉淀，而没有用脂溶性溶媒进行较多量的脂溶性生物碱的提取，脂溶性有效成份不能充分获得。不仅如此，已有方法是先用溶媒为盐酸甲醇，后用中性氧化铝分离，可能存在有溶媒的毒副作用，以及有机物的残留。而且本工艺繁琐，成本较高，工业化大生产操作难度大。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种所得提取物中总生物碱含量可高达60％、总生物碱中盐酸小檗胡含量达60％，从而提高制剂水平的黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法及其制剂。
本发明黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法的特点是按以下步骤进行，所述份数均为重量份；a、取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉，混合得粉料；b、向粉料中加入5～10倍量70～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用4～10倍量水煎煮1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用1～6倍生药量乙酸乙酯萃取1～4次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0～5.0，加入NaCl使含量为5～10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0～7.0，得提取物B；
d、合并提取物A和提取物B，50～70℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
本发明中以上述方法提取的黄连、吴茱萸总生物碱的制剂特点是将所提取的黄连、吴茱萸总生物碱按常规制剂工艺制成用于治疗急慢性胃炎、胃溃疡的各种剂型。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在1、本发明方法使总生物碱提取得率有效提高。
2、本发明方法通过使用乙酸乙酯将脂溶性生物碱进行萃取，避免了有效成份的损失，脂溶性生物碱转移率有效提高。
3、本发明方法以常规的乙醇作为溶媒，不过柱，溶媒没有毒副作用，不会留下有机残留物。
4、本发明方法所得提取物的总生物碱含量大于60％，总生物碱中盐酸小檗碱含量为60％，其它生物碱占40％，含量得到国家对申报新药的要求，以其制成制剂，可以大大提高制剂水平，而且药理作用效果明显。
5、本发明工艺流程简单，不再需要已有技术中比较繁琐的过中性氧化铝柱步骤，工业化大生产操作难度小，成本大大降低。
具体实施例方式提取方法按以下步骤进行，所述份数均为重量份；a、取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉，混合得粉料；b、向粉料中加入5～10倍量70～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用4～10倍量水煎煮1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液。
c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用1～6倍生药量乙酸乙酯萃取1～4次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0～5.0，加入NaCl使含量为5～10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0～7.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，50～70℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
具体实施中，有益效果更显突的方案包括在步骤b中，向粉料中加入6～9倍量80～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2小时。
在步骤b中，药渣再用6～9倍量水煎煮1～3次，每次0.5～2小时。
在步骤c中，稠膏用1～3倍生药量乙酸乙酯萃取1～2次。
在步骤c中，滤液用盐酸调pH为1.0～3.0。
在步骤c中，沉淀后用水洗涤至pH为4.0～6.0。
将所提取的黄连、吴茱萸总生物碱按常规制剂工艺制成用于治疗急慢性胃炎、胃溃疡的各种剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂。
实施例1按以下步骤操作a、备料取黄连21kg，吴茱萸3.5kg作为原料，将黄连、吴茱萸分别粉碎成粗粉后混合，得粉料；b、提取向粉料中加入90％的乙醇196kg，回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用196kg水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用24500ml乙酸乙酯萃取2次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为2.0，加入NaCl使含量为6％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为5.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，60℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
按常规胶囊剂制备工艺，取黄连、吴茱萸总生物碱共4.4kg(以盐酸小檗碱计2.20kg)，加辅料适量，混合均匀，填充于空心胶囊壳中，得胶囊10000粒，每粒含总生物碱(以盐酸小檗碱计)110mg。口服，每日两次，每次两粒。
实施例2按以下步骤操作a、备料取黄连21kg，吴茱萸3.5kg作为原料，将黄连、吴茱萸分别粉碎成粗粉后混合，得粉料；b、提取向粉料中加入70％的乙醇147kg，回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用147kg水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用49000ml乙酸乙酯萃取2次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0，加入NaCl使含量为5％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，60℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
按常规片剂制备工艺，取黄连、吴茱萸总生物碱共4.00kg(以盐酸小檗碱计2.00kg)，加辅料适量，混合均匀制粒后压片，得片剂10000片，每片含总生物碱(以盐酸小檗碱计)100mg。口服，每日两次，每次两片，温开水送服。
实施例3按以下步骤操作。
a、备料取黄连21kg，吴茱萸3.5kg作为原料，将黄连、吴茱萸分别粉碎成粗粉后混合，得粉料；b、提取向粉料中加入95％的乙醇245kg，回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用245kg水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用98000ml乙酸乙酯萃取2次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为4.0，加入NaCl使含量为10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为7.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，60℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
按常规颗粒剂制备工艺，取黄连、吴茱萸总生物碱共4.20kg(以盐酸小檗碱计2.10kg)，加辅料适量，混合均匀，制粒后，得颗粒剂25000g，每袋重5g，每袋含总生物碱(以盐酸小檗碱计)105mg。口服，每日两次，每次一袋，开水冲服。
本发明提取所得黄连、吴茱萸总生物碱的含量测定方法及药理作用如下黄连、吴茱萸总生物碱的含量测定1、取本品粉末0.2，精密称定，置50ml量瓶中，用盐酸-甲醇(1∶100)溶解并稀释至刻度，摇匀。照柱色谱法(中国药典2000年版I部附录VIC)试验，精密量取5ml，置氧化铝柱(内经约0.9cm，中性氧化铝5g，湿法装柱，用乙醇约30ml预洗)上，用乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，置50ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置50ml量瓶中，用0.05mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀。照分光光度法(中国药典2000年版I部附录附录V A)，在345nm的波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱(C20H17NO4·HCl)的吸收系数为728计算，即得。
本品每1g含总生物碱以盐酸小檗碱(C20H17NO4·HCl)计，不得低于0.5g。
2、照高效液相色谱法(中国药典2000年版I部附录附录VI D)测定色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-四氢呋喃-醋酸(51∶48∶1∶0.1)为流动相；检测波长为225nm。理论塔板数按吴茱萸碱峰计算应不低于7000对照品溶液的制备精密称取吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品粉末约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述两种对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定即得。本品每g含吴茱萸碱(C19H17N30)和吴茱萸次碱(C18H13N30)的总量不得少于0.3mg。
3、照高效液相色谱法(附录VI D)测定色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水(3∶7)，内含0.025mol·L-1磷酸二氢钾，0.025mg·L-1十二烷基磺酸钠，磷酸调PH5。检测波长为345nm。理论塔板数按吴茱萸碱峰计算应不低于7000对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、硫酸黄连碱和盐酸药根碱对照品适量，加甲醇-盐酸(100∶1)定量稀释制成每1ml中含小檗碱0.2g，含巴马亭、黄连碱和药根碱均为0.02mg的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末0.1g，精密称定，置50ml量瓶中，用盐酸-甲醇(1∶100)溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取1ml至10ml量瓶中，用盐酸-甲醇(1∶100)稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定即得。
本品每1g含小檗碱不得低于0.3g；含巴马亭不得低于0.08g；黄连碱不得低于0.07g；药根碱不得低于0.05g。
黄连、吴茱萸总生物碱的药理作用一、黄连、吴茱萸总生物碱对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤模型的影响大鼠给予盐酸-乙醇后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸总生物碱及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
二、黄连、吴茱萸总生物碱对因水浸应激造成的胃粘膜损伤模型的影响由试验可知，大鼠给予水浸应激后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
三、黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠因热板所致痛阈值的影响由试验可知，黄连、吴茱萸总生物碱小、中、大剂量(0.10、0.20、0.40g/kg，分别相当于临床用量的5、10、20倍)灌胃给予小鼠7天后，可明显提高因热板所致小鼠的痛阈值，经统计学分析，在给药后30分钟和60分钟时与生理盐水组相比较具有显著意义(分别为P＜0.05～P＜0.001)。与黄连、吴茱萸原剂型相比具有同等的药理作用。
四、黄连、吴茱萸总生物碱对因0.6％醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响试验表明，黄连、吴茱萸总生物碱三剂量及黄连、吴茱萸原剂型均可明显抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，与生理盐酸水组相比较，有非常显著意义，其中黄连、吴茱萸总生物碱中、大剂量组经统计分析分别为P＜0.05和P＜0.05(其中有2只动物尾静脉注射时失败，3只动物解剖时出血严重影响检测)。提示黄连、吴茱萸总生物碱具有一定的抗炎作用。
关于对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503；氢氧化铝，山西临汾民康制药厂生产，批号040202；动物1、来源，种属，品系，合格证安徽医科大学实验动物中心提供，Wister大鼠，远交封闭系，皖医动准第03号。
2、体重200-250g3、性别♂。
4、动物数60只，每组10只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器
1、盐酸，2、乙醇，3、阿拉伯胶。
试验方法参照文献方法，取大鼠60只，雄性，随机均分为5组，分别为阿拉伯胶对照组、黄连、吴茱萸组、氢氧化铝组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的阿拉伯胶液(5％，1ml/100g)；黄连、吴茱萸组给予1.00g/kg的黄连、吴茱萸；氢氧化铝组给予0.45g/kg的氢氧化铝；总生物碱组分别给予0.05、0.10、0.20g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)；禁食48小时(不禁水)后，按上分组给药1ml/100g或对照液，1小时后每只大鼠灌胃盐酸-乙醇混合液1.5ml/只，再过1小时后用过量乙醚麻醉大鼠致死，开腹取胃，用夹子夹紧贲门，由幽门注入1％甲醛溶液5ml，夹紧幽门，将全胃置于1％甲醛溶液中固定10min。沿胃大弯剪开，将胃外翻，用清水轻轻洗去胃内容物。将胃平铺于玻璃板上，用尺子测量胃粘膜损伤长度，以损伤长度(损伤长度大于1mm者加倍计算)总和作为胃粘膜损伤指数，并计算与给药前的差值，与生理盐水组相比较，并进行统计学处理，结果见表1。
表1 对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较**P＜0.01，***P＜0.001，试验结果由试验可知，大鼠给予盐酸-乙醇后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
关于对大鼠急性应激性胃粘膜损伤模型的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对对大鼠急性应激性胃粘膜损伤模型的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503；氢氧化铝，山西临汾民康制药厂生产，批号040202；动物1、来源，种属，品系，合格证安徽医科大学实验动物中心提供，Wister大鼠，远交封闭系，皖医动准第03号。
2、体重150-200g3、性别♂。
4、动物数60只，每组10只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器1、乙醚，甲醛溶液。
2、恒温水浴锅，自制大鼠固定器。
试验方法参照文献方法，取大鼠60只，雄性，随机均分为5组，分别为阿拉伯胶对照组、黄连、吴茱萸组、氢氧化铝组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的阿拉伯胶液(5％，1ml/100g)；黄连、吴茱萸组给予1.00g/kg的黄连、吴茱萸；氢氧化铝组给予0.45g/kg的氢氧化铝；总生物碱组分别给予0.05、0.10、0.20g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)；禁食24小时(不禁水)后，按上分组给药1ml/100g或对照液。先用乙醚轻度麻醉，四肢各系上一条丝绳后，在把大鼠仰卧位放在特制固定钢板上，头部用特制的固定器固定，然后给药，于给药后20min将固定好的大鼠直立浸于23℃的恒温水槽内，水面以齐剑突为宜，水浸20h后，放血，处死。结扎幽门和贲门后取胃，每胃由腺胃部注入6ml生理盐水，并将其放入1％甲醛溶液中固定10min，沿胃大弯剪开，将胃外翻，用清水轻轻洗去胃内容物。将胃平铺于玻璃板上，用尺子测量胃粘膜损伤长度，以损伤长度(损伤长度大于1mm者加倍计算)总和作为胃粘膜损伤指数，并计算与给药前的差值，与生理盐水组相比较，并进行统计学处理，结果见表2。
表2 对大鼠急性应激性胃粘膜损伤模型的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，试验结果由试验可知，大鼠给予水浸应激后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
关于对小鼠热板所致痛阈值的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠因热板所致痛阈值的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503。
试验动物1、来源，种属，品系，合格证安徽省医学科学研究所实验动物中心提供，昆明种小鼠，远交封闭系，皖医动准第01号。
2、体重18～22g3、性别♀。
4、动物数50只，每组10只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器热板仪安徽省药物研究所自制；电热恒温水浴锅，上海医疗器械厂产品。
试验方法参照文献方法，取♀性昆明种小鼠50只，随机分成5组，分别为对照组、黄连、吴茱萸组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的生理盐水；黄连、吴茱萸组给予2.00g/kg的黄连、吴茱萸；总生物碱组分别给予0.10、0.20、0.40g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的5、10、20倍)；分别灌胃给予0.2ml/10g相应供试液，连续7天，第7天给完药后0.5h时做试验。末次给药后0.5h、1.0h将小鼠放入热板上(将恒温水浴调节至55±0.5℃，上放入2000ml的铁皮烧怀，底部接触水面)，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间(S)作为该鼠的痛阈值，并作t检验，比较组间差异显著性。
试验结果由试验可知，黄连、吴茱萸总生物碱小、中、大剂量(0.10、0.20、0.40g/kg，分别相当于临床用量的5、10、20倍)灌胃给予小鼠7天后，可明显提高因热板所致小鼠的痛阈值，经统计学分析，在给药后30分钟和60分钟时与生理盐水组相比较具有显著意义(分别为P＜0.05～P＜0.001)。与黄连、吴茱萸原剂型相比具有同等的药理作用。结果见表3表3 黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠因热板所致痛阈值的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
关于对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503。
动物1、来源、种属、品名、合格证安徽省医学科学研究所实验动物中心提供，昆明种小鼠，远交封闭系，皖医动准第01号。
2、体重18-22g3、性别♂♀各半。
4、动物数60只，每组12只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器1、依文思蓝，上海化学试剂采购供应站行知校办厂分装，批号881102。
2、醋酸天津市东丽区天大化学试剂厂出品，批号020215。
3、721型分光光度计，上海第三分析仪器厂出品。
4、80-2沉淀离心机，上海手术器械厂产品。
5、TG 328B型电光分析天平，上海天平仪器厂产品。
试验方法参照文献方法，取小鼠60只，随机分成5组，分别为对照组、黄连、吴茱萸组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的生理盐水；黄连、吴茱萸组给予2.00g/kg的黄连、吴茱萸；总生物碱组分别给予0.10、0.20、0.40g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的5、10、20倍)；分别灌胃给予0.2ml/10g相应供试液，连续5天，末次给完药后0.5h时做试验。于末次药后30min尾静脉注射依文思兰生理盐水溶液0.1ml/10g，然后立即腹腔注射0.6％醋酸0.1ml/10g，20min后处死动物，用生理盐水每次约2-3ml清洗腹腔3次，合并腹腔洗液，加生理盐水至10ml，混匀后，3000r/min离心15min，取上清液加入0.1N的NaOH 0.1ml，于590min在721分光光度计上比色，测定光密度，结果进行统计分析(t检验)。
试验结果试验表明，黄连、吴茱萸总生物碱三剂量及黄连、吴茱萸原剂型均可明显抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，与生理盐酸水组相比较，有非常显著意义，其中黄连、吴茱萸总生物碱中、大剂量组经统计分析分别为P＜0.05和P＜0.05(其中有2只动物尾静脉注射时失败，3只动物解剖时出血严重影响检测)。提示黄连、吴茱萸总生物碱具有一定的抗炎作用。见表4表4 黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较*P＜0.0权利要求
1.黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法，其特征是按以下步骤进行，所述份数均为重量份；a、取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉，混合得粉料；b、向粉料中加入5～10倍量70～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用4～10倍量水煎煮1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用1～6倍生药量乙酸乙酯萃取1～4次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0～5.0，加入NaCl使含量为5～10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0～7.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，50～70℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在所述步骤b中，向所述粉料中加入的是6～9倍量80～95％的乙醇回流提取1～3次，每次为0.5～2小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是在所述步骤b中，所述药渣是用6～9倍量的水煎煮1～3次，每次0.5～2小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是在所述步骤c中，对所述步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏后，用1～3倍生药量乙酸乙酯萃取1～2次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是在所述步骤c中，所述滤液用盐酸调pH为1.0～3.0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是在所述步骤c中，沉淀后用水洗涤至pH为4.0～6.0，得提取物B。
7.一种权利要1所述方法提取的黄连、吴茱萸总生物碱制剂，其特征在是将所提取的黄连、吴茱萸总生物碱按常规制剂工艺制成用于治疗急慢性胃炎、胃溃疡的各种剂型。
全文摘要
黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法及其制剂，提取方法特点是取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉后混合，经乙醇回流提取，回收乙醇，稠膏用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得提取物；乙醇回流后的药渣加水煎煮过滤，浓缩得浓缩液；萃取后的水溶液和浓缩液过滤，滤液用盐酸调pH为1.0～4.0，溶液中加NaCl使含量为5～10％，搅拌使其溶解，静置滤过，沉淀用水洗涤至pH为4.0～7.0得提取物，与上述提取物合并，减压干燥、粉碎即得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。按该方法提取的黄连、吴茱萸总生物碱具有抗胃炎、胃溃疡及镇痛等药理作用，其总生物碱含量大于60％，总生物碱中盐酸小檗碱含量为60％，其它生物碱占40％。本发明易于实施、成本低、易制成各种制剂。
文档编号A61P1/04GK1660210SQ20041006589
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月23日 优先权日2004年12月23日
发明者杨士友, 黄世福, 贺飞, 张毅, 吕凌 申请人:安徽省药物研究所, 杨士友
技术领域：
本发明涉及中国药典收载的一种中药复方黄连、吴茱萸的有效成份提取方法及其提取物的应用，特别是从中药复方中提取总生物碱的方法。
背景技术：
黄连、吴茱萸总生物碱对于急慢性胃炎、肠炎、胃溃疡等疾病有较好的疗效。但黄连、吴茱萸药物的生产过程中，对于原料药的提取是采用水煎提取法(或直接粉碎制成成品药)，该方法得到的提取物是浸膏，这种提取物纯度低，吸湿性强，制剂制备困难，制剂质量较差，服用量大。已有在公开号为CN 1431014A的发明专申请中，公开了一种黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法，该方法为将黄连、吴茱萸固定配方粉料加入5～10倍0.5～5％的盐酸甲醇作为提取溶剂，回流提取，药渣用水提取，合并以上两提取液，回收甲醇后提取物过中性氧化铝柱，浓缩后提取物再用乙醇提取，得黄连、吴茱萸总生物碱。但这一方法的运用，总生物碱提取得率和脂溶性生物碱转移率都较低。同时，在这项技术中，只用酸沉淀，而没有用脂溶性溶媒进行较多量的脂溶性生物碱的提取，脂溶性有效成份不能充分获得。不仅如此，已有方法是先用溶媒为盐酸甲醇，后用中性氧化铝分离，可能存在有溶媒的毒副作用，以及有机物的残留。而且本工艺繁琐，成本较高，工业化大生产操作难度大。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种所得提取物中总生物碱含量可高达60％、总生物碱中盐酸小檗胡含量达60％，从而提高制剂水平的黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法及其制剂。
本发明黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法的特点是按以下步骤进行，所述份数均为重量份；a、取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉，混合得粉料；b、向粉料中加入5～10倍量70～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用4～10倍量水煎煮1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用1～6倍生药量乙酸乙酯萃取1～4次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0～5.0，加入NaCl使含量为5～10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0～7.0，得提取物B；
d、合并提取物A和提取物B，50～70℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
本发明中以上述方法提取的黄连、吴茱萸总生物碱的制剂特点是将所提取的黄连、吴茱萸总生物碱按常规制剂工艺制成用于治疗急慢性胃炎、胃溃疡的各种剂型。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在1、本发明方法使总生物碱提取得率有效提高。
2、本发明方法通过使用乙酸乙酯将脂溶性生物碱进行萃取，避免了有效成份的损失，脂溶性生物碱转移率有效提高。
3、本发明方法以常规的乙醇作为溶媒，不过柱，溶媒没有毒副作用，不会留下有机残留物。
4、本发明方法所得提取物的总生物碱含量大于60％，总生物碱中盐酸小檗碱含量为60％，其它生物碱占40％，含量得到国家对申报新药的要求，以其制成制剂，可以大大提高制剂水平，而且药理作用效果明显。
5、本发明工艺流程简单，不再需要已有技术中比较繁琐的过中性氧化铝柱步骤，工业化大生产操作难度小，成本大大降低。
具体实施例方式提取方法按以下步骤进行，所述份数均为重量份；a、取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉，混合得粉料；b、向粉料中加入5～10倍量70～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用4～10倍量水煎煮1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液。
c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用1～6倍生药量乙酸乙酯萃取1～4次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0～5.0，加入NaCl使含量为5～10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0～7.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，50～70℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
具体实施中，有益效果更显突的方案包括在步骤b中，向粉料中加入6～9倍量80～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2小时。
在步骤b中，药渣再用6～9倍量水煎煮1～3次，每次0.5～2小时。
在步骤c中，稠膏用1～3倍生药量乙酸乙酯萃取1～2次。
在步骤c中，滤液用盐酸调pH为1.0～3.0。
在步骤c中，沉淀后用水洗涤至pH为4.0～6.0。
将所提取的黄连、吴茱萸总生物碱按常规制剂工艺制成用于治疗急慢性胃炎、胃溃疡的各种剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂。
实施例1按以下步骤操作a、备料取黄连21kg，吴茱萸3.5kg作为原料，将黄连、吴茱萸分别粉碎成粗粉后混合，得粉料；b、提取向粉料中加入90％的乙醇196kg，回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用196kg水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用24500ml乙酸乙酯萃取2次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为2.0，加入NaCl使含量为6％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为5.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，60℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
按常规胶囊剂制备工艺，取黄连、吴茱萸总生物碱共4.4kg(以盐酸小檗碱计2.20kg)，加辅料适量，混合均匀，填充于空心胶囊壳中，得胶囊10000粒，每粒含总生物碱(以盐酸小檗碱计)110mg。口服，每日两次，每次两粒。
实施例2按以下步骤操作a、备料取黄连21kg，吴茱萸3.5kg作为原料，将黄连、吴茱萸分别粉碎成粗粉后混合，得粉料；b、提取向粉料中加入70％的乙醇147kg，回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用147kg水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用49000ml乙酸乙酯萃取2次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0，加入NaCl使含量为5％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，60℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
按常规片剂制备工艺，取黄连、吴茱萸总生物碱共4.00kg(以盐酸小檗碱计2.00kg)，加辅料适量，混合均匀制粒后压片，得片剂10000片，每片含总生物碱(以盐酸小檗碱计)100mg。口服，每日两次，每次两片，温开水送服。
实施例3按以下步骤操作。
a、备料取黄连21kg，吴茱萸3.5kg作为原料，将黄连、吴茱萸分别粉碎成粗粉后混合，得粉料；b、提取向粉料中加入95％的乙醇245kg，回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用245kg水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用98000ml乙酸乙酯萃取2次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为4.0，加入NaCl使含量为10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为7.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，60℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
按常规颗粒剂制备工艺，取黄连、吴茱萸总生物碱共4.20kg(以盐酸小檗碱计2.10kg)，加辅料适量，混合均匀，制粒后，得颗粒剂25000g，每袋重5g，每袋含总生物碱(以盐酸小檗碱计)105mg。口服，每日两次，每次一袋，开水冲服。
本发明提取所得黄连、吴茱萸总生物碱的含量测定方法及药理作用如下黄连、吴茱萸总生物碱的含量测定1、取本品粉末0.2，精密称定，置50ml量瓶中，用盐酸-甲醇(1∶100)溶解并稀释至刻度，摇匀。照柱色谱法(中国药典2000年版I部附录VIC)试验，精密量取5ml，置氧化铝柱(内经约0.9cm，中性氧化铝5g，湿法装柱，用乙醇约30ml预洗)上，用乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，置50ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置50ml量瓶中，用0.05mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀。照分光光度法(中国药典2000年版I部附录附录V A)，在345nm的波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱(C20H17NO4·HCl)的吸收系数为728计算，即得。
本品每1g含总生物碱以盐酸小檗碱(C20H17NO4·HCl)计，不得低于0.5g。
2、照高效液相色谱法(中国药典2000年版I部附录附录VI D)测定色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-四氢呋喃-醋酸(51∶48∶1∶0.1)为流动相；检测波长为225nm。理论塔板数按吴茱萸碱峰计算应不低于7000对照品溶液的制备精密称取吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品粉末约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述两种对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定即得。本品每g含吴茱萸碱(C19H17N30)和吴茱萸次碱(C18H13N30)的总量不得少于0.3mg。
3、照高效液相色谱法(附录VI D)测定色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水(3∶7)，内含0.025mol·L-1磷酸二氢钾，0.025mg·L-1十二烷基磺酸钠，磷酸调PH5。检测波长为345nm。理论塔板数按吴茱萸碱峰计算应不低于7000对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、硫酸黄连碱和盐酸药根碱对照品适量，加甲醇-盐酸(100∶1)定量稀释制成每1ml中含小檗碱0.2g，含巴马亭、黄连碱和药根碱均为0.02mg的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末0.1g，精密称定，置50ml量瓶中，用盐酸-甲醇(1∶100)溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取1ml至10ml量瓶中，用盐酸-甲醇(1∶100)稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定即得。
本品每1g含小檗碱不得低于0.3g；含巴马亭不得低于0.08g；黄连碱不得低于0.07g；药根碱不得低于0.05g。
黄连、吴茱萸总生物碱的药理作用一、黄连、吴茱萸总生物碱对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤模型的影响大鼠给予盐酸-乙醇后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸总生物碱及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
二、黄连、吴茱萸总生物碱对因水浸应激造成的胃粘膜损伤模型的影响由试验可知，大鼠给予水浸应激后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
三、黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠因热板所致痛阈值的影响由试验可知，黄连、吴茱萸总生物碱小、中、大剂量(0.10、0.20、0.40g/kg，分别相当于临床用量的5、10、20倍)灌胃给予小鼠7天后，可明显提高因热板所致小鼠的痛阈值，经统计学分析，在给药后30分钟和60分钟时与生理盐水组相比较具有显著意义(分别为P＜0.05～P＜0.001)。与黄连、吴茱萸原剂型相比具有同等的药理作用。
四、黄连、吴茱萸总生物碱对因0.6％醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响试验表明，黄连、吴茱萸总生物碱三剂量及黄连、吴茱萸原剂型均可明显抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，与生理盐酸水组相比较，有非常显著意义，其中黄连、吴茱萸总生物碱中、大剂量组经统计分析分别为P＜0.05和P＜0.05(其中有2只动物尾静脉注射时失败，3只动物解剖时出血严重影响检测)。提示黄连、吴茱萸总生物碱具有一定的抗炎作用。
关于对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503；氢氧化铝，山西临汾民康制药厂生产，批号040202；动物1、来源，种属，品系，合格证安徽医科大学实验动物中心提供，Wister大鼠，远交封闭系，皖医动准第03号。
2、体重200-250g3、性别♂。
4、动物数60只，每组10只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器
1、盐酸，2、乙醇，3、阿拉伯胶。
试验方法参照文献方法，取大鼠60只，雄性，随机均分为5组，分别为阿拉伯胶对照组、黄连、吴茱萸组、氢氧化铝组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的阿拉伯胶液(5％，1ml/100g)；黄连、吴茱萸组给予1.00g/kg的黄连、吴茱萸；氢氧化铝组给予0.45g/kg的氢氧化铝；总生物碱组分别给予0.05、0.10、0.20g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)；禁食48小时(不禁水)后，按上分组给药1ml/100g或对照液，1小时后每只大鼠灌胃盐酸-乙醇混合液1.5ml/只，再过1小时后用过量乙醚麻醉大鼠致死，开腹取胃，用夹子夹紧贲门，由幽门注入1％甲醛溶液5ml，夹紧幽门，将全胃置于1％甲醛溶液中固定10min。沿胃大弯剪开，将胃外翻，用清水轻轻洗去胃内容物。将胃平铺于玻璃板上，用尺子测量胃粘膜损伤长度，以损伤长度(损伤长度大于1mm者加倍计算)总和作为胃粘膜损伤指数，并计算与给药前的差值，与生理盐水组相比较，并进行统计学处理，结果见表1。
表1 对盐酸-乙醇所致大鼠急性胃粘膜损伤的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较**P＜0.01，***P＜0.001，试验结果由试验可知，大鼠给予盐酸-乙醇后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
关于对大鼠急性应激性胃粘膜损伤模型的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对对大鼠急性应激性胃粘膜损伤模型的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503；氢氧化铝，山西临汾民康制药厂生产，批号040202；动物1、来源，种属，品系，合格证安徽医科大学实验动物中心提供，Wister大鼠，远交封闭系，皖医动准第03号。
2、体重150-200g3、性别♂。
4、动物数60只，每组10只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器1、乙醚，甲醛溶液。
2、恒温水浴锅，自制大鼠固定器。
试验方法参照文献方法，取大鼠60只，雄性，随机均分为5组，分别为阿拉伯胶对照组、黄连、吴茱萸组、氢氧化铝组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的阿拉伯胶液(5％，1ml/100g)；黄连、吴茱萸组给予1.00g/kg的黄连、吴茱萸；氢氧化铝组给予0.45g/kg的氢氧化铝；总生物碱组分别给予0.05、0.10、0.20g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)；禁食24小时(不禁水)后，按上分组给药1ml/100g或对照液。先用乙醚轻度麻醉，四肢各系上一条丝绳后，在把大鼠仰卧位放在特制固定钢板上，头部用特制的固定器固定，然后给药，于给药后20min将固定好的大鼠直立浸于23℃的恒温水槽内，水面以齐剑突为宜，水浸20h后，放血，处死。结扎幽门和贲门后取胃，每胃由腺胃部注入6ml生理盐水，并将其放入1％甲醛溶液中固定10min，沿胃大弯剪开，将胃外翻，用清水轻轻洗去胃内容物。将胃平铺于玻璃板上，用尺子测量胃粘膜损伤长度，以损伤长度(损伤长度大于1mm者加倍计算)总和作为胃粘膜损伤指数，并计算与给药前的差值，与生理盐水组相比较，并进行统计学处理，结果见表2。
表2 对大鼠急性应激性胃粘膜损伤模型的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，试验结果由试验可知，大鼠给予水浸应激后，可以造成胃粘膜损伤模型，给予阳性对照药及总生物碱后，对胃粘膜溃疡的形成有比较明显的保护作用，经统计学分析，分别给予总生物碱0.05、0.10、0.20g/kg(分别相当于临床用量的2.5、5、10倍)后，与阴性对照组相比有非常显著意义，分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001，与黄连、吴茱萸及氢氧化铝有相同的药理作用。提示总生物碱具有一定的抗胃炎及胃溃疡形成作用。
关于对小鼠热板所致痛阈值的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠因热板所致痛阈值的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503。
试验动物1、来源，种属，品系，合格证安徽省医学科学研究所实验动物中心提供，昆明种小鼠，远交封闭系，皖医动准第01号。
2、体重18～22g3、性别♀。
4、动物数50只，每组10只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器热板仪安徽省药物研究所自制；电热恒温水浴锅，上海医疗器械厂产品。
试验方法参照文献方法，取♀性昆明种小鼠50只，随机分成5组，分别为对照组、黄连、吴茱萸组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的生理盐水；黄连、吴茱萸组给予2.00g/kg的黄连、吴茱萸；总生物碱组分别给予0.10、0.20、0.40g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的5、10、20倍)；分别灌胃给予0.2ml/10g相应供试液，连续7天，第7天给完药后0.5h时做试验。末次给药后0.5h、1.0h将小鼠放入热板上(将恒温水浴调节至55±0.5℃，上放入2000ml的铁皮烧怀，底部接触水面)，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间(S)作为该鼠的痛阈值，并作t检验，比较组间差异显著性。
试验结果由试验可知，黄连、吴茱萸总生物碱小、中、大剂量(0.10、0.20、0.40g/kg，分别相当于临床用量的5、10、20倍)灌胃给予小鼠7天后，可明显提高因热板所致小鼠的痛阈值，经统计学分析，在给药后30分钟和60分钟时与生理盐水组相比较具有显著意义(分别为P＜0.05～P＜0.001)。与黄连、吴茱萸原剂型相比具有同等的药理作用。结果见表3表3 黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠因热板所致痛阈值的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
关于对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响试验目的观察黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响。
受试药物1、药物名称黄连、吴茱萸总生物碱2、提供单位安徽省药物研究所提供。
3、批号040418。
4、含量每g总生物碱内含生药10.5g。
5、配制方法用蒸馏水配制。
6、对照药品黄连、吴茱萸，湖北施恩堂制药有限公司生产，批号030503。
动物1、来源、种属、品名、合格证安徽省医学科学研究所实验动物中心提供，昆明种小鼠，远交封闭系，皖医动准第01号。
2、体重18-22g3、性别♂♀各半。
4、动物数60只，每组12只。
5、实验环境实验室温度为18-28℃，相对湿度为50-70％。
6、颗粒饲料由阜阳颖泉康乐实验动物饲料有限公司提供。
试剂及仪器1、依文思蓝，上海化学试剂采购供应站行知校办厂分装，批号881102。
2、醋酸天津市东丽区天大化学试剂厂出品，批号020215。
3、721型分光光度计，上海第三分析仪器厂出品。
4、80-2沉淀离心机，上海手术器械厂产品。
5、TG 328B型电光分析天平，上海天平仪器厂产品。
试验方法参照文献方法，取小鼠60只，随机分成5组，分别为对照组、黄连、吴茱萸组及总生物碱小、中、大剂量组。对照组给予等体积的生理盐水；黄连、吴茱萸组给予2.00g/kg的黄连、吴茱萸；总生物碱组分别给予0.10、0.20、0.40g/kg的总生物碱提取物(分别相当于临床用量的5、10、20倍)；分别灌胃给予0.2ml/10g相应供试液，连续5天，末次给完药后0.5h时做试验。于末次药后30min尾静脉注射依文思兰生理盐水溶液0.1ml/10g，然后立即腹腔注射0.6％醋酸0.1ml/10g，20min后处死动物，用生理盐水每次约2-3ml清洗腹腔3次，合并腹腔洗液，加生理盐水至10ml，混匀后，3000r/min离心15min，取上清液加入0.1N的NaOH 0.1ml，于590min在721分光光度计上比色，测定光密度，结果进行统计分析(t检验)。
试验结果试验表明，黄连、吴茱萸总生物碱三剂量及黄连、吴茱萸原剂型均可明显抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，与生理盐酸水组相比较，有非常显著意义，其中黄连、吴茱萸总生物碱中、大剂量组经统计分析分别为P＜0.05和P＜0.05(其中有2只动物尾静脉注射时失败，3只动物解剖时出血严重影响检测)。提示黄连、吴茱萸总生物碱具有一定的抗炎作用。见表4表4 黄连、吴茱萸总生物碱对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(X±SD)
注与生理盐水组相比较*P＜0.0权利要求
1.黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法，其特征是按以下步骤进行，所述份数均为重量份；a、取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉，混合得粉料；b、向粉料中加入5～10倍量70～95％乙醇回流提取1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；药渣再用4～10倍量水煎煮1～3次，每次0.5～3小时，过滤，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0～1.2，得浓缩液；c、对步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏，用1～6倍生药量乙酸乙酯萃取1～4次，回收乙酸乙酯后分别得提取物A和水溶液；水溶液和步骤b的浓缩液合并，静置，滤过，滤液用盐酸调pH为1.0～5.0，加入NaCl使含量为5～10％(重量/体积)，搅拌使其溶解，静置后滤过，沉淀后用水洗涤至pH为3.0～7.0，得提取物B；d、合并提取物A和提取物B，50～70℃下减压干燥，粉碎，得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在所述步骤b中，向所述粉料中加入的是6～9倍量80～95％的乙醇回流提取1～3次，每次为0.5～2小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是在所述步骤b中，所述药渣是用6～9倍量的水煎煮1～3次，每次0.5～2小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是在所述步骤c中，对所述步骤b乙醇提取液回收乙醇得稠膏后，用1～3倍生药量乙酸乙酯萃取1～2次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是在所述步骤c中，所述滤液用盐酸调pH为1.0～3.0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是在所述步骤c中，沉淀后用水洗涤至pH为4.0～6.0，得提取物B。
7.一种权利要1所述方法提取的黄连、吴茱萸总生物碱制剂，其特征在是将所提取的黄连、吴茱萸总生物碱按常规制剂工艺制成用于治疗急慢性胃炎、胃溃疡的各种剂型。
全文摘要
黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法及其制剂，提取方法特点是取黄连6份、吴茱萸1份，分别粉碎成粗粉后混合，经乙醇回流提取，回收乙醇，稠膏用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得提取物；乙醇回流后的药渣加水煎煮过滤，浓缩得浓缩液；萃取后的水溶液和浓缩液过滤，滤液用盐酸调pH为1.0～4.0，溶液中加NaCl使含量为5～10％，搅拌使其溶解，静置滤过，沉淀用水洗涤至pH为4.0～7.0得提取物，与上述提取物合并，减压干燥、粉碎即得提取物黄连、吴茱萸总生物碱。按该方法提取的黄连、吴茱萸总生物碱具有抗胃炎、胃溃疡及镇痛等药理作用，其总生物碱含量大于60％，总生物碱中盐酸小檗碱含量为60％，其它生物碱占40％。本发明易于实施、成本低、易制成各种制剂。
文档编号A61P1/04GK1660210SQ20041006589
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月23日 优先权日2004年12月23日
发明者杨士友, 黄世福, 贺飞, 张毅, 吕凌 申请人:安徽省药物研究所, 杨士友
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