猪白细胞干扰素的制备方法
专利名称：猪白细胞干扰素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，具体是用于紧急预防和治疗猪上呼吸道感染、流行性腹泻等病毒性疾病的广谱猪用白细胞干扰素的制备方法。
背景技术：
猪病毒性疾病仍是当前严重制约养猪业健康发展的主要传染病，全国每年均有上亿头猪在不同季节发生病毒性传染病，如猪上呼吸道感染、猪流行性腹泻、猪瘟等。猪一旦感染发病，则有起病急、临床症状严重、极易传播扩散，以及感染率和死亡率均较高的特点，对养殖业危害极大。更为重要的是，猪在某些引起人兽共患疾病中扮演者“基因混合器”的作用，由此产生的“杂交”病毒，有可能引起人类新型传染病。因此，积极预防和治疗猪病毒性疾病一直是共同关注的问题。干扰素(Interferon，IFN)自1959年Isaacs等发现以来，已在临床应用多年，是目前公认的机体抗病毒感染防御体系中，出现最早且对大多数病毒均有抑制作用的一组糖蛋白，此外该组糖蛋白还具有明显的免疫调节功能和抗肿瘤活性。Torlone等于1965年报道了使用猪外周血白细胞研制出猪白细胞干扰素(PLIFN)并应用于猪病毒性疾病治疗的研究结果，引起了国内外学者的高度重视和兴趣。国内杨子楼、刘万钧和张立明等不但分别研制出高效价PLIFN，还将研制出的PLIFN用于治疗猪流行性腹泻和流行性出血热，均获得较好治疗效果。近年国内已有四川世红生物技术有限公司生产的猪白细胞干扰素出售，但在兽医临床上，猪白细胞干扰素尚未被广泛应用，主要原因在于用户对产品不够了解，且需冷藏保存和运送，推广受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪白细胞干扰素的制备方法，借鉴人脐血白细胞干扰素制备工艺，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装和冻干等工艺，制成猪白细胞干扰素冻干粉针剂。
本发明技术方案如下猪白细胞干扰素的制备方法，包括以下步骤
(1)、以2000rpm离心装有猪的新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml；(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯猪白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；(3)、在启动后的猪白细胞悬液中加入鸡新城疫病毒NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量的含10％猪血清或猪血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4放置4～5天，灭活病毒，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到猪白细胞干扰素粗制品。
所述的猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于对猪白细胞干扰素粗制品依下列步骤精制(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾KCNS，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀，(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0，(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0～8.5，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(11)、沉淀物中加入1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5MKCNS)溶液；
(12)、4℃搅拌8～24小时，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0～3.5；(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；(18)、3万g离心1小时，弃沉淀；(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；(20)、无菌分装，-70℃保存。
PB是指不含有盐的缓冲溶液，预温的培养液是指把温度4℃ RPMI 1640加热到接近37℃。
本发明制备的猪白细胞干扰素，经严格安全检验后，制成冻干粉针剂，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，规格为干扰素含量≥2万单位/瓶，2～8℃或室温保存。使用时要轻轻摇匀后方可进行肌肉注射，乳猪5000～10000单位/头/天；仔猪10000～20000单位/头/天；育肥猪20000～40000单位/头/天。每日注射1次，一个疗程3～5次。
本发明制备的猪白细胞干扰素，具有广谱抗病毒作用，主要用于紧急预防和治疗病毒性上呼吸道感染猪、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合症和流行性腹泻等病毒性疾病。
本发明成功解决了猪新鲜血源来源易受污染等问题，制成的猪白细胞干扰素，注入动物机体后，稳定性强、储运方便、安全可靠、无毒副作用和不污染环境等特点。
在治疗已发病猪的同时，应及时隔离未发病猪，并给予等量药物预防注射，使用本发明制备的猪白细胞干扰素时，应注意环境的消毒等综合预防措施，防治再感染或疫病的复发。
具体实施例方式
猪白细胞干扰素制备工艺一、配制抗凝剂(每支12500单位的肝素钠加Hank`s液10ml，每毫升为1250单位)及抗生素(卡那霉素，使用时终浓度为100μg/ml)。
二、猪全血采集，在动物手术间无菌采集猪心脏全血，加入抗凝剂与抗生素，摇匀，在4℃冰箱放置备用。
三、制备鸡新城疫病毒(F系)四、按产品说明书规定溶解RPMI 1640粉剂，经蔡氏滤器加压过滤，无菌检测后在4℃冰箱放置备用。
五、粗制品干扰素制备(1)、以2000rpm离心装有猪的新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml。
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯猪白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时。
(3)、在启动后的猪白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量含10％猪血清或猪血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4放置4～5天，灭活病毒，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到猪白细胞干扰素粗制品。
PB是指不含有盐的缓冲溶液，预温的培养液是指把温度4℃ RPMI 1640加热到接近37℃。
上述经检验合格的粗制干扰素在4℃下，以2000rpm离心30分钟，取上清液用蔡氏滤器加压过滤，无菌收集滤液，再取样进行无菌检验效价测定、安全检验和外源病毒检验等合格后，加入终浓度含5％体积脱脂牛奶作为冻干保护剂混匀后，置入冻干保存。再经真空密度测定，剩余水分检测合格后，置4℃或室温(≤25℃)保存备用。
干扰素粗制品可依下列步骤精制(盐析纯化)(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾(KCNS)，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀；(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0；(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(11)、沉淀物中加入原1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS)溶液；(12)、4℃搅拌过夜，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0～3.5；(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；(18)、3万g离心1小时，弃沉淀；(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；(20)、无菌分装，-70℃保存。
权利要求
1.猪白细胞干扰素的制备方法，包括以下步骤(1)、以2000rpm离心装有猪的新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml；(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯猪白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；(3)、在启动后的猪白细胞悬液中加入鸡新城疫病毒NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量的含10％猪血清或猪血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4放置4～5天，灭活病毒，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到猪白细胞干扰素粗制品。
2.根据权利要求1所述的猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于对猪白细胞干扰素粗制品依下列步骤精制(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾KCNS，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀，(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0，(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0～8.5，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(11)、沉淀物中加入1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5MKCNS)溶液；(12)、4℃搅拌8～24小时，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0～3.5；(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；(18)、3万g离心1小时，弃沉淀；(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；(20)、无菌分装，-70℃保存。
全文摘要
本发明公开了一种猪白细胞干扰素的制备方法，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装和冻干等工艺，制成的猪白细胞干扰素冻干粉针剂，注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠、无毒副作用和不污染环境等特点。可用于防治猪上呼吸道感染、流行性腹泻等病毒性疾病。也可供实验室研究使用。
文档编号A61P31/12GK1661035SQ20041006592
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月25日 优先权日2004年12月25日
发明者王明丽 申请人:王明丽
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，具体是用于紧急预防和治疗猪上呼吸道感染、流行性腹泻等病毒性疾病的广谱猪用白细胞干扰素的制备方法。
背景技术：
猪病毒性疾病仍是当前严重制约养猪业健康发展的主要传染病，全国每年均有上亿头猪在不同季节发生病毒性传染病，如猪上呼吸道感染、猪流行性腹泻、猪瘟等。猪一旦感染发病，则有起病急、临床症状严重、极易传播扩散，以及感染率和死亡率均较高的特点，对养殖业危害极大。更为重要的是，猪在某些引起人兽共患疾病中扮演者“基因混合器”的作用，由此产生的“杂交”病毒，有可能引起人类新型传染病。因此，积极预防和治疗猪病毒性疾病一直是共同关注的问题。干扰素(Interferon，IFN)自1959年Isaacs等发现以来，已在临床应用多年，是目前公认的机体抗病毒感染防御体系中，出现最早且对大多数病毒均有抑制作用的一组糖蛋白，此外该组糖蛋白还具有明显的免疫调节功能和抗肿瘤活性。Torlone等于1965年报道了使用猪外周血白细胞研制出猪白细胞干扰素(PLIFN)并应用于猪病毒性疾病治疗的研究结果，引起了国内外学者的高度重视和兴趣。国内杨子楼、刘万钧和张立明等不但分别研制出高效价PLIFN，还将研制出的PLIFN用于治疗猪流行性腹泻和流行性出血热，均获得较好治疗效果。近年国内已有四川世红生物技术有限公司生产的猪白细胞干扰素出售，但在兽医临床上，猪白细胞干扰素尚未被广泛应用，主要原因在于用户对产品不够了解，且需冷藏保存和运送，推广受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪白细胞干扰素的制备方法，借鉴人脐血白细胞干扰素制备工艺，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装和冻干等工艺，制成猪白细胞干扰素冻干粉针剂。
本发明技术方案如下猪白细胞干扰素的制备方法，包括以下步骤
(1)、以2000rpm离心装有猪的新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml；(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯猪白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；(3)、在启动后的猪白细胞悬液中加入鸡新城疫病毒NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量的含10％猪血清或猪血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4放置4～5天，灭活病毒，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到猪白细胞干扰素粗制品。
所述的猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于对猪白细胞干扰素粗制品依下列步骤精制(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾KCNS，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀，(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0，(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0～8.5，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(11)、沉淀物中加入1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5MKCNS)溶液；
(12)、4℃搅拌8～24小时，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0～3.5；(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；(18)、3万g离心1小时，弃沉淀；(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；(20)、无菌分装，-70℃保存。
PB是指不含有盐的缓冲溶液，预温的培养液是指把温度4℃ RPMI 1640加热到接近37℃。
本发明制备的猪白细胞干扰素，经严格安全检验后，制成冻干粉针剂，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，规格为干扰素含量≥2万单位/瓶，2～8℃或室温保存。使用时要轻轻摇匀后方可进行肌肉注射，乳猪5000～10000单位/头/天；仔猪10000～20000单位/头/天；育肥猪20000～40000单位/头/天。每日注射1次，一个疗程3～5次。
本发明制备的猪白细胞干扰素，具有广谱抗病毒作用，主要用于紧急预防和治疗病毒性上呼吸道感染猪、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合症和流行性腹泻等病毒性疾病。
本发明成功解决了猪新鲜血源来源易受污染等问题，制成的猪白细胞干扰素，注入动物机体后，稳定性强、储运方便、安全可靠、无毒副作用和不污染环境等特点。
在治疗已发病猪的同时，应及时隔离未发病猪，并给予等量药物预防注射，使用本发明制备的猪白细胞干扰素时，应注意环境的消毒等综合预防措施，防治再感染或疫病的复发。
具体实施例方式
猪白细胞干扰素制备工艺一、配制抗凝剂(每支12500单位的肝素钠加Hank`s液10ml，每毫升为1250单位)及抗生素(卡那霉素，使用时终浓度为100μg/ml)。
二、猪全血采集，在动物手术间无菌采集猪心脏全血，加入抗凝剂与抗生素，摇匀，在4℃冰箱放置备用。
三、制备鸡新城疫病毒(F系)四、按产品说明书规定溶解RPMI 1640粉剂，经蔡氏滤器加压过滤，无菌检测后在4℃冰箱放置备用。
五、粗制品干扰素制备(1)、以2000rpm离心装有猪的新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml。
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯猪白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时。
(3)、在启动后的猪白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量含10％猪血清或猪血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4放置4～5天，灭活病毒，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到猪白细胞干扰素粗制品。
PB是指不含有盐的缓冲溶液，预温的培养液是指把温度4℃ RPMI 1640加热到接近37℃。
上述经检验合格的粗制干扰素在4℃下，以2000rpm离心30分钟，取上清液用蔡氏滤器加压过滤，无菌收集滤液，再取样进行无菌检验效价测定、安全检验和外源病毒检验等合格后，加入终浓度含5％体积脱脂牛奶作为冻干保护剂混匀后，置入冻干保存。再经真空密度测定，剩余水分检测合格后，置4℃或室温(≤25℃)保存备用。
干扰素粗制品可依下列步骤精制(盐析纯化)(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾(KCNS)，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀；(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0；(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(11)、沉淀物中加入原1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS)溶液；(12)、4℃搅拌过夜，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0～3.5；(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；(18)、3万g离心1小时，弃沉淀；(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；(20)、无菌分装，-70℃保存。
权利要求
1.猪白细胞干扰素的制备方法，包括以下步骤(1)、以2000rpm离心装有猪的新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml；(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯猪白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；(3)、在启动后的猪白细胞悬液中加入鸡新城疫病毒NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量的含10％猪血清或猪血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4放置4～5天，灭活病毒，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到猪白细胞干扰素粗制品。
2.根据权利要求1所述的猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于对猪白细胞干扰素粗制品依下列步骤精制(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾KCNS，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀，(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0，(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0～8.5，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(11)、沉淀物中加入1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5MKCNS)溶液；(12)、4℃搅拌8～24小时，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0～3.5；(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；(18)、3万g离心1小时，弃沉淀；(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；(20)、无菌分装，-70℃保存。
全文摘要
本发明公开了一种猪白细胞干扰素的制备方法，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装和冻干等工艺，制成的猪白细胞干扰素冻干粉针剂，注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠、无毒副作用和不污染环境等特点。可用于防治猪上呼吸道感染、流行性腹泻等病毒性疾病。也可供实验室研究使用。
文档编号A61P31/12GK1661035SQ20041006592
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月25日 优先权日2004年12月25日
发明者王明丽 申请人:王明丽
最新回复(0)