基于多芳香化合物的药物组合物的制作方法
专利名称：基于多芳香化合物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及以特别可用作抗肿瘤医药产品的多芳香化合物为基础的药物组合物。
1999年，用于减少癌肿瘤大小，包括肿瘤发育过程，消除癌细胞肿块和扩散危险的细胞毒性治疗(化疗)使最近引入的化学物质与已经使用了几十年的其它物质结合。例如，近40年作为结肠直肠癌最活跃的治疗剂5-氟脲嘧啶(5-FU)，当肿瘤不再对5-FU敏感时，可能被其它对拓扑异构酶I专一性的抑制剂(irinotecan或topotecan)代替。更一般地，可得到的用于治疗结肠直肠癌的治疗性毒物也可以通过oxaliplatin，一种5-FU的新颖就地“供体”或胸苷酸合成酶的选择性抑制剂的有效性而丰富。这种共存不限于结肠直肠癌的治疗，因为乳腺，卵巢和肺癌的化疗现在广泛地使用了紫杉烷衍生物家族(paclitaxel和docetaxel)。迫切需要更有效和更耐受的治疗剂，从而改善存活率和患者的生活质量，因为，再以结肠直肠肿瘤为例，已经证实(S.L.Parker，T.Tong，S.Bolden et al.，CA Cancer J.Clin.，1997)，仅在美国，在1997年就有131000个新病例被确诊，其中54000人死亡。这一现状促使发明人将其注意焦点放在很少研究过，在温海的海鞘类动物体内鉴定的多芳香化合物家族，去开发新的医用化合物，选择性地合成从化学设计/修饰研究衍生，并具有明显治疗性细胞毒性活性的化合物。
覆盖了地球表面70％以上的海洋是海洋植物和海绵的家，其进行的系统生药学研究显示，这些生物种可能含有具有良好药理性质的复杂生物碱。例如，海绵Cryptotheca crypta和Halichondria okadai是深入研究的主体，因为在其细胞中发现有cytarabin或halichondrinB存在。这与被囊类动物家族的情况相似，因为从生活在Balearic岛(西班牙)的被囊类动物Aplidium albicans分离出了aplidin。四氢异喹诺酮结构的生物碱已经从鞘类动物Ecteinascidia turbinata分离出来。其中，ecteinascidin-743已经是临床前深入研究的主体(E.Igbicka et al.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.130 p.34)，并且也是用于确定其作为抗癌医药品的治疗效力的主体(A.Bowman etal.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.452 p.118；M.Villanova-Calero et al.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.455p.119；E.Citkovic et al.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.456p.119)。新的五环吖啶衍生物已经成为药化研究的主体(D.J.Haganet al.，J.Chem.Soc.，Perkin Transf.，1997；12739-2746)。
这些化合物中，应该提到meridine，一种从海鞘Amphicarpameridiana或海绵Corticum sp.提取的天然生物碱。meridine由Schmitz等人分离(J.Org.Chem.1991；56804-808)，然后在US-A-5182287(Gunawardana等人，1993年1月23日)中描述了其在鼠白血病(P388)模型上的抗增生性质和其抗真菌性质。其抗真菌性质由McCarthy等人(J.of Nat.Products 1992；551664-1668)描述，而其对两种人细胞系结肠癌细胞(HT-29)和肺癌细胞(A549)的细胞毒性由Longley等人报道(J.of Nat.Products 1993；56915-920)描述。meridine的合成已经根据Kitahara等人(Chem.Pharm.Bull.，1994；421363-1364)，Bontemps等人(Tetrahedron 1997；371743-1750)和Kitahara等人(Tetrahedron 1998；548421-8432)的各种方法进行。
这些化合物中，应该提到cystodamine，一种由Bontemps等人(Tetrahedron lett.，1994；357023-7026)从海鞘类动物Cystodytes dellechiajei分离的对人淋巴性白血病具有活性的五环生物碱。
本发明的主题是含有有效量的选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的药物组合物 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
更具体地，本发明的主题是选自式I和式II的化合物，其中R1，R3和R4选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’，-NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R2选自硝基和-NHCOCF3基，和这些化合物与药用酸的加成盐。
在优选的方案中，本发明的主题是包括有效量的选自其中R1选自氢和甲氧基和-N(CH3)2基的式I化合物，和其中R1选自氢和甲氧基，-N(CH3)2和-NHCOCH3基，而R2是-NHCOCF3基的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的药物组合物。
在另一种形式中，本发明的主题是包括有效量的选自其中R3是-COOEt基的式I化合物，和其中R3是-COOEt基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的药物组合物。
在另一种形式中，本发明的主题是包括有效量的选自其中R4是甲氧基的式I化合物，和其中R4是甲氧基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的药物组合物。
表述“与药用酸的加成盐”指具有游离碱的生物学性质，但没有负作用的盐。特别是这些盐可以是与无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸或磷酸；酸性金属盐，如正磷酸二钠和硫酸一钾，和有机酸的盐。
一般说来，式I和II的化合物根据Kitahara等人(Chem.Pharm.Bull.，1994；421363-1364)，和Kitahara等人(Tetrahedron 1998；548421-8432)所述的一般反应路线获得。根据该路线，式II化合物可以通过在4-位取代的喹啉-5，8-二酮和取代的氮杂-二烯之间的杂Diels-Alder反应，接着使中间体二氢化的化合物脱氢而制备。式I化 下列实施例举例说明式I和II化合物的制备。实施例16-氯-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮(CR 8250)将1.2g(4mmol)4-(2-三氟乙酰氨基苯基)-1-二甲基氨基-1-氮杂-1，3-丁二烯和1ML乙酸酐加入0.7g(3.63mmol)4-氯喹啉-5，8-二酮在50ML乙腈中的溶液。反应介质被回流6小时，在旋转蒸发器上蒸出溶剂。滤过硅胶(99.5/0.5二氯甲烷/甲醇)纯化后，得到0.46g加合物。该化合物溶于100ML甲苯，加入4g Pd/C(10％)，反应介质被回流2小时。过滤并用甲醇然后二氯甲烷洗涤残余物后，将滤液在旋转蒸发器上浓缩，然后通过快速硅胶柱层析(98/2二氯甲烷/甲醇)纯化，给出87mg金黄色粉末形式的化合物CRL 8250。·产率6％·熔点152℃··1H NMR(CDCl3)7.21(d，1H，J＝9Hz)；7.46(dd，1H，J＝7.5和7.5Hz)；7.58(m，2H)；7.72(m，2H)；7.81(s，1H)；8.94(d，1H，J＝5.1Hz)；9.13(d，1H，J＝4.7Hz).·13C NMR(CDCl3)115.49(q，J＝287.2Hz)；125.55；128.11；128.27；129.20；129.35；130.16；131.02；131.32；131.52；133.58；145.13；147.57；148.24；149.85；154.35；154.86；155.34(q，J＝37Hz)；179.28；182.40.
将1.9g(6.5mmol)4-(2-三氟乙酰氨基苯基)-1-二甲基氨基-1-氮杂-1，3-丁二烯，2.2ML乙酸酐和1.6g Pd/C(10％)先后加入5，8-二氧代喹诺酮(1.04g，5.9mmol)在500ML乙腈中的溶液。反应介质在氮气氛中回流15小时。在旋转蒸发器上蒸出溶剂后，所得的粗产物通过快速硅胶柱层析(二氯甲烷然后95/5二氯甲烷/甲醇)纯化，给出400mg化合物CRL 8249黄色粉末(或其在8位的氧代互变异构体)。·产率16％·熔点＞260℃·IR(CHCl3)1664，1685，1735，3 3 34，3401cm-1.·MSm/z 413(33)；344(17)；301(100)；177(44).·1H NMR(CDCl3)6.90(dd，1H，J＝9.9Hz)；7.19(dd1H，J＝7.8和1.5Hz)；7.47(ddd，1H，J＝7.8，7.8和1.1Hz)；7.60(m，2H)；7.68(m，2H)；7.93(d，1H，J＝9.9Hz)；9.09(d，1H，J＝4.8Hz).·13C NMR(CDCl3)115.56(q，J＝288Hz)；126.34；126.90；127.08；128.69；129.12；130.89；134.61；135.63；146.85；148.02；150.56；151.70；152.83；154.92；155.57(q，J＝38Hz)；161.92；169.63；179.50；181.13.
根据Kitahara等人，Tetrahedron 1998；548421-8432所述的方法合成此化合物。
将1.2ml(19.27mmol)甲基碘和158mg(1.8mmol)Ag2CO3加入100mg(0.288mmol)溶于75ML氯仿中的化合物CRL 8456。混合物在无光的情况下在50℃搅拌48小时。蒸出溶剂后，所得的粗产物通过快速柱层析(二氯甲烷)纯化，以黄色粉末形式给出56mg化合物8457。·产率54％·熔点＞260℃·IR(CHCl3)1670，1701cm-1.·MSm/z 361(2)；315(42)；314(100)；286(32)；257(7)；188(15).·1H NMR(CDCl3)4.21(s，3H)；7.06(d，1H，J＝8.8Hz)；7.27(dd，1H，J＝7.5和1.5Hz)；7.45(d，1H，J＝4.8Hz)；7.69(ddd，1H，J＝1.5；8.2和7.5Hz)；7.77(ddd，1H，J＝7.5；8.2和1.1Hz)；8.20(d，1H，J＝8.4Hz)；8.34(dd，1H，J＝8.2和1.1Hz)；9.14(d，1H，J＝4.8Hz).·13C NMR(CDCl3)55.00；117.62；124.77；125.53；126.64；128.51；129.40；129.85；133.93；135.03；137.64；146.82；147.68；149.25；149.43；154.24；167.63；179.85；182.07.
下列药理试验的结果证明了式I和II化合物的细胞毒性，和最大耐受剂量。1-测定最大耐受剂量(MTD)以4-至6-周大的B6D2F1/Jico小鼠评价最大耐受剂量。化合物以在2.5至160mg/kg范围内增加的剂量腹膜内给药。通过观察单独给药所考虑的产物后14天的周期内动物的存活率来测定MTD的值(以mg/kg表达)。在此周期内也监测动物体重的变化。
最大耐受剂量(MTD)的估算结果在下表中给出
表I
2-在培养物中对肿瘤细胞系的细胞毒性活性用MTT比色试验评价式I和II化合物对肿瘤细胞的影响。MTT试验的原理基于由代谢活性活细胞将黄色产物MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑翁)线粒体还原为蓝色产物甲赞。所得的甲赞的量与在培养孔中存在的活细胞的量成正比。甲赞的量通过光谱计测量。
该细胞系在37℃，保持在含有25MMHEPES MEM(最少基本培养基)基培养基的有盖的培养皿中的单层培养物中。适合于生长各种二倍体或初级哺乳动物细胞的该培养基然后补加-5％量的在56℃脱补体1小时的FCS(胎牛血清)，-0.6mg/ml L-谷氨酰胺，-200IU/ML青霉素，-200mg/ml螺旋霉素，-0.1mg/ml庆大霉素。
从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)获得12种人癌细胞系。这12种细胞系是-U-373MG(ATCC编号HTB-17)和U-87MG(ATCC编号HTB-14)，它们是两种成胶质细胞瘤。-SW1088(ATCC编号HTB-12)，它是一种星形细胞瘤，-A549(ATCC编号CCL-185)和A-427(ATCC编号HTB-53)，它们是两种非小细胞肺癌，-HCT-15(ATCC编号CCL-225)和LoVo(ATCC编号CCL-229)，它们是两种结肠直肠癌，-T-47D(ATCC编号HTB-133)和MCF7(ATCC编号HTB-22)，它们是两种乳腺癌，-J82(ATCC编号HTB-1)和T24(ATCC编号HTB-4)，它们是两种膀胱癌，-PC-3(ATCC编号CRL-1435)，这是一种前列腺癌。
实验将100μl含有200000至50000(根据所用的细胞类型)细胞/ML培养基的细胞悬浮液在平底96-孔多孔板上接种，并在包含5％二氧化碳和70％湿度的大气中于37℃温育。温育24小时后，将该培养基用100μl含有其浓度范围为10-5至10-10M的各种试验化合物或用于溶解试验产物的溶剂(对照条件)的新鲜培养基代替。在上述条件下温育72小时后，该培养基用100μl以1mg/ml的浓度溶于RPMI 1640中的MTT黄色溶液替换。微滴板在37℃再温育3小时，然后在400×g离心10分钟。除去MTT的黄色溶液，在细胞水平所形成的蓝色甲赞晶体被溶于100μl DMSO。然后将微滴板振动5分钟。通过在分别对应于甲赞的最大吸收波长和背景干扰的570nm和630nm的波长用DYNATECHIMMUNOASSAY SYSTEM机器以分光光度计定量测定在实验的最后由仍然存活的细胞将黄色MTT产物转化为蓝色甲所产生蓝色的强度。软件可以将分光光度计的读数换算成平均光密度值，也可以是标准偏差(Std.Dev.)和平均标准误差(SEM)值。
式I和式II化合物对不同肿瘤细胞系的细胞生长的抑制活性与天然产物Meridine(CRL 8348)比较。所有式I和式II化合物根据所试验的化合物和肿瘤系，以10-6M和10-10M之间的抑制浓度50(IC50)对12种人肿瘤系U-87MG，U-373MG，SW1088，T24，J82，HCT-15，LoVo，MCF7，T-47D，A549，A-427和PC-3细胞的增殖显示明显的抑制活性。在各种细胞系上获得的在IC50附近(flanking)的浓度值以举例的方式在表II中给出
表II
表III给出了平均IC50值(nM)(从对所研究的12种肿瘤系的细胞毒性计算)的结果和MTD/IC50比(这些比值通过形成以无单位数值表达的MTD值和IC50值的比值而计算)。
表III
*各种化合物的MTD/IC50比以meridine的比值等于1作为参考来估算。
所述化合物对肿瘤细胞系模型所给出的IC50值(nM)小于或等价于天然化合物(meridine和cystodamine)。其最大耐受剂量接近于meridine和cystodamine。如表III中所示，当其IC50值明显地低于天然产物时，则本发明中举例的化合物的耐受性/细胞毒性活性比明显地高于meridine和cystodamine。因而这些化合物由于其细胞毒性，可以在高于由天然产物meridine和cystodamine诱导的组织浓度用作抗肿瘤药品。因此，其特征在于更好的治疗可操纵性。
由于其细胞毒性，所述的式I和II化合物，或以其药用盐或溶剂化物形式可以用作药品的活性成分。
式I和II化合物一般以根据每m2体表或每kg体重所确定的剂量单位给药。所说的剂量单位优选地被配制成其中活性成分与一种(或多种)药用赋形剂混合的药用组合物。
根据被治疗个体的癌症病理，上述式I和II的化合物以0.05至350mg/m2体表的剂量使用，优选地为0.5至50mg/m2/天，在急性期，治愈性治疗的情况下，其剂量为各疗程治疗周期数的函数。对于维持性治疗，根据疗程的治疗周期数，式I和II化合物最好以0.05至25mg/m2/天，的剂量，优选地以0.1至1.5mg/m2/天，的剂量使用。
在本发明用于口服或静脉内给药的药物组合物中，活性成分可以以给药单位形式给药，与适合于人治疗的常规药用载体混合。适合于给药的单位形式包含口服给药形式如片剂，它是可划分的，或胶囊，植入和静脉内给药形式。
对于肠胃外给药(以恒定的流速静脉内灌注)，含有药理上可共容的分散剂和/或增溶剂，例如丙二醇或聚乙二醇的无菌水悬浮液，无菌等渗盐溶液或无菌和可注射溶液被使用。
因此，为了制备用于在1至24小时进行灌注的静脉注射的水溶液，可以使用共溶剂醇类如乙醇，甘醇如聚乙二醇或丙二醇，和亲水性表面活性剂如Tween80。
当制备片剂形式的固体组合物时，润湿剂如月桂基硫酸钠可被加入微粒化或非微粒化的活性成分中，整体与药用载体与硅胶，明胶，淀粉，乳糖，硬脂酸镁，滑石，阿拉伯胶等混合。片剂可以用蔗糖，各种聚合物或其他合适的材料包衣，或者被这样处理，使其具有维持或延长的活性，和连续释放预定量的活性成分。
胶囊的制备通过将活性成分与稀释剂如甘醇或甘油酯混合，并将所得的混合物灌入软或硬胶囊中而获得。
活性成分也可以被任选地与一种或多种载体或添加剂配制为微胶囊或微球的形式。
活性成分也可以以与环糊剂，例如α-，β-或γ-环糊剂，2-羟基丙基-β-环糊剂或甲基-β-环糊剂的配合物的形式存在。
由于其强有力的细胞毒性，式I和II的化合物可被用于治疗大多数实体肿瘤，尤其是用于治疗脑瘤，肺癌，卵巢和乳腺肿瘤，结肠直肠癌，前列腺癌和睾丸肿瘤。
权利要求
1.含有有效量的选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物的药物组合物 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
2. 如权利要求1的药物组合物，含有有效量的选自式I和式II化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物，其中R1，R3和R4选自氢，卤素，羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’，-NH2，-N(R)2，-NHR，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
3.如权利要求2的药物组合物，包含有效量的选自其中R1选自氢和甲氧基和-N(CH3)2的式I化合物和其中R1选自氢和甲氧基，-N(CH3)2和-NHCOCH3基，而R2是-NHCOCF3基的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的化合物。
4.如权利要求2的药物组合物，包括有效量的选自其中R3是-COOEt基的式I化合物，和其中R3是-COOEt基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的化合物。
5.如权利要求2的药物组合物，包括有效量的选自其中R4是甲氧基的式I化合物，和其中R4是甲氧基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的化合物。
6.如下化合物4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，6-甲氧基-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，6-(二甲基氨基)-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，6-(乙酰氨基)-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，8-甲氧基-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，4-(2-三氟乙酰氨基苯基)-5，10-二氧代吡啶并[3，2-g]喹啉-7-羧酸乙酯，8-甲氧基-4-(2-硝基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，4-(2-硝基苯基)-5，10-二氧代吡啶并[3，2-g]喹啉-7-羧酸乙酯，苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，12-二甲基氨基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，10-羟基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，10-甲氧基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，11-乙基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉羧酸酯-8-酮，和其与药用酸的加成盐。
7.选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物在生产抗肿瘤药物中的用途 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
8.治疗肿瘤患者的方法，包括对该患者施用有效量的选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
全文摘要
本发明涉及包含有效量的选自式(I)和(II)化合物的化合物的药物组合物,其中:R
文档编号A61K31/4745GK1344269SQ0080519
公开日2002年4月10日 申请日期2000年3月17日 优先权日1999年3月18日
发明者E·德弗洛纳, N·博特普斯－萨别罗斯, F·达罗, J·巴斯蒂德, R·基斯, A·弗里德曼 申请人:L·拉峰试验公司
技术领域：
本发明涉及以特别可用作抗肿瘤医药产品的多芳香化合物为基础的药物组合物。
1999年，用于减少癌肿瘤大小，包括肿瘤发育过程，消除癌细胞肿块和扩散危险的细胞毒性治疗(化疗)使最近引入的化学物质与已经使用了几十年的其它物质结合。例如，近40年作为结肠直肠癌最活跃的治疗剂5-氟脲嘧啶(5-FU)，当肿瘤不再对5-FU敏感时，可能被其它对拓扑异构酶I专一性的抑制剂(irinotecan或topotecan)代替。更一般地，可得到的用于治疗结肠直肠癌的治疗性毒物也可以通过oxaliplatin，一种5-FU的新颖就地“供体”或胸苷酸合成酶的选择性抑制剂的有效性而丰富。这种共存不限于结肠直肠癌的治疗，因为乳腺，卵巢和肺癌的化疗现在广泛地使用了紫杉烷衍生物家族(paclitaxel和docetaxel)。迫切需要更有效和更耐受的治疗剂，从而改善存活率和患者的生活质量，因为，再以结肠直肠肿瘤为例，已经证实(S.L.Parker，T.Tong，S.Bolden et al.，CA Cancer J.Clin.，1997)，仅在美国，在1997年就有131000个新病例被确诊，其中54000人死亡。这一现状促使发明人将其注意焦点放在很少研究过，在温海的海鞘类动物体内鉴定的多芳香化合物家族，去开发新的医用化合物，选择性地合成从化学设计/修饰研究衍生，并具有明显治疗性细胞毒性活性的化合物。
覆盖了地球表面70％以上的海洋是海洋植物和海绵的家，其进行的系统生药学研究显示，这些生物种可能含有具有良好药理性质的复杂生物碱。例如，海绵Cryptotheca crypta和Halichondria okadai是深入研究的主体，因为在其细胞中发现有cytarabin或halichondrinB存在。这与被囊类动物家族的情况相似，因为从生活在Balearic岛(西班牙)的被囊类动物Aplidium albicans分离出了aplidin。四氢异喹诺酮结构的生物碱已经从鞘类动物Ecteinascidia turbinata分离出来。其中，ecteinascidin-743已经是临床前深入研究的主体(E.Igbicka et al.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.130 p.34)，并且也是用于确定其作为抗癌医药品的治疗效力的主体(A.Bowman etal.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.452 p.118；M.Villanova-Calero et al.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.455p.119；E.Citkovic et al.，NCIEORTC symposium，1998；Abst.456p.119)。新的五环吖啶衍生物已经成为药化研究的主体(D.J.Haganet al.，J.Chem.Soc.，Perkin Transf.，1997；12739-2746)。
这些化合物中，应该提到meridine，一种从海鞘Amphicarpameridiana或海绵Corticum sp.提取的天然生物碱。meridine由Schmitz等人分离(J.Org.Chem.1991；56804-808)，然后在US-A-5182287(Gunawardana等人，1993年1月23日)中描述了其在鼠白血病(P388)模型上的抗增生性质和其抗真菌性质。其抗真菌性质由McCarthy等人(J.of Nat.Products 1992；551664-1668)描述，而其对两种人细胞系结肠癌细胞(HT-29)和肺癌细胞(A549)的细胞毒性由Longley等人报道(J.of Nat.Products 1993；56915-920)描述。meridine的合成已经根据Kitahara等人(Chem.Pharm.Bull.，1994；421363-1364)，Bontemps等人(Tetrahedron 1997；371743-1750)和Kitahara等人(Tetrahedron 1998；548421-8432)的各种方法进行。
这些化合物中，应该提到cystodamine，一种由Bontemps等人(Tetrahedron lett.，1994；357023-7026)从海鞘类动物Cystodytes dellechiajei分离的对人淋巴性白血病具有活性的五环生物碱。
本发明的主题是含有有效量的选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的药物组合物 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
更具体地，本发明的主题是选自式I和式II的化合物，其中R1，R3和R4选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’，-NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R2选自硝基和-NHCOCF3基，和这些化合物与药用酸的加成盐。
在优选的方案中，本发明的主题是包括有效量的选自其中R1选自氢和甲氧基和-N(CH3)2基的式I化合物，和其中R1选自氢和甲氧基，-N(CH3)2和-NHCOCH3基，而R2是-NHCOCF3基的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的药物组合物。
在另一种形式中，本发明的主题是包括有效量的选自其中R3是-COOEt基的式I化合物，和其中R3是-COOEt基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的药物组合物。
在另一种形式中，本发明的主题是包括有效量的选自其中R4是甲氧基的式I化合物，和其中R4是甲氧基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的药物组合物。
表述“与药用酸的加成盐”指具有游离碱的生物学性质，但没有负作用的盐。特别是这些盐可以是与无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸或磷酸；酸性金属盐，如正磷酸二钠和硫酸一钾，和有机酸的盐。
一般说来，式I和II的化合物根据Kitahara等人(Chem.Pharm.Bull.，1994；421363-1364)，和Kitahara等人(Tetrahedron 1998；548421-8432)所述的一般反应路线获得。根据该路线，式II化合物可以通过在4-位取代的喹啉-5，8-二酮和取代的氮杂-二烯之间的杂Diels-Alder反应，接着使中间体二氢化的化合物脱氢而制备。式I化 下列实施例举例说明式I和II化合物的制备。实施例16-氯-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮(CR 8250)将1.2g(4mmol)4-(2-三氟乙酰氨基苯基)-1-二甲基氨基-1-氮杂-1，3-丁二烯和1ML乙酸酐加入0.7g(3.63mmol)4-氯喹啉-5，8-二酮在50ML乙腈中的溶液。反应介质被回流6小时，在旋转蒸发器上蒸出溶剂。滤过硅胶(99.5/0.5二氯甲烷/甲醇)纯化后，得到0.46g加合物。该化合物溶于100ML甲苯，加入4g Pd/C(10％)，反应介质被回流2小时。过滤并用甲醇然后二氯甲烷洗涤残余物后，将滤液在旋转蒸发器上浓缩，然后通过快速硅胶柱层析(98/2二氯甲烷/甲醇)纯化，给出87mg金黄色粉末形式的化合物CRL 8250。·产率6％·熔点152℃··1H NMR(CDCl3)7.21(d，1H，J＝9Hz)；7.46(dd，1H，J＝7.5和7.5Hz)；7.58(m，2H)；7.72(m，2H)；7.81(s，1H)；8.94(d，1H，J＝5.1Hz)；9.13(d，1H，J＝4.7Hz).·13C NMR(CDCl3)115.49(q，J＝287.2Hz)；125.55；128.11；128.27；129.20；129.35；130.16；131.02；131.32；131.52；133.58；145.13；147.57；148.24；149.85；154.35；154.86；155.34(q，J＝37Hz)；179.28；182.40.
将1.9g(6.5mmol)4-(2-三氟乙酰氨基苯基)-1-二甲基氨基-1-氮杂-1，3-丁二烯，2.2ML乙酸酐和1.6g Pd/C(10％)先后加入5，8-二氧代喹诺酮(1.04g，5.9mmol)在500ML乙腈中的溶液。反应介质在氮气氛中回流15小时。在旋转蒸发器上蒸出溶剂后，所得的粗产物通过快速硅胶柱层析(二氯甲烷然后95/5二氯甲烷/甲醇)纯化，给出400mg化合物CRL 8249黄色粉末(或其在8位的氧代互变异构体)。·产率16％·熔点＞260℃·IR(CHCl3)1664，1685，1735，3 3 34，3401cm-1.·MSm/z 413(33)；344(17)；301(100)；177(44).·1H NMR(CDCl3)6.90(dd，1H，J＝9.9Hz)；7.19(dd1H，J＝7.8和1.5Hz)；7.47(ddd，1H，J＝7.8，7.8和1.1Hz)；7.60(m，2H)；7.68(m，2H)；7.93(d，1H，J＝9.9Hz)；9.09(d，1H，J＝4.8Hz).·13C NMR(CDCl3)115.56(q，J＝288Hz)；126.34；126.90；127.08；128.69；129.12；130.89；134.61；135.63；146.85；148.02；150.56；151.70；152.83；154.92；155.57(q，J＝38Hz)；161.92；169.63；179.50；181.13.
根据Kitahara等人，Tetrahedron 1998；548421-8432所述的方法合成此化合物。
将1.2ml(19.27mmol)甲基碘和158mg(1.8mmol)Ag2CO3加入100mg(0.288mmol)溶于75ML氯仿中的化合物CRL 8456。混合物在无光的情况下在50℃搅拌48小时。蒸出溶剂后，所得的粗产物通过快速柱层析(二氯甲烷)纯化，以黄色粉末形式给出56mg化合物8457。·产率54％·熔点＞260℃·IR(CHCl3)1670，1701cm-1.·MSm/z 361(2)；315(42)；314(100)；286(32)；257(7)；188(15).·1H NMR(CDCl3)4.21(s，3H)；7.06(d，1H，J＝8.8Hz)；7.27(dd，1H，J＝7.5和1.5Hz)；7.45(d，1H，J＝4.8Hz)；7.69(ddd，1H，J＝1.5；8.2和7.5Hz)；7.77(ddd，1H，J＝7.5；8.2和1.1Hz)；8.20(d，1H，J＝8.4Hz)；8.34(dd，1H，J＝8.2和1.1Hz)；9.14(d，1H，J＝4.8Hz).·13C NMR(CDCl3)55.00；117.62；124.77；125.53；126.64；128.51；129.40；129.85；133.93；135.03；137.64；146.82；147.68；149.25；149.43；154.24；167.63；179.85；182.07.
下列药理试验的结果证明了式I和II化合物的细胞毒性，和最大耐受剂量。1-测定最大耐受剂量(MTD)以4-至6-周大的B6D2F1/Jico小鼠评价最大耐受剂量。化合物以在2.5至160mg/kg范围内增加的剂量腹膜内给药。通过观察单独给药所考虑的产物后14天的周期内动物的存活率来测定MTD的值(以mg/kg表达)。在此周期内也监测动物体重的变化。
最大耐受剂量(MTD)的估算结果在下表中给出
表I
2-在培养物中对肿瘤细胞系的细胞毒性活性用MTT比色试验评价式I和II化合物对肿瘤细胞的影响。MTT试验的原理基于由代谢活性活细胞将黄色产物MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑翁)线粒体还原为蓝色产物甲赞。所得的甲赞的量与在培养孔中存在的活细胞的量成正比。甲赞的量通过光谱计测量。
该细胞系在37℃，保持在含有25MMHEPES MEM(最少基本培养基)基培养基的有盖的培养皿中的单层培养物中。适合于生长各种二倍体或初级哺乳动物细胞的该培养基然后补加-5％量的在56℃脱补体1小时的FCS(胎牛血清)，-0.6mg/ml L-谷氨酰胺，-200IU/ML青霉素，-200mg/ml螺旋霉素，-0.1mg/ml庆大霉素。
从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)获得12种人癌细胞系。这12种细胞系是-U-373MG(ATCC编号HTB-17)和U-87MG(ATCC编号HTB-14)，它们是两种成胶质细胞瘤。-SW1088(ATCC编号HTB-12)，它是一种星形细胞瘤，-A549(ATCC编号CCL-185)和A-427(ATCC编号HTB-53)，它们是两种非小细胞肺癌，-HCT-15(ATCC编号CCL-225)和LoVo(ATCC编号CCL-229)，它们是两种结肠直肠癌，-T-47D(ATCC编号HTB-133)和MCF7(ATCC编号HTB-22)，它们是两种乳腺癌，-J82(ATCC编号HTB-1)和T24(ATCC编号HTB-4)，它们是两种膀胱癌，-PC-3(ATCC编号CRL-1435)，这是一种前列腺癌。
实验将100μl含有200000至50000(根据所用的细胞类型)细胞/ML培养基的细胞悬浮液在平底96-孔多孔板上接种，并在包含5％二氧化碳和70％湿度的大气中于37℃温育。温育24小时后，将该培养基用100μl含有其浓度范围为10-5至10-10M的各种试验化合物或用于溶解试验产物的溶剂(对照条件)的新鲜培养基代替。在上述条件下温育72小时后，该培养基用100μl以1mg/ml的浓度溶于RPMI 1640中的MTT黄色溶液替换。微滴板在37℃再温育3小时，然后在400×g离心10分钟。除去MTT的黄色溶液，在细胞水平所形成的蓝色甲赞晶体被溶于100μl DMSO。然后将微滴板振动5分钟。通过在分别对应于甲赞的最大吸收波长和背景干扰的570nm和630nm的波长用DYNATECHIMMUNOASSAY SYSTEM机器以分光光度计定量测定在实验的最后由仍然存活的细胞将黄色MTT产物转化为蓝色甲所产生蓝色的强度。软件可以将分光光度计的读数换算成平均光密度值，也可以是标准偏差(Std.Dev.)和平均标准误差(SEM)值。
式I和式II化合物对不同肿瘤细胞系的细胞生长的抑制活性与天然产物Meridine(CRL 8348)比较。所有式I和式II化合物根据所试验的化合物和肿瘤系，以10-6M和10-10M之间的抑制浓度50(IC50)对12种人肿瘤系U-87MG，U-373MG，SW1088，T24，J82，HCT-15，LoVo，MCF7，T-47D，A549，A-427和PC-3细胞的增殖显示明显的抑制活性。在各种细胞系上获得的在IC50附近(flanking)的浓度值以举例的方式在表II中给出
表II
表III给出了平均IC50值(nM)(从对所研究的12种肿瘤系的细胞毒性计算)的结果和MTD/IC50比(这些比值通过形成以无单位数值表达的MTD值和IC50值的比值而计算)。
表III
*各种化合物的MTD/IC50比以meridine的比值等于1作为参考来估算。
所述化合物对肿瘤细胞系模型所给出的IC50值(nM)小于或等价于天然化合物(meridine和cystodamine)。其最大耐受剂量接近于meridine和cystodamine。如表III中所示，当其IC50值明显地低于天然产物时，则本发明中举例的化合物的耐受性/细胞毒性活性比明显地高于meridine和cystodamine。因而这些化合物由于其细胞毒性，可以在高于由天然产物meridine和cystodamine诱导的组织浓度用作抗肿瘤药品。因此，其特征在于更好的治疗可操纵性。
由于其细胞毒性，所述的式I和II化合物，或以其药用盐或溶剂化物形式可以用作药品的活性成分。
式I和II化合物一般以根据每m2体表或每kg体重所确定的剂量单位给药。所说的剂量单位优选地被配制成其中活性成分与一种(或多种)药用赋形剂混合的药用组合物。
根据被治疗个体的癌症病理，上述式I和II的化合物以0.05至350mg/m2体表的剂量使用，优选地为0.5至50mg/m2/天，在急性期，治愈性治疗的情况下，其剂量为各疗程治疗周期数的函数。对于维持性治疗，根据疗程的治疗周期数，式I和II化合物最好以0.05至25mg/m2/天，的剂量，优选地以0.1至1.5mg/m2/天，的剂量使用。
在本发明用于口服或静脉内给药的药物组合物中，活性成分可以以给药单位形式给药，与适合于人治疗的常规药用载体混合。适合于给药的单位形式包含口服给药形式如片剂，它是可划分的，或胶囊，植入和静脉内给药形式。
对于肠胃外给药(以恒定的流速静脉内灌注)，含有药理上可共容的分散剂和/或增溶剂，例如丙二醇或聚乙二醇的无菌水悬浮液，无菌等渗盐溶液或无菌和可注射溶液被使用。
因此，为了制备用于在1至24小时进行灌注的静脉注射的水溶液，可以使用共溶剂醇类如乙醇，甘醇如聚乙二醇或丙二醇，和亲水性表面活性剂如Tween80。
当制备片剂形式的固体组合物时，润湿剂如月桂基硫酸钠可被加入微粒化或非微粒化的活性成分中，整体与药用载体与硅胶，明胶，淀粉，乳糖，硬脂酸镁，滑石，阿拉伯胶等混合。片剂可以用蔗糖，各种聚合物或其他合适的材料包衣，或者被这样处理，使其具有维持或延长的活性，和连续释放预定量的活性成分。
胶囊的制备通过将活性成分与稀释剂如甘醇或甘油酯混合，并将所得的混合物灌入软或硬胶囊中而获得。
活性成分也可以被任选地与一种或多种载体或添加剂配制为微胶囊或微球的形式。
活性成分也可以以与环糊剂，例如α-，β-或γ-环糊剂，2-羟基丙基-β-环糊剂或甲基-β-环糊剂的配合物的形式存在。
由于其强有力的细胞毒性，式I和II的化合物可被用于治疗大多数实体肿瘤，尤其是用于治疗脑瘤，肺癌，卵巢和乳腺肿瘤，结肠直肠癌，前列腺癌和睾丸肿瘤。
权利要求
1.含有有效量的选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物的药物组合物 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
2. 如权利要求1的药物组合物，含有有效量的选自式I和式II化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物，其中R1，R3和R4选自氢，卤素，羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’，-NH2，-N(R)2，-NHR，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
3.如权利要求2的药物组合物，包含有效量的选自其中R1选自氢和甲氧基和-N(CH3)2的式I化合物和其中R1选自氢和甲氧基，-N(CH3)2和-NHCOCH3基，而R2是-NHCOCF3基的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的化合物。
4.如权利要求2的药物组合物，包括有效量的选自其中R3是-COOEt基的式I化合物，和其中R3是-COOEt基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的化合物。
5.如权利要求2的药物组合物，包括有效量的选自其中R4是甲氧基的式I化合物，和其中R4是甲氧基而R2选自-NHCOCF3和-NO2的式II化合物，和这些化合物与药用酸的加成盐的化合物。
6.如下化合物4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，6-甲氧基-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，6-(二甲基氨基)-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，6-(乙酰氨基)-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，8-甲氧基-4-(2-三氟乙酰氨基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，4-(2-三氟乙酰氨基苯基)-5，10-二氧代吡啶并[3，2-g]喹啉-7-羧酸乙酯，8-甲氧基-4-(2-硝基苯基)吡啶并[3，2-g]喹啉-5，10-二酮，4-(2-硝基苯基)-5，10-二氧代吡啶并[3，2-g]喹啉-7-羧酸乙酯，苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，12-二甲基氨基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，10-羟基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，10-甲氧基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉-8-酮，11-乙基苯并[b]吡啶并[4，3，2-de][1，7]菲咯啉羧酸酯-8-酮，和其与药用酸的加成盐。
7.选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物在生产抗肿瘤药物中的用途 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
8.治疗肿瘤患者的方法，包括对该患者施用有效量的选自下式化合物和这些化合物与药用酸加成盐的化合物 其中R1，R3，R4，R5和R6选自氢，卤素和羟基，-CHO，-OR，-COOH，-CN，-CO2R，-CONHR，-CONRR’， -NH2，-NHR，-N(R)2，-NH-CH2-CH2-N(CH3)2，-NHCOR，吗啉代，硝基和-SO3H基，R和R’选自C1-C6烷基，而Ar是C6-C14芳基，R2选自硝基和-NHCOCF3基。
全文摘要
本发明涉及包含有效量的选自式(I)和(II)化合物的化合物的药物组合物,其中:R
文档编号A61K31/4745GK1344269SQ0080519
公开日2002年4月10日 申请日期2000年3月17日 优先权日1999年3月18日
发明者E·德弗洛纳, N·博特普斯－萨别罗斯, F·达罗, J·巴斯蒂德, R·基斯, A·弗里德曼 申请人:L·拉峰试验公司
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