方柱五角瓜参中新的抗肿瘤化合物PhilinopsideE的制作方法
专利名称：方柱五角瓜参中新的抗肿瘤化合物Philinopside E的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种从海洋动物方柱五角瓜参中分离得到的新的抗肿瘤化合物Philinopside E。
背景技术：
方柱五角瓜参(Pentacta quadrangulasis Lesson)，广泛分布于我国广东、福建海域，为瓜参科棘皮动物。体壁红色，长约5-10cm，背部有棘突。多生长于潮间带或沿岸浅海石底，广泛分布于我国广东和福建沿海地区。民间用于治疗胃病。有关所含的皂苷类成分的化学结构及抗肿瘤活性迄今尚未见有过报道。
发明内容
本发明是从生长于中国广东湛江海域的方柱五角瓜参中提取分离到的一种新的皂苷类化合物，命名为Philinopside E，其结构式如下 Philinopside E为白色无定形粉末，212.5-214.5℃分解，分子式C53H81O24NaS；电喷雾-飞行时间-阳离子质谱(ESI-MS+)中出现1179[M+Na]+离子峰，电喷雾-飞行时间-阴离子质谱(ESI-MS-)中出现1179[M+Na]+离子峰。红外光谱IR(KBr)cm-13420(羟基)，1750(羰基)，1648(双键)，1216(硫酸酯基)，1070(苷键)。1H和13C核磁共振数据见表1。
表1.Philinopside E的1H和13C核磁共振数据苷元部分 糖部分碳原子序号 碳化学位移 氢化学位移(J)碳原子序号碳化学位移(J) 氢化学位移136.0t Hα1.42mXyl1(1→C-3)Hβ1.70m1′ 105.1d4.72(1H，d，6.8)227.1t Hα1.93 2′ 83.4d 3.98mHβ2.07 3′ 75.3d 4.25m389.1d 3.26dd，(4.2，11.9) 4′ 76.3d 5.05m439.6s5′ 64.2t Hα3.64m548.5d 1.02mHβ4.72d623.0t Hα2.02mHβ2.02mQui(1→2Xyl1)7121.8d 5.65d(0.8) 1″ 105.3d5.04(1H，d，7.2)8144.2s 2″ 75.3d 3.95m947.2d 3.73d(14.0) 3″ 75.5d 4.02m10 35.8s4″ 86.0d 3.60(t，8.8)11 22.5t Hα1.58m5″ 71.8d 3.73mHβ1.70 6″ 18.0q 1.68d12 29.8t Hα2.04mHβ2.24mXyl2(1→4Qui)13 56.7s1 105.1d4.82(1H，d，7.2)14 45.7 2 73.6d 3.96m15 52.0t Hα2.62d(16)3 87.4d 4.10mHβ2.43d(16)4 69.0d 4.05m16 212.8s 5 66.5t Hα3.59m17 63.7t 2.79sHβ4.20m18 178.5s19 24.1q 1.24sMeglu(1→3xyl2)20 83.3s1″″ 105.4d5.28(1H，d，8.9)21 26.3q 1.43s2″″ 75.0d 3.96m22 38.5t Hα1.64m3″″ 87.9d 3.71mHβ1.80m4″″ 70.7d 4.02m23 22.5t Hα1.85m5″″ 78.1d 3.93m.
Hβ1.85m6″″ 62.1t Hα4.17m24 38.0t Hα1.98mHβ4.43(d，10.4)Hβ1.98mOCH360.7q 3.84s25 145.6s26 110.5t 4.78s27 22.2q 1.70s30 17.3q 1.11s31 28.8q 1.28s32 31.9q 1.17sXyl木糖，Qui鸡纳糖，Glc葡萄糖，J值(偶合常数)
本发明还提供了从方柱五角瓜参中提取分离Philinopside E的方法，其步骤如下(1)提取新鲜方柱五角瓜参，洗净去掉内脏后，自然风干，取干燥体壁，粉碎后用5倍量(重量)85％的乙醇室温浸泡提取7天，滤出乙醇提取液，减压回收乙醇，再用正丁醇萃取，正丁醇萃取物依次用石油醚、氯仿和乙醚萃取后，用大孔树酯柱脱盐，得总皂苷提取物。
(2)分离上述总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.2)混合溶剂淋洗，薄层层析检测，收集含philinopside E的流份，再经过高效液相分离，55％甲醇为流动相分离得到Philinopside E的纯品。
本发明对Philinopside E进行了体外抗肿瘤试验，表明其有明显的抑制肿瘤的效果。试验所用的细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即P-388(小鼠淋巴瘤)HL-60(人白血病)A-549(人肺癌)SPCA4(人肺腺癌)MKN-28(人胃癌)SGC-7901(人胃癌)HCT-116(人结肠腺癌)BEL-7402(人肝癌)MDA-MB-435(人乳腺癌)MDA-MB-468人乳腺癌)HO-8910人卵巢癌 A431人皮肤磷癌细胞WI-38人肺成纤维细胞试验方法为国际通用的SRB法根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加本发明化合物10μl/孔。每个浓度设三复孔。并设生理盐水对照及无细胞凋零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma公司)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标仪520nm波长下测定OD值。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率 半数有效抑制浓度IC50值采用Logit法计算。试验结果见表2。
表2.Philinopside E对肿瘤细胞的抑制作用肿瘤细胞株P-388HL-60A-549MKN-28 SPC-A4SGC-7901 HCT-116 BEL-7402 HO-8910IC50μM 1.06±0.10.62±0.11.47±0.25.53±0.73.65±0.6 3.01±0.2 1.74±0.21.75±0.1 2.14±0.2IC50表示本发明化合物的半数有效抑制浓度上述实验结果表明，Philinopside E对9种不同的肿瘤细胞株均显示明显的抑制作用。
本发明还对Philinopside E进行了体内抗肿瘤试验，结果表明其有明显的抑制肿瘤效果。具体实验方法如下(1)Philinopside E对小鼠S-180肉瘤的治疗作用实验选用18～22克雌性KM小鼠(上海实验动物中心)及生长良好的7～11天的S-180瘤种(中科院上海药物研究所提供)，将瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腹部皮下，约1～2.5×106个细胞/只，接种后24小时随机分笼，静脉给药七天。并以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为阳性对照，阴性对照(NS)注射等体积生理盐水。末次注射后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，计算肿瘤抑制率并进行T检验。结果见表3。
表3.Philinopside E对小鼠S-180肉瘤的治疗作用实验结果给药 动物数 平均体重 瘤重 抑瘤率组别剂量 P值途径 开始 最后开始最后 x±SD％NS20 20 21.432.2 2.20±0.62 -- --Philinopside E 2mg/kg i.v 10 10 21.625.9 1.40±0.56 36.4 ＜0.01Philinopside E 4mg/kg i.v 10 10 21.321.3 0.66±0.13 70.0 ＜0.015-Fu75mg/kg i.v 10 10 21.626.4 0.54±0.30 75.5 ＜0.01实验结果表明，Philinopside E对小鼠S-180肉瘤有明显的生长抑制作用。
(2)Philinopside E对小鼠H22肝癌的治疗作用实验试验方法同Philinopside E对小鼠S-180肉瘤(中科院上海药物研究所提供)的实验治疗作用。实验结果见表4。
表4.Philinopside E对小鼠H22肝癌的治疗作用实验结果给药 动物数平均体重 瘤重 抑瘤率组别剂量 P值途径开始最后 开始最后x±SD％NS - 20 20 21.432.22.22±0.62 --Philinopside E 1mg/kgi.v 10 10 21.529.31.31±0.56 34.8 ＜0.01Philinopside E 3mg/kgi.v 10 10 21.623.50.96±0.40 52.2 ＜0.015-Fu75mg/kg i.v 10 10 21.724.40.37±0.26 81.6 ＜0.01实验结果表明，Philinopside E对小鼠H22肝癌有十分明显的生长抑制作用。
本发明还对Philinopside E进行了抑制肿瘤新生血管生成的抗肿瘤试验，结果表明Philinopside E对肿瘤新生血管生成有明显的抑制作用。实验方法和结果如下(1)内皮细胞增殖实验将微血管内皮细胞(HMEC-1)2×103个/100μl/孔种于96孔板，24小时待细胞贴壁后，加入不同浓度的Philinopside E，每个浓度三个复孔，并设生理盐水对照及无细胞调零孔。在37℃、5％CO2条件下培养72小时后，倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma公司)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tri s溶液，酶标仪540nm波长下读数。
实验结果其平均IC50为1.60±0.48μM(n＝2)，作用效果呈明显量效关系。表明Philinopside E能明显抑制内皮细胞HMEC-1的增殖。
(2)内皮细胞管腔形成抑制实验Matrigel胶(Sigma公司)在0℃融化后，迅速加入到96孔板中(60μl/孔)，在37℃静置1小时，使胶凝固。每孔加入HMEC-1细胞悬液5×103个/100μl/孔。同时分别加入不同浓度Philinopside E，使其最终浓度各为5μM，1μM，0.2μM，0.04μM。在37℃、5％CO2、95％湿度下培养24小时。在倒置显微镜下观察，随机选三个视野拍照(×100)，每个照片的管腔总长度用图形处理软件AdobePhotoshop测量，并计算抑制率。
实验结果对HMEC的IC50为1.52±0.05(μM)；对HUVEC的IC50为1.16±0.02(μM)。表明Philinopside E明显抑制内皮细胞管腔的形成。
(3)内皮细胞迁移抑制实验1∶3倍稀释的Matrigel胶20μl铺于Transwell膜(8μm孔径Boyden Chambertranswell，Costar，Cambrige，MA)上，25℃让其干燥。将含不同药物浓度(5μM，1μM，0.2μM，0.04μM)的HMEC-1细胞悬液2×104个/100μl/孔加入到上室，下室加入0.6ml同上室含相同浓度药物的DMEM培养基。37℃、5％CO2、95％湿度下培养48小时。用棉签小心去除膜上未迁移的细胞，将细胞固定，伊红染色。在相差显微镜(Olympus Japan)下观察并拍照(×100)，随机选3个视野计算迁移细胞数，并计算抑制率。
实验结果对HMEC的IC50为1.36±0.12(μM)；对HUVEC的IC50为1.09±0.01(μM)。表明Philinopside E明显抑制内皮细胞迁移。
(4)鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验受精鸡胚若干枚置于37℃孵化8天。在静置鸡胚的上方开一2×2cm大小的窗口。切破壳膜，暴露出绒毛尿囊膜。将载有Philinopside E不同浓度药液的滤纸放在尿囊膜血管较少部位。封窗后放入孵化箱中孵化两天。然后将窗口扩大，轻轻夹开Whatman滤纸，解剖显微镜下测量无血管区域，并拍摄。
实验结果Philinopside E明显抑制鸡胚尿囊膜血管生成(CAM)，作用剂量2.5nmol/egg，5nmol/egg，10nmol/egg。作用效果呈明显的量效关系。
(5)诱导凋亡实验把HMEC细胞种于灭菌的盖玻片上，待其长满80％，加入不同浓度的Philinoside E，作用24-36小时，用TUNEL试剂盒，按其方法进行检测。
实验结果Philonopside E明显诱导内皮细胞的凋亡，作用剂量0.625μM，1.25μM，2.5μM。有明显的量效关系。
(6)细胞粘附抑制实验用不同的细胞外基质包被96孔板。无血清培养液饥饥饿的内皮细胞种于其中并加入不同浓度的Philinopside E，1小时后吸去培养液，轻轻的用PBS将未贴壁的细胞洗掉。将粘附下来的细胞用4％多聚甲醛固定，最后用0.5％结晶紫将细胞染色，在590nm处检测。
实验结果Philinopside E明显抑制HMEC细胞粘附，IC50为2.85±0.18(μM)。
(7)Western-blot实验把HMEC细胞种于6孔培养板中，待其长满，换无血清培养液，饥饿24小时。加入不同浓度的Philinopside E，作用1h，用50ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)刺激5-10分钟。处理后的细胞用SDS上样缓冲液裂解。经7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样蛋白转移到硝酸纤维素膜上，加入要检测蛋白的相应识别抗体和第二抗体。最后以辣根过氧化物酶显色系统检测。
实验结果Philinopside E影响VEGF信号转导通路。westenblot检测表明Philinopside E可以明显抑制VEGF下游激活形式的信号分子P-AKT、P-MAPK、P-FAK、P-paxillin，并抑制磷酸化形式的受体VEGFR2。
以上实验表明，本发明化合物有明显的抑制肿瘤的作用，故可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对开发利用海洋药用生物资源具有重要价值。
具体实施例方式下面通过实施例进一步描述Philinopside E的分离制备。
选择生长于中国广东省湛江海域的新鲜方柱五角瓜参60kg，洗净去掉内脏后，自然风干。取干燥体壁，粉碎后用5倍量(重量)85％的乙醇室温浸泡提取7天。滤出乙醇提取液，减压回收乙醇，再用正丁醇(50L)分多次萃取，正丁醇萃取物依次用石油醚(5L)、氯仿(5L)和乙醚(5L)萃取后得流浸膏。将流浸膏溶于3倍重量水中，过滤，滤液通过D101大孔树酯柱，依次用水和80％的乙醇洗脱。收集80％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷110克。取总皂苷55克进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.2)的洗脱液洗脱，收集含Philinopside E的流份，减压蒸干后得10.8克。取其中500毫克进行高效液相分离纯化(HPLC条件为Zorbax 300 SB-C18，55％甲醇为流动相，1.5ml/min，室温)，得Philinopside E纯品27毫克。
权利要求
1.一种化合物Philinoside E，其特征在于化学结构式如下
2.权利要求1所述化合物Philonopside E的制备方法，具体步骤如下(1)提取新鲜方柱五角瓜参，洗净去掉内脏后，自然风干，取干燥体壁粉碎，85％的乙醇室温浸泡提取7天，滤出提取液，减压回收乙醇，乙醇提取物再用正丁醇萃取，正丁醇萃取物依次用石油醚、氯仿和乙醚萃取后得流浸膏，将流浸膏溶于水中过大孔树酯柱，依次用水和80％的乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷提取物；(2)分离上述总皂苷应用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.2)混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含Philinopside E的流份，再经高效液相分离纯化，55％甲醇为流动相洗脱，得到Philinopside E纯品。
3.权利要求1所述化合物Philinopside E在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，具体为一种从方柱五角瓜参中分离到的抗肿瘤化合物Philinopside E，分子式C
文档编号A61P35/00GK1634973SQ200410067500
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月26日 优先权日2004年10月26日
发明者易杨华, 丁健, 张诗龙, 田芳, 李玲, 章雄文, 刘宝姝, 陈奕 申请人:中国人民解放军第二军医大学
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种从海洋动物方柱五角瓜参中分离得到的新的抗肿瘤化合物Philinopside E。
背景技术：
方柱五角瓜参(Pentacta quadrangulasis Lesson)，广泛分布于我国广东、福建海域，为瓜参科棘皮动物。体壁红色，长约5-10cm，背部有棘突。多生长于潮间带或沿岸浅海石底，广泛分布于我国广东和福建沿海地区。民间用于治疗胃病。有关所含的皂苷类成分的化学结构及抗肿瘤活性迄今尚未见有过报道。
发明内容
本发明是从生长于中国广东湛江海域的方柱五角瓜参中提取分离到的一种新的皂苷类化合物，命名为Philinopside E，其结构式如下 Philinopside E为白色无定形粉末，212.5-214.5℃分解，分子式C53H81O24NaS；电喷雾-飞行时间-阳离子质谱(ESI-MS+)中出现1179[M+Na]+离子峰，电喷雾-飞行时间-阴离子质谱(ESI-MS-)中出现1179[M+Na]+离子峰。红外光谱IR(KBr)cm-13420(羟基)，1750(羰基)，1648(双键)，1216(硫酸酯基)，1070(苷键)。1H和13C核磁共振数据见表1。
表1.Philinopside E的1H和13C核磁共振数据苷元部分 糖部分碳原子序号 碳化学位移 氢化学位移(J)碳原子序号碳化学位移(J) 氢化学位移136.0t Hα1.42mXyl1(1→C-3)Hβ1.70m1′ 105.1d4.72(1H，d，6.8)227.1t Hα1.93 2′ 83.4d 3.98mHβ2.07 3′ 75.3d 4.25m389.1d 3.26dd，(4.2，11.9) 4′ 76.3d 5.05m439.6s5′ 64.2t Hα3.64m548.5d 1.02mHβ4.72d623.0t Hα2.02mHβ2.02mQui(1→2Xyl1)7121.8d 5.65d(0.8) 1″ 105.3d5.04(1H，d，7.2)8144.2s 2″ 75.3d 3.95m947.2d 3.73d(14.0) 3″ 75.5d 4.02m10 35.8s4″ 86.0d 3.60(t，8.8)11 22.5t Hα1.58m5″ 71.8d 3.73mHβ1.70 6″ 18.0q 1.68d12 29.8t Hα2.04mHβ2.24mXyl2(1→4Qui)13 56.7s1 105.1d4.82(1H，d，7.2)14 45.7 2 73.6d 3.96m15 52.0t Hα2.62d(16)3 87.4d 4.10mHβ2.43d(16)4 69.0d 4.05m16 212.8s 5 66.5t Hα3.59m17 63.7t 2.79sHβ4.20m18 178.5s19 24.1q 1.24sMeglu(1→3xyl2)20 83.3s1″″ 105.4d5.28(1H，d，8.9)21 26.3q 1.43s2″″ 75.0d 3.96m22 38.5t Hα1.64m3″″ 87.9d 3.71mHβ1.80m4″″ 70.7d 4.02m23 22.5t Hα1.85m5″″ 78.1d 3.93m.
Hβ1.85m6″″ 62.1t Hα4.17m24 38.0t Hα1.98mHβ4.43(d，10.4)Hβ1.98mOCH360.7q 3.84s25 145.6s26 110.5t 4.78s27 22.2q 1.70s30 17.3q 1.11s31 28.8q 1.28s32 31.9q 1.17sXyl木糖，Qui鸡纳糖，Glc葡萄糖，J值(偶合常数)
本发明还提供了从方柱五角瓜参中提取分离Philinopside E的方法，其步骤如下(1)提取新鲜方柱五角瓜参，洗净去掉内脏后，自然风干，取干燥体壁，粉碎后用5倍量(重量)85％的乙醇室温浸泡提取7天，滤出乙醇提取液，减压回收乙醇，再用正丁醇萃取，正丁醇萃取物依次用石油醚、氯仿和乙醚萃取后，用大孔树酯柱脱盐，得总皂苷提取物。
(2)分离上述总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.2)混合溶剂淋洗，薄层层析检测，收集含philinopside E的流份，再经过高效液相分离，55％甲醇为流动相分离得到Philinopside E的纯品。
本发明对Philinopside E进行了体外抗肿瘤试验，表明其有明显的抑制肿瘤的效果。试验所用的细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即P-388(小鼠淋巴瘤)HL-60(人白血病)A-549(人肺癌)SPCA4(人肺腺癌)MKN-28(人胃癌)SGC-7901(人胃癌)HCT-116(人结肠腺癌)BEL-7402(人肝癌)MDA-MB-435(人乳腺癌)MDA-MB-468人乳腺癌)HO-8910人卵巢癌 A431人皮肤磷癌细胞WI-38人肺成纤维细胞试验方法为国际通用的SRB法根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加本发明化合物10μl/孔。每个浓度设三复孔。并设生理盐水对照及无细胞凋零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma公司)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标仪520nm波长下测定OD值。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率 半数有效抑制浓度IC50值采用Logit法计算。试验结果见表2。
表2.Philinopside E对肿瘤细胞的抑制作用肿瘤细胞株P-388HL-60A-549MKN-28 SPC-A4SGC-7901 HCT-116 BEL-7402 HO-8910IC50μM 1.06±0.10.62±0.11.47±0.25.53±0.73.65±0.6 3.01±0.2 1.74±0.21.75±0.1 2.14±0.2IC50表示本发明化合物的半数有效抑制浓度上述实验结果表明，Philinopside E对9种不同的肿瘤细胞株均显示明显的抑制作用。
本发明还对Philinopside E进行了体内抗肿瘤试验，结果表明其有明显的抑制肿瘤效果。具体实验方法如下(1)Philinopside E对小鼠S-180肉瘤的治疗作用实验选用18～22克雌性KM小鼠(上海实验动物中心)及生长良好的7～11天的S-180瘤种(中科院上海药物研究所提供)，将瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腹部皮下，约1～2.5×106个细胞/只，接种后24小时随机分笼，静脉给药七天。并以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为阳性对照，阴性对照(NS)注射等体积生理盐水。末次注射后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，计算肿瘤抑制率并进行T检验。结果见表3。
表3.Philinopside E对小鼠S-180肉瘤的治疗作用实验结果给药 动物数 平均体重 瘤重 抑瘤率组别剂量 P值途径 开始 最后开始最后 x±SD％NS20 20 21.432.2 2.20±0.62 -- --Philinopside E 2mg/kg i.v 10 10 21.625.9 1.40±0.56 36.4 ＜0.01Philinopside E 4mg/kg i.v 10 10 21.321.3 0.66±0.13 70.0 ＜0.015-Fu75mg/kg i.v 10 10 21.626.4 0.54±0.30 75.5 ＜0.01实验结果表明，Philinopside E对小鼠S-180肉瘤有明显的生长抑制作用。
(2)Philinopside E对小鼠H22肝癌的治疗作用实验试验方法同Philinopside E对小鼠S-180肉瘤(中科院上海药物研究所提供)的实验治疗作用。实验结果见表4。
表4.Philinopside E对小鼠H22肝癌的治疗作用实验结果给药 动物数平均体重 瘤重 抑瘤率组别剂量 P值途径开始最后 开始最后x±SD％NS - 20 20 21.432.22.22±0.62 --Philinopside E 1mg/kgi.v 10 10 21.529.31.31±0.56 34.8 ＜0.01Philinopside E 3mg/kgi.v 10 10 21.623.50.96±0.40 52.2 ＜0.015-Fu75mg/kg i.v 10 10 21.724.40.37±0.26 81.6 ＜0.01实验结果表明，Philinopside E对小鼠H22肝癌有十分明显的生长抑制作用。
本发明还对Philinopside E进行了抑制肿瘤新生血管生成的抗肿瘤试验，结果表明Philinopside E对肿瘤新生血管生成有明显的抑制作用。实验方法和结果如下(1)内皮细胞增殖实验将微血管内皮细胞(HMEC-1)2×103个/100μl/孔种于96孔板，24小时待细胞贴壁后，加入不同浓度的Philinopside E，每个浓度三个复孔，并设生理盐水对照及无细胞调零孔。在37℃、5％CO2条件下培养72小时后，倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma公司)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tri s溶液，酶标仪540nm波长下读数。
实验结果其平均IC50为1.60±0.48μM(n＝2)，作用效果呈明显量效关系。表明Philinopside E能明显抑制内皮细胞HMEC-1的增殖。
(2)内皮细胞管腔形成抑制实验Matrigel胶(Sigma公司)在0℃融化后，迅速加入到96孔板中(60μl/孔)，在37℃静置1小时，使胶凝固。每孔加入HMEC-1细胞悬液5×103个/100μl/孔。同时分别加入不同浓度Philinopside E，使其最终浓度各为5μM，1μM，0.2μM，0.04μM。在37℃、5％CO2、95％湿度下培养24小时。在倒置显微镜下观察，随机选三个视野拍照(×100)，每个照片的管腔总长度用图形处理软件AdobePhotoshop测量，并计算抑制率。
实验结果对HMEC的IC50为1.52±0.05(μM)；对HUVEC的IC50为1.16±0.02(μM)。表明Philinopside E明显抑制内皮细胞管腔的形成。
(3)内皮细胞迁移抑制实验1∶3倍稀释的Matrigel胶20μl铺于Transwell膜(8μm孔径Boyden Chambertranswell，Costar，Cambrige，MA)上，25℃让其干燥。将含不同药物浓度(5μM，1μM，0.2μM，0.04μM)的HMEC-1细胞悬液2×104个/100μl/孔加入到上室，下室加入0.6ml同上室含相同浓度药物的DMEM培养基。37℃、5％CO2、95％湿度下培养48小时。用棉签小心去除膜上未迁移的细胞，将细胞固定，伊红染色。在相差显微镜(Olympus Japan)下观察并拍照(×100)，随机选3个视野计算迁移细胞数，并计算抑制率。
实验结果对HMEC的IC50为1.36±0.12(μM)；对HUVEC的IC50为1.09±0.01(μM)。表明Philinopside E明显抑制内皮细胞迁移。
(4)鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验受精鸡胚若干枚置于37℃孵化8天。在静置鸡胚的上方开一2×2cm大小的窗口。切破壳膜，暴露出绒毛尿囊膜。将载有Philinopside E不同浓度药液的滤纸放在尿囊膜血管较少部位。封窗后放入孵化箱中孵化两天。然后将窗口扩大，轻轻夹开Whatman滤纸，解剖显微镜下测量无血管区域，并拍摄。
实验结果Philinopside E明显抑制鸡胚尿囊膜血管生成(CAM)，作用剂量2.5nmol/egg，5nmol/egg，10nmol/egg。作用效果呈明显的量效关系。
(5)诱导凋亡实验把HMEC细胞种于灭菌的盖玻片上，待其长满80％，加入不同浓度的Philinoside E，作用24-36小时，用TUNEL试剂盒，按其方法进行检测。
实验结果Philonopside E明显诱导内皮细胞的凋亡，作用剂量0.625μM，1.25μM，2.5μM。有明显的量效关系。
(6)细胞粘附抑制实验用不同的细胞外基质包被96孔板。无血清培养液饥饥饿的内皮细胞种于其中并加入不同浓度的Philinopside E，1小时后吸去培养液，轻轻的用PBS将未贴壁的细胞洗掉。将粘附下来的细胞用4％多聚甲醛固定，最后用0.5％结晶紫将细胞染色，在590nm处检测。
实验结果Philinopside E明显抑制HMEC细胞粘附，IC50为2.85±0.18(μM)。
(7)Western-blot实验把HMEC细胞种于6孔培养板中，待其长满，换无血清培养液，饥饿24小时。加入不同浓度的Philinopside E，作用1h，用50ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)刺激5-10分钟。处理后的细胞用SDS上样缓冲液裂解。经7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样蛋白转移到硝酸纤维素膜上，加入要检测蛋白的相应识别抗体和第二抗体。最后以辣根过氧化物酶显色系统检测。
实验结果Philinopside E影响VEGF信号转导通路。westenblot检测表明Philinopside E可以明显抑制VEGF下游激活形式的信号分子P-AKT、P-MAPK、P-FAK、P-paxillin，并抑制磷酸化形式的受体VEGFR2。
以上实验表明，本发明化合物有明显的抑制肿瘤的作用，故可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对开发利用海洋药用生物资源具有重要价值。
具体实施例方式下面通过实施例进一步描述Philinopside E的分离制备。
选择生长于中国广东省湛江海域的新鲜方柱五角瓜参60kg，洗净去掉内脏后，自然风干。取干燥体壁，粉碎后用5倍量(重量)85％的乙醇室温浸泡提取7天。滤出乙醇提取液，减压回收乙醇，再用正丁醇(50L)分多次萃取，正丁醇萃取物依次用石油醚(5L)、氯仿(5L)和乙醚(5L)萃取后得流浸膏。将流浸膏溶于3倍重量水中，过滤，滤液通过D101大孔树酯柱，依次用水和80％的乙醇洗脱。收集80％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷110克。取总皂苷55克进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.2)的洗脱液洗脱，收集含Philinopside E的流份，减压蒸干后得10.8克。取其中500毫克进行高效液相分离纯化(HPLC条件为Zorbax 300 SB-C18，55％甲醇为流动相，1.5ml/min，室温)，得Philinopside E纯品27毫克。
权利要求
1.一种化合物Philinoside E，其特征在于化学结构式如下
2.权利要求1所述化合物Philonopside E的制备方法，具体步骤如下(1)提取新鲜方柱五角瓜参，洗净去掉内脏后，自然风干，取干燥体壁粉碎，85％的乙醇室温浸泡提取7天，滤出提取液，减压回收乙醇，乙醇提取物再用正丁醇萃取，正丁醇萃取物依次用石油醚、氯仿和乙醚萃取后得流浸膏，将流浸膏溶于水中过大孔树酯柱，依次用水和80％的乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷提取物；(2)分离上述总皂苷应用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.2)混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含Philinopside E的流份，再经高效液相分离纯化，55％甲醇为流动相洗脱，得到Philinopside E纯品。
3.权利要求1所述化合物Philinopside E在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，具体为一种从方柱五角瓜参中分离到的抗肿瘤化合物Philinopside E，分子式C
文档编号A61P35/00GK1634973SQ200410067500
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月26日 优先权日2004年10月26日
发明者易杨华, 丁健, 张诗龙, 田芳, 李玲, 章雄文, 刘宝姝, 陈奕 申请人:中国人民解放军第二军医大学
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