一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白筛选和鉴定方法
专利名称：一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白筛选和鉴定方法
技术领域：
本发明属于中医药技术领域。具体涉及一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法及其应用。
背景技术：
针灸是我国常用的临床治疗疾病的方法之一，其临床有效性正在被世界多国接受或成为医疗方法之一被推广应用。
在中国，经临床实践证明，针灸治疗有效的病种包括神经、内分泌、免疫、循环、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感觉、运动等机体各个系统的疾病约300余种，并随着临床应用的扩展，针灸治疗的有效病症在不断增加。
研究工作在证明针灸作用的临床有效性前提下，对针灸治疗疾病的作用原理也进行了深入研究。结果表明，针灸作用具有整体、双向调节的特点，其调节作用可通过神经—内分泌—免疫网络等多途径得到发挥，从而证明针灸效应的存在。
以针灸临床有效性为基础的针灸作用原理研究，引出了针灸效应物质基础的深层次问题。由于针灸效应的整体性和双向性特点，难以用单一的检测方法对其效应物质基础进行逐一研究，因此引入高通量的系统、同步研究方法，成为针灸效应物质基础研究的突破口。高通量的基因组学和蛋白质组学理论与技术为这一研究创造了良好的工作平台。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究针灸效应的响应基因和应答蛋白，设计该蛋白的筛选和鉴定方法。
本发明提供了一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法。
本发明的方法是基于这样的原理针灸效应是一种生命活动现象，生命活动是建立在蛋白质及其相互作用基础上的信息传导过程，这一过程是基因表达、蛋白质功能表现、蛋白质—蛋白质相互作用的信息反应序列。因此从基因、蛋白质入手，研究针灸效应的响应基因和应答蛋白，将是针灸效应物质基础研究的最佳突破口。高通量的基因组学和蛋白质组学理论与技术也为这一研究创造了良好的工作平台。
本发明的方法包括下列步骤(1)采集样本采取疾病机体或模型疾病机体经针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官与组织器官匀浆液。将血液、组织液、组织器官匀浆液存放于-80℃冰箱中，非人体的组织器官存放于液氮中；(2)基因表达序列分析对针灸治疗后的非人体组织器官进行针灸效应差异表达基因分析，并以差异表达基因标签为线索，获得针刺响应基因相对应的表达蛋白(特定效应蛋白)；(3)针灸治疗特定蛋白筛选采用蛋白质组技术对针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官匀浆液进行针灸治疗特定蛋白筛选；(4)针灸特定效应蛋白的鉴定采用质谱分析方法。回收针灸响应基因所对应的表达蛋白，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽谱图进行联机数据库和网络数据库分析，获得差异表达蛋白质的氨基酸序列。确定针刺效应特定蛋白的氨基酸序列；(5)针灸特定效应蛋白的活性分析将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用；或选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用。
本发明的方法中所指的针灸方法可以是传统的针灸方法以及传统针灸方法与电学、光学、声学、磁学相结合的现代针灸方法，如针刺、艾灸、拔火罐、温针、电针、头针、穴位注射、穴位敷贴、穴位埋藏、穴位割治、穴位挑治、穴位结扎、刺络放血、激光针、冷冻针、皮肤针或耳针。针灸治疗有效的病种可以是神经、内分泌、免疫、循环、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感觉或运动机体各个系统的疾病。针灸作用的对象可以是人体、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、马、牛或羊。
本发明的另一目的是提供了基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白在药物筛选中的应用，该应用的方法包括下列步骤1)将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用；2)选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用。
本发明针灸效应特定蛋白在药物筛选中的应用，可以采用以下方法实现1)将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用，根据其对动物疾病模型治疗的有效性，搜寻其在人体的同源蛋白，或对其进行结构改造取消其在人体的异质性，应用基因工程的方法生产生物制剂药品；2)选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用，根据其作用，再将针灸特定效应蛋白做为配体，利用配体垂钓技术筛选与之相结合的小分子化合物，将与之相结合的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选；3)根据针灸特定效应蛋白的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术，快速筛选与之相作用的小分子化合物，将与之相作用的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选。
创新药物是现代生物医药发展的核心，靶标发现是创新药物的首要步骤。传统的靶标发现依赖于病理生理机制的发展，存在靶标功能验证过程中失败率较高的投入风险。
本发明以建立在针灸治疗有效性基础上的针灸效应响应基因和应答蛋白为靶标筛选起点，其筛选范围建立在有效性基础之上，可最大限度避免上述风险，提高靶标筛选成功率，同时创立以针灸治疗为基础的靶标筛选策略，在药物筛选中将有很大的应用价值。
具体实施例方式实施例1 哮喘模型大鼠针刺治疗后血清中抗哮喘活性蛋白的筛选与鉴定选择临床上针灸治疗哮喘有效的方法，用于治疗模型哮喘大鼠，隔天针刺大鼠大椎、肺俞、风门穴1次，14天后，心脏采血法采取针刺治疗后的哮喘大鼠血液，常规方法制备血清(称之为“针刺血清”)。将针刺血清首先经液相色谱分析，分为＜14.3kD、14.3kD-45kD、＞45kD三个分子量段，将不同分子量段的针刺血清分别使用蛋白质组的2-DE蛋白质电泳分离技术，获得了五个与针刺抗哮喘有关的特异表达蛋白点，它们是点1MW＝39.8kD，PI＝4.9；点2MW＝39.5kD，PI＝5.0；点3MW＝44.1kD，PI＝5.1；点4MW＝17.3kD，PI＜4.5；点5MW＝16.9kD，PI＜4.5。切取上述5个特异蛋白质点，进行质谱分析，这五个蛋白质点分别是锌指蛋白208、甲状腺激素受体相关蛋白、60S核糖体蛋白L13或假想蛋白FLJ32191、免疫抑制剂的受体A04604、锌指蛋白91。其中蛋白质点4被质谱鉴定为一种免疫抑制剂的受体，我们称之为A04604。将A04604注射入哮喘大鼠，可以明显降低哮喘大鼠的气道阻力，具有明显的抗哮喘药物开发前景。
根据A04604的氨基酸序列，从数据库中检索到了其三维结构，将A04604的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术和小分子化合物数据库，筛选出了8种与之相作用的小分子化合物，这些小分子化合物是药物筛选的基础。
将A04604作为配体，应用配体垂钓技术检测到该蛋白与四种植物来源的小分子化合物有明显的结合活性。这四种植物来源的小分子化合物为药物筛选提供了物质基础。
实施例2 便秘模型大鼠针刺治疗后大肠组织匀浆液中抗便秘蛋白的筛选与鉴定用复方地芬诺酯(10.0mg/kg)灌胃方法制备大鼠便秘模型，根据临床经验选取“合谷”、“后三里”两穴对便秘大鼠进行针刺治疗。治疗结束后处死大鼠，迅速分离大鼠大肠，用NS冲洗干净后，用滤纸吸净多余水分，剪取约200mg大肠组织，加入2.0ml细胞裂解液，在冰水混合物中以1500转/min制备匀浆，反复冻融3个循环，加入20μg/ml脱氧核糖核酸酶I 10μl和5μg/ml核糖核酸酶A 10μl，4℃作用15分钟后，以每分钟12000转离心30分钟，收集上清液制得大肠蛋白质提取液。用蛋白质组的SDS-PAGE蛋白质分离技术，对针刺治疗后的大鼠大肠蛋白质提取液进行电泳分析，筛选得到分子量为27.24kDa和22.79kDa两个蛋白条带与针刺治疗大鼠便秘模型有关。切取这两个特异的蛋白质条带，进行质谱分析，它们分别是蛋白质C5081和C5082，制备这两种蛋白质的抗体，并将其按一定比例混合应用于便秘大鼠，可明显环节大鼠便秘症状，证明其具有良好的抗大鼠便秘作用。为进一步药物筛选奠定了工作基础。
实施例3 哮喘模型大鼠针刺治疗后肺组织中针刺相应基因表达蛋白的筛选与鉴定选择临床上针灸治疗哮喘有效的方法，用于治疗模型哮喘大鼠，隔天针刺大鼠大椎、肺俞、风门穴1次，14天后，采取针刺治疗后哮喘大鼠的肺组织，快速在冰冷条件下用生理盐水清洗干净肺组织表面的血液，剔除脂肪和无关结缔组织，迅速将清洗干净的肺组织置液氮中保存。
根据基因表达序列分析方法的操作手册进行针刺抗哮喘效应相应基因的基因表达序列分析。经过抽提样品总RNA、分离mRNA、连接带oligo(dT)的磁珠、合成cDNA第一链、合成cDNA第二链、Nla III酶切、cDNA连接接头、标签酶酶切、将标签体连接成双标签体、扩增102bp的双标签体并分离纯化、分离纯化26bp的双标签体、连接26bp的双标签体、克隆连接体至载体pZErO-1中并转化、PCR鉴定及测序、数据分析等步骤，得到最终SAGE标签体序列的数据库及相关的统计报告。经数据对比分析，明确针刺抗哮喘效应响应基因差异表达序列所代表的基因注释。将SAGE结果提示差异的基因，通过RT-PCR、Northern Blot验证差异的准确性。以针刺抗哮喘差异表达响应基因标签为线索，扩增相应全长cDNA序列，并将全长cDNA构入表达载体，回收针刺响应基因相对应的表达蛋白。
将回收的针刺响应基因相对应的表达蛋白经过质谱鉴定，获得了一种与抗哮喘有关的蛋白质G208。将G208注射入哮喘大鼠，可以明显降低哮喘大鼠的气道阻力，具有明显的抗哮喘药物开发前景。
权利要求
1.一种于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法，其特征在于该方法包括下列步骤①采集样本采取疾病机体或模型疾病机体经针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官与组织器官匀浆液，将血液、组织液、组织器官匀浆液存放于-80℃冰箱中，非人体的组织器官存放于液氮中；②基因表达序列分析对针灸治疗后的非人体组织器官进行针灸效应差异表达基因分析，并以差异表达基因标签为线索，获得针刺响应基因相对应的表达蛋白(特定效应蛋白)；③针灸治疗特定蛋白筛选采用蛋白质组技术对针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官匀浆液进行针灸治疗特定蛋白筛选；④针灸特定效应蛋白的鉴定采用质谱分析方法，回收针灸响应基因所对应的表达蛋白，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽谱图进行联机数据库和网络数据库分析，获得差异表达蛋白质的氨基酸序列，确定针刺效应特定蛋白的氨基酸序列；⑤针灸特定效应蛋白的活性分析将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用；或选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用。
2.根据权利要求1所述的一种于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法，其特征在于其中所述的针灸包括可以是传统的针灸方法以及传统针灸方法与电学、光学、声学、磁学相结合的现代针灸方法，如针刺、艾灸、拔火罐、温针、电针、头针、穴位注射、穴位敷贴、穴位埋藏、穴位割治、穴位挑治、穴位结扎、刺络放血、激光针、冷冻针、皮肤针或耳针；针灸治疗有效的病种可以是神经、内分泌、免疫、循环、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感觉或运动机体各个系统的疾病；针灸作用的对象可以是人体、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、马、牛或羊。
3.基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白在药物筛选中的应用，其特征在于该应用方法包括下列步骤1)将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用，根据其对动物疾病模型治疗的有效性，搜寻其在人体的同源蛋白，或对其进行结构改造取消其在人体的异质性，应用基因工程的方法生产生物制剂药品；2)选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用，根据其作用，再将针灸特定效应蛋白做为配体，利用配体垂钓技术筛选与之相结合的小分子化合物，将与之相结合的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选；3)根据针灸特定效应蛋白的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术，快速筛选与之相作用的小分子化合物，将与之相作用的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选。
全文摘要
本发明提供了一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法。本发明研究针灸效应的响应基因和应答蛋白，以针灸作用的有效性为基础，建立在基因组和蛋白质组技术平台上的针灸效应特定蛋白的筛选和鉴定方法。本发明的方法在药物筛选中有很大的实用价值。
文档编号A61H39/08GK1623499SQ20041006766
公开日2005年6月8日 申请日期2004年10月29日 优先权日2004年10月29日
发明者杨永清, 王宇, 陈汉平, 崔建美 申请人:上海市针灸经络研究所, 上海中医药大学
技术领域：
本发明属于中医药技术领域。具体涉及一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法及其应用。
背景技术：
针灸是我国常用的临床治疗疾病的方法之一，其临床有效性正在被世界多国接受或成为医疗方法之一被推广应用。
在中国，经临床实践证明，针灸治疗有效的病种包括神经、内分泌、免疫、循环、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感觉、运动等机体各个系统的疾病约300余种，并随着临床应用的扩展，针灸治疗的有效病症在不断增加。
研究工作在证明针灸作用的临床有效性前提下，对针灸治疗疾病的作用原理也进行了深入研究。结果表明，针灸作用具有整体、双向调节的特点，其调节作用可通过神经—内分泌—免疫网络等多途径得到发挥，从而证明针灸效应的存在。
以针灸临床有效性为基础的针灸作用原理研究，引出了针灸效应物质基础的深层次问题。由于针灸效应的整体性和双向性特点，难以用单一的检测方法对其效应物质基础进行逐一研究，因此引入高通量的系统、同步研究方法，成为针灸效应物质基础研究的突破口。高通量的基因组学和蛋白质组学理论与技术为这一研究创造了良好的工作平台。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究针灸效应的响应基因和应答蛋白，设计该蛋白的筛选和鉴定方法。
本发明提供了一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法。
本发明的方法是基于这样的原理针灸效应是一种生命活动现象，生命活动是建立在蛋白质及其相互作用基础上的信息传导过程，这一过程是基因表达、蛋白质功能表现、蛋白质—蛋白质相互作用的信息反应序列。因此从基因、蛋白质入手，研究针灸效应的响应基因和应答蛋白，将是针灸效应物质基础研究的最佳突破口。高通量的基因组学和蛋白质组学理论与技术也为这一研究创造了良好的工作平台。
本发明的方法包括下列步骤(1)采集样本采取疾病机体或模型疾病机体经针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官与组织器官匀浆液。将血液、组织液、组织器官匀浆液存放于-80℃冰箱中，非人体的组织器官存放于液氮中；(2)基因表达序列分析对针灸治疗后的非人体组织器官进行针灸效应差异表达基因分析，并以差异表达基因标签为线索，获得针刺响应基因相对应的表达蛋白(特定效应蛋白)；(3)针灸治疗特定蛋白筛选采用蛋白质组技术对针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官匀浆液进行针灸治疗特定蛋白筛选；(4)针灸特定效应蛋白的鉴定采用质谱分析方法。回收针灸响应基因所对应的表达蛋白，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽谱图进行联机数据库和网络数据库分析，获得差异表达蛋白质的氨基酸序列。确定针刺效应特定蛋白的氨基酸序列；(5)针灸特定效应蛋白的活性分析将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用；或选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用。
本发明的方法中所指的针灸方法可以是传统的针灸方法以及传统针灸方法与电学、光学、声学、磁学相结合的现代针灸方法，如针刺、艾灸、拔火罐、温针、电针、头针、穴位注射、穴位敷贴、穴位埋藏、穴位割治、穴位挑治、穴位结扎、刺络放血、激光针、冷冻针、皮肤针或耳针。针灸治疗有效的病种可以是神经、内分泌、免疫、循环、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感觉或运动机体各个系统的疾病。针灸作用的对象可以是人体、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、马、牛或羊。
本发明的另一目的是提供了基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白在药物筛选中的应用，该应用的方法包括下列步骤1)将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用；2)选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用。
本发明针灸效应特定蛋白在药物筛选中的应用，可以采用以下方法实现1)将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用，根据其对动物疾病模型治疗的有效性，搜寻其在人体的同源蛋白，或对其进行结构改造取消其在人体的异质性，应用基因工程的方法生产生物制剂药品；2)选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用，根据其作用，再将针灸特定效应蛋白做为配体，利用配体垂钓技术筛选与之相结合的小分子化合物，将与之相结合的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选；3)根据针灸特定效应蛋白的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术，快速筛选与之相作用的小分子化合物，将与之相作用的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选。
创新药物是现代生物医药发展的核心，靶标发现是创新药物的首要步骤。传统的靶标发现依赖于病理生理机制的发展，存在靶标功能验证过程中失败率较高的投入风险。
本发明以建立在针灸治疗有效性基础上的针灸效应响应基因和应答蛋白为靶标筛选起点，其筛选范围建立在有效性基础之上，可最大限度避免上述风险，提高靶标筛选成功率，同时创立以针灸治疗为基础的靶标筛选策略，在药物筛选中将有很大的应用价值。
具体实施例方式实施例1 哮喘模型大鼠针刺治疗后血清中抗哮喘活性蛋白的筛选与鉴定选择临床上针灸治疗哮喘有效的方法，用于治疗模型哮喘大鼠，隔天针刺大鼠大椎、肺俞、风门穴1次，14天后，心脏采血法采取针刺治疗后的哮喘大鼠血液，常规方法制备血清(称之为“针刺血清”)。将针刺血清首先经液相色谱分析，分为＜14.3kD、14.3kD-45kD、＞45kD三个分子量段，将不同分子量段的针刺血清分别使用蛋白质组的2-DE蛋白质电泳分离技术，获得了五个与针刺抗哮喘有关的特异表达蛋白点，它们是点1MW＝39.8kD，PI＝4.9；点2MW＝39.5kD，PI＝5.0；点3MW＝44.1kD，PI＝5.1；点4MW＝17.3kD，PI＜4.5；点5MW＝16.9kD，PI＜4.5。切取上述5个特异蛋白质点，进行质谱分析，这五个蛋白质点分别是锌指蛋白208、甲状腺激素受体相关蛋白、60S核糖体蛋白L13或假想蛋白FLJ32191、免疫抑制剂的受体A04604、锌指蛋白91。其中蛋白质点4被质谱鉴定为一种免疫抑制剂的受体，我们称之为A04604。将A04604注射入哮喘大鼠，可以明显降低哮喘大鼠的气道阻力，具有明显的抗哮喘药物开发前景。
根据A04604的氨基酸序列，从数据库中检索到了其三维结构，将A04604的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术和小分子化合物数据库，筛选出了8种与之相作用的小分子化合物，这些小分子化合物是药物筛选的基础。
将A04604作为配体，应用配体垂钓技术检测到该蛋白与四种植物来源的小分子化合物有明显的结合活性。这四种植物来源的小分子化合物为药物筛选提供了物质基础。
实施例2 便秘模型大鼠针刺治疗后大肠组织匀浆液中抗便秘蛋白的筛选与鉴定用复方地芬诺酯(10.0mg/kg)灌胃方法制备大鼠便秘模型，根据临床经验选取“合谷”、“后三里”两穴对便秘大鼠进行针刺治疗。治疗结束后处死大鼠，迅速分离大鼠大肠，用NS冲洗干净后，用滤纸吸净多余水分，剪取约200mg大肠组织，加入2.0ml细胞裂解液，在冰水混合物中以1500转/min制备匀浆，反复冻融3个循环，加入20μg/ml脱氧核糖核酸酶I 10μl和5μg/ml核糖核酸酶A 10μl，4℃作用15分钟后，以每分钟12000转离心30分钟，收集上清液制得大肠蛋白质提取液。用蛋白质组的SDS-PAGE蛋白质分离技术，对针刺治疗后的大鼠大肠蛋白质提取液进行电泳分析，筛选得到分子量为27.24kDa和22.79kDa两个蛋白条带与针刺治疗大鼠便秘模型有关。切取这两个特异的蛋白质条带，进行质谱分析，它们分别是蛋白质C5081和C5082，制备这两种蛋白质的抗体，并将其按一定比例混合应用于便秘大鼠，可明显环节大鼠便秘症状，证明其具有良好的抗大鼠便秘作用。为进一步药物筛选奠定了工作基础。
实施例3 哮喘模型大鼠针刺治疗后肺组织中针刺相应基因表达蛋白的筛选与鉴定选择临床上针灸治疗哮喘有效的方法，用于治疗模型哮喘大鼠，隔天针刺大鼠大椎、肺俞、风门穴1次，14天后，采取针刺治疗后哮喘大鼠的肺组织，快速在冰冷条件下用生理盐水清洗干净肺组织表面的血液，剔除脂肪和无关结缔组织，迅速将清洗干净的肺组织置液氮中保存。
根据基因表达序列分析方法的操作手册进行针刺抗哮喘效应相应基因的基因表达序列分析。经过抽提样品总RNA、分离mRNA、连接带oligo(dT)的磁珠、合成cDNA第一链、合成cDNA第二链、Nla III酶切、cDNA连接接头、标签酶酶切、将标签体连接成双标签体、扩增102bp的双标签体并分离纯化、分离纯化26bp的双标签体、连接26bp的双标签体、克隆连接体至载体pZErO-1中并转化、PCR鉴定及测序、数据分析等步骤，得到最终SAGE标签体序列的数据库及相关的统计报告。经数据对比分析，明确针刺抗哮喘效应响应基因差异表达序列所代表的基因注释。将SAGE结果提示差异的基因，通过RT-PCR、Northern Blot验证差异的准确性。以针刺抗哮喘差异表达响应基因标签为线索，扩增相应全长cDNA序列，并将全长cDNA构入表达载体，回收针刺响应基因相对应的表达蛋白。
将回收的针刺响应基因相对应的表达蛋白经过质谱鉴定，获得了一种与抗哮喘有关的蛋白质G208。将G208注射入哮喘大鼠，可以明显降低哮喘大鼠的气道阻力，具有明显的抗哮喘药物开发前景。
权利要求
1.一种于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法，其特征在于该方法包括下列步骤①采集样本采取疾病机体或模型疾病机体经针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官与组织器官匀浆液，将血液、组织液、组织器官匀浆液存放于-80℃冰箱中，非人体的组织器官存放于液氮中；②基因表达序列分析对针灸治疗后的非人体组织器官进行针灸效应差异表达基因分析，并以差异表达基因标签为线索，获得针刺响应基因相对应的表达蛋白(特定效应蛋白)；③针灸治疗特定蛋白筛选采用蛋白质组技术对针灸治疗后的血液、组织液、非人体组织的组织器官匀浆液进行针灸治疗特定蛋白筛选；④针灸特定效应蛋白的鉴定采用质谱分析方法，回收针灸响应基因所对应的表达蛋白，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽谱图进行联机数据库和网络数据库分析，获得差异表达蛋白质的氨基酸序列，确定针刺效应特定蛋白的氨基酸序列；⑤针灸特定效应蛋白的活性分析将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用；或选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用。
2.根据权利要求1所述的一种于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法，其特征在于其中所述的针灸包括可以是传统的针灸方法以及传统针灸方法与电学、光学、声学、磁学相结合的现代针灸方法，如针刺、艾灸、拔火罐、温针、电针、头针、穴位注射、穴位敷贴、穴位埋藏、穴位割治、穴位挑治、穴位结扎、刺络放血、激光针、冷冻针、皮肤针或耳针；针灸治疗有效的病种可以是神经、内分泌、免疫、循环、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感觉或运动机体各个系统的疾病；针灸作用的对象可以是人体、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、马、牛或羊。
3.基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白在药物筛选中的应用，其特征在于该应用方法包括下列步骤1)将针灸特定效应蛋白应用于相应的疾病动物模型，以适合疾病的方法检测其对疾病的治疗作用，根据其对动物疾病模型治疗的有效性，搜寻其在人体的同源蛋白，或对其进行结构改造取消其在人体的异质性，应用基因工程的方法生产生物制剂药品；2)选择相应疾病的已知靶点，应用配体垂钓技术检测针灸特定效应蛋白对疾病已知靶点的抑制或激动作用，根据其作用，再将针灸特定效应蛋白做为配体，利用配体垂钓技术筛选与之相结合的小分子化合物，将与之相结合的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选；3)根据针灸特定效应蛋白的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术，快速筛选与之相作用的小分子化合物，将与之相作用的小分子化合物直接或经过结构改造进行药物筛选。
全文摘要
本发明提供了一种基于针灸作用有效性的机体特定效应蛋白的筛选和鉴定方法。本发明研究针灸效应的响应基因和应答蛋白，以针灸作用的有效性为基础，建立在基因组和蛋白质组技术平台上的针灸效应特定蛋白的筛选和鉴定方法。本发明的方法在药物筛选中有很大的实用价值。
文档编号A61H39/08GK1623499SQ20041006766
公开日2005年6月8日 申请日期2004年10月29日 优先权日2004年10月29日
发明者杨永清, 王宇, 陈汉平, 崔建美 申请人:上海市针灸经络研究所, 上海中医药大学
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