淋巴细胞的制作方法及免疫治疗剂的制作方法
专利名称：淋巴细胞的制作方法及免疫治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种淋巴细胞的激活增殖方法以及由此方法而等到的细胞免疫治疗剂。
背景技术：
癌症的治疗，现在有许多免疫疗法。目前在抗癌效应细胞、细胞因子、抗癌抗体和瘤苗及基因治疗研究的各个方面都有明显进展，并取得了一定技术突破和临床疗效。比如为提高癌症患者自身的免疫力，投入许多种类的免疫化学物质，像干扰素、白介素等细胞素类，或是免疫赋活剂。其中细胞因子的诱生、抗癌效应细胞的激活方法是研究的热点。有效抗癌因子的诱导、细胞因子及其构成的网络，不仅在激活免疫细胞、诱生细胞因子和调节整个抗癌免疫反应中起重要作用，还具有直接抑制肿瘤细胞的增殖转移作用，是肿瘤生物治疗的重要制剂。目前IL-2、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ和IFN-β等细胞因子已被应用于临床，但真正有显效杀伤功能的细胞因子为数不多，效果理想的也很少，甚至有的还有很强的副作用。故需寻找有效的治疗癌症的方法。
现在，临床上有多种将免疫细胞取出体外，激活增殖之后再同输体内的治疗方法。代表的方法有LAK细胞，CAT细胞，TCL细胞，TIL细胞等。
LAK细胞是用血细胞分离机用数小时分离患者的血液细胞，可以得到5×105～5×1010个单核细胞，通过白介素2的刺激获得LAK细胞。最后，将得到的LAK细胞和大量的白介素2回输体内。其结果是对一部分癌症患者、部分种类的癌症有治疗效果。但是，大多数患者会伴有发热、恶寒、恶心、呕吐、呼吸困难、甚至皮肤红斑等重症的副作用。此方法的欠点是需要大量的淋巴细胞，以及和淋巴细胞同时输回体内的细胞素所引起的严重的副作用。
CAT细胞疗法是用少量的末梢淋巴细胞，通过固化的抗CD3抗体激活淋巴细胞，然后用白介素2刺激细胞使之增殖。本治疗法有使癌肿缩小或是消失的报道。但是其中的一部分细胞的活性没有被充分的发挥和利用。
TIL细胞疗法是用癌肿内或癌肿周围的淋巴细胞，用和LAK细胞同样的方法，将淋巴细胞和白介素2一起培养之后投入人体。和CAT细胞疗法相比，TIL细胞疗法对癌细胞的认识能力较强。
CTL细胞疗法和CAT细胞疗法相似，也是用少量的末梢淋巴细胞，通过固化的抗CD3抗体激活淋巴细胞，然后用白介素2刺激细胞使之增殖。但同时加入一些肿瘤特异性抗原，反复地刺激淋巴细胞使之对肿瘤细胞具有特异性的认识能力。对癌细胞的杀伤能力要大于LAK细胞疗法和CAT细胞疗法。
以上这些疗法都是着眼于如何提高T细胞的活性，而忽视了淋巴细胞中占有相当比例的NK细胞的利用价值。
NK细胞约占外周血淋巴细胞总数的5-7％。在人体中，T细胞的抗肿瘤作用和NK细胞的抗肿瘤作用有互补作用。T细胞对肿瘤细胞的伤害作用依赖于class I抗原的提示，而NK细胞能够作用于有可能因为class I抗原减少而不能被识别的肿瘤细胞。NK细胞对癌细胞的转移有着重要的作用，特别是转移性癌的初期阶段尤为重要。
IL-12是一种糖蛋白，分子量为75kd。是由B细胞以及单球系细胞产生的，其特征是对NK细胞有明显的活性化作用，能够强力的促进NK细胞的增殖和杀伤作用，是一种NK细胞刺激因子。同时，IL-12还能够促进T细胞的增殖和杀伤作用，显著增强LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL的应答能力。IL-12具有诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，增加NK细胞表达各种细胞因子受体和粘附分子的能力，又可以启动Th0细胞向Th1细胞的发育，抑制IL-4介导IgE的合成、协同SCF诱导骨髓细胞的生成，IL-12在先天性和获得性抗肿瘤免疫中均发挥重要作用，具有良好的抗癌应用价值。
IL-12直接投入体内，会产生严重的副作用。无法起到杀伤癌细胞的效果。而用IL-12激活NK细胞则可以达到治疗癌症的目的。
发明内容
要解决的问题同时提高T细胞和NK细胞的数量和对癌细胞的杀伤活性。在对癌肿起治疗作用的同时，也可有效的防止癌细胞在体内的扩散和转移。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-12存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-2和IL-12存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在IL-12以及IL-2存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种细胞免疫制剂，在优选的技术方案中涉及用上述的淋巴细胞、或以上述的淋巴细胞为主体，或是做为治疗手段的一部分的、用于癌症或是感染症等治疗用的免疫治疗制剂。
实验方法本技术所用的淋巴细胞，不仅仅限于末梢血淋巴细胞，也可用于上皮性淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、恶性腹水内淋巴细胞、恶性胸水内淋巴细胞等等存在于人体中的所有种类的淋巴细胞。并没有特别的限制，但是末梢血淋巴细胞由于容易取得且分离方便，所以比较常用。细胞的数目以1×106～5×107个为宜。
将上述的细胞，在抗CD3抗体的存在的环境下培养。CD3存在于T细胞的表面，通过CD3分子的介导，将刺激情报传送到细胞内部，而激活细胞使细胞开始增值。CD3是抗原认识的重要的细胞表面分子。而CD3分子介导的细胞刺激，则是由抗CD3抗体实现的。
抗CD3抗体可以由自由态的形式，也可以将其固化。后者的效果更好。抗CD3抗体的固化可以用灭菌的生理盐水或是磷酸缓冲液溶解，浓度为0.1～100μg/ml。固化载体以塑料、玻璃等素材为好，通常的培养瓶即可。固化方法是将上述抗CD3抗体溶液加入同化容器中，4～37℃静置2～24小时。固化后的容器置于4-30℃保存。使用时在常温用生理盐水洗净。
本技术使用IL-12作为刺激因子。IL-12用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度为1～2000国际单位/ml。
本技术使用IL-2作为共同刺激因子。IL-2用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度为1～2000国际单位/ml。
淋巴细胞的培养液没有特别的要求，只要是适用于淋巴细胞生长的培养液均可。比如RPMI-164O、AIM-V、DMEM、IMDM等。根据需要可以加入牛胎儿血清，牛血清蛋白或是人的血清。将淋巴细胞悬浮于含有IL-2和IL-12的培养液中，加到用抗CD3抗体固化过的容器中。
培养方法按照通常的细胞培养方法进行。一般要求在CO2培养箱中进行，CO2浓度为1-10％。温度为30-40℃，培养时间2-20天。培养期间应观察细胞的生长情况，以及计数细胞的数量。一般在培养数天后，培养液会变成黄色。此时应加入一定量新的培养液，同时补充一定量的IL-2和IL-12溶液。
在抗CD3抗体存在的条件下，长期培养不利于淋巴细胞的大量增殖，因此在淋巴细胞增值到一定程度时，应将细胞移到没有抗CD3抗体存在的环境下培养。通常是在培养后的第3-7天，将培养细胞移入气体通透性培养袋中培养。
在此阶段，细胞的增殖需要不断地添加新鲜的培养液，以及新鲜的IL-2和IL-12溶液。细胞浓度为1×105～1×108/ml。
本技术，主要是诱导NK细胞增值，提高NK细胞的杀伤细胞的溶解活性，以及诱导NK细胞的IFN-γ和相关细胞素的分泌能力。后者能进一步激活细胞介导的免疫反应。可以提高非特异性淋巴细胞的反应能力，提高对癌细胞的非特异性杀伤能力，既可杀伤癌细胞，又有较强的防止癌细胞转移的能力。
本技术，还可以诱导T淋巴细胞增值，提高特异性淋巴细胞反应和高度特异性CTL反应。
本技术，还可以诱导CD4+T细胞、CD8+T细胞的增殖。
本技术还可以通过增加NK细胞表达各种细胞因子受体和粘附分子的能力，提高对肿瘤的杀伤能力。
作为一种治疗剂，细胞的数量为1×105～1×1012个。为证明本发明技术方案的有效性，可按照下列方法进行试验本技术的最佳实施方案本技术是应用人的淋巴细胞。实验所用的淋巴细胞，可以是末梢血淋巴细胞，也可用是上皮性淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、恶性腹水内淋巴细胞、恶性胸水内淋巴细胞等等存在于人体中的所有种类的淋巴细胞。由于末梢血淋巴细胞容易取得且分离方便，所以常用末梢血淋巴细胞。细胞的数目以1×106～50×106个为宜。
抗CD3抗体的固化可以用灭菌的生理盐水或是磷酸缓冲液溶解，浓度为0.1～100μg/ml，以1～10μg/ml为宜。固化载体以塑料、玻璃等素材为宜，通常的培养瓶即可。固化方法是将上述抗CD3抗体溶液加入固化容器中，4～37℃静置2～24小时。固化后的容器置于4℃冰箱保存。使用时在常温用生理盐水洗净。
本技术使用IL-12作为刺激因子。IL-12用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度以1～2000国际单位/ml为宜。
本技术使用IL-2作为共同刺激因子。IL-2用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度以1～2000国际单位/ml，以10～2000国际单位/ml为宜。
淋巴细胞的培养液要适用于淋巴细胞生长的培养液。比如RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM等。根据需要可以加入牛胎儿血清，牛血清蛋白或是人的血清。将淋巴细胞悬浮于含有IL-2和IL-12的培养液中，加到用抗CD3抗体固化的容器中。
培养方法按照通常的细胞培养方法进行。一般要求在CO2培养箱中进行，CO2浓度为1-10％，以5％为宜。温度为30-40℃，以37℃为宜。培养时间2-21天，以7-14天为宜。培养期间应观察细胞的生长情况，以及计数细胞的数量。一般在培养时间，通常为3天后，培养液会变成黄色。此时应加入一定量新的培养液，同时补充一定量的IL-2和IL-12溶液，以等浓度为宜。
在CD3抗体存在的条件下，长期培养不利于淋巴细胞的大量增殖，因此在淋巴细胞增值到一定程度时，应将细胞移到没有抗CD3抗体存在的环境下培养。通常是在培养后的第3-7天，将培养细胞移入气体通透性培养袋中培养，以5-7天为宜。
在此阶段，细胞的增殖需要不断地添加新鲜的培养液，以及新鲜的IL-2和IL-12溶液。细胞浓度为1×105～100×105个/ml，以5×105～10×105个/ml为宜。
培养结束后，将细胞离心回收，细胞洗净后用生理盐水悬浮，备用。
作为一种治疗剂，细胞的数量为1×105～1×1012，以1×107～1×1011个为宜。
有益效果本技术可以提供一个对癌细胞具有较高活性、较大数量的淋巴细胞。是通过T细胞和NK细胞共同作用而实验的。既可以用于治疗癌症，更可以防止癌细胞的扩散。
权利要求
1.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体存在的条件下的培养方法。
2.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-12存在的条件下的培养方法。
3.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-2和IL-12存在的条件下的培养方法。
4.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在IL-12以及IL-2存在的条件下的培养方法。
5.细胞免疫制剂，由权利要求1、权利要求2、权利要求3、权利要求4或、权利要求5所述的淋巴细胞培养方法所制备的细胞为主体、或是为治疗手段的一部分的治疗用制剂。
全文摘要
一种淋巴细胞的激活增殖方法以及由此方法而等到的细胞免疫治疗剂。是用IL－2和IL－12刺激淋巴细胞，特别是激活NK细胞和T细胞，促进非特异性NK细胞以及特异性CTL的应答能力，增强其杀伤活性。本技术提供一种淋巴细胞的制备方法，以及由这种方法制备的、用于癌症或是各种感染症的治疗的一种免疫治疗剂。
文档编号A61K35/26GK1724655SQ20041007073
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月23日 优先权日2004年7月23日
发明者宋清华 申请人:宋清华
技术领域：
本发明涉及一种淋巴细胞的激活增殖方法以及由此方法而等到的细胞免疫治疗剂。
背景技术：
癌症的治疗，现在有许多免疫疗法。目前在抗癌效应细胞、细胞因子、抗癌抗体和瘤苗及基因治疗研究的各个方面都有明显进展，并取得了一定技术突破和临床疗效。比如为提高癌症患者自身的免疫力，投入许多种类的免疫化学物质，像干扰素、白介素等细胞素类，或是免疫赋活剂。其中细胞因子的诱生、抗癌效应细胞的激活方法是研究的热点。有效抗癌因子的诱导、细胞因子及其构成的网络，不仅在激活免疫细胞、诱生细胞因子和调节整个抗癌免疫反应中起重要作用，还具有直接抑制肿瘤细胞的增殖转移作用，是肿瘤生物治疗的重要制剂。目前IL-2、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ和IFN-β等细胞因子已被应用于临床，但真正有显效杀伤功能的细胞因子为数不多，效果理想的也很少，甚至有的还有很强的副作用。故需寻找有效的治疗癌症的方法。
现在，临床上有多种将免疫细胞取出体外，激活增殖之后再同输体内的治疗方法。代表的方法有LAK细胞，CAT细胞，TCL细胞，TIL细胞等。
LAK细胞是用血细胞分离机用数小时分离患者的血液细胞，可以得到5×105～5×1010个单核细胞，通过白介素2的刺激获得LAK细胞。最后，将得到的LAK细胞和大量的白介素2回输体内。其结果是对一部分癌症患者、部分种类的癌症有治疗效果。但是，大多数患者会伴有发热、恶寒、恶心、呕吐、呼吸困难、甚至皮肤红斑等重症的副作用。此方法的欠点是需要大量的淋巴细胞，以及和淋巴细胞同时输回体内的细胞素所引起的严重的副作用。
CAT细胞疗法是用少量的末梢淋巴细胞，通过固化的抗CD3抗体激活淋巴细胞，然后用白介素2刺激细胞使之增殖。本治疗法有使癌肿缩小或是消失的报道。但是其中的一部分细胞的活性没有被充分的发挥和利用。
TIL细胞疗法是用癌肿内或癌肿周围的淋巴细胞，用和LAK细胞同样的方法，将淋巴细胞和白介素2一起培养之后投入人体。和CAT细胞疗法相比，TIL细胞疗法对癌细胞的认识能力较强。
CTL细胞疗法和CAT细胞疗法相似，也是用少量的末梢淋巴细胞，通过固化的抗CD3抗体激活淋巴细胞，然后用白介素2刺激细胞使之增殖。但同时加入一些肿瘤特异性抗原，反复地刺激淋巴细胞使之对肿瘤细胞具有特异性的认识能力。对癌细胞的杀伤能力要大于LAK细胞疗法和CAT细胞疗法。
以上这些疗法都是着眼于如何提高T细胞的活性，而忽视了淋巴细胞中占有相当比例的NK细胞的利用价值。
NK细胞约占外周血淋巴细胞总数的5-7％。在人体中，T细胞的抗肿瘤作用和NK细胞的抗肿瘤作用有互补作用。T细胞对肿瘤细胞的伤害作用依赖于class I抗原的提示，而NK细胞能够作用于有可能因为class I抗原减少而不能被识别的肿瘤细胞。NK细胞对癌细胞的转移有着重要的作用，特别是转移性癌的初期阶段尤为重要。
IL-12是一种糖蛋白，分子量为75kd。是由B细胞以及单球系细胞产生的，其特征是对NK细胞有明显的活性化作用，能够强力的促进NK细胞的增殖和杀伤作用，是一种NK细胞刺激因子。同时，IL-12还能够促进T细胞的增殖和杀伤作用，显著增强LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL的应答能力。IL-12具有诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，增加NK细胞表达各种细胞因子受体和粘附分子的能力，又可以启动Th0细胞向Th1细胞的发育，抑制IL-4介导IgE的合成、协同SCF诱导骨髓细胞的生成，IL-12在先天性和获得性抗肿瘤免疫中均发挥重要作用，具有良好的抗癌应用价值。
IL-12直接投入体内，会产生严重的副作用。无法起到杀伤癌细胞的效果。而用IL-12激活NK细胞则可以达到治疗癌症的目的。
发明内容
要解决的问题同时提高T细胞和NK细胞的数量和对癌细胞的杀伤活性。在对癌肿起治疗作用的同时，也可有效的防止癌细胞在体内的扩散和转移。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-12存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-2和IL-12存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种淋巴细胞的培养方法，在优选的技术方案中涉及将淋巴细胞在IL-12以及IL-2存在的条件下的培养方法。
本技术提供了一种细胞免疫制剂，在优选的技术方案中涉及用上述的淋巴细胞、或以上述的淋巴细胞为主体，或是做为治疗手段的一部分的、用于癌症或是感染症等治疗用的免疫治疗制剂。
实验方法本技术所用的淋巴细胞，不仅仅限于末梢血淋巴细胞，也可用于上皮性淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、恶性腹水内淋巴细胞、恶性胸水内淋巴细胞等等存在于人体中的所有种类的淋巴细胞。并没有特别的限制，但是末梢血淋巴细胞由于容易取得且分离方便，所以比较常用。细胞的数目以1×106～5×107个为宜。
将上述的细胞，在抗CD3抗体的存在的环境下培养。CD3存在于T细胞的表面，通过CD3分子的介导，将刺激情报传送到细胞内部，而激活细胞使细胞开始增值。CD3是抗原认识的重要的细胞表面分子。而CD3分子介导的细胞刺激，则是由抗CD3抗体实现的。
抗CD3抗体可以由自由态的形式，也可以将其固化。后者的效果更好。抗CD3抗体的固化可以用灭菌的生理盐水或是磷酸缓冲液溶解，浓度为0.1～100μg/ml。固化载体以塑料、玻璃等素材为好，通常的培养瓶即可。固化方法是将上述抗CD3抗体溶液加入同化容器中，4～37℃静置2～24小时。固化后的容器置于4-30℃保存。使用时在常温用生理盐水洗净。
本技术使用IL-12作为刺激因子。IL-12用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度为1～2000国际单位/ml。
本技术使用IL-2作为共同刺激因子。IL-2用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度为1～2000国际单位/ml。
淋巴细胞的培养液没有特别的要求，只要是适用于淋巴细胞生长的培养液均可。比如RPMI-164O、AIM-V、DMEM、IMDM等。根据需要可以加入牛胎儿血清，牛血清蛋白或是人的血清。将淋巴细胞悬浮于含有IL-2和IL-12的培养液中，加到用抗CD3抗体固化过的容器中。
培养方法按照通常的细胞培养方法进行。一般要求在CO2培养箱中进行，CO2浓度为1-10％。温度为30-40℃，培养时间2-20天。培养期间应观察细胞的生长情况，以及计数细胞的数量。一般在培养数天后，培养液会变成黄色。此时应加入一定量新的培养液，同时补充一定量的IL-2和IL-12溶液。
在抗CD3抗体存在的条件下，长期培养不利于淋巴细胞的大量增殖，因此在淋巴细胞增值到一定程度时，应将细胞移到没有抗CD3抗体存在的环境下培养。通常是在培养后的第3-7天，将培养细胞移入气体通透性培养袋中培养。
在此阶段，细胞的增殖需要不断地添加新鲜的培养液，以及新鲜的IL-2和IL-12溶液。细胞浓度为1×105～1×108/ml。
本技术，主要是诱导NK细胞增值，提高NK细胞的杀伤细胞的溶解活性，以及诱导NK细胞的IFN-γ和相关细胞素的分泌能力。后者能进一步激活细胞介导的免疫反应。可以提高非特异性淋巴细胞的反应能力，提高对癌细胞的非特异性杀伤能力，既可杀伤癌细胞，又有较强的防止癌细胞转移的能力。
本技术，还可以诱导T淋巴细胞增值，提高特异性淋巴细胞反应和高度特异性CTL反应。
本技术，还可以诱导CD4+T细胞、CD8+T细胞的增殖。
本技术还可以通过增加NK细胞表达各种细胞因子受体和粘附分子的能力，提高对肿瘤的杀伤能力。
作为一种治疗剂，细胞的数量为1×105～1×1012个。为证明本发明技术方案的有效性，可按照下列方法进行试验本技术的最佳实施方案本技术是应用人的淋巴细胞。实验所用的淋巴细胞，可以是末梢血淋巴细胞，也可用是上皮性淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、恶性腹水内淋巴细胞、恶性胸水内淋巴细胞等等存在于人体中的所有种类的淋巴细胞。由于末梢血淋巴细胞容易取得且分离方便，所以常用末梢血淋巴细胞。细胞的数目以1×106～50×106个为宜。
抗CD3抗体的固化可以用灭菌的生理盐水或是磷酸缓冲液溶解，浓度为0.1～100μg/ml，以1～10μg/ml为宜。固化载体以塑料、玻璃等素材为宜，通常的培养瓶即可。固化方法是将上述抗CD3抗体溶液加入固化容器中，4～37℃静置2～24小时。固化后的容器置于4℃冰箱保存。使用时在常温用生理盐水洗净。
本技术使用IL-12作为刺激因子。IL-12用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度以1～2000国际单位/ml为宜。
本技术使用IL-2作为共同刺激因子。IL-2用生理盐水、磷酸缓冲液，或是培养液溶解，浓度以1～2000国际单位/ml，以10～2000国际单位/ml为宜。
淋巴细胞的培养液要适用于淋巴细胞生长的培养液。比如RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM等。根据需要可以加入牛胎儿血清，牛血清蛋白或是人的血清。将淋巴细胞悬浮于含有IL-2和IL-12的培养液中，加到用抗CD3抗体固化的容器中。
培养方法按照通常的细胞培养方法进行。一般要求在CO2培养箱中进行，CO2浓度为1-10％，以5％为宜。温度为30-40℃，以37℃为宜。培养时间2-21天，以7-14天为宜。培养期间应观察细胞的生长情况，以及计数细胞的数量。一般在培养时间，通常为3天后，培养液会变成黄色。此时应加入一定量新的培养液，同时补充一定量的IL-2和IL-12溶液，以等浓度为宜。
在CD3抗体存在的条件下，长期培养不利于淋巴细胞的大量增殖，因此在淋巴细胞增值到一定程度时，应将细胞移到没有抗CD3抗体存在的环境下培养。通常是在培养后的第3-7天，将培养细胞移入气体通透性培养袋中培养，以5-7天为宜。
在此阶段，细胞的增殖需要不断地添加新鲜的培养液，以及新鲜的IL-2和IL-12溶液。细胞浓度为1×105～100×105个/ml，以5×105～10×105个/ml为宜。
培养结束后，将细胞离心回收，细胞洗净后用生理盐水悬浮，备用。
作为一种治疗剂，细胞的数量为1×105～1×1012，以1×107～1×1011个为宜。
有益效果本技术可以提供一个对癌细胞具有较高活性、较大数量的淋巴细胞。是通过T细胞和NK细胞共同作用而实验的。既可以用于治疗癌症，更可以防止癌细胞的扩散。
权利要求
1.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体存在的条件下的培养方法。
2.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-12存在的条件下的培养方法。
3.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在抗CD3抗体以及IL-2和IL-12存在的条件下的培养方法。
4.一种淋巴细胞的培养方法，涉及将淋巴细胞在IL-12以及IL-2存在的条件下的培养方法。
5.细胞免疫制剂，由权利要求1、权利要求2、权利要求3、权利要求4或、权利要求5所述的淋巴细胞培养方法所制备的细胞为主体、或是为治疗手段的一部分的治疗用制剂。
全文摘要
一种淋巴细胞的激活增殖方法以及由此方法而等到的细胞免疫治疗剂。是用IL－2和IL－12刺激淋巴细胞，特别是激活NK细胞和T细胞，促进非特异性NK细胞以及特异性CTL的应答能力，增强其杀伤活性。本技术提供一种淋巴细胞的制备方法，以及由这种方法制备的、用于癌症或是各种感染症的治疗的一种免疫治疗剂。
文档编号A61K35/26GK1724655SQ20041007073
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月23日 优先权日2004年7月23日
发明者宋清华 申请人:宋清华
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