具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物及其制备方法和含它们的制剂的制作方法
专利名称：具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物及其制备方法和含它们的制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然产物及其半合成，具体地说，是具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物及其制备方法，和含有它们的药物制剂，以及该药物制剂在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血药物中的应用。
背景技术：
近20年来，随着天然药物化学和药理学研究的不断深入及分析手段突飞猛进的发展，多糖的研究引起了国内外学者极大的兴趣。药理实验表明，银耳多糖具有增强免疫功能、抗放射和促进骨髓造血机能、升高白细胞、抗肿瘤、降低胆固醇等广泛的生物活性。
多糖由单糖聚合而成，是聚合度超过10的极性大分子。由于多糖组分中单糖的种类繁多，连接形式千差万别，多糖的结构极其复杂，由此决定了多糖生物学活性的多样性。目前，虽尚未完全搞清中药多糖的构-效关系，但可以认为其活性与分子结构、溶解度、粘度、分子量等密切相关。许多报导表明，多糖分子中取代基对多糖活性影响很大。在牛膝多糖分子中引入一定量的硫酸基团，其生物活性大大提高，并且具有抗病毒的作用。大量研究证明，香菇多糖能增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力，提高机体抗肿瘤功能，而将其硫酸酯化后，其生物活性发生变化，具有抑制爱滋病病毒的作用。
目前，已报道许多经硫酸酯化的多糖如地衣多糖、右旋糖酐、裂褶菌多糖、海藻多糖、木聚糖具有明显的抑制HIV活性。在这些多糖中SO42-是抗HIV-1所必需的，而且SO42-的含量不足(每个糖单位只有一个SO42-如硫酸软骨素和N-脱硫肝素)也无活性。但对于银耳多糖硫酸酯化的研究还未见报导。
发明内容
本发明的目的在于，提供了具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物，简称STF。
本发明的另一个目的是提供了均一体银耳多糖修饰物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供了均一体银耳多糖修饰物的药物制剂。
本发明的还一个目的在于，提供了以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的药物制剂，在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血等药物中的应用。
本发明从银耳孢子发酵物中，经水煮醇沉、除蛋白后，用Sephadex凝胶柱层析分离、纯化，得到均一体银耳多糖TF。进一步对TF进行结构修饰，用氯磺酸进行酯化，制备出不同硫含量的银耳多糖硫酸酯(STF)。本发明的内容目前尚无文献报道，为一类新的化合物。
本发明的均一体银耳多糖修饰物由下述方法获得将银耳孢子发酵物经水煮醇沉、除蛋白后，用Sephadex凝胶柱层析分离、纯化，得到银耳多糖TF，用酯化试剂进行酯化，制备出如下的银耳多糖修饰物(化合物I)。
其中，R1＝H or SO3Na、R2＝H or SO3Na；R＝H or SO3Na；n＞10；R、R1、R2不同时＝H。
所述均一体银耳多糖修饰物的制备方法，包括
(1)将银耳孢子发酵粉加水煮提，冷却、离心，上清液浓缩后加乙醇沉淀，过滤取沉淀，真空干燥得粗多糖；取粗多糖加水煮提，冷却、离心，上清液用sevage法除蛋白，用乙醇沉淀，过滤取沉淀，真空干燥，得精制多糖；取精制多糖用Sephadex凝胶柱层析分离、纯化，得到均一体银耳多糖TF。
(2)取均一体多糖TF，加入无水甲酰胺，在30-80℃加入酯化试剂，搅拌、室温放置一天，然后用NaOH中和到PH为6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析，乙醇析出沉淀，制得STF。
或为 R1、R2、R限定范围如前所述；n＞10；所述的酯化试剂为吡啶与氯磺酸的混合物，一般的体积比为0.1∶1-30V/V，较好为0.1∶1-25V/V，最佳为1∶1-10V/V。
所述的酯化试剂的制备如下
酯化试剂将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入吡啶，充分搅拌使之冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸约30-40分钟滴加完毕，然后再室温搅拌30分钟，加热到50℃，再继续搅拌30分钟。
本发明所述的以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的制剂，是指制剂含有治疗有效量的银耳多糖修饰物，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。
其中，所述的均一体银耳多糖修饰物的治疗有效量一般为0.1～500mg；较好为1～200mg；最佳5～100mg。
所述的制剂包括口服制剂、液体制剂或外用制剂。其中，口服制剂为片剂、胶囊、缓释片、滴丸、颗粒剂或口服液；液体制剂为冻干粉针、注射液、大、小输液或静脉滴注液等注射给药制剂；外用制剂为霜剂或膏剂。
所述的大、小输液是指均一体银耳多糖修饰物的氯化钠或葡萄糖注射剂。
所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，抗氧剂(如焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠)，防腐剂(苯甲醇)；稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。
上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与均一体银耳多糖修饰物混合，当银耳多糖修饰物的用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。
各种药物制剂的制备具体操作如下(1)、按配置总量计称取含10-70％银耳多糖修饰物，加入30-90％的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等，充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时压制成片，使每片含银耳多糖修饰物40-240mg；或将制成的湿颗粒直接在60-70℃干燥2-4小时，然后充填入空胶壳中，使每粒胶囊含银耳多糖修饰物30-280mg。
(2)、注射液和大、小输液的制备是取0.01-70％的银耳多糖修饰物与蒸馏水配液，或加入稳定剂，经G4漏斗过滤后，分装灭菌，制得。
所述的冻干剂是由0.08-50％银耳多糖修饰物与药用辅料(乳糖、甘露醇、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖的一种或几种的组合)混合，较好的药用辅料是甘露醇，分装灭菌，制得。
(3)、按配置总量计称取含10％-60％均一体银耳多糖修饰物，加入40％-90％的填充剂、崩解剂、矫味剂等，充分搅拌混合用12-14目筛制成颗粒。在60-70℃干燥2-4小时，使每克颗粒剂含银耳多糖修饰物100-400mg。
(4)、按配置总量计称取含10％-60％银耳多糖修饰物，加入40％-90％的填充剂、抗氧剂等，加热熔融温度(40-90℃)，使原料和辅料充分混溶，滴制成丸，使每粒滴丸含银耳多糖修饰物4-30mg。
本发明的施药量可根据用药途径、给药方式、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等诸多因素加以调整，日剂量一般为0.1～300mg/kg；较好为0.1～100mg/kg；最佳0.1～60mg/kg。
本发明的均一体多糖修饰物具有如下的理化特性1、Sephades G-200层析柱(2.5×33cm)。取样品STF，15g溶于最小体积的0.9％Nacl中，加入柱顶。用0.9％Nacl洗脱，流速1.5ml/小时，1ml/管分部收集，测定各管含糖量。结果发现STF为单一洗脱峰。
通过对TF经过硫酸酯化的结构修饰，得到两个硫酸酯化多糖STF-I吡啶∶氯磺酸(1∶1)和STF-II(吡啶∶氯磺酸1∶3)测定其分子量，经过元素分析，测定了其C、H、S的含量。
本发明进一步公开了以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的药物制剂，在用于制备治疗增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血等药物中的应用。
下述的药理实验进一步说明了均一体银耳多糖修饰物的药理活性，及其治疗作用。
一抑制牛免疫缺陷病毒(BIV)实验材料和方法1.材料细胞及病毒胎牛肺细胞(Fetal Bovine Lung，FBL)，牛免疫缺陷病毒R29毒株(Bovine Immunodeficiency Virus R29 strain，BIVR29)试剂与药品DMEM培养基、青霉素/链霉素(P/S)、Trypsin、Tris、EDTA、胎牛血清(美国GIBCO/BRL公司)。AZT购自Sigma公司。(1)阳性对照药物AZT溶于二甲基亚砜(DMSO)中，用PBS稀释到浓度0.1mM(0.026mg/ml)，过滤除菌，储于-20℃。(2)银耳多糖硫酸酯用PBS稀释到0.1mg/ml、0.15mg/ml0.2mg/ml三个浓度，过滤除菌，储于-20℃。
2.方法细胞培养以DEME培养基(1％P/S，10％胎牛血清)在37℃，5％CO2培养箱中培养FBL细胞，细胞传代所用消化液含0.02％EIDTA 0.25％胰酶。
病毒培养将BIV(R29)感染的FBL细胞(BIV-R29/FBL)与正常的FBL细胞1∶1混合培养，使BIV大量扩增。
药物对细胞毒实验(FBL)以40000/孔的密度将FBL细胞铺于24孔板，24小时后细胞密度增至50000/孔，加入0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml的药物，以正常细胞为阴性对照，AZT为阳性对照。正常细胞长满之后(约72小时)，计数每孔细胞数，确定药物50％致死浓度(IC50)药物对BIV感染引起合胞体形成抑制实验以40000/孔的密度将FBL细胞铺于24孔板，24小时后以2000/孔的密度加入BIV-R29/FBL(MOI＝1∶25)，同时加入待测药物(浓度<IC50>，以AZT为阳性对照，等体积PBS为阴性对照，72小时后计数合胞体形成数量。
银耳多糖硫酸酯STF-I对胎牛肺细胞的细胞毒实验
细胞毒结果银耳多糖硫酸酯STF-I，IC50＞0.2mg/mlSTF-I对BIV感染引起的合胞体形成的抑制作用
合胞体数与对照孔相近++++合胞体数比对照孔少75％+++合胞体数比对照孔少50％++合胞体数比对照孔少25％+基本无合胞体出现二.抗肿瘤实验材料与方法1材料动物选择放射所自繁殖IRM-2纯系小鼠，雌雄兼用。
瘤种放射所动物室从IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤(病理结论)传代培养。
药物配制STF-I设三个剂量组6mg/kg，12mg/kg，24mg/kg，溶剂为蒸馏水。
2方法接种选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的IRM-2小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，新洁尔灭消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内剥肿瘤，切开肿瘤成直径2mm左右的小块，在动物左侧腹股沟处皮下接种。
分组给药接种后次日将动物随机分组，设对照组及高、中、低四个组，每天给药一次，腹腔注射，每次0.5ml，对照组给予蒸馏水0.5ml，连续给药10天。
疗效评价停药后24小时后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。
肿瘤抑制率C-T/C×100％式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
银耳多糖硫酸酯STF-I抑制淋巴瘤试验
结果STF-I在浓度24mg/kg时，抑瘤率59.8％(P＜0.01)，但毒性较大，低剂量时抑瘤作用不明显。
三抗放射、升高白细胞试验。
1.实验材料1.1动物纯种C57小鼠，体重22-24g.
1.1实验方法1.2.1分组与给药动物随机分为五组(15只/组，雌雄各半)对照组、药物(STF-II)6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四个剂量组。照射前第3、2、1天连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。
1.1.2致伤条件137Cs-γ射线一次全身照射，剂量分别为7.5Gy，剂量率为89.1404伦/分。
观察指标(1)白细胞数照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，眼眶取血，白细胞稀释液稀释，电子显微镜下记数细胞数。
(2)DNA含量，照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，取一侧股骨，生理盐水冲洗骨髓。加入反应液，紫外分光光度计上测定吸光度。
(3)CFU-S(Colong forming unit of spleen)将脾脏放入Bouin氏液内，24小时后，肉眼记数突出脾脏表面的结节数(CFU-S)实验结果银耳多糖硫酸酯STF-II对辐射损伤小鼠升高白细胞实验
经统计学处理，60mg/Kg组，DNA(OD/根)，WBC×109/L，CFU-S各项指标，与对照组相比差异显著。
四、增强免疫力实验1.实验材料1.1动物纯种C57小鼠，体重22-24g.
1.2实验方法
1.2.1分组与给药动物随机分为五组(15只/组，雌雄各半)对照组、药物6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四个剂量组。照射前第3、2、1天连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。
1.2.2致伤条件137Cs-γ射线一次全身照射，剂量分别为7.5Gy，剂量率为89.1404伦/分。
观察指标(1)脾指数取出脾脏，称重，计算脾指数(2)胸腺指数取出胸腺，称重，计算脾指数银耳多糖硫酸酯STF-II对辐射损伤小鼠提高免疫力实验
经统计学处理，60mg/Kg组，脾指数，胸腺指数两项指标与对照组相比有显著性差异。
五、抗凝血作用1.实验材料1.1动物纯种C57小鼠，体重22-24g.
1.2实验方法1.2.1分组与给药动物随机分为3组(10只/组，雌雄各半)对照组、药物6mg/kg、15mg/kg两个剂量组。尾静脉注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，10分钟后按全血毛细玻管法测定凝血时间，结果见表。
银耳多糖硫酸酯STF-II对小鼠凝血时间的影响
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不作为对本发明的限制。
实施例1银耳多糖修饰物STF-I、STF-II的合成酯化试剂的配制酯化试剂(1)将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入1mL吡啶，充分搅拌使之冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸1mL约30-40分钟滴加完毕，此时烧瓶中出现大量淡黄色固体，然后再室温搅拌30分钟，加热到50℃，再搅拌到固体溶解。
酯化试剂(2)将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入1ml吡啶，充分搅拌，使之冷却。用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸3ml，约30-40分钟滴加完毕，并于室温搅拌30分钟。
多糖的酯化<1>取503mg多糖TF，加6ml无水甲酰胺搅拌，恒温在50℃加酯化试剂(1)，搅拌半小时，反应结束后，室温放置一天，然后加10ml水，用2.5M的NaOH中和到PH为6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析3天。取透析袋内溶液，减压，回收溶液至少量，加三倍体积的乙醇，析出沉淀。抽滤取沉淀，沉淀用乙醚洗，置真空干燥器中，最后得产品为804mg，命名为STF-I，硫含量为11.28％。
<2>将201mg多糖TF，悬浮于4ml无水甲酰胺中，搅拌30分钟，然后逐渐加入酯化试剂(2)于45℃搅拌4小时，反应结束后，室温放置一天，然后加4ml水，用2.5M的NaOH中和到PH为6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析3天。取透析袋内溶液，减压，回收溶液至少量，加三倍体积的乙醇，析出沉淀。抽滤取沉淀，沉淀用乙醚洗，置真空干燥器中，得产品260mg，定名为STF-II，硫含量为11.77％。
实施例2在无菌条件下取银耳多糖修饰物STF-I18g，置于容器中，加注射用水1000ml，加碳酸钠1.8g调节PH至5.5-7.5，加入甘露醇50g、乳糖20g，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，加入1.5g活性碳，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只0.6ml进行分装，采用冷冻干燥法，制得黄色疏松块状物，封口即得。
实施例3无菌条件下取银耳多糖修饰物STF-I100g，加入到注射用水24000ml中，加入60g硫代硫酸钠搅拌30分钟，加入30g活性炭，搅拌吸附30分钟，除炭、精滤、灌封、灭菌，即得注射液。
或无菌条件下取银耳多糖修饰物STF-I100g，加入注射用水24000ml中，经G4漏斗过滤后，分装灭菌，制得注射液。
实施例4银耳多糖修饰物STF-I1000g，药用淀粉600g，糊精600g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时，制成1000片，使每片含均一体银耳多糖修饰物0.3g。
实施例5银耳多糖修饰物STF-II1000g，药用淀粉1000g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装1#胶囊，每粒0.2g在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚的了解，在不脱离下述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案保护范围内。且本发明亦不受说明书中所举实施例的实施方式的限制。
权利要求
1.具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物，由下述方法获得将银耳孢子发酵物经水煮、醇沉、除蛋白，用凝胶柱层析分离、纯化，得到银耳多糖TF，用酯化试剂进行酯化，制备出如下的银耳多糖修饰物； 其中，R1＝H or SO3Na、R2＝H or SO3Na；R＝H or SO3Na；n＞10；R、R1、R2不同时＝H。
2.权利要求1所述均一体银耳多糖修饰物的制备方法，包括(1)将银耳孢子发酵物水煮提、冷却、离心，上清液浓缩后加乙醇沉淀，过滤取沉淀，真空干燥得粗多糖；再加水煮提，冷却、离心，上清液用sevage法除蛋白，用乙醇沉淀；过滤取沉淀，真空干燥，得精制多糖后凝胶柱层析分离、纯化，得到均一体银耳多糖TF；(2)取银耳多糖TF，加入无水甲酰胺，在30-80℃加入酯化试剂，搅拌，室温放置，用NaOH中和至PH6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析，乙醇析出沉淀，制得STF。
3.如权利要求2所述的均一体银耳多糖修饰物的制备方法，其特征在于，所述的酯化试剂为吡啶∶氯磺酸0.1∶1-30V/V。
4.一种以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的制剂，该制剂含有治疗有效量的银耳多糖修饰物，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述的制剂，其中，均一体银耳多糖的治疗有效量为0.1-500mg。
6.如权利要求4所述的制剂，其中，均一体银耳多糖的治疗有效量为1-200mg。
7.如权利要求4-6所述的制剂，其中，该制剂包括口服制剂、液体制剂或外用制剂。
8.如权利要求7所述的制剂，其中，口服制剂为片剂、胶囊、缓释片、滴丸、颗粒剂或口服液；液体制剂为冻干粉针、注射液、大、小输液或静脉滴注液等注射给药制剂；外用制剂为霜剂或膏剂。
9.均一体银耳多糖修饰物在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物，及其制备方法和含它们的制剂。银耳多糖修饰物的制备方法取均一体多糖TF，加入无水甲酰胺，在30－80℃加入酯化试剂，搅拌，室温放置一天，然后用NaOH中和到PH为6－7，过滤，滤液用蒸馏水透析，乙醇析出沉淀，得化合物STF。本发明的均一体银耳多糖修饰物具有一定的抑制牛免疫缺陷病毒感染引起的合胞体形成的作用；对IRM－2小鼠的淋巴瘤有较好的抑制作用，还具有升高白细胞、抗凝血、提高免疫力等作用。因此，均一体银耳多糖修饰物作为一个多功能的药物，具有抗肿瘤、抗病毒，抗凝血等作用。
文档编号A61K31/715GK1778823SQ20041007286
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者徐文清, 李美佳, 刘培勋, 周则卫, 沈秀, 王月英 申请人:中国医学科学院放射医学研究所
技术领域：
本发明涉及天然产物及其半合成，具体地说，是具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物及其制备方法，和含有它们的药物制剂，以及该药物制剂在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血药物中的应用。
背景技术：
近20年来，随着天然药物化学和药理学研究的不断深入及分析手段突飞猛进的发展，多糖的研究引起了国内外学者极大的兴趣。药理实验表明，银耳多糖具有增强免疫功能、抗放射和促进骨髓造血机能、升高白细胞、抗肿瘤、降低胆固醇等广泛的生物活性。
多糖由单糖聚合而成，是聚合度超过10的极性大分子。由于多糖组分中单糖的种类繁多，连接形式千差万别，多糖的结构极其复杂，由此决定了多糖生物学活性的多样性。目前，虽尚未完全搞清中药多糖的构-效关系，但可以认为其活性与分子结构、溶解度、粘度、分子量等密切相关。许多报导表明，多糖分子中取代基对多糖活性影响很大。在牛膝多糖分子中引入一定量的硫酸基团，其生物活性大大提高，并且具有抗病毒的作用。大量研究证明，香菇多糖能增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力，提高机体抗肿瘤功能，而将其硫酸酯化后，其生物活性发生变化，具有抑制爱滋病病毒的作用。
目前，已报道许多经硫酸酯化的多糖如地衣多糖、右旋糖酐、裂褶菌多糖、海藻多糖、木聚糖具有明显的抑制HIV活性。在这些多糖中SO42-是抗HIV-1所必需的，而且SO42-的含量不足(每个糖单位只有一个SO42-如硫酸软骨素和N-脱硫肝素)也无活性。但对于银耳多糖硫酸酯化的研究还未见报导。
发明内容
本发明的目的在于，提供了具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物，简称STF。
本发明的另一个目的是提供了均一体银耳多糖修饰物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供了均一体银耳多糖修饰物的药物制剂。
本发明的还一个目的在于，提供了以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的药物制剂，在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血等药物中的应用。
本发明从银耳孢子发酵物中，经水煮醇沉、除蛋白后，用Sephadex凝胶柱层析分离、纯化，得到均一体银耳多糖TF。进一步对TF进行结构修饰，用氯磺酸进行酯化，制备出不同硫含量的银耳多糖硫酸酯(STF)。本发明的内容目前尚无文献报道，为一类新的化合物。
本发明的均一体银耳多糖修饰物由下述方法获得将银耳孢子发酵物经水煮醇沉、除蛋白后，用Sephadex凝胶柱层析分离、纯化，得到银耳多糖TF，用酯化试剂进行酯化，制备出如下的银耳多糖修饰物(化合物I)。
其中，R1＝H or SO3Na、R2＝H or SO3Na；R＝H or SO3Na；n＞10；R、R1、R2不同时＝H。
所述均一体银耳多糖修饰物的制备方法，包括
(1)将银耳孢子发酵粉加水煮提，冷却、离心，上清液浓缩后加乙醇沉淀，过滤取沉淀，真空干燥得粗多糖；取粗多糖加水煮提，冷却、离心，上清液用sevage法除蛋白，用乙醇沉淀，过滤取沉淀，真空干燥，得精制多糖；取精制多糖用Sephadex凝胶柱层析分离、纯化，得到均一体银耳多糖TF。
(2)取均一体多糖TF，加入无水甲酰胺，在30-80℃加入酯化试剂，搅拌、室温放置一天，然后用NaOH中和到PH为6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析，乙醇析出沉淀，制得STF。
或为 R1、R2、R限定范围如前所述；n＞10；所述的酯化试剂为吡啶与氯磺酸的混合物，一般的体积比为0.1∶1-30V/V，较好为0.1∶1-25V/V，最佳为1∶1-10V/V。
所述的酯化试剂的制备如下
酯化试剂将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入吡啶，充分搅拌使之冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸约30-40分钟滴加完毕，然后再室温搅拌30分钟，加热到50℃，再继续搅拌30分钟。
本发明所述的以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的制剂，是指制剂含有治疗有效量的银耳多糖修饰物，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。
其中，所述的均一体银耳多糖修饰物的治疗有效量一般为0.1～500mg；较好为1～200mg；最佳5～100mg。
所述的制剂包括口服制剂、液体制剂或外用制剂。其中，口服制剂为片剂、胶囊、缓释片、滴丸、颗粒剂或口服液；液体制剂为冻干粉针、注射液、大、小输液或静脉滴注液等注射给药制剂；外用制剂为霜剂或膏剂。
所述的大、小输液是指均一体银耳多糖修饰物的氯化钠或葡萄糖注射剂。
所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，抗氧剂(如焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠)，防腐剂(苯甲醇)；稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。
上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与均一体银耳多糖修饰物混合，当银耳多糖修饰物的用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。
各种药物制剂的制备具体操作如下(1)、按配置总量计称取含10-70％银耳多糖修饰物，加入30-90％的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等，充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时压制成片，使每片含银耳多糖修饰物40-240mg；或将制成的湿颗粒直接在60-70℃干燥2-4小时，然后充填入空胶壳中，使每粒胶囊含银耳多糖修饰物30-280mg。
(2)、注射液和大、小输液的制备是取0.01-70％的银耳多糖修饰物与蒸馏水配液，或加入稳定剂，经G4漏斗过滤后，分装灭菌，制得。
所述的冻干剂是由0.08-50％银耳多糖修饰物与药用辅料(乳糖、甘露醇、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖的一种或几种的组合)混合，较好的药用辅料是甘露醇，分装灭菌，制得。
(3)、按配置总量计称取含10％-60％均一体银耳多糖修饰物，加入40％-90％的填充剂、崩解剂、矫味剂等，充分搅拌混合用12-14目筛制成颗粒。在60-70℃干燥2-4小时，使每克颗粒剂含银耳多糖修饰物100-400mg。
(4)、按配置总量计称取含10％-60％银耳多糖修饰物，加入40％-90％的填充剂、抗氧剂等，加热熔融温度(40-90℃)，使原料和辅料充分混溶，滴制成丸，使每粒滴丸含银耳多糖修饰物4-30mg。
本发明的施药量可根据用药途径、给药方式、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等诸多因素加以调整，日剂量一般为0.1～300mg/kg；较好为0.1～100mg/kg；最佳0.1～60mg/kg。
本发明的均一体多糖修饰物具有如下的理化特性1、Sephades G-200层析柱(2.5×33cm)。取样品STF，15g溶于最小体积的0.9％Nacl中，加入柱顶。用0.9％Nacl洗脱，流速1.5ml/小时，1ml/管分部收集，测定各管含糖量。结果发现STF为单一洗脱峰。
通过对TF经过硫酸酯化的结构修饰，得到两个硫酸酯化多糖STF-I吡啶∶氯磺酸(1∶1)和STF-II(吡啶∶氯磺酸1∶3)测定其分子量，经过元素分析，测定了其C、H、S的含量。
本发明进一步公开了以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的药物制剂，在用于制备治疗增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血等药物中的应用。
下述的药理实验进一步说明了均一体银耳多糖修饰物的药理活性，及其治疗作用。
一抑制牛免疫缺陷病毒(BIV)实验材料和方法1.材料细胞及病毒胎牛肺细胞(Fetal Bovine Lung，FBL)，牛免疫缺陷病毒R29毒株(Bovine Immunodeficiency Virus R29 strain，BIVR29)试剂与药品DMEM培养基、青霉素/链霉素(P/S)、Trypsin、Tris、EDTA、胎牛血清(美国GIBCO/BRL公司)。AZT购自Sigma公司。(1)阳性对照药物AZT溶于二甲基亚砜(DMSO)中，用PBS稀释到浓度0.1mM(0.026mg/ml)，过滤除菌，储于-20℃。(2)银耳多糖硫酸酯用PBS稀释到0.1mg/ml、0.15mg/ml0.2mg/ml三个浓度，过滤除菌，储于-20℃。
2.方法细胞培养以DEME培养基(1％P/S，10％胎牛血清)在37℃，5％CO2培养箱中培养FBL细胞，细胞传代所用消化液含0.02％EIDTA 0.25％胰酶。
病毒培养将BIV(R29)感染的FBL细胞(BIV-R29/FBL)与正常的FBL细胞1∶1混合培养，使BIV大量扩增。
药物对细胞毒实验(FBL)以40000/孔的密度将FBL细胞铺于24孔板，24小时后细胞密度增至50000/孔，加入0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml的药物，以正常细胞为阴性对照，AZT为阳性对照。正常细胞长满之后(约72小时)，计数每孔细胞数，确定药物50％致死浓度(IC50)药物对BIV感染引起合胞体形成抑制实验以40000/孔的密度将FBL细胞铺于24孔板，24小时后以2000/孔的密度加入BIV-R29/FBL(MOI＝1∶25)，同时加入待测药物(浓度<IC50>，以AZT为阳性对照，等体积PBS为阴性对照，72小时后计数合胞体形成数量。
银耳多糖硫酸酯STF-I对胎牛肺细胞的细胞毒实验
细胞毒结果银耳多糖硫酸酯STF-I，IC50＞0.2mg/mlSTF-I对BIV感染引起的合胞体形成的抑制作用
合胞体数与对照孔相近++++合胞体数比对照孔少75％+++合胞体数比对照孔少50％++合胞体数比对照孔少25％+基本无合胞体出现二.抗肿瘤实验材料与方法1材料动物选择放射所自繁殖IRM-2纯系小鼠，雌雄兼用。
瘤种放射所动物室从IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤(病理结论)传代培养。
药物配制STF-I设三个剂量组6mg/kg，12mg/kg，24mg/kg，溶剂为蒸馏水。
2方法接种选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的IRM-2小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，新洁尔灭消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内剥肿瘤，切开肿瘤成直径2mm左右的小块，在动物左侧腹股沟处皮下接种。
分组给药接种后次日将动物随机分组，设对照组及高、中、低四个组，每天给药一次，腹腔注射，每次0.5ml，对照组给予蒸馏水0.5ml，连续给药10天。
疗效评价停药后24小时后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。
肿瘤抑制率C-T/C×100％式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
银耳多糖硫酸酯STF-I抑制淋巴瘤试验
结果STF-I在浓度24mg/kg时，抑瘤率59.8％(P＜0.01)，但毒性较大，低剂量时抑瘤作用不明显。
三抗放射、升高白细胞试验。
1.实验材料1.1动物纯种C57小鼠，体重22-24g.
1.1实验方法1.2.1分组与给药动物随机分为五组(15只/组，雌雄各半)对照组、药物(STF-II)6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四个剂量组。照射前第3、2、1天连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。
1.1.2致伤条件137Cs-γ射线一次全身照射，剂量分别为7.5Gy，剂量率为89.1404伦/分。
观察指标(1)白细胞数照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，眼眶取血，白细胞稀释液稀释，电子显微镜下记数细胞数。
(2)DNA含量，照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，取一侧股骨，生理盐水冲洗骨髓。加入反应液，紫外分光光度计上测定吸光度。
(3)CFU-S(Colong forming unit of spleen)将脾脏放入Bouin氏液内，24小时后，肉眼记数突出脾脏表面的结节数(CFU-S)实验结果银耳多糖硫酸酯STF-II对辐射损伤小鼠升高白细胞实验
经统计学处理，60mg/Kg组，DNA(OD/根)，WBC×109/L，CFU-S各项指标，与对照组相比差异显著。
四、增强免疫力实验1.实验材料1.1动物纯种C57小鼠，体重22-24g.
1.2实验方法
1.2.1分组与给药动物随机分为五组(15只/组，雌雄各半)对照组、药物6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四个剂量组。照射前第3、2、1天连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。
1.2.2致伤条件137Cs-γ射线一次全身照射，剂量分别为7.5Gy，剂量率为89.1404伦/分。
观察指标(1)脾指数取出脾脏，称重，计算脾指数(2)胸腺指数取出胸腺，称重，计算脾指数银耳多糖硫酸酯STF-II对辐射损伤小鼠提高免疫力实验
经统计学处理，60mg/Kg组，脾指数，胸腺指数两项指标与对照组相比有显著性差异。
五、抗凝血作用1.实验材料1.1动物纯种C57小鼠，体重22-24g.
1.2实验方法1.2.1分组与给药动物随机分为3组(10只/组，雌雄各半)对照组、药物6mg/kg、15mg/kg两个剂量组。尾静脉注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，10分钟后按全血毛细玻管法测定凝血时间，结果见表。
银耳多糖硫酸酯STF-II对小鼠凝血时间的影响
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不作为对本发明的限制。
实施例1银耳多糖修饰物STF-I、STF-II的合成酯化试剂的配制酯化试剂(1)将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入1mL吡啶，充分搅拌使之冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸1mL约30-40分钟滴加完毕，此时烧瓶中出现大量淡黄色固体，然后再室温搅拌30分钟，加热到50℃，再搅拌到固体溶解。
酯化试剂(2)将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入1ml吡啶，充分搅拌，使之冷却。用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸3ml，约30-40分钟滴加完毕，并于室温搅拌30分钟。
多糖的酯化<1>取503mg多糖TF，加6ml无水甲酰胺搅拌，恒温在50℃加酯化试剂(1)，搅拌半小时，反应结束后，室温放置一天，然后加10ml水，用2.5M的NaOH中和到PH为6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析3天。取透析袋内溶液，减压，回收溶液至少量，加三倍体积的乙醇，析出沉淀。抽滤取沉淀，沉淀用乙醚洗，置真空干燥器中，最后得产品为804mg，命名为STF-I，硫含量为11.28％。
<2>将201mg多糖TF，悬浮于4ml无水甲酰胺中，搅拌30分钟，然后逐渐加入酯化试剂(2)于45℃搅拌4小时，反应结束后，室温放置一天，然后加4ml水，用2.5M的NaOH中和到PH为6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析3天。取透析袋内溶液，减压，回收溶液至少量，加三倍体积的乙醇，析出沉淀。抽滤取沉淀，沉淀用乙醚洗，置真空干燥器中，得产品260mg，定名为STF-II，硫含量为11.77％。
实施例2在无菌条件下取银耳多糖修饰物STF-I18g，置于容器中，加注射用水1000ml，加碳酸钠1.8g调节PH至5.5-7.5，加入甘露醇50g、乳糖20g，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，加入1.5g活性碳，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只0.6ml进行分装，采用冷冻干燥法，制得黄色疏松块状物，封口即得。
实施例3无菌条件下取银耳多糖修饰物STF-I100g，加入到注射用水24000ml中，加入60g硫代硫酸钠搅拌30分钟，加入30g活性炭，搅拌吸附30分钟，除炭、精滤、灌封、灭菌，即得注射液。
或无菌条件下取银耳多糖修饰物STF-I100g，加入注射用水24000ml中，经G4漏斗过滤后，分装灭菌，制得注射液。
实施例4银耳多糖修饰物STF-I1000g，药用淀粉600g，糊精600g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时，制成1000片，使每片含均一体银耳多糖修饰物0.3g。
实施例5银耳多糖修饰物STF-II1000g，药用淀粉1000g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装1#胶囊，每粒0.2g在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚的了解，在不脱离下述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案保护范围内。且本发明亦不受说明书中所举实施例的实施方式的限制。
权利要求
1.具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物，由下述方法获得将银耳孢子发酵物经水煮、醇沉、除蛋白，用凝胶柱层析分离、纯化，得到银耳多糖TF，用酯化试剂进行酯化，制备出如下的银耳多糖修饰物； 其中，R1＝H or SO3Na、R2＝H or SO3Na；R＝H or SO3Na；n＞10；R、R1、R2不同时＝H。
2.权利要求1所述均一体银耳多糖修饰物的制备方法，包括(1)将银耳孢子发酵物水煮提、冷却、离心，上清液浓缩后加乙醇沉淀，过滤取沉淀，真空干燥得粗多糖；再加水煮提，冷却、离心，上清液用sevage法除蛋白，用乙醇沉淀；过滤取沉淀，真空干燥，得精制多糖后凝胶柱层析分离、纯化，得到均一体银耳多糖TF；(2)取银耳多糖TF，加入无水甲酰胺，在30-80℃加入酯化试剂，搅拌，室温放置，用NaOH中和至PH6-7，过滤，滤液用蒸馏水透析，乙醇析出沉淀，制得STF。
3.如权利要求2所述的均一体银耳多糖修饰物的制备方法，其特征在于，所述的酯化试剂为吡啶∶氯磺酸0.1∶1-30V/V。
4.一种以均一体银耳多糖修饰物为活性成分的制剂，该制剂含有治疗有效量的银耳多糖修饰物，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述的制剂，其中，均一体银耳多糖的治疗有效量为0.1-500mg。
6.如权利要求4所述的制剂，其中，均一体银耳多糖的治疗有效量为1-200mg。
7.如权利要求4-6所述的制剂，其中，该制剂包括口服制剂、液体制剂或外用制剂。
8.如权利要求7所述的制剂，其中，口服制剂为片剂、胶囊、缓释片、滴丸、颗粒剂或口服液；液体制剂为冻干粉针、注射液、大、小输液或静脉滴注液等注射给药制剂；外用制剂为霜剂或膏剂。
9.均一体银耳多糖修饰物在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗凝血药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物，及其制备方法和含它们的制剂。银耳多糖修饰物的制备方法取均一体多糖TF，加入无水甲酰胺，在30－80℃加入酯化试剂，搅拌，室温放置一天，然后用NaOH中和到PH为6－7，过滤，滤液用蒸馏水透析，乙醇析出沉淀，得化合物STF。本发明的均一体银耳多糖修饰物具有一定的抑制牛免疫缺陷病毒感染引起的合胞体形成的作用；对IRM－2小鼠的淋巴瘤有较好的抑制作用，还具有升高白细胞、抗凝血、提高免疫力等作用。因此，均一体银耳多糖修饰物作为一个多功能的药物，具有抗肿瘤、抗病毒，抗凝血等作用。
文档编号A61K31/715GK1778823SQ20041007286
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者徐文清, 李美佳, 刘培勋, 周则卫, 沈秀, 王月英 申请人:中国医学科学院放射医学研究所
最新回复(0)