一种疫苗稀释剂及其制备方法
专利名称：一种疫苗稀释剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗稀释剂，尤其涉及一种具有分子免疫增强作用的疫苗稀释剂；本发明还涉及该疫苗稀释剂的制备方法。
背景技术：
我国是世界第二大肉类产品生产大国，年产量达六千万吨以上，年人均占有量超过50Kg。2002年全国生猪出栏量超过6亿头，广东省超过3200万头。由于药物残留和品质欠佳，出口量不到产量的3％。随着发达国家绿色贸易避垒的加强，我国畜禽产品市场将面临着更为剧烈的竞争，“绿色”产品成为需求的方向。为减少畜禽病害发生，同时为避免长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，以发展优质、无公害的农业畜禽产品，保证我国畜牧业持续健康发展并参与国际市场的竞争，具有分子免疫增强作用的疫苗稀释剂将起着极其重要的作用。
CpG称为免疫刺激序列(immunostimulatory DNA sequence，ISS)，是具有免疫刺激功能的DNA短序(CpGOND)，一种非甲基化具有回文结构的六聚体。近来大量免疫学研究证实含CpG基序的DNA分子具有以下免疫效果(1)诱导B细胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素(IFN-γ)分泌。从而既能诱导强的体液免疫，又可以诱导细胞免疫和CTL反应，唤醒机体先天性的免疫保护机制，国际上被称为第三代非特异性免疫增强剂。
从另一方面---佐剂而言，铝盐作为佐剂用于人类的免疫接种已有70多年的历史，并且一直是唯一的用于人类疫苗的佐剂。但铝盐佐剂有其明显的缺点，即不能诱导产生Th1反应，并干扰细胞免疫，阻断CD8+CTL的激活，使得疫苗的免疫保护不全面、不持久。弗氏完全佐剂(CFA)可引起接种抗原的Th1反应，诱导有效的细胞和体液免疫，但由于其严重的副作用未能批准用于人体，在动物免疫过程中，对动物有较大的副作用，引起应急反应。ODN具有较好的安全性，在反义治疗研究中，超过100mg/kg的剂量仍是安全的，而CpGODN免疫佐剂的用量仅为10μg～100μg。大量的实验证明，CpGODN能够诱导比铝盐佐剂更强的免疫反应，无法与铝盐佐剂混用的减毒活疫苗或多价疫苗，可以利用CpGODN来增强免疫反应。特别是低免疫原性抗原或减轻超敏反应或无反应需要特殊的佐剂时，可以利用铝盐佐剂和CpGODN的协同增强效果，表明了CpGODN作为佐剂的明显优势。因此，开展高效疫苗稀释剂的研究，避免长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展，对发展绿色食品的生产和保障人民的身体健康有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效提高养殖动物机体的免疫力的免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂，本发明的另一个目的在于提供该疫苗稀释剂的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明疫苗稀释剂是一种含有1μg/ml～1000μg/ml的CpG序列的盐溶液。
本发明所述盐溶液为0.001M～0.01M的Tri-HCl，获得所需的高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
本发明疫苗稀释剂的制备方法为，将含CpG序列的细菌培养繁殖后，用碱裂解处理粗步提取CpG DNA，再经亲和层析柱和离子交换层析柱制得高纯度的CpGDNA，再添加盐溶液，制备高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
本发明所述的工程菌培养繁殖以及碱裂解处理的过程为1、将所述工程菌用LB培养基培养过夜，收集菌液；2、将收集到的菌液在5000-10000rpm下离心3-5min，用0.3-0.5ml由30-50mmol/l葡萄糖、10-25mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和8-10mmol/l EDTA组成的溶液重悬；3、在上述重悬后的菌液中加入8-10mg/ml的溶菌酶40-50μl，处理10-15min后，加入由0.1-0.2mol/l NaOH和0.8-1％SDS组成的溶液0.8-1ml充分混匀，静置5-10min；4、然后加入由3-5mol/l乙酸钾40-60ml、冰醋酸10-11.5ml和蒸馏水20-28.5ml组成的溶液0.5-0.75ml充分混匀，于冰上放置5-10min；5、将混合后的菌液在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液；6.、在沉淀中加入1-3倍体积乙醇于-20℃温度下放置15-25min，在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液，沉淀用TE溶解；本发明所述亲和层析柱PlasmidSelect XK16/40 CV＝20-40ml；缓冲液平衡及上样缓冲液1.5-2.5M(NH4)2SO4；1-10mMEDTA；1-100mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液1.0-2.0M Nacl；1-3M(NH4)2SO4；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样所述步骤(6)中纯化的DNA，上样量0.1-1.0mg/ml；上样后，以洗脱缓冲液洗脱超螺旋质粒DNA，而在上样过程中，开环的DNA没有与凝胶结合。
本发明所述离子交换层析柱Source 30Q XK16/40 CV＝20-40ml；缓冲液平衡及上样缓冲液0.1-2.0M Nacl；5-15mMEDTA；
10-200mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液0.1-1.5M Nacl；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样PlasimdSelect纯化的质粒，加入2-6倍体积的缓冲液稀释；上样后，以洗脱缓冲液洗脱未结合DNA。
本发明具有以下有益效果该疫苗稀释剂是全谱非特异性免疫增强剂，能够提升动物的自身免疫能力。用本发明制备的疫苗稀释剂能够增强灭活及减毒疫苗的免疫效果，也能有效增强基因工程疫苗的免疫效果，尤其是能够增强全谱的DNA疫苗免疫效果。避免了长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展。
具体实施例方式
使用的CpG DNA片断的序列为5’TCCATGACGTTCCTGACGTT3’(德国HMG BiotechGmbH公司)文章请见(《江苏医药杂志》2002年3月第28卷第3期)中《CpG ODN对哮喘小鼠Th1/Th2相关细胞因子表达的影响》采用《分子克隆实验指南》中常规的基因工程技术即可将该CpG DNA片断克隆入pUC18质粒中，而获得含CpG DNA片断的重组质粒。
再用《分子克隆实验指南》中的CaCl2转化法将该质粒导入细菌中，即为含CpGDNA片断的基因工程菌。
将上述工程菌依次作如下处理用组分为10g/l蛋白胨、5g/l氯化钠和5g/l酵母膏的LB培养基培养过夜后收集10ml菌液的菌体，将收集到的菌液在8000rpm下离心4min。再用0.4ml由40mmol/l葡萄糖、20mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和9mmol/l EDTA组成的溶液重悬。在重悬后的菌液中加入9mg/ml的溶菌酶45μl，处理13min后，加入由0.2mol/l NaOH和1％SDS组成的溶液1ml充分混匀，静置8min。然后加入由4mol/l乙酸钾50ml、冰醋酸11ml和蒸馏水25ml组成的溶液0.6ml充分混匀，于冰上放置8min；将混合后的菌液在8000rpm下离心9min，倒出上清液。在沉淀中加入2倍体积乙醇于-20℃温度下放置20min，在8000rpm下离心9min，倒出上清液，沉淀用TE溶解。
用30ml容量水平衡PlasmidSelect XK16/40凝胶柱，将上述TE溶解的DNA溶液作为样品液，上样，平衡及上样缓冲液由2M(NH4)2SO4、5mMEDTA、50mMTriscl组成，pH为7；上样量0.5mg/ml；上样后，以用1.5M Nacl；2M(NH4)2SO4；10mMEDTA；100mMTriscl组成，pH为7的洗脱缓冲液洗脱，洗脱缓冲液洗脱超螺旋质粒DNA，而在上样过程中，开环的DNA没有与凝胶结合。
接着用30ml容量水平衡Source 30Q XK16/40凝胶柱，将上步纯化的DNA溶液作为样品液，平衡及上样缓冲液由1M Nacl、10mMEDTA、100mMTriscl组成，pH为7；加入4倍体积的上样缓冲液稀释；上样后，以用1M Nacl；10mMEDTA；100mMTriscl组成，pH为7的洗脱缓冲液洗脱未结合DNA。
在上步纯化的1ml DNA中添加1.4-699ml的0.01M的Tri-HCl获得含浓度为1-500μg/ml CpG序列高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
采用ELISA法及MTT法检测由本实施例制备的疫苗稀释剂对疫苗的效果，结果如下(1)以疫苗稀释剂与鸡法氏囊疫苗混合，滴鼻免疫SPF鸡，在免疫14，21天血清抗体滴度是只加鸡法氏囊疫苗组(疫苗组)的3-5倍。并使未接受抗原刺激的小鸡体内血液中CD4+、CD8+T细胞数量增加，刺激T淋巴细胞的增殖分化。
(2)以疫苗稀释剂与猪猪繁殖呼吸综合症疫苗混合(疫苗稀释剂组)，注射免疫初生小猪，在免疫3，7天血清抗体滴度是只加猪伪狂犬疫苗组(疫苗组)的5-8倍。疫苗稀释剂组淋巴细胞刺激指数(SI)和白细胞介数-2(IL-2)的水平是疫苗组的2-3倍。
(3)用传染性法氏囊超强毒对SPF鸡攻毒，用该方法纯化的疫苗稀释剂对SPF鸡保护率达78.5％，用该方法纯化的疫苗稀释剂和疫苗对SPF鸡保护率达100％，单独疫苗对SPF鸡保护率为89.4％，常规方法制备的疫苗稀释剂对SPF鸡保护率为30.3％，对照组死亡率达到99.1％。
权利要求
1.一种疫苗稀释剂，其特征在于该稀释剂是含有浓度为1μg～500μg/ml的CpG序列的盐溶液。
2.根据权利要求1所述的疫苗稀释剂，其特征在于盐溶液为0.001～0.01M的Tri-HCl。
3.权利要求1所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于将含CpG序列的细菌培养繁殖后，用碱裂解处理粗步提取CpG DNA，再经亲和层析柱和离子交换层析柱制得高纯度的CpG DNA，再添加盐溶液，制备得高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
4.根据权利要求3所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于所述的工程菌培养繁殖以及碱裂解处理的过程为(1)将所述工程菌用LB培养基培养过夜，收集菌液；(2)将收集到的菌液在5000-10000rpm下离心3-5min，用0.3-0.5ml由30-50mmol/l葡萄糖、10-25mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和8-10mmol/l EDTA组成的溶液重悬；(3)在上述重悬后的菌液中加入8-10mg/ml的溶菌酶40-50μl，处理10-15min后，加入由0.1-0.2mol/l NaOH和0.8-1％SDS组成的溶液0.8-1ml充分混匀，静置5-10min；(4)然后加入由3-5mol/l乙酸钾40-60ml、冰醋酸10-11.5ml和蒸馏水20-28.5ml组成的溶液0.5-0.75ml充分混匀，于冰上放置5-10min；(5)将混合后的菌液在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液；(6)在沉淀中加入2倍体积乙醇于-20℃温度下放置20min，在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液，沉淀用TE溶解；
5.根据权利要求3所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于所述亲和层析柱PlasmidSelect XK16/40 CV＝20-40ml；其中采用的平衡及上样缓冲液为1.5-2.5M(NH4)2SO4；1-10mMEDTA；1-100mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液为1.0-2.0M Nacl；1-3M(NH4)2SO4；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样步骤(6)中纯化的DNA，上样量为0.1-1.0mg/ml；上样后，以洗脱缓冲液洗脱超螺旋质粒DNA。
6.根据权利要求3所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于所述离子交换层析柱Source 30Q XK16/40 CV＝20-40ml；其中采用的平衡及上样缓冲液为0.1-2.0M Nacl；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液为0.1-1.5M Nacl；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样亲和层析柱纯化的质粒，加入2-6倍体积的缓冲液稀释；上样后，以洗脱缓冲液洗脱未结合DNA。
全文摘要
本发明公开了一种疫苗稀释剂及其制备方法，该疫苗稀释剂是一种含有高效免疫增强作用的CpG序列盐溶液；将含CpG序列的细菌培养繁殖后，用碱裂解处理粗步提取CpG DNA，再经亲和层析柱和离子交换层析柱制得高纯度的CpG DNA，再添加盐溶液，制备高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。本发明疫苗稀释剂是全谱非特异性免疫增强剂，能够提升动物的自身免疫能力，尤其是能够增强全谱的DNA疫苗免疫效果；避免了长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展。
文档编号A61K47/26GK1660439SQ200410077600
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者张玲华, 田兴山, 潘木水, 周风珍, 邝哲师, 李国立 申请人:广东省农业科学院农业生物技术研究所
技术领域：
本发明涉及一种疫苗稀释剂，尤其涉及一种具有分子免疫增强作用的疫苗稀释剂；本发明还涉及该疫苗稀释剂的制备方法。
背景技术：
我国是世界第二大肉类产品生产大国，年产量达六千万吨以上，年人均占有量超过50Kg。2002年全国生猪出栏量超过6亿头，广东省超过3200万头。由于药物残留和品质欠佳，出口量不到产量的3％。随着发达国家绿色贸易避垒的加强，我国畜禽产品市场将面临着更为剧烈的竞争，“绿色”产品成为需求的方向。为减少畜禽病害发生，同时为避免长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，以发展优质、无公害的农业畜禽产品，保证我国畜牧业持续健康发展并参与国际市场的竞争，具有分子免疫增强作用的疫苗稀释剂将起着极其重要的作用。
CpG称为免疫刺激序列(immunostimulatory DNA sequence，ISS)，是具有免疫刺激功能的DNA短序(CpGOND)，一种非甲基化具有回文结构的六聚体。近来大量免疫学研究证实含CpG基序的DNA分子具有以下免疫效果(1)诱导B细胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素(IFN-γ)分泌。从而既能诱导强的体液免疫，又可以诱导细胞免疫和CTL反应，唤醒机体先天性的免疫保护机制，国际上被称为第三代非特异性免疫增强剂。
从另一方面---佐剂而言，铝盐作为佐剂用于人类的免疫接种已有70多年的历史，并且一直是唯一的用于人类疫苗的佐剂。但铝盐佐剂有其明显的缺点，即不能诱导产生Th1反应，并干扰细胞免疫，阻断CD8+CTL的激活，使得疫苗的免疫保护不全面、不持久。弗氏完全佐剂(CFA)可引起接种抗原的Th1反应，诱导有效的细胞和体液免疫，但由于其严重的副作用未能批准用于人体，在动物免疫过程中，对动物有较大的副作用，引起应急反应。ODN具有较好的安全性，在反义治疗研究中，超过100mg/kg的剂量仍是安全的，而CpGODN免疫佐剂的用量仅为10μg～100μg。大量的实验证明，CpGODN能够诱导比铝盐佐剂更强的免疫反应，无法与铝盐佐剂混用的减毒活疫苗或多价疫苗，可以利用CpGODN来增强免疫反应。特别是低免疫原性抗原或减轻超敏反应或无反应需要特殊的佐剂时，可以利用铝盐佐剂和CpGODN的协同增强效果，表明了CpGODN作为佐剂的明显优势。因此，开展高效疫苗稀释剂的研究，避免长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展，对发展绿色食品的生产和保障人民的身体健康有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效提高养殖动物机体的免疫力的免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂，本发明的另一个目的在于提供该疫苗稀释剂的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明疫苗稀释剂是一种含有1μg/ml～1000μg/ml的CpG序列的盐溶液。
本发明所述盐溶液为0.001M～0.01M的Tri-HCl，获得所需的高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
本发明疫苗稀释剂的制备方法为，将含CpG序列的细菌培养繁殖后，用碱裂解处理粗步提取CpG DNA，再经亲和层析柱和离子交换层析柱制得高纯度的CpGDNA，再添加盐溶液，制备高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
本发明所述的工程菌培养繁殖以及碱裂解处理的过程为1、将所述工程菌用LB培养基培养过夜，收集菌液；2、将收集到的菌液在5000-10000rpm下离心3-5min，用0.3-0.5ml由30-50mmol/l葡萄糖、10-25mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和8-10mmol/l EDTA组成的溶液重悬；3、在上述重悬后的菌液中加入8-10mg/ml的溶菌酶40-50μl，处理10-15min后，加入由0.1-0.2mol/l NaOH和0.8-1％SDS组成的溶液0.8-1ml充分混匀，静置5-10min；4、然后加入由3-5mol/l乙酸钾40-60ml、冰醋酸10-11.5ml和蒸馏水20-28.5ml组成的溶液0.5-0.75ml充分混匀，于冰上放置5-10min；5、将混合后的菌液在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液；6.、在沉淀中加入1-3倍体积乙醇于-20℃温度下放置15-25min，在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液，沉淀用TE溶解；本发明所述亲和层析柱PlasmidSelect XK16/40 CV＝20-40ml；缓冲液平衡及上样缓冲液1.5-2.5M(NH4)2SO4；1-10mMEDTA；1-100mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液1.0-2.0M Nacl；1-3M(NH4)2SO4；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样所述步骤(6)中纯化的DNA，上样量0.1-1.0mg/ml；上样后，以洗脱缓冲液洗脱超螺旋质粒DNA，而在上样过程中，开环的DNA没有与凝胶结合。
本发明所述离子交换层析柱Source 30Q XK16/40 CV＝20-40ml；缓冲液平衡及上样缓冲液0.1-2.0M Nacl；5-15mMEDTA；
10-200mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液0.1-1.5M Nacl；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样PlasimdSelect纯化的质粒，加入2-6倍体积的缓冲液稀释；上样后，以洗脱缓冲液洗脱未结合DNA。
本发明具有以下有益效果该疫苗稀释剂是全谱非特异性免疫增强剂，能够提升动物的自身免疫能力。用本发明制备的疫苗稀释剂能够增强灭活及减毒疫苗的免疫效果，也能有效增强基因工程疫苗的免疫效果，尤其是能够增强全谱的DNA疫苗免疫效果。避免了长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展。
具体实施例方式
使用的CpG DNA片断的序列为5’TCCATGACGTTCCTGACGTT3’(德国HMG BiotechGmbH公司)文章请见(《江苏医药杂志》2002年3月第28卷第3期)中《CpG ODN对哮喘小鼠Th1/Th2相关细胞因子表达的影响》采用《分子克隆实验指南》中常规的基因工程技术即可将该CpG DNA片断克隆入pUC18质粒中，而获得含CpG DNA片断的重组质粒。
再用《分子克隆实验指南》中的CaCl2转化法将该质粒导入细菌中，即为含CpGDNA片断的基因工程菌。
将上述工程菌依次作如下处理用组分为10g/l蛋白胨、5g/l氯化钠和5g/l酵母膏的LB培养基培养过夜后收集10ml菌液的菌体，将收集到的菌液在8000rpm下离心4min。再用0.4ml由40mmol/l葡萄糖、20mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和9mmol/l EDTA组成的溶液重悬。在重悬后的菌液中加入9mg/ml的溶菌酶45μl，处理13min后，加入由0.2mol/l NaOH和1％SDS组成的溶液1ml充分混匀，静置8min。然后加入由4mol/l乙酸钾50ml、冰醋酸11ml和蒸馏水25ml组成的溶液0.6ml充分混匀，于冰上放置8min；将混合后的菌液在8000rpm下离心9min，倒出上清液。在沉淀中加入2倍体积乙醇于-20℃温度下放置20min，在8000rpm下离心9min，倒出上清液，沉淀用TE溶解。
用30ml容量水平衡PlasmidSelect XK16/40凝胶柱，将上述TE溶解的DNA溶液作为样品液，上样，平衡及上样缓冲液由2M(NH4)2SO4、5mMEDTA、50mMTriscl组成，pH为7；上样量0.5mg/ml；上样后，以用1.5M Nacl；2M(NH4)2SO4；10mMEDTA；100mMTriscl组成，pH为7的洗脱缓冲液洗脱，洗脱缓冲液洗脱超螺旋质粒DNA，而在上样过程中，开环的DNA没有与凝胶结合。
接着用30ml容量水平衡Source 30Q XK16/40凝胶柱，将上步纯化的DNA溶液作为样品液，平衡及上样缓冲液由1M Nacl、10mMEDTA、100mMTriscl组成，pH为7；加入4倍体积的上样缓冲液稀释；上样后，以用1M Nacl；10mMEDTA；100mMTriscl组成，pH为7的洗脱缓冲液洗脱未结合DNA。
在上步纯化的1ml DNA中添加1.4-699ml的0.01M的Tri-HCl获得含浓度为1-500μg/ml CpG序列高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
采用ELISA法及MTT法检测由本实施例制备的疫苗稀释剂对疫苗的效果，结果如下(1)以疫苗稀释剂与鸡法氏囊疫苗混合，滴鼻免疫SPF鸡，在免疫14，21天血清抗体滴度是只加鸡法氏囊疫苗组(疫苗组)的3-5倍。并使未接受抗原刺激的小鸡体内血液中CD4+、CD8+T细胞数量增加，刺激T淋巴细胞的增殖分化。
(2)以疫苗稀释剂与猪猪繁殖呼吸综合症疫苗混合(疫苗稀释剂组)，注射免疫初生小猪，在免疫3，7天血清抗体滴度是只加猪伪狂犬疫苗组(疫苗组)的5-8倍。疫苗稀释剂组淋巴细胞刺激指数(SI)和白细胞介数-2(IL-2)的水平是疫苗组的2-3倍。
(3)用传染性法氏囊超强毒对SPF鸡攻毒，用该方法纯化的疫苗稀释剂对SPF鸡保护率达78.5％，用该方法纯化的疫苗稀释剂和疫苗对SPF鸡保护率达100％，单独疫苗对SPF鸡保护率为89.4％，常规方法制备的疫苗稀释剂对SPF鸡保护率为30.3％，对照组死亡率达到99.1％。
权利要求
1.一种疫苗稀释剂，其特征在于该稀释剂是含有浓度为1μg～500μg/ml的CpG序列的盐溶液。
2.根据权利要求1所述的疫苗稀释剂，其特征在于盐溶液为0.001～0.01M的Tri-HCl。
3.权利要求1所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于将含CpG序列的细菌培养繁殖后，用碱裂解处理粗步提取CpG DNA，再经亲和层析柱和离子交换层析柱制得高纯度的CpG DNA，再添加盐溶液，制备得高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。
4.根据权利要求3所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于所述的工程菌培养繁殖以及碱裂解处理的过程为(1)将所述工程菌用LB培养基培养过夜，收集菌液；(2)将收集到的菌液在5000-10000rpm下离心3-5min，用0.3-0.5ml由30-50mmol/l葡萄糖、10-25mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和8-10mmol/l EDTA组成的溶液重悬；(3)在上述重悬后的菌液中加入8-10mg/ml的溶菌酶40-50μl，处理10-15min后，加入由0.1-0.2mol/l NaOH和0.8-1％SDS组成的溶液0.8-1ml充分混匀，静置5-10min；(4)然后加入由3-5mol/l乙酸钾40-60ml、冰醋酸10-11.5ml和蒸馏水20-28.5ml组成的溶液0.5-0.75ml充分混匀，于冰上放置5-10min；(5)将混合后的菌液在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液；(6)在沉淀中加入2倍体积乙醇于-20℃温度下放置20min，在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液，沉淀用TE溶解；
5.根据权利要求3所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于所述亲和层析柱PlasmidSelect XK16/40 CV＝20-40ml；其中采用的平衡及上样缓冲液为1.5-2.5M(NH4)2SO4；1-10mMEDTA；1-100mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液为1.0-2.0M Nacl；1-3M(NH4)2SO4；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样步骤(6)中纯化的DNA，上样量为0.1-1.0mg/ml；上样后，以洗脱缓冲液洗脱超螺旋质粒DNA。
6.根据权利要求3所述的疫苗稀释剂的制备方法，其特征在于所述离子交换层析柱Source 30Q XK16/40 CV＝20-40ml；其中采用的平衡及上样缓冲液为0.1-2.0M Nacl；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；洗脱缓冲液为0.1-1.5M Nacl；5-15mMEDTA；10-200mMTriscl pH6.5-8.0；上样亲和层析柱纯化的质粒，加入2-6倍体积的缓冲液稀释；上样后，以洗脱缓冲液洗脱未结合DNA。
全文摘要
本发明公开了一种疫苗稀释剂及其制备方法，该疫苗稀释剂是一种含有高效免疫增强作用的CpG序列盐溶液；将含CpG序列的细菌培养繁殖后，用碱裂解处理粗步提取CpG DNA，再经亲和层析柱和离子交换层析柱制得高纯度的CpG DNA，再添加盐溶液，制备高效免疫增强作用高纯度的疫苗稀释剂。本发明疫苗稀释剂是全谱非特异性免疫增强剂，能够提升动物的自身免疫能力，尤其是能够增强全谱的DNA疫苗免疫效果；避免了长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展。
文档编号A61K47/26GK1660439SQ200410077600
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者张玲华, 田兴山, 潘木水, 周风珍, 邝哲师, 李国立 申请人:广东省农业科学院农业生物技术研究所
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