靶向抗原呈递细胞的抗病毒疫苗的制作方法

专利名称：靶向抗原呈递细胞的抗病毒疫苗的制作方法
技术领域：
总地来说，本发明涉及免疫领域，以及更具体地，涉及新的基于抗-⑶40的抗病毒疫苗。
背景技术：
在不限制本发明的范围的前提下，本发明的背景与抗原呈递结合描述。授予Ledbetter等人的第7，118，751号美国专利中教导了抗原呈递的疫苗和方法的一个实例，其涉及DNA疫苗，该DNA疫苗编码氨基端抗原，所述的氨基端抗原连接到结合CD40的羧基端功能域。总地来说，教导了将一种或多种抗原靶向细胞表面受体，从而提高抗原特异性的体液及细胞免疫应答的疫苗。将连接到结合于细胞表面受体的功能域的抗原(或多种抗 原)内在化，从而将抗原转移到细胞内结构(intracellular compartment)中，在所述的细胞内结构中，所述的抗原被分解成为肽，并加载到MHC分子上。对所述的肽抗原具有特异性的T细胞被活化，从而导致增强的免疫应答。所述的疫苗可以包括连接到结合至少一种受体的功能域的抗原，或者包括编码连接到结合于至少一种受体的功能域的抗原的DNA质粒。本发明优选的实施方案将HIV-Ienv抗原靶向CD40受体，导致将抗原向CD40阳性细胞的递送，以及选择性地活化将HIV-Ienv抗原呈递到T细胞的细胞上的⑶40受体。另一个实例见于Li等人递交的第20080254026号美国专利申请，其涉及抗-⑶40单克隆抗体拮抗剂，及其应用的方法。总地来说，公开了用于治疗在表达⑶40的细胞上通过激发CD40信号转导所介导的疾病的疗法的组合物和方法。所述的方法包括将治疗上有效量的抗-CD40抗体或其抗原结合片段拮抗剂给予对其有需要的患者。所述的抗-CD40抗体或其抗原结合片段拮抗剂没有显著的激动剂活性，但是当该抗体结合于表达人类CD40的细胞上的CD40抗原时显示拮抗剂活性。所述的抗-CD40抗体或其抗原结合片段的拮抗剂活性有利地抑制表达人类CD40的细胞的增殖和/或分化，所述的表达人类CD40的细胞如B细胞。由Delucia递交的第20080241139号美国专利申请中教导了另一个实例，其涉及包含微生物TLR激动剂、CD40或者4-1BB激动剂以及可选地抗原的佐剂组合，及其在细胞免疫中诱导协同增强(synergistic enhancement)的用途。总地来说，本申请据称教导了包含至少一种微生物TLR激动剂如整个的病毒、细菌或者酵母或者其部分如膜、原生质球、胞质或者形骸细胞，CD40或者4-1BB激动剂，以及可选地抗原的佐剂组合,所述的抗原的所有三个部分可以为分开的，或者公开了包含同样的重组微生物或者病毒的佐剂组合。还提供了这些免疫佐剂在治疗不同的慢性疾病中的用途，所述的慢性疾病如癌症和HIV感染。由Bernett等人递交的第20080199471号美国专利申请涉及经优化的0)40抗体及使用其的方法。总地来说，该申请据称教导了靶向CD40的抗体，其中所述的抗体包括与亲代抗体相关的至少一种修饰，其中所述的修饰改变对Fe Y R的亲和性或者改变与亲代抗体相关的效应子作用。还公开了使用该发明的抗体的方法。最后，由Tripp等人递交的第20080181915号美国专利申请涉及用于呼吸道合胞体病毒的CD40配体佐剂。总地来说，该申请据称教导了用于增强对宿主中RSV的免疫应答的方法和佐剂，其中所述的方法和佐剂包括CD40结合蛋白的来源。优选地，所述的CD40结合蛋白质是CD40L，并且所述的来源是包括可操作地连接到CD40L编码区域的启动子的载体。由该发明的佐剂和方法产生的提高的免疫应答包括增加的Thl细胞因子表达和增加的抗体产生。

发明内容
在一个实施方案中，本发明是包括式Ab_(PL-Ag) x、Ab- (Ag-PL) x、Ab- (PL-Ag-PL)x、Ab- (Ag-PL-Ag) x、Ab- (PL-Ag) x-PL 或者 Ab- (Ag-PL) x-Ag 的融合蛋白；其中 Ab 是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个抗原；以及其中X是从I到20的整数，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。在一个方面，Ag选自病毒抗原、肿瘤抗原、感染性疾病抗原、自身免疫抗原、毒素或者其组合。在另一个方面，所述的Ag是肽串联体(concatemer)。在 另一个方面，所述的PL是肽串联体。在另一个方面，-(PL-Ag) X, -(Ag-PL) X, -(PL-Ag-PL)X或者-(Ag-PL-Ag)x位于Ab重链或其片段的羧基末端。在另一个方面，所述的Ag在宿主中引发体液免疫应答和/或细胞免疫应答。在一个方面，所述的Ab至少包括抗-CD40_12E12. 3F3 (ATCC 登记号 PTA-9854)、抗 _CD40_12B4. 2C10 (保藏提交号 HS446,ATCC 登记号 PTA-10653)和抗 _CD40_11B6. 1C3 (保藏提交号 HS440，ATCC 登记号 PTA-10652)的可变区。在一个方面，所述的Ag选自自身免疫疾病中涉及的，与自身免疫疾病或者障碍相关的抗原，所述的抗原选自谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、天然的DNA、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂蛋白脂质蛋白、乙酰胆碱受体组分、甲状腺球蛋白及促甲状腺激素(TSH)受体。在另一个方面，所述的Ag选自感染性疾病抗原，所述的感染性疾病抗原选自细菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原和真菌抗原。在另一个方面，X包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18或者19。在另一个方面，所述的融合蛋白包括两个或者更多个来自不同抗原，并由至少一个肽接头(PU隔开的Ag。在另一个方面，所述的融合蛋白包括两个或多个由至少一个PL隔开的Ag，所述的PL包括丙氨酸和丝氨酸。在另一个方面，所述的Ab是抗体片段，其选自 Fv、Fab、Fab，、F (ab，) 2、Fe 或者 ScFv0在一个方面，所述的Ab特异性地结合于第I类MHC、第II类MHC、⑶I、⑶2、CD3、CD4、CD8、CDllb, CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MACRO、DEC-205、甘露糖受体、胰岛蛋白、DECTIN-U B7-1、B7-2、IFN-y 受体和IL-2受体、ICAM-1、Fe Y受体、T细胞受体或者凝集素。在另一个方面,所述的Ab是IgA、IgD、IgE、IgG或者IgM或者其同种型(isotype)。在另一个方面，所述的Ab是人类抗体或者人源化(humanized)抗体。在另一个方面，所述的PL包括丙氨酸和丝氨酸。在另一个方面，所述的 PL 选自 SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. :11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO. 12),TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.13)或者 TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. :14)。本发明的再一个实施方案是编码融合蛋白的核酸表达载体，所述的融合蛋白包括编码抗体轻链或其片段的第一多核苷酸；以及编码抗体重链或其片段的第二多核苷酸；其中所述的融合蛋白包含下式Ab-(PL-Ag)X或者Ab-(Ag-PL)X ;其中Ab是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个抗原；以及其中X是从I到20的整数，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。在一个方面，所述的(PL-Ag) X或者(Ag-PL) X位于Ab重链或其片段的羧基末端。在另一个方面，所述的第一多核苷酸和第二多核苷酸位于一个表达载体上。在另一个方面，所述的Ag选自感染性疾病抗原，所述的疾病抗原选自细菌、病毒、寄生虫及真菌抗原。在另一个方面4包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或者19。在另一个方面，所述的融合蛋白包括两个或者更多个来自不同的抗原，并由至少一个肽接头隔开的Ag。在另一个方面，所述的融合蛋白包括两个或多个由至少一个PL隔开的Ag，所述的PL包括丙氨酸和丝氨酸。在另一个方面，所述的Ab是抗体片段，其选自Fv、Fab、Fab’、F(ab’ )2,Fe或者ScFv。在一个方面，所述的Ab特异性地结合于第I类MHC、第II类MHC、CDl、CD2、CD3、CD4、CD8、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、80〇六-2、嫩0 0、0￡0205、甘露糖受体、胰岛蛋白、0￡(1'爪-1、87-1、87-2、正^￥受体和IL-2受体、ICAM-U FC y受体、T细胞受体或者凝集素。在另一个方面，所述的Ab是IgA、IgD、 IgE、IgG或者IgM或者其同种型(isotype)。在另一个方面,所述的Ab是人类抗体或者人源化(humanized)抗体。在另一个方面，所述的PL包括丙氨酸和丝氨酸和/或所述的PL选自SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO. 11),PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.12) ；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. :13)或者 TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQID NO. :14)。在另一个方面，所述的第一多核苷酸和第二多核苷酸在组成型启动子的下游。本发明的另一个实施方案是包括式NH2Ab-(PL-Ag) x-COOH或者NH2-Ab-(Ag-PL)x-COOH的稳定的、可分泌的融合蛋白，其中Ab是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个免疫原性抗原；以及其中X是从I到20的整数，所述的融合蛋白与不可溶或不稳定的单独的Ab-Ag蛋白相比，在溶液中是稳定及可溶的。另一个实施方案是稳定抗原肽的方法，所述的方法包括将一种或多种不稳定或者不可溶的抗原肽掺入融合蛋白中，其中所述的融合蛋白具有以下的结构Ab-(PL-Ag)x或者Ab-(Ag-PL) X ;其中Ab是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个抗原；以及其中X是从I到20的整数，所述的融合蛋白在溶液中是稳定及可溶的，在该溶液中Ab-Ag是不可溶或不稳定的。本发明的再另一个实施方案是包括核酸表达载体的宿主细胞，所述的核酸表达载体包括编码抗体轻链的第一多核苷酸；和表达抗体重链融合蛋白的第二多核苷酸，所述的融合蛋白包括下式=Ab-(PL-Ag) X或者Ab-(Ag-PL) X ;其中Ab是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个抗原；以及其中X是从I到20的整数，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。在另一个实施方案中，所述的宿主细胞包含产生融合蛋白的表达载体，所述的融合蛋白包括下式Ab_ (PL-Ag) x、Ab_ (Ag-PL) x、Ab_ (PL-Ag-PL) x、Ab_ (Ag-PL-Ag) x、Ab_ (PL-Ag)x-PL或者Ab-(Ag-PL)x-Ag ;其中Ab是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个抗原；以及其中X是从I到20的整数，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。本发明还包括药物组合物，所述的药物组合物包括具有下式的抗体Ab-(PL_Ag)X、Ab- (Ag-PL) X、Ag- (PL-Ag-PL) x、Ab- (Ag-PL-Ag) x、Ab (PL-Ag) x-PL 或者 Ab- (Ag-PL) x-Ag ；其中Ab是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个抗原；以及其中X是从I到20的整数，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。本发明的另一个实施方案是包括式Ab_(PL-Ag)X-(PLy-Agz)n或者Ab-(Ag-PL)x-(PLy-Agz)n的融合蛋白；其中Ab是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；其中Ag是至少一个抗原；以及其中X是从I到20的整数；其中n为0到19 ;并且其中y或者z为0到10，其中所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。
另一个实施方案是经分离和纯化的疫苗，所述的疫苗包括选自SEQ ID NO :6,7,
8、9、10、16、17、18、19、20、36、37、96、97、98、99、110、 I11、112、118、I19、134、136、138、146和147的特异性地结合于⑶40的重链；以及特异性地结合于⑶40的轻链。在一个方面，所述的抗体被进一步鉴定为人源化抗体。本发明的又一个实施方案是包含式Ab-(PL-Ag) x、Ab- (Ag-PL) x、Ag- (PL-Ag-PL)x、Ab-(Ag-PL-Ag) x、Ab (PL-Ag) x-PL 或者 Ab-(Ag-PL) x-Ag 的融合蛋白；其中 Ab 是抗体或者其片段；其中PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；Ag是至少一个病毒抗原；以及其中X是从I到20的整数。在一个方面，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的PL具有更高的稳定性。在另一个方面，所述的Ag包括来自腺病毒、逆转录酶病毒、细小核糖核酸病毒、疱疫病毒、轮状病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、冠状病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒(orthomyxovirus)、本扬病毒(bunyavirus)、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒(papilomavirus)、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒的肽。在另一个方面，所述的Ag包括肽，所述的肽来自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、脊髓灰质炎、天花、风疹、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感或感冒病毒的至少一种。在另一个方面，所述的Ag 选自Nef (66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. : I)、Nef (116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gag pl7(17_35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3) ；Gagpl7-p24 (253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)、或者 Pol325-355 (RT 158-188)为AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO. :5)的至少一种。在另一个方面，所述的Ag为19到32个残基。在另一个方面，所述的Ag选自以MHC-I类分子呈现的HIV-I Nef、Gag和Env蛋白质中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。在另一个方面，所述的 Ag 选自 HIV gpl20、gp41、Gag、pl7、p24、p2、p7、pi、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu 和 Nef。在另一个方面，x 包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18或者19。在另一个方面，所述的Ag包括由不同的肽接头隔开的来自不同的抗原的病毒肽。在另一个方面，所述的Ag由至少一个含有丙氨酸和丝氨酸的PL隔开。在另一个方面，所述的融合蛋白选自SEQ ID NO. :21、22、23、24、25、26或者36。在另一个方面，所述的融合蛋白从包括多核苷酸载体的细胞中分离，所述的多核苷酸载体编码所述的融合蛋白，所述的多核苷酸载体包括SEQ ID NO. :21、22、23、24、25、26或者36。在另一个方面，所述的Ab包含SEQ ID NO. :37和38。在另一个方面，所述的融合蛋白从包括多核苷酸载体的细胞中分离，所述的多核苷酸载体编码所述的融合蛋白，并且所述的Ab部分包括SEQ ID 39和40。在另一个方面，Ag选自 SEQ ID NO. :52-56、58-60、61-69、70-72 或者 73-77 中的至少一个，所述的 Ag 为 17 至Ij60 个残基。在另一个方面，所述的 Ag 为 8、10、12、14、15、16、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55到60个残基长。在另一个方面，所述的Ag包括至少一个脂肽。在另一个方面，所述的Ag位于羧基末端，并进一步地包括羧基末端(Palm)-NH2基团。在另一个方面，所述的PL选自SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO. 11),PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.
12),TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. :13)或者 TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQID NO. :14)。在另一个方面，所述的PL包括丙氨酸和丝氨酸。
本发明的另一个实施方案是病毒抗原递送载体，所述的载体包括融合蛋白，所述的融合蛋白包括抗-CD40抗体或其片段及在该抗-CD40抗体的羧基末端上的一个或者多个病毒肽，其中当存在两个或多个病毒肽时，所述的病毒肽由一个或多个肽接头分开，所述的肽接头包括至少一个潜在的糖基化位点。在另一个方面，抗原递送载体是抗-CD40抗体或其片段以及位于该抗-CD40抗体轻链、重链或者轻链和重链两者的羧基末端的两个或更多个病毒肽，其中当两个或更多个病毒肽由包括至少一个潜在的糖基化位点的一个或更多个肽接头分开。本发明的再另一个实施方案是稳定病毒肽的方法，所述的方法包括将一个或者更多个不稳定或者不可溶的病毒肽与抗体一起掺入融合蛋白中，所述的抗体及所述的病毒肽由一个或多个肽接头分开，所述的肽接头包括一个或多个糖基化位点。再另一个实施方案是增强T细胞响应的方法，所述的方法包括使用有效量的疫苗对需要接种的受试者进行免疫，所属的疫苗包括式的Ab-(PL-Ag)x或者Ab-(Ag-PL)X ;其中Ab是抗体或其片段；PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；Ag是至少一种病毒抗原；并且X是从I到20的整数。在一个方面，所述的所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。在另一个方面，所述的至少一种的病毒抗原包括来自腺病毒、逆转录酶病毒、细小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、冠状病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、苜Ij粘病毒、正粘病毒(orthomyxovirus)、本扬病毒(bunyavirus)、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒(papilomavirus)、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒的肽。在一个方面，所述的至少一种病毒抗原包括肽，所述的肽来自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、脊髓灰质炎、天花、风疹、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感或感冒病毒的至少一种。在一个方面，所述的Ag 选自Nef (66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. : I)、Nef (116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL (SEQ ID NO. :2)、Gag pl7(17_35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO. :3)、Gagp17-p24 (253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)和 / 或 Pol325-355(RT 158-188)为 AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)。在另一个方面，所述的Ag为19到32个残基，其选自以MHC-I类分子呈现的HIV-I Nef、Gag和Env蛋白质中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。在另一个方面，所述的Ag选自 HIV gpl20、gp41、Gag、pl7、p24、p2、p7、pi、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu 和 Nef0 在另一个方面，x 包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或者19。在另一个方面，所述的Ag包括两个或多个来自不同病毒的抗原。在另一个方面，PL包括丙氨酸和丝氨酸。在另一个方面，所述的疫苗选自SEQ ID NO. :21、22、23、24、
25、26或者36。在另一个方面，所述的Ab包括SEQ ID NO. :37和38。在另一个方面，所述的 Ag 选自 SEQ ID NO 52-56、58-60、61-69、70-72 或者 73-77 的至少一种。在另一个方面，所述的Ag为17到60个残基。在另一个方面，所述的Ag为8、10、12、14、15、16、
18、19、20、25、30、35、40、45、50、55到60个残基长。在另一个方面，所述的Ag为8、10、
12、14、15、16、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55 到 60 个残基长。在另一个方面，所述 的Ag包括脂肽。在另一个方面，所述的Ag位于羧基末端，并包括羧基末端(Palm)-NH2基团。在另一个方面，所述的 PL 选自 SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. :11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO. 12),TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.
13)、或者 TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. :14)。本发明的又一个实施方案是制备对HIV肽特异性的，产生IFNy的T细胞的方法，所述的方法包括将受试者使用融合蛋白进行免疫，所述的融合蛋白包括抗-CD40抗体或其片段，在所述抗体的羧基末端具有一个或多个HIV肽；并且从所述的受试者分离外周血液单核细胞，其中将所述的经分离的外周血液单核细胞浓缩以得到产生抗HIV IFNy的T细胞，其中所述的抗-⑶40抗体包括SEQ ID NOS. :37和38或其片段。在一个方面，所述的受试者是怀疑具有HIV感染的患者。在另一个方面，所述的融合蛋白包括两个或者更多个HIV肽，并且所述的肽由一个或者多个肽接头隔开。在另一个方面，所述的融合蛋白包括两个或更多个HIV肽并且所述的肽由一个或更多个包括糖基化序列的肽接头隔开。在另一个方面，所述的融合蛋白包括两个或者多个HIV肽，并且所述的肽由一个或多个含有丙氨酸和丝氨酸的肽接头隔开。在另一个方面，所述的一个或多个HIV肽包括至少一个脂肽。在另一个方面，所述的一个或多个HIV肽包括羧基末端的(Palm)-NH2基团。在另一个方面，所述的一个或多个HIV肽具有19到32个氨基酸长，并且选自以不同MHC-I类分子呈现的HIV-lNef、Gag和Env蛋白质中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。在另一个方面，所述的一个或多个 HIV 肽选自 HIV gpl20、gp41、Gag、pl7、p24、p2、p7、pi、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu和Nef。在另一个方面，所述的一个或多个病毒肽选自以下的至少一个Nef (66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO.I)、Nef(116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gag pl7 (17-35)EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3) ；Gag pl7_p24(253-284) NPPIPVGEIYKRff11LGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)和 / 或Pol 325-355(RT 158-188)为 AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)。本发明再一个实施方案是包括抗-CD40抗体或其片段的融合蛋白，其在抗体的羧基末端具有一个或多个由包括至少一个丙氨酸和一个丝氨酸的肽接头隔开的病毒肽。在一个方面，所述的一个或多个病毒肽是HIV肽。在另一个方面，所述的一个或多个病毒肽选自以下的至少一个Nef (66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAA VDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO.
I)、Nef(116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gag pl7 (17-35)EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3) ；Gag pl7_p24(253-284) NPPIPVGEIYKRff11LGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)和 / 或Pol 325-355(RT 158-188)为 AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)。本发明还包括制备融合蛋白的方法，所述的方法包括向表达载体中插入核酸构建体，所述的核酸构建体包含编码具有下式的蛋白质的多核苷酸Ab-(PL-Ag)x或者Ab-(Ag-PL)X ;其中Ab是抗体或其片段；PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；Ag是至少一种病毒抗原；并且X是从I到20的整数；并且将该载体在足以允许所述融合蛋白表达的条件下进行培养。在一个方面，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。在另一个方面，所述的至少一个病毒抗原包括来自腺病毒、逆转录酶病毒、细小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、冠状病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒(orthomyxovirus)、本扬病毒(bunyavirus)、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳 头瘤病毒(papilomavirus)、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒的肽。在一个方面，所述的至少一种病毒抗原包括肽，所述的肽来自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、脊髓灰质炎、天花、风疹、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感或感冒病毒的至少一种。在另一个方面，所述的融合蛋白是Ab的轻链，Ab的重链或者Ab的轻链和重链两者。在另一个方面，所述的Ag选自Nef(66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAA VDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. 1),Nef(116-145) HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gagpl7(17-35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQID NO. 3) ；Gag pl7_p24(253-284) NPPIPVGEIYKRff11LGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.
4)和/ 或 PoI 325-355(RT 158-188)为 AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.5)。本发明的再另一个实施方案包括将抗原特异性的T细胞在体外扩增(expand)的方法，所述的方法包括从HIV患者分离PBMC ;将该经分离的PBMC与有效量的a⑶40.LIP05HIV肽疫苗温育；在有效量的IL-2的存在下扩增所述的PBMC ;收获细胞；并且评估该细胞的细胞因子产量，从而确定抗-HIV特异性的T细胞的存在。另一个实施方案是通过下述方法制备的HIV抗原特异性的T细胞，所述的方法包括从HIV患者分离PBMC ;将该经分离的PBMC与有效量的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗温育；在有效量的IL-2的存在下扩增所述的PBMC ;收获细胞；并且评估该细胞的细胞因子产量，从而确定抗-HIV特异性的T细胞的存在。另一个实施方案是制备的治疗性疫苗的方法，所述的方法包括将树突细胞加载a⑶40. LIP05HIV肽疫苗，所述的a⑶40. LIP05HIV疫苗包括分离HIV患者的单核细胞；使用IFNa和GM-CSF将所述的单核细胞分化成为树突细胞；并且将经分化的树突细胞暴露于a CD40. LIP05HIV肽，其中所加载的树突细胞能够在体外激发自体HIV-肽特异性的T细胞。本发明还包括通过以下方法制备的治疗性疫苗，所述的方法包括将树突细胞加载a⑶40. LIP05HIV肽疫苗，所述的a⑶40. LIP05HIV疫苗包括分离HIV患者的单核细胞；使用IFNa和GM-CSF将所述的单核细胞分化成为树突细胞；并且将经分化的树突细胞暴露于a CD40. LIP05HIV肽，其中所加载的树突细胞能够在体外激发自体HIV-肽特异性的T细胞。另一个实施方案是治疗性疫苗，所述的疫苗包括选自SEQ ID NO. :21、22、23、24、
25、26或者36。本发明的再一个实施方案包括含有融合蛋白的治疗性疫苗，所述的融合蛋白包含式Ab- (PL-Ag) X、Ab- (Ag-PL) x、Ab- (PL-Ag-PL) x、Ab- (Ag-PL-Ag) x、Ab- (PL-Ag) x-PL或者Ab-(Ag-PL)X-Ag ;其中Ab是抗体或其片段；PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；Ag是至少一种病毒抗原；并且X是从I到20的整数。本发明的再一个实施方案包括融合蛋白，所述的融合蛋白包含式Ab-(PL_Ag)x、Ab- (Ag-PL) x、Ab- (PL-Ag-PL) x、Ab- (Ag-PL-Ag) x、Ab- (PL-Ag) x-PL 或者 Ab- (Ag-PL) x-Ag ；其中Ab是抗体或其片段；PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；Ag是至少一种癌症抗原；并且X是从I到20的整数。在一个方面，所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。在另一个方面，所述的Ag选自肿瘤关联的抗原，所述的与肿瘤关联的抗原选自CEA、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE, GAGE、MAGE 1-4,6和12、MUC-相关蛋白(粘液素)(MUC-1、MUC-2等等)、GM2和⑶2神经节苷 月旨、ras、myc、酪氨酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、MARC0-MART、细胞周期蛋白BI、细胞周期蛋白D、Pmel 17 (gplOO)、GnT-V内含子V序列、(N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA) ,PRAME (黑色素瘤抗原)、@_连环蛋白、MUM-I-B (黑色素瘤普遍存在的突变基因产物(melanoma ubiquitous mutated gene product))、GAGE (黑色素瘤抗原)I、BAGE (黑色素瘤抗原)2-10、C-ERB2 (Her2/neu)、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、gp75、人乳头瘤病毒(human papilloma virus) (HPV)E6 和 E7, p53、肺抗性蛋白(lung resistance protein) (LRP)、Bcl_2 和 Ki_67。在另一个方面，所述的 Ag 选自肿瘤相关的抗原，所述抗原包括来自以下疾病的抗原白血病和淋巴瘤、神经肿瘤如星形细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、肠胃肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或者阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或者唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分癌症、甲状腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。在另一个方面，所述的Ag选自以下的至少之一 MWWPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV(SEQ ID NO. 74), LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPO)DSSHD(SEQ ID NO. :75)、LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ ID NO. :76)、NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCS⑶SGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ ID NO. :77)或者 SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQID NO. 78)及其片段。在另一个方面，所述的Ag选自以下的至少之一 MDQVPFSV(SEQ IDNO. 113),ITDQVPFSV(SEQ ID NO. :114)、YLEPGPVTV(SEQ ID NO. :115)、YLEPGPVTA(SEQ IDNO. 116),KTffGQYffQV(SEQ ID NO. 117),DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTII NGSQVffGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVffKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ(SEQ ID NO. 122), PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTffDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTS CGSSPVPAS(SEQ ID NO. :124)、GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO. :126)、QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASS頂STESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYG SFSVTLDIVQ (SEQ ID NO. :128)以及 GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO. :130)及其片段。在另一个方面，所述的Ag选自MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO. :132)和DffLVQVQMKFRLLQETMYMTV SIIDRFMQNNCVPKK (SEQ ID NO. :133)。在另一个方面，所述的Ag选自MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO. :141)、
QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO. :142)、LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ IDNO. 143)和AAGSWAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO. : 144)及其片段的至少一个。在另一个方面，所述的Ag为19到32个氨基酸长。在另一个方面，所述的Ag为17到60个氨基酸长，并选自在PSA或者细胞周期蛋白I中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。在另一个方面，X包括1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或者19。在另一个方面，所述的Ag包含两个或多个来自不同的癌症抗原的癌症肽，并且所述的癌症肽由PL隔开。在另一个方面，所述的Ag由至少一个含有丙氨酸和丝氨酸的PL隔开。在另一个方面,所述的Ag选自SEQ ID NO.74-78、79-86、87-92、93-95、113-117、122-130、132-133 和 141-144。在另一个方面，所述的Ab包含SEQ ID NO. :38和39。在另一个方面，所述的Ab由包含SEQ ID NO. :40和41的核酸表达载体表达。在另一个方面，所述的PL选自SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.
11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO. :12)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ IDNO. 13)或者 TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. : 14)。在另一个方面，所述的 PL 包含丙氨酸和丝氨酸。本发明的再一个实施方案包括抗原递送载体,所述的载体表达抗-⑶40抗体或其片段，及所述的抗-CD40抗体的轻链、重链或轻链和重链两者的羧基末端上的两个或更多个癌症肽，其中当存在两个或更多个癌症肽时，所述的癌症肽由包含至少一个糖基化位点的一个或多个肽接头隔开。在一个方面，所述的一个或多个肽接头选自SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO. :11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQID NO. :12)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO. 13)或者TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO. :14)。本发明的再另一个实施方案包括抗-⑶40融合蛋白，所述的抗-⑶40融合蛋白包含抗-CD40抗体或其片段，及所述的抗-CD40抗体的羧基末端上的一个或更多个癌症肽，其中当存在两个或更多个癌症肽时，所述的癌症肽由包含至少一个糖基化位点的一个或多个肽接头隔开。在一个方面，所述的抗体片段选自Fv'FatKFab' > F (ab' )2、Fc或者ScFv片段。在另一个方面，所述的 Ag 选自 SEQ ID NO. :74-78、79-86、87-92、93-95、113-117、122-130、132-133 和 141-144。
本发明的再一个实施方案包括稳定癌症肽的方法，所述的方法包括将一种或者多种不稳定或者不可溶的癌症肽与抗体掺入融合蛋白中，其中所述的抗体和所述的癌症肽由一个或多个包含一个或多个糖基化位点的肽接头隔开。在另一个方面，所述的融合蛋白包含两个或多个癌症肽，并且所述的癌症肽由一个或更多个肽接头隔开。在另一个方面，所述的融合蛋白包含两个或者多个癌症肽，并且所述的肽由一个或多个肽接头隔开。在另一个方面，所述的融合蛋白包含两个或多个癌症肽，并且所述的肽由含有丙氨酸和丝氨酸的一个或多个接头隔开。在另一个方面，所述的癌症肽选自肿瘤关联的抗原，所述的肿瘤关联的抗原选自CEA、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE, GAGE、MAGE 1-4,6和12、MUC-相关蛋白(粘液素)(MUC-l、MUC-2等等)、GM2和⑶2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART (黑色素瘤抗原)、MARC0-MART、细胞周期蛋白BI、细胞周期蛋白D、Pmel 17 (gplOO)、GnT-V内含子V序列、(N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME (黑色素瘤抗原)、^ -连环蛋白、MUM-I-B (黑色素瘤普遍存在的突变基因产物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE (黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、EBNA (爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、gp75、人乳头瘤病毒(即￥)￡6和￡7，？53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2和Ki-67。在另一个方面，所述的Ag选自肿瘤关联的抗原，所述的抗原包括来自以下 疾病的抗原白血病和淋巴瘤、神经肿瘤如星形细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、肠胃肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或者阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或者唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分癌症、甲状腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。在另一个方面，所述的Ag选自以下的至少之一 MWWPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV(SEQ ID NO. 74), LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPO)DSSHD(SEQ ID NO. :75)、LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ ID NO. :76)、NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ ID NO. :77)或者 SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ IDNO. 78)及其片段。在另一个方面，所述的Ag选自以下的至少之一 MDQVPFSV(SEQ ID NO. :113)、ITDQVPFSV(SEQ ID NO. :114)、YLEPGPVTV (SEQ ID NO. :115)、YLEPGPVTA (SEQ ID NO.116) ,KTffGQYffQV(SEQ ID NO. :117)、DTTEP ATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCffRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVffGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSffSQKRSFVYVffKTWGQYffQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ(SEQID NO. :122)、PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS(SEQ ID NO. 124), GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO. : 126)、QVTTTEffVETTARELPIPEPEGPDASS頂STESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYG SFSVTLDIVQ(SEQID NO. 128)以及 GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO. :130)及其片段。在另一个方面，所述的Ag 选自 MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO. : 132)和 DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK(SEQ ID NO.133)的至少一个。在另一个方面，所述的Ag 选自 MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO. : 141)、QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO. : 142)、LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ ID NO. :143)和 AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO. :144)及其片段的至少一个。在另一个方面，所述的Ag为19到32个氨基酸长。在另一个方面，所述的Ag为17到60个氨基酸长并选自在PSA或者细胞周期蛋白I中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。在另一个方面，X 包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或者 19。在另一个方面，所述的融合蛋白包含来自不同抗原的癌症肽，该癌症肽由不同的肽接头隔开。在另一个方面，所述的融合蛋白包含两个或者多个由包含丙氨酸和丝氨酸的一个或者更多个肽接头隔开。在另一个方面，所述的抗体包含SEQ ID NO. :38和39。在另一个方 面，所述的融合蛋白由核酸表达载体表达，所述核酸表达载体包含SEQ ID NO. :40和
41。在另一个方面，所述的肽接头选自 SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. :11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO. : 12)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ IDNO. 13)或者 TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. :14)。本发明的再另一个实施方案包括增强T细胞响应的方法，所述的方法包括使用有效量的疫苗对需要接种的受试者进行免疫，所述的疫苗包含融合蛋白，所述的融合蛋白包含抗-CD40抗体或其部分及连接到所述的抗-CD40抗体的羧基末端的一个或者更多个癌症肽。在另一个方面，所述的癌症肽选自肿瘤关联的抗原，所述的肿瘤关联的抗原选自CEA、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE, GAGE、MAGE 1-4,6 和 12、MUC-相关蛋白(粘液素)(例如MUC-l、MUC-2等等)、GM2和⑶2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART (黑色素瘤抗原)、MARC0-MART、细胞周期蛋白BI、细胞周期蛋白D、Pmel 17(gpl00)、GnT-V内含子V序列、(N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME (黑色素瘤抗原)、P -连环蛋白、MUM-I-B (黑色素瘤普遍存在的突变基因产物)、GAGE (黑色素瘤抗原)I、BAGE (黑色素瘤抗原)2-10、C-ERB2 (Her2/neu)、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、gp75、人乳头瘤病毒(HPV) E6和E7，p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2和Ki-67。在另一个方面，所述的Ag选自肿瘤关联的抗原，所述的抗原包括来自以下疾病的抗原白血病和淋巴瘤、神经肿瘤如星形细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、肠胃肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或者阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或者唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分癌症、甲状腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。本发明的再另一个实施方案包括制备抗-⑶40抗原融合蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞中表达包含抗-CD40抗体或其片段的融合蛋白，所述的融合蛋白在所述的抗-CD40抗体或其片段的羧基末端包含一个或更多个的癌症肽，其中当存两个或多个癌症肽由一个或多个接头隔开时，至少一个接头包含糖基化位点；并且分离该融合蛋白。在另一个方面，将在宿主中表达的融合蛋白进一步地分离和纯化。在另一个方面，所述的宿主是真核细胞。在另一个方面，所述的癌症肽选自肿瘤关联的抗原，所述的肿瘤关联的抗原选自CEA、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE, GAGE、MAGE1_4、6 和 12、MUC-相关蛋白(粘液素)(MUC-1、MUC-2等等)、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART (黑色素瘤抗原)、MARCO-MART、细胞周期蛋白BI、细胞周期蛋白D、Pmel 17(gpl00)、GnT-V内含子V序列、(N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME (黑色素瘤抗原)、P -连环蛋白、MUM-I-B (黑色素瘤普遍存在的突变基因产物)、GAGE (黑色素瘤抗原)I、BAGE (黑色素瘤抗原)2-10、C-ERB2 (Her2/neu)、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、gp75、人乳头瘤病毒(HPV) E6和E7，p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2和Ki-67。在另一个方面，所述的癌症肽选自肿瘤关联的抗原，所述的抗原包括来自以下疾病的抗原白血病和淋巴瘤、神经肿瘤如星形细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、肠胃肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或者阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或者唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分癌症、甲状腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。在另一个方面，所述的癌症肽选自以下的至少之一 MWWPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGW ECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV(SEQ ID NO. 74),LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPO)DSSHD(SEQ ID NO. :75)、LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ ID NO. :76)、 NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ ID NO. :77)或者 SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ IDNO. 78)o在另一个方面，所述的癌症肽选自以下的至少之一MDQVPFSV(SEQ ID NO.113),ITDQVPFSV(SEQ ID NO. : 114)、YLEPGPVTV(SEQ ID NO. :115)、YLEPGPVTA(SEQ ID NO.116),KTffGQYffQV(SEQ ID NO. :117)、DTTEP ATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIffVNNTIINGSQVffGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVffKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ(SEQ ID NO. 122), PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTffDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTS CGSSPVPAS(SEQ ID NO. :124)、GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO. 126),QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYG SFSVTLDIVQ (SEQ ID NO. :128)以及 GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEQ ID NO. :130)及其片段。在另一个方面，所述的癌症肽选自MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO. :132)和 DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK(SEQ ID NO.133)的至少一个。在另一个方面，所述的癌症肽选自MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO. 141), QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO. :142)、LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ ID NO. :143)和 AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO. 144)及其片段的至少一个。本发明的再另一个实施方案包括将抗原特异性的T细胞在体外扩增的方法，所述的方法包括从癌症患者分离外周血液单核细胞(PBMC);将该经分离的PBMC与产生免疫反应量的a CD40-(PL-Ag)X或者a CD40-(Ag-PL)x疫苗进行温育；其中Ag是肿瘤关联的抗原，并且X是I到20的整数；在有效量的IL-2的存在下扩增所述的PBMC ;收获细胞；并且评估该细胞的细胞因子产量，从而确定抗癌症特异性的T细胞的存在。本发明的再另一个实施方案包括与肿瘤关联的抗原特异性T细胞，所述的T细胞通过下述方法制备从癌症患者分离外周血液单核细胞；将该经分离的PBMC与产生免疫反 应的量的a⑶40-(PL-Ag) X或者a⑶40-(Ag-PL) X疫苗进行温育；其中Ag是肿瘤关联的抗原，并且X是I到20的整数；在有效量的IL-2的存在下扩增所述的PBMC ;收获细胞；并且评估该细胞的细胞因子产量，从而确定抗抗原特异性的T细胞的存在。本发明的再另一个实施方案包括含有融合蛋白的治疗性疫苗，所述的融合蛋白包含式Ab_ (PL-Ag) x、Ab- (Ag-PL) x、Ab- (PL-Ag-PL) x、Ab- (Ag-PL-Ag) x、Ab- (PL-Ag) x-PL 或者Ab-(Ag-PL)X-Ag ;其中Ab是抗体或其片段；PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；Ag是至少一种癌症抗原；并且X是从I到20的整数。


为了更完全地理解本发明的特征和优点，在此参考本发明的详述及所附的图，并且其中图I显示了与不同的HIV肽融合的蛋白质A亲和性重组抗体(第I至5泳道)，所述的重组抗体由经转染的293F细胞分泌，经还原性SDS. PAGE及考马斯亮蓝染色分析。图2显示了与不同的HIV肽融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第I和第2泳道)，所述的重组抗体由经转染的293F细胞分泌，随后通过还原性SDS. PAGE及考马斯亮蓝染色分析。图3显示了与不同的HIV肽链融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第I到第5泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，并经还原性SDSPAGE和考马斯亮蓝染色分析。图4显示了与不同的HIV肽链融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第I到第6泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，并经还原性SDSPAGE和考马斯亮蓝染色分析。图5描述了在体外使用的方案，用于分析a⑶40. LIP05HIV肽融合重组抗体(a⑶40. LIP05rAb)在PBMC培养物的环境下引发抗原特异性的T细胞扩增的效力。图6显示了在来自HIV患者的PBMC中，HIV肽特异性的IFNy的产生，所述的PBMC与不同浓度的抗CD40. LIP05肽链疫苗进行温育。C是对照组，其未接受疫苗，并且标出了培养物对各个肽的基线响应。图7是a⑶40. LIP05肽疫苗针对来自8例HIV患者的5个肽区域的响应的总结。图8显示了 a⑶40. LIP05HIV肽疫苗引发能分泌多种细胞因子的对HIV肽特异性的T细胞的扩增-疫苗的希望得到的特征。图8还显示了 a⑶40. LIP05HIV肽引发gag253、nef66、nef 116和pol325肽特异性的响应，其特征在于多种细胞因子的产生(患者A5)。图9显示了用于检测a⑶40. LIP05HIV肽疫苗指导抗原特异性T细胞扩增的能力的方案，所述的T细胞从DC的靶向摄取及在其表面MHC复合物上呈现肽表位得到。图10显示了响应于来自DC-T细胞共培养物的HIV肽的细胞因子分泌，所述的DC-T细胞共培养物使用不同剂量的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗进行处理(患者A10)。图11显示了将来自患者A4的PBMC用a⑶40. LIP05HIV肽疫苗处理，引发对gag253区域有特异性，而对可变的接头序列无特异性的抗原-特异性的T细胞的扩增。图12A是显示了粗体可变的接头区域，下划线的连接序列和涂成灰色的HIV肽区域的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗的重链序列。图12A显示了使用a⑶40. LIP05HIV肽疫苗处理来自患者A3的PBMC，引发了抗原特异性T细胞的增殖，所述的抗原特异性T细胞对 gag253、nef66和nefll6有特异性，而对可变的接头序列没有特异性。图12B显示HIV患者A17PBMC与30nM的三种不同的HIV5肽DC靶向疫苗温育所引起的HIV抗原特异性T细胞响应。图12C是与图12B中显示类似的研究，除了 PBMC是来自不同的HIV患者(A2)外。图12D显示了 15个不同的HIV肽响应[从3例患者中取样的5个肽区域]，发现抗-⑶40.HIV5pep疫苗在引发广谱的HIV肽特异性CD8+和CD4+T响应中，优于抗-DCIR. HIV5p印、抗-L0X-1. HIV5pep和非-LIP05的混合物。图13 显示了抗-CD40mAb :IL_4DC 的内在化。将 IL-4DC 使用 500ng/ml 的抗-CD40-Alexa 568进行处理。图14显示了由抗-⑶40HA1靶向的DC增殖⑶4和⑶8T细胞。将加载了 2ug/ml的抗-CD40-HA或者对照Ig-HAl的5xl0e3IFNDC与标记了 CFSE的自体CD4+或CD8+T细胞共同温育7天。随后将细胞使用抗-⑶4或者抗-⑶8抗体进行染色。通过测定CFSE稀释来检测细胞的增殖。图15显示了 HAl融合蛋白针对CD4+T增殖的滴定。将加载了融合蛋白的IFNDC (5K)与标记了 CFSE的⑶4+T细胞(200k)共培养7天。图16显示了由抗-⑶40-HA1靶向的IFNDC激活HAl-特异性的⑶4+T细胞。将⑶4+T细胞使用加载了 5 u M的标记肽的DC进行再活化，并且随后进行细胞外IFN y染色。图17显示了由抗-⑶40-HA1靶向的IFNDC激活HAl-特异性的⑶4+T细胞。将CD4+T细胞使用加载了 5 u M的标记肽的DC进行再活化36小时，并且随后分析培养物上清以测量其IFNy。图18显示了靶向⑶40导致了 MAR T-I特异性的⑶8+T细胞的增强的交叉敏化(cross priming)。将加载了融合蛋白的IFNDC (5K/孔)与经纯化的⑶8+T细胞共培养10天。将细胞使用抗-CD8和四聚体进行染色。细胞来自健康的供体(HLA-A*0201+)。图19显示了靶向⑶40导致MART-I特异性的⑶8+T细胞的增强的交叉敏化(使用来自不同的健康供体的细胞进行的8次重复的实验的总结)。图20显示了使用抗-⑶40-MART-1靶向的IFNDC诱导的⑶8+CTL是有功能的。与使用融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+T细胞与加载了 10 肽表位的T2细胞进行混
八
口 o图21显示了使用IFNDC诱导的⑶8+CTL是有功能的，所述的IFNDC使用抗-CD40-Flu Ml进行靶向。将与融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+ T细胞与加载了I. OnM肽表位的T2细胞混合。图22显示了测试由连接到PSA(前列腺特异性抗原)的抗-⑶4012E12组成的疫苗引发原态T细胞群体扩增的能力的方案的概括。对应于宽范围的PSA表位的PSA特异性CD4+T细胞。总地来说，将与健康供体的单核细胞的IFN a和GM-CSF培养得到的DC与该疫苗进行温育。次日，将细胞放置在新鲜的培养基中，并加入同一供体的纯⑶4+T细胞。几天之后，加入PSA肽，并且在4小时之后测定在培养物上清中分泌的Y -IFN水平。图23显示了多种PSA肽引发产生强烈的Y-IFN的响应，这表明抗-⑶4012E12和类似的抗-CD40剂能有效地将抗原递送到DC，导致引发针对该抗原的多个表位的免疫应答的敏化。
图24显示了抗-CD40-PSA靶向的DC诱导PSA-特异性的CD8+T细胞响应。使用lug mAb融合蛋白将IFNDC与PSA进行靶向。将经纯化的自体⑶8+T细胞共培养10天。将细胞使用抗-⑶8和PSA(KLQCVDLHV)-四聚体进行染色。细胞来自HLA_A*0201阳性的健康供体。该结果证实了抗-⑶40将PSA有效地递送到DC，而DC反过来引发PSA特异性的⑶8+T细胞的扩增。图25示意图(左)以及肽池中T细胞的IFN y产生，以及对照表示供体2。将加载了 g/ml的抗-⑶40-细胞周期蛋白Dl的5xl0e3IFNDC与经纯化的自体⑶4+T细胞(2xl0e5)共培养8天。随后将细胞与5 ii M的得自细胞周期蛋白Dl的单个肽在布雷菲德菌素甲A(Brefeldin A)的存在下再刺激5小时。将细胞进行染色，从而测量细胞内的IFNY表达。图26显示了肽的扫描，以及在图25所示的肽池中得到的T细胞的IFNy产生，并且对照表示供体2。将加载了 2 u g/ml的抗-⑶40-细胞周期蛋白Dl的5xl0e3IFNDC与经纯化的自体⑶4+T细胞(2xl0e5)共培养8天。随后将细胞与5 y M的得自细胞周期蛋白Dl的单个肽在布雷菲德菌素甲的存在下再刺激5小时。将细胞进行染色，从而测量细胞内的IFN y表达。图27显示了抗-⑶40-MART-1肽抗体的表达和构建体设计。图28是MART-I的⑶4+和⑶8+免疫显性表位的总结。图29显示了抗-⑶40_gpl00肽抗体的表达和构建体设计。图30显示了附加的抗-⑶40_gpl00肽抗体的设计。图31显示了附加的抗-⑶40_gpl00肽抗体的表达和构建体设计。图32是gplOO中对CD4+和CD8+免疫显性表位的总结。图33显示了附加的抗-⑶40_gpl00肽抗体的表达和构建体设计。图34A显示了融合到任一抗体的H链的C末端的全长的细胞周期蛋白BI或者凝集蛋白(cohesion)不能从哺乳动物的293F细胞中分泌。图34B显示了融合到任一抗体的H链的C末端的全长的细胞周期蛋白BI或者黏联蛋白不能从哺乳动物的293F细胞中分泌。图35显示了基于已知的或者推测的结构域区的细胞周期蛋白BI分割策略。图36显示了细胞周期蛋白Dl的片段pl、p3和p4而非p2在直接融合到H链的C末端时表达良好。图37显示了与可变的接头序列进行不同组合，直接融合到H链C端时，不同细胞周期蛋白Dl片段的相对表达水平。图38显示了不同的H链-细胞周期蛋白Dl片段构建体及其作为疫苗的相对的表达能力的总结。图39显示了融合到靶向DC的抗体H链的C末端的全长细胞周期蛋白Dl作为分泌的重组抗体表达很差。发明描述尽管在下文中详细讨论了本发明的不同实施方案的制备和使用，应该认识到，本发明提供了多种可实施的发明构思，所述发明构思能在多种特定的环境下实施。在此讨论的特定实施方案仅仅是用于制备及使用本发明的具体方式的说明，而不限制本发明的范
围。 为了便于理解本发明，在下文定义了多个术语。在此定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员一般所理解的含义。术语如“一个(a)”，“一个(an)”及“该(the) ”不是仅指单个的实体，而是包括其具体实例可以用于说明的大类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方式
，然而其使用不限制本发明，除非在权利要求中指出。本发明还包括抗体(或者“Ab”)或其片段的变体和其他改变，例如抗-⑶40融合蛋白(抗体与术语“免疫球蛋白”可交换地使用)。如本文中所使用的，术语“抗体或其片段”包括完整的抗体或者抗体的片段，例如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2、Fe、及单链的Fv片段(ScFv)或者任意生物上有效的能特异性地结合于例如CD40的免疫球蛋白片段。来自人类或者是人源化抗体在人类中具有降低的免疫原性或者没有免疫原性，并且与非人类的抗体相比，具有更低数量的免疫原性表位或者没有免疫原性表位。一般地选择在人类中具有降低水平的免疫原性，或者没有免疫原性的抗体及其片段。如本文中所使用的，术语“Ag”或者“抗原”指能够结合于免疫球蛋白分子的抗原结合区域，或者能够引发免疫应答的物质，所述的免疫应答如通过将抗原呈递到主要组织相容性抗原(MHC)细胞蛋白的T细胞介导的免疫应答。如本文中所使用的，“抗原”包括但不限于抗原决定簇、半抗原及免疫原，所述的免疫原可以是肽、小分子、碳水化合物、脂类、核酸或其组合。熟练的免疫学家能够认识到，当讨论处理从而呈递到T细胞上的抗原时，术语“抗原”是指由MHC呈递到T细胞受体上的T细胞表位的抗原的那些部分(例如肽的片段)。在B细胞介导的免疫应答的环境下，以对“抗原”特异性的抗体的形式使用时，结合到抗体(轻链和重链)的互补决定区的抗原的部分，该结合部分可以是线性的或者三维的表位。在本发明的环境下，术语抗原在两个环境下使用，即，抗体对于蛋白质抗原(CD40)是特异性的，但还携带一个或多个用于由MHC呈递到T细胞上的肽表位。在特定的情况下，将本发明的疫苗或者融合蛋白所递送的抗原内在化，并在呈递之前通过抗原呈递细胞进行加工，例如通过切割所述抗体或者融合蛋白的一个或多个部分。如本文中所使用的,术语“抗原肽(antigenic peptide) ”指特异性地由B-细胞或者T-细胞识别的多肽抗原的那部分。B细胞通过抗体的产生对外来的抗原决定簇作出响应，而T-淋巴细胞是介导细胞免疫。因此，抗原肽是抗原被抗体所识别的那些部分，或者在MHC的环境下，是抗原被T-细胞受体所识别的那些部分。如本文中所使用的，术语“表位”指能特异性地结合到免疫球蛋白，或者由主要组织相容性抗原(MHC)蛋白(如I类的或者I类的)呈递到T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇一般地是5-30个氨基酸长的短肽，其适合MHC分子的沟槽，所述的MHC分子向T细胞受体呈现特定的氨基酸侧链，并在沟槽中具有特定的其他残基，例如由于沟槽的特定的电荷特征，肽的侧链和T细胞受体。一般来说，当解离常数是ImM、IOOnM或者甚至IOnM时，抗体特异性地结合于抗原。如本文所使用的，术语“载体(vector)”在两个不同的环境下使用。当使用术语“载体”指疫苗时，载体用于描述用于指导或者递送疫苗的抗原部分的非抗原部分。例如，可以将抗体或者其片段连接到引发免疫应答的抗原上，或者与该抗原形成融合蛋白。对于细胞疫苗来说，递送和/或呈递抗原的载体是抗原呈递细胞，其由加载了抗原的细胞进行递送。在特定的情况下，细胞载体自身也可以加工抗原(或多种抗原)，并将其呈递到T细胞，并且激发抗原特异性的免疫应答。当在核酸的环境下使用时，“载体”指构建体，所述的构建体能够在宿主细胞中递送，并且优选地能够表达一个或多个感兴趣的基因或者多核苷酸序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或者RNA表达载体、与阳离子缩合(eondensing)剂有关的DNA或者RNA表达载体、包裹在脂质体和特定的真核细胞如生产细胞(producer cell)中的DNA或者RNA表达载体。 本发明的组合物和方法可以与大范围的肽和/或蛋白使用，其中抗体或其片段和肽接头或者“PL”形成稳定的和/或可溶的蛋白。如本文中所使用的，所述的组合物和方法使用包含下式的递送载体=Ab-(PL-Ag)X或者Ab-(Ag-PL)X ;其中Ab是抗体或其片段；PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头；Ag是至少一种病毒抗原；并且X是从I到20的整数。用于本发明的抗体的一个 实例一个包括抗 _CD40_12E12. 3F3 (ATCC 登记号 PTA-9854)、抗 _CD40_12B4. 2C10(保藏编号 HS446, ATCC 登记号 PTA-10653)和抗 _CD40_11B6. 1C3(保藏编号 HS440, ATCC 登记号PTA-10652)的可变区。如本文中所使用的，术语“稳定的”和“不稳定的”当其指蛋白时，用于描述保持其三维结构和/或活性(稳定的)，或立刻或随时间失去其三维结构和/或活性(不稳定的)的肽或蛋白质。如本文中所使用的，术语“不溶的”指在细胞中产生时(例如在真核或者原核细胞中，或者在体外表达的重组蛋白)，在不使用变性条件或者变性剂(例如分别地热或者化学变性剂)的情况下在溶液中不可溶。发现在本文中教导的抗体或其片段及接头将具有所述的肽的抗体融合蛋白从不可溶和/或不稳定转化成稳定和/或可溶的蛋白。另一个稳定性与不稳定性的实例是，在同样的溶液中测量时，蛋白的功能域具有稳定的构型时，其具有比蛋白的不稳定功能域更高的熔化温度CU。当在同样的溶液中测量时，如果Tm的差为至少约2°C，一个功能域与另一个功能域相比是稳定的，所述的差更优选地为约4°C，再更优选地为约7°C，又更优选地为约10°C，还更优选地为约15°C，再更优选地为约20°C，还再优选地为约25°C，以及最优选地为约30°C。如本文中所使用的，“多核苷酸”或者“核酸”指单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的链(包括天然核苷酸的已知类似物)。双链的核酸序列包括互补的序列。所述的多核苷酸可以编码免疫球蛋白的可变区和/或恒定区，所述的免疫球蛋白的可变区和/或恒定区与一个或多个接头形成融合蛋白。在本发明的应用中，可以将多克隆位点(MCS)改造为抗体的重链和/或轻链的羧基末端的位置，从而使得能在接头之间框内插入所表达的肽。如本文中所使用的，术语“经分离的多核苷酸”指来自基因组、cDNA、或者来自合成的多核苷酸或其一些组合。由于其来源，所述的“经分离的多核苷酸”(I)其从本质上与发现该“经分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或者部分不相关；(2)其可操作地连接到在自然条件下不与之连接的多核苷酸；或者(3)在自然条件下不以更大的序列的部分出现。本领域技术人员能够意识到，可以使用本领域中已知的技术在核酸的层面上进行操作，从而设计和完成具有式Ab-(PL-Ag)X或者Ab-(Ag-PL)X的载体，所述的现有技术中已知的技术如 John Wiley 和 Sons, Current Protocols in Molecular Biology, 2007 中教导的，其相关的部分在此引入作为参考。总地来说，可以使用聚合酶链式反应、寡核苷酸的酶促插A (enzymatic insertion)或者载体中的聚合酶链式反应片段插入Ab、Ag和PL的编码核酸序列，所述的载体可以是表达载体。为了便于在抗体的轻链、重链或者轻链和重链两者的羧基末端插入(PL-Ag)x或者(Ag-PL)x，可以使用所述的抗体序列按顺序改造多克隆位点(MCS)。如本文中所使用的，术语“多肽”指氨基酸的聚合物，而不指特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义之内。此术语不表示或者排除所述多肽的表达后修饰，所述表达后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。定义中所包括的例如，含有一个或多 现有技术中已知的修饰，所述的修饰可以是天然产生的和非天然产生的。术语“功能域”或者“多肽功能域”指在天然构型下，折叠成单个球形功能域的多肽序列，其可以显示出分离的(discrete)结合或者功能性能。多肽或者氨基酸序列“得自”指明的核酸序列，指多肽具有与该序列中编码的多肽相同的氨基酸序列或其部分，其中所述的部分由至少3-5个氨基酸构成，优选地由4-7个氨基酸构成，更优选地由至少8-10个氨基酸构成，以及还更优选地由11-15个氨基酸构成；或者所述的多肽与该序列中编码的多肽在免疫上是可识别的。该术语还包括从所指明的核酸序列表达的多肽。如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”指任意的材料，所述的材料当与本发明的免疫球蛋白(Ig)融合蛋白结合时，使得所述的Ig能保持生物活性，并且一般地与受试者的免疫系统不反应。实例包括，但不限于标准的药物载体如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液，及不同类型的润湿剂。可以在本发明中使用特定的稀释剂，例如，对于气雾剂或者肠道外给药，所述的稀释剂可以是磷酸盐缓冲盐水，或者生理(0.85%)盐水。本发明提供了 CD40结合分子，所述的结合分子包括至少一个免疫球蛋白轻链可变区(')，其包括按顺序的超可变区⑶Rly⑶R2[和⑶R3y所述的⑶RL具有氨基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO. :41)，所述的 CDR2l 具有氨基酸序列 YTSILHS (SEQ ID NO. 42),以及所述的⑶R3l具有氨基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO. :43)，并且所述的结合分子的氨基酸序列显示于SEQ ID NO. 37中；及其直接的等价物。相应地，本发明提供了⑶40结合分子，所述的结合分子包括至少一个免疫球蛋白重链可变区(Vh)，其包括按顺序的超可变区⑶R1h、⑶R2h和⑶R3h，所述的⑶RIh具有氨基酸序列GFTFSDYYMY(SEQ ID NO. :44)，以及所述的CDR2H具有氨基酸序列YINSGGGSTYYPDTVKG (SEQ ID NO. 45)，以及所述的 CDR3H 具有氨基酸序列 RGLPFHAMDY (SEQID NO. :46)，并且所述的结合分子的氨基酸序列显示于SEQ ID NO. 38中；及其直接的等价物。
在一个方面，本发明提供了单功能域的CD40结合分子，所述的分子包含经分离的免疫球蛋白轻链，所述的轻链包含前文所定义的重链可变区(\)。在另一个方面，本发明提供了单功能域的CD40结合分子，所述的分子包含经分离的免疫球蛋白重链，所述的重链包含前文所定义的重链可变区(Vh)。在另一个方面，本发明还提供了包括重链(Vh)和轻链(Vl)可变区两者的⑶40结合分子，其中所述的CD40结合分子包含至少一个抗原结合位点，所述的CD40结合分子包含a)免疫球蛋白的重链可变区(VL)，其包含按顺序的超可变区⑶Rlp⑶R2[和⑶R3y所述的CDRlL具有氨基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO. :41)，所述的CDR2l具有氨基酸序列 YTSILHS (SEQ ID NO. :42)，以及所述的 CDR3l 具有氨基酸序列 QQFNKLPPT (SEQ ID NO.43)，并且所述的结合分子的氨基酸序列显示于SEQ ID N0.1中；以及b)免疫球蛋白轻链可变区(VH)，其包含按顺序的超可变区⑶R1h、⑶R2h和⑶R3h，所述的⑶RIh具有氨基酸序列GFTFSDYYMY (SEQ ID NO. :44)，所述的 CDR2H 具有氨基酸序列 HNSGGGSTYYPDTVKG (SEQ IDNO. :45)，以及所述的0 311具有氨基酸序列RGLPFHAMDY (SEQ ID NO. :46)，并且所述的结 合分子的氨基酸序列显示于SEQ ID NO. 38中；及其直接的等价物。除非另外地指明，任意的多肽链在本文中都描述为具有从N-末端开始，并在C末端结束的氨基酸序列。如果抗原结合位点包括Vh和'区两者，其可以位于同一多肽分子上，或者优选地，各个区可以位于不同的链上，其中Vh区为免疫球蛋白的重链或其片段的部分，以及\为免疫球蛋白的轻链或其片段的部分。本发明的抗体靶向的抗原的非限定性实例包括，但不限于细胞表面标记物，其选自 I 类 MHC、II 类 MHC、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MACRO、DEC-205、甘露糖受体、胰岛蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN- y受体和IL-2受体、ICAM-I、Fe y受体、T细胞受体、凝集素或者其他的免疫细胞受体。在一个特定实例中，由本发明的抗体部分所靶向的所述抗原是由抗原呈递细胞特异性地表达的，所述的抗原呈递细胞例如树突细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和B细胞。如本文中所使用的，术语“CD40结合分子”指单独地或者与其他的分子相关联时能结合于CD40抗原的任意分子，其具有本文教导的\和Vh CDR的一种或多种，在一些情况下具有2、3、4、5或者全部的6个CDR。结合反应可以通过标准方法(定性测定)显示，所述的方法例如通过阻碍其他分子与CD40的结合进行测定的生物测定，或者任意种类的结合或活性测定(例如免疫应答的激发、减少或者调节)，上述的测定以阴性对照测试作为参考，在该阴性对照测试中，使用具有不相关的特异性但是属于同一同种型(isotype)的抗体，例如抗-CD 25或者抗-CD 80抗体。本发明还可以制成单链的抗体，所述的单链抗体中，抗体的重链和轻链可变区由肽接头共价地连接，所述的肽接头包含10到30个氨基酸，优选地15-25个氨基酸。因此，该结构不包括重链和轻链的恒定部分，并且认为小肽间隔区比整个的恒定部分具有较少的免疫原性。如在本文中所使用的，术语“嵌合抗体”指重链或者轻链或者重链和轻链两者的恒定区为人类来源，而重链和轻链两者的可变区为非人(如小鼠、仓鼠或者大鼠)的，或者是人类来源但是来自不同的人类抗体的抗体。
如本文中所使用的，术语“⑶R-移植抗体”指高度可变的互补决定区(complementarity determining regions)得自供体的抗体,如非人类(例如小鼠)的抗体或者不同的人类抗体，而免疫球蛋白的其他部分的全部或者基本上全部(例如可变区的恒定区域)得自受体抗体(人化抗体的情形下-人类来源的抗体)。CDR移植抗体可以在构架区，例如在接近高度可变区的构架区域的部分包括供体序列的若干氨基酸。如本文中所使用的，术语“人类抗体”指重链和轻链两者的恒定区和可变区均属人类来源，或者大体上与人类来源的序列相同，而不一定来自同一个抗体的抗体，其包括由小鼠产生的抗体，其中小鼠、仓鼠或者大鼠的免疫球蛋白的可变和恒定部分基因已经由其人类等价物替代，例如，其一般描述于EP 0546073B1、第5，545，806号美国专利、第5，569，825号美国专利、第5，625，126号美国专利、第5，633，425号美国专利、第5，661，016号美国专利、第5，770，429号美国专利、EP 0438474B1和EP 0463151B1中，相关的部分在此结合作为参考。本发明的⑶40结合分子可以是人源化抗体，该抗体包含得自抗-⑶4012E12. 3F3、抗-⑶40 11B6. 1C3或者抗-⑶40_12B4. 2C10抗体的⑶R。嵌合抗体的一个实例包括重链 和轻链两者的可变区具有人类来源，例如抗⑶40_12EI2. 3F3抗体，SEQ ID NO. :151或者SEQ ID NO. :152 中的抗-CD4012B4. 2C10 和 / 或抗-CD40_11B6. 1C3，SEQ ID NO. :153 和SEQ ID NO. :154或其组合的那些可变区，所述的CD40_12EI2. 3F3抗体是SEQ ID NO. :148和SEQ ID NO. :149的部分。所述的恒定区功能域优选地包括适用的人类恒定区功能域，例如描述于"Sequences of Proteins of Immunological Interest" , Kabat E. A.等人，US Department of Health and Human Services,Public Health Service, N ationalInstitute of Health中。其核酸序列可见于例如SEQ ID NO. :8和9。超可变区可以与任意类型的构架区关联，所述的构架区例如为人类来源的。适用的构架区由Kabat E.A.描述。一种重链构架是抗-⑶40_12E12. 3F3抗体，抗-CD40-12B42C10-SEQ ID NO. :151 或者 SEQ ID NO. :152 和 / 或抗-CD40-11B6. 1C3-SEQID NO. :154或其组合，例如FR1L、FR2L、FR3L和FR4L区的重链构架，所述的抗-CD40_12E12. 3F3抗体是SEQ ID NO. :149的部分。以类似的方式，SEQ ID NO. 148显示了抗 _CD40_12E12. 3F3(或者分别为抗-CD40_12B4. 2C10 和抗-CD40_11B6. 1C3, SEQ IDNO. 150和153的等价物)重链构架，所述的构架包含FRIh, FR2h、FR3h和FR4H的序列。所述的CDR可以加到人类抗体构架上，例如在授予Rybak等人的7，456，260中所描述的，其教导了新的人类可变链构架区及包含该构架区，相关的部分和构架序列的人源化抗体，其在此引入作为参考。为了完成遗传学水平上的植入，本发明还包括VL和VH区的基本核酸序列，以及完整的抗体和其人源化类型，本发明的核酸序列包括SEQ ID NO. :155和156，其分别地为抗-CD40抗体的轻链和重链，以及包括核酸序列，所述的核酸序列包含用于同样的氨基酸序列及其保守的变体的可变密码子，所述的保守的变体在核酸或者氨基酸水平上具有85%、90%、95%或者100%的序列同源性。类似地，⑶R分别地，成组地或者2、3、4或者5个或者全部一起可以在核酸或者氨基酸水平上具有85 %、90 %、95 %或者100 %的序列同源性。一般在非人的系统中刺激生成(raise)抗在所有人类中天然地发现的蛋白质的单克隆抗体，例如在小鼠中，因此其一般地为非人类的蛋白质。这一点的直接后果是，由杂交瘤产生的异基因抗体当给药到人类时，引起不想要的，主要由所述的异基因抗体的恒定区所介导的免疫应答。异基因抗体容易引起宿主免疫应答，从而限制了该抗体的用途，由于其不能在长时间内给药。因此，使用单链的、单功能域的、嵌合的、CDR-移植的或者尤其地人类的抗体是特别有用的，该抗体在给药到人类时，不太可能引起显著的异基因响应。本发明包括在氨基酸序列上有小的改变的抗体，所述的改变如一个、几个或者甚至数个氨基酸的缺失、增加或者取代，所述的有小的改变的抗体仅仅是原蛋白的等位形式，其具有基本上相同的性质。可以在不同的检测中方便地测试针对CD40与其受体的结合的抑制，所述的检测描述于下文。术语“到同样的程度”意味着在前文中提到的检测中，在统计学的意义上，对照和等价的分子显示出本质上相同的CD40结合抑制曲线。例如所使用的检测可以是本发明的结合分子对CD40的结合的竞争性抑制检测。一般地说，人类的抗-⑶40抗体至少包含(a) —个轻链，其包含可变区和人类轻链的恒定部分，所述的可变区具有与SEQ ID NO. I中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，所述的SEQ ID NO. I从第I位的氨基酸开始，到第107位的氨基酸结束；以及(b) 一个重链，其包含可变区和人类重链的恒定部分，所述的可变区具有与SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。人类的重链的恒定部分可以是Y I、Y 2、Y 3、y4、P2或者5或者e类型，优选地为Y类型,然而人类轻链的恒定部分可以为K或者入类型(其包括了 X I、X 2和X 3亚型)但是优选为K类型。可变区和恒定区的一般位置上的氨基酸序列在本领域中是已知的，并一般地符合Kabat命名法。本发明的⑶40结合分子可以通过重组DNA技术生产。因此，必须构建编码该结合分子的一个或多个DNA分子，使其和合适的控制序列在一起，并将其转移到适合的宿主生物中进行表达。以非常一般的方式相应地提供了 (i)编码本发明的CD40结合分子的单个功能域的DNA分子，本发明的单链CD40结合分子，本发明的CD40结合分子的重链或者轻链或其片段；以及(ii)本发明的DNA分子通过重组方法在生产本发明的CD40结合分子中的用途。现有技术的当前状态是，本领域技术人员可以根据本文中所提供的信息合成本发明的DNA分子，即，超可变区的氨基酸序列和编码其的DNA序列。构建可变区基因的方法例如描述于EPA 239,400中，其相关的部分在此结合作为参考。总地来说，克隆了编码MAb的可变区的基因。确定编码构架和超可变区的DNA片段，并且除去了编码所述的超可变区的DNA片段，从而使编码所述的构架区的DNA片段在连接处与适合的限制性位点融合。所述的限制性位点可以按照标准步骤，通过DNA分子的诱变在合适的位置产生。根据SEQ ID NO. I和3或者2和4 (分别为氨基酸和核酸序列)中给出的序列，通过DNA合成制备了双链的合成CDR盒。这些盒通常提供为具有粘性末端,从而其能连接到构架的结合处(junction)。为了得到编码本发明的所述的CD40结合分子的DNA构建体，没有必要从生产的杂肿瘤细胞系中得到mRNA。例如，第WO 90/07861号PCT申请就通过重组DNA技术生成抗体给出了完整的指示，其仅给出了关于基因的核苷酸序列的书面信息，其相关的部分在此结合作为参考。总地来说，该方法包括多种寡核苷酸的合成，其通过PCR方法的扩增，以及其剪切从而得到所想要的DNA序列。包括适合的启动子的表达载体或者编码重链和轻链的恒定部分的基因可以公开获得。因此，一旦制备了本发明的DNA分子，其可以方便地转移到合适的表达载体中。也可以通过标准的方法，例如WO 88/1649中所描述的方法制备编码单链抗体的DNA分子。在前文的基础上，说明书的充分公开不必进行杂交瘤或者细胞系的保藏。例如，制备了特异性地结合到⑶40上的第一和第二 DNA构建体。总地来说，第一DNA构建体编码轻链或其片段，并且包含a)第一部分，该部分编码可变区，所述的可变区包含构架和超可变区的二者之一，所述的超可变区位于序列CDRlp CDR2l和CDR3[中，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO. I中；该第一部分从编码所述的可变区的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码所述可变区的最后一个氨基酸的密码子结束，以及b)第二部分，该第二部分编码轻链恒定部分或其片段，其从编码重链的恒定部分的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子处结束，随后为终止密码子。所述的第一部分编码可变区，该可变区具有与SEQ ID NO. I中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。第二部分编码人类的重链的恒定部分，更优选地人类的Yl链的恒定部分。该第二部分可以是基因组来源的DNA片段(包含内含子)或者cDNA片段(没 有内含子)。第二 DNA构建体编码重链或其片段，并包含a)第一部分，该第一部分编码包含构架和超可变区二者之一的可变区；所述的超可变区为⑶RIh以及可选地为⑶R2j^P⑶R3h，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO. 2中；该第一部分从编码所述的可变区的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码所述可变区的最后一个氨基酸的密码子结束，以及b)第二部分，该第二部分编码重链恒定部分或其片段，其从编码轻链的恒定部分的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子结束，随后为终止密码子。所述的第一部分编码可变区，该可变区具有与SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。所述的第一部分具有如SEQ ID NO. 2中所示的核酸序列，从第I位的核苷酸开始并且在第321位的核苷酸结束。同时优选地，该第二部分编码人类轻链的恒定部分，更优选地编码人类的K链的恒定部分。本发明还包括CD40结合分子，其中CDR1l、CDR2l、CDR3l、CDR1h、CDR2h或者CDR3H或者构架中的一个或多个残基，一般地仅数个(如FR1-4L或者H)从显示于SEQ ID NO. 37和SEQ ID NO. 38的残基变化为例如对应的DNA序列的定点突变。本发明还包括编码该改变的⑶40结合分子的DNA序列。尤其地，本发明包括⑶40结合分子，其中⑶Rly⑶R2[和/或⑶R3l的一个或多个残基从SEQ ID NO. 37所示的残基变化，以及⑶R1H、⑶R2H和/或⑶R3H的一个或多个残基从SEQ ID NO. 38所示的残基变化。各个DNA构建体置于适合的控制序列的控制下，尤其地，在适合的启动子的控制下。任意类型的启动子都可以使用，只要其适合所述的在其中DNA构建体转移用于表达的宿主生物即可。然而，如果表达在哺乳动物细胞中进行，可以在B细胞中使用免疫球蛋白基因启动子。所述的第一和第二部分可以由内含子隔开，并且，可以将增强子合适地放置于第一部分和第二部分之间的内含子中。该转录而不翻译的增强子的存在可以帮助进行充分的转录。在特定的实施方案中，第一和第二 DNA构建体包含增强子，所述的增强子为例如重链人类基因的增强子。想要的抗体可以在细胞培养物中，或者在转基因动物中产生。适用的转基因动物可以根据标准方法得到，所述的标准方法包括将位于适合的控制序列下的所述的第一和第二 DNA构建体微注射到卵子中，将如此制备的卵子转移到合适的假妊娠雌性中，并选择表达想要的抗体的后代。本发明还提供了能够在原核或者真核细胞系中复制的表达载体，所述的表达载体包含前文描述的DNA构建体的至少之一。随后将含有DNA构建体的各个表达载体转移到适合的宿主生物中。当DNA构建体分别插入到两个表达载体中时，可以将其分别地进行转移，即每个细胞中一种类型的载体，或者将其共转移，后者可能是优选的。适用的宿主生物可以是细菌、酵母或者哺乳动物细胞系，后者是优选的。更优选地，所述的哺乳动物细胞系来自淋巴，如骨髓瘤、杂交瘤或者正常的永生B细胞，其合适地不表达任何的内源抗体重链或者轻链。当在细胞培养物中产生所述的抗体链时，必须首先将DNA构建体插入到单个的表达载体中，或者插入到两个分别的但是相容的表达载体中，后者可能是优选的。为了在哺乳动物中进行表达，优选地将⑶40结合分子的编码序列整合到基因座内的宿主细胞DNA中，所述的基因座允许或者帮助该CD40结合分子的高水平表达。
在本发明的再一个方面，提供了产生CD40结合分子的产物的方法，该方法包括(i)将使用以上定义的表达载体转化的生物进行培养；并且(ii)从培养物中回收CD40结合分子。依照本发明，发现了抗-⑶40_12E12. 3F3抗体显示出对人类⑶40的抗原表位具有结合特异性。因此，最出人意料的是此表位的抗体，例如抗_CD40_12E12. 3F3抗体能将抗原高效地呈递到树突细胞(DC)。抗体，尤其是嵌合抗体和⑶R-移植抗体，以及尤其地人类抗体，所述抗体对成熟的人类CD40的抗原表位具有结合特异性；以及该抗体在加载DC抗原中的用途是新颖的，并包括在本发明的范围内。为了使用本发明的抗-CD40抗体来治疗适应症，适当的剂量理所应当地根据例如将要使用的在本文中公开的抗体、宿主、给药方式和所治疗的疾病的性质和严重程度而变化。然而，在预防性的用途中，在从约0. 05mg到约IOmg每千克体重的剂量下，更通常地在约0. Img到约5mg每千克体重的剂量下，得到令人满意的结果。在预防用途中给药的频率通常地在约一周一次到约每三个月一次的范围内，更通常地在约每两周一次到约每十周一次的范围内，例如每4到8周一次。本发明的抗-CD40抗体可以经肠道外、经静脉内给药，例如给药到肘前静脉或者其他外周静脉、经肌肉内给药或者皮下给药。本发明的药物组合物可以按照传统的方式进行制造，例如为冻干的形式。在即用给药时，将其溶解在合适的含水载体中，例如注射用无菌水，或者无菌缓冲生理盐水。如果期待制备更大体积的溶液用于输注给药而不是弹丸注射(bolus injection)给药,在配制时将人类血清白蛋白或者患者自身的肝素化血液加入到盐水中是有利的。过量的该生理惰性的蛋白的存在阻止抗体被吸收到输注溶液所使用的容器和管的壁上而丢失。如果使用了白蛋白，适合的浓度是按重量计盐水溶液的0. 5%到4. 5%。本发明的一个实施方案提供了免疫缀合物(immunoconjugate),所述的免疫缀合物包含本发明的人源化抗体，例如人源化抗-CD40抗体，其连接到一个或多个效应分子(effector molecule)、抗原和/或可检测的标记上。优选地,所述的效应分子是治疗性的分子，例如含有一个或多个T细胞表位的一个或者多个肽、毒素、小分子、细胞因子或者趋化因子、酶或者放射性标记。
典型的毒素包括但不限于假单胞菌外毒素或者白喉毒素。小分子的实例包括但不限于化疗化合物，如紫杉醇(taxol)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleiomycin)。典型的细胞因子包括但不限于IL_1、IL-2、IL-4、IL-5、IL_6和IL-12、IL-17和IL-25。典型的酶包括但不限于RNA酶、DNA酶、蛋白酶、激酶和半胱天冬酶。典型的放射性同位素包括但不限于32P和125L如本文中所使用的，术语“表位”指能够激发免疫应答的分子或者物质。在一个实例中，表位包括但不限于多肽和编码多肽的核酸，其中当该多肽经过加工并且呈递到主要组织相容性抗原(MHC)分子时，该核酸到多肽的表达能够激发免疫应答。一般地说，表位包括呈递到细胞表面上的肽，所述的肽非共价地结合于I类或者II类MHC的结合沟，从而其可以与T细胞受体及各自的T细胞辅助分子相互作用。抗原的蛋白水解加工。由MHC呈现到抗原呈递细胞上的表位是更大的肽或者蛋白质抗原前体的切割肽或者产物。对于MHC I表位来说，蛋白质抗原通常由细胞中固有的蛋白酶体消化。细胞内的蛋白酶体消化产生约3到23个氨基酸长度的肽片段，随后该肽片段加载到MHC蛋白上。细胞内或者在细胞外的环境中的其他蛋白水解作用可以进一步 地剪切(trim)并加工这些片段。MHC II类表位的加工通常通过来自溶酶体/内涵体的隔室(compartment)中的细胞内蛋白酶加工进行。本发明包括，在一个实施方案中，连接到抗-CD40抗体(或其片段)的预加工的肽，通过该肽在抗原呈递细胞中发生增强的免疫应答。为了识别潜在有效的作为免疫原性化合物的表位，单独进行MHC结合预测是有用的，但通常是不充分的。本发明包括特异性地鉴定抗原内表位的方法，所述的表位最可能在探寻特定来源的抗原呈递细胞及应答子T细胞(responder T cell)中引起免疫应答。本发明使得能够为那些表位的鉴定进行快速和简易的检测，所述的表位最可能在使用患者自身的抗原呈递细胞和T细胞系统时产生想要的免疫应答。本发明的组合物和方法适用于任意的蛋白质序列，使得使用者鉴定能够结合到MHC并且合适地呈递到对该抗原响应的T细胞的表位。相应地，本发明不限于任意特定的靶或者医疗条件，相反涵盖来自任意有用的来源的MHC表位。如本文中所适用的，术语“镶饰的(veneered) ”指人源化抗体构架，在该抗体构架上，将抗原结合位点或者得自非人抗体的CDR(例如小鼠、大鼠或者仓鼠)置于人类的重链和轻链保守结构构架区中(FR)，例如在轻链或者重链多核苷酸中，将非人抗体的特异性“移植”到人类的构架中。表达所述的镶饰的抗体的多核苷酸表达载体或者多种载体可以转染哺乳动物的细胞，从而表达重组的人类抗体，该重组的人类抗体显示非人抗体的抗原特异性，并且经历会增强其表达、稳定性、溶解性或其组合的翻译后修饰。抗原用于本发明的病毒性抗原实例包括但不限于，例如HIV、HCV> CMV、腺病毒、反转录病毒、小核糖核酸病毒等等。反转录病毒抗原的非限制性实例如来自人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原的反转录病毒抗原,如来自gag、pol和env基因、Nef蛋白、反转录酶和其他的HIV组分的基因产物；肝炎病毒抗原如乙型肝炎病毒的S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒的前-S抗原，和其他肝炎如甲、乙和丙型肝炎病毒组分，例如丙型肝炎病毒RNA ;流感病毒抗原如血凝素和神经氨酸苷酶及其他的流感病毒组分；麻疹病毒抗原如麻疹病毒融合蛋白及其他的麻疹病毒组分；风疹病毒抗原如蛋白质El和E2及其他的风疹病毒组分；轮状病毒抗原如VP7sc和其他的轮状病毒组分；巨细胞病毒抗原如包膜糖蛋白B及其他的巨细胞病毒抗原组分；呼吸道合胞体病毒抗原如RSV融合蛋白、M2蛋白和其他的呼吸道合胞体病毒组分；单纯疱疹病毒抗原如极早期蛋白、糖蛋白D及其它的单纯疱疹病毒抗原组分；水痘带状疱疹病毒抗原如gpl、gpH和其他的水痘带状疱疹病毒抗原组分；日本脑炎病毒抗原如蛋白质E、M-E、M-E-NSU NSU NS1_NS2A、80% E及其它的日本脑炎病毒抗原组分；狂犬病病毒抗原如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白及其它的狂犬病病毒抗原组分。其他的病毒性抗原的实例参见 Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe,D. M. (Raven Press, New Y ork, 1991)。至少一个的病毒抗原可以是肽,所述的肽来自腺病毒、反转录病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒、冠状病毒、披膜病毒、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒、本扬病毒、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒。在某些具体的非限制性实例中，所述的至少一种病毒抗原是肽，所述的肽得自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、骨髓灰质炎、天花、风疹；呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感和/或感冒病毒的至少一种。
在一个方面，所述的一种或多种抗原肽选自Nef (66-97) :VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. : I)、Nef (116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL (SEQ ID NO. :2)、Gag pl7(17_35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO. :3)、Gagpl7-p24(253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)、或者 Pol325-355 (RT 158-188)为AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)的至少一种。在一个方面，所述的融合蛋白肽由一个或者多个接头隔开，所述的接头选自SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO. : 11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQID NO. : 12)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. 13)；或者TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO. :14)。可以使用本发明的抗-CD40抗原疫苗进行递送的抗原靶包括编码抗原的基因，所述的抗原如病毒性抗原、细菌性抗原、真菌性抗原或者寄生虫抗原。病原体包括锥虫，绦虫，蛔虫，蠕虫，疟疾。肿瘤标记物例如胎儿抗原或者前列腺特异性的抗原可以按此方式进行靶向。其他的实例包括HIV env蛋白和乙型肝炎表面抗原。为了接种的目的给予根据本发明的载体要求该载体相关的抗原是充分地无免疫原性的，从而使得该转基因的长期表达成为可能，而该转基因的强免疫应答是想要的。在一些情况下，对个体的接种的需要可以只是偶发的，例如每年一次或者两年一次，并且该接种提供针对感染剂的长期免疫保护。本发明中用于载体以及最终用作抗原的生物、过敏原和核酸和氨基酸序列可以在第6，541，011号美国专利中找到，其相关的部分在此结合作为参考，尤其地，将生物和特定的序列匹配的表格可以用于本发明。与在本文中公开的抗-CD40抗原疫苗一起使用的细菌性抗原包括，但不限于例如细菌抗原，如百日咳毒素、纤维状血凝素、百日咳杆菌粘附素、FIM2, FM3、腺苷酸环化酶和其他的百日咳细菌抗原组分；白喉细菌抗原如白喉毒素或者白喉类毒素，及其它的白喉细菌抗原组分；破伤风细菌抗原如破伤风毒素或者破伤风类毒素，及其它的破伤风细菌抗原组分；链球菌细菌抗原如M蛋白和其他的链球菌细菌性抗原组分；革兰氏阴性杆菌细菌抗原如脂多糖和其他的革兰氏阴性细菌抗原组分；结核分枝杆菌细菌性抗原如分枝菌酸、热激蛋白65(HSP65)、30kDa的主分泌蛋白、抗原85A及其他的分枝杆菌抗原组分；幽门螺旋杆菌细菌性抗原组分；肺炎球菌细菌性抗原如肺炎球菌溶血素、肺炎荚膜多糖和其他的肺炎球菌细菌性抗原组分；流感嗜血杆菌细菌抗原如荚膜多糖和其他的流感嗜血杆菌细菌抗原组分；炭疽细菌性抗原如炭疽保护性抗原和其他的炭疽细菌性抗原组分；立克次体细菌性抗原如rompA和其他立克次体细菌性抗原组分。本文中所描述的细菌性抗原还包括任意其他的细菌、分枝杆菌、支原体、立克次氏体或者衣原体的抗原。病原体的部分或者全部也可以是流感嗜血杆菌、恶性疟原虫、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、淋球菌、沙门氏菌、血清型伤寒杆菌、志贺菌、霍乱弧菌、登革热、脑炎、日本脑炎、莱姆病、鼠疫菌、西尼罗河病毒、黄热病、野兔热、肝炎(病毒性、细菌性)，RSV(呼吸道合胞病毒)、HPIV1和HPIV3、腺病毒、天花、过敏和癌症。用于本发明的组合物和方法的真菌性抗原包括，但不限于例如假丝酵母真菌性抗原组分、组织胞浆菌真菌性抗原如热激蛋白60(HSP60)及其它组织胞浆菌真菌性抗原组分；隐球菌真菌性抗原如荚膜多糖和其他的隐球菌真菌性抗原组分；球孢子菌真菌性抗原如小球抗原和其他的球孢子菌真菌性抗原组分；和癣真菌性抗原例如毛癣菌素和其他的球 孢子菌真菌性抗原组分。原生动物和其他的寄生虫抗原的实例包括，但不限于例如恶性疟原虫抗原如裂殖子表面抗原，子孢子表面抗原，环子孢子(circumsporozoite)抗原，配子体/配子表面抗原，红内期抗原Pf 155/RESA和其他的疟原虫抗原组分；弓形虫抗原如SAG-I、p30和其他的弓形虫抗原组分；血吸虫抗原如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其他的血吸虫抗原组分；硕大利什曼原虫抗原和其他利什曼原虫抗原如gp63，脂磷聚糖和其相关的蛋白，和其他的利什曼原虫抗原组分；以及克氏锥虫抗原如75-77kDa抗原，56kDa抗原和其他的锥虫抗原组分。可以使用本发明的抗-CD40抗原疫苗进行靶向的抗原一般地按照多种因素进行选择，所述的因素包括内在化的可能性、免疫细胞特异性的水平、所靶向的免疫细胞的类型，免疫细胞成熟和/或激活程度等等。在这个实施方案中，抗体可以是单特异性或者双特异性的抗体，后者包括一个抗-CD40的结合功能域，和一个抗第二种抗原的结合功能域，所述的第二种抗原例如树突细胞的细胞表面标记物，如I类MHC、II类MHC、B7-2、⑶18、⑶29、CD31、CD43、CD44、CD45、CD54、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR 和 / 或 Dectin-I等等；而在一些情况下，也缺少⑶2、⑶3、⑶4、⑶8、⑶14、⑶15、⑶16、⑶19、⑶20、⑶56、和/或⑶57。抗原呈递细胞的细胞表面标记物的实例包括但不限于I类MHC、II类MHC、⑶45、B7-1、B7-2、IFN- y受体和IL-2受体、ICAM-I和/或Fe Y受体。T细胞的细胞表面标记物的实例包括，但不限于⑶3、⑶4、⑶8、⑶14、⑶20、⑶I lb、⑶16、⑶45和HLA-DR。位于细胞表面用于递送的靶抗原包括特征为肿瘤抗原的那些，其一般地得自肿瘤组织的细胞的细胞表面、细胞质、核、细胞器等。本发明的抗体部分的肿瘤靶的实例包括但不限于血液癌症如白血病和淋巴瘤,神经肿瘤如星形细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃肠肿瘤如胃癌和结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系统肿瘤如子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管瘤、或唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分癌症、甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。可以利用本发明，单独或者结合递送到免疫细胞，进行抗原呈递的抗原的实例包括肿瘤蛋白如突变的致癌基因；与肿瘤关联的病毒蛋白；以及肿瘤粘液素和糖脂。所述的抗原可以是与肿瘤关联的病毒性蛋白，可能是前文记载的各类病毒。特定的抗原可以是肿瘤的特征(通常不由肿瘤前体细胞表达的蛋白的一个子集)或者可以是通常能够地在肿瘤前体细胞中表达但是具有肿瘤的突变特征的蛋白质。其他的抗原包括正常蛋白的突变变体，其具有改变的活性或者亚细胞的分布，例如产生肿瘤抗原的基因的突变。用于抗-CD40融合蛋白疫苗的肿瘤抗原的具体的非限制性实例包括，例如CEA、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE, GAGE、MAGE 1-4，6 和 12、MUC (黏液素)(如MUC-1, MUC-2等等)、GM2和⑶2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART (黑色素瘤抗原)、Pmel 17 (gplOO)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰基葡萄糖胺转移酶V内含子V序列)，前列腺Ca psm.PRAME (黑色素瘤抗原)、@_连环蛋白、MUM-I-B (黑色素瘤中普遍存在的突变基因产物)，GAGE (黑色素瘤抗原)I、MAGE, BAGE (黑色素瘤抗原)2-10, C-ERB2 (Her2/neu)、 DAGE, EBNA (爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1_6、gp75、人类乳头瘤病毒(HPV) E6和E7、p53、肺抗性蛋白(lung resistance protein) (LRP)、Bcl_2、Ki_67、细胞周期蛋白 BI、gplOO、存活素和NYESO-I。除此之外，免疫原性的分子可以是涉及自身免疫疾病的开始和/或传播的自身抗原，其病理学在很大程度上是由于对相应的靶器官、组织或者细胞如SLE或者MG表达的分子有特异性的抗体的活性。在该疾病中，可能希望将持续进行中的抗体介导的(即Th2-类型的)对相关的自身抗原的免疫应答朝细胞(即Thl类型的)免疫应答的方向控制。或者可以期待通过预防性地诱导针对合适的自身抗原的Thl响应，使针对受试者的自身抗原的Th2响应不发生或者其水平降低，所述的受试者不具有，但是怀疑易患相关的免疫疾病。感兴趣的自身抗原包括但不限于(a)关于SLE、Smith蛋白、RNP核糖核蛋白及SS-A和SS-B蛋白；以及(b)关于MG、乙酰胆碱受体。其他包含在一种或多种类型的自 身免疫应答的多种抗原的实例包括例如内源激素如黄体生成素(luteinizing hormone)、促卵泡素(follicular stimulating hormone)、睾酮(testosterone)、生长激素、催乳素(prolactin)和其他的激素。在自身免疫疾病、过敏症和移植排斥中涉及的抗原可以用于本发明的组合物和方法。例如，下列自身免疫疾病或障碍中涉及的任意一种或多者中的抗原可以用于本发明糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus),关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括异位性皮炎和湿疹样皮炎)、牛皮癣、干燥综合征，包括继发干燥综合征的干燥性角结膜炎、斑秃、由于节肢动物叮咬反应引发的过敏反应、克罗恩病、阿弗他溃疡、虹膜炎、结膜炎、角结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双边进展性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、克罗恩病、Graves眼病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和肺间质纤维化。自身免疫疾病中涉及的抗原的实例包括谷氨酸脱羧酶65 (GAD65)、天然的DNA、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein)、髓鞘蛋白脂质蛋白(myelin proteolipid protein)、乙酰胆碱受体组分、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)和促甲状腺激素(TSH)受体。过敏症中涉及的抗原的实例包括花粉抗原，如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原、动物源性抗原如尘螨抗原和猫科动物抗原、组织相容性抗原(histocompatiblity antigen)和青霉素及其他治疗药物。移植排斥中涉及的抗原的实例包括移植到移植接收者中的移植物的抗原组分，所述的移植物如心脏、肺、肝、胰腺、肾和神经移植组分。所述的抗原可以是在治疗自身免疫疾病中有用的修饰的肽配体(alteredpeptide ligand)。本领域技术人员应该认识到，任意的蛋白质效应分子的序列都可以进行这样的修饰，该修饰基本上不影响所述效应子蛋白质的功能上的优点。例如，甘氨酸和丙氨酸一般被认为是可交换的，天冬氨酸和谷氨酸以及天冬酰胺和谷氨酰胺也是如此。本领域的技术人员应认识到效应子序列的许多不同变体能编码活性大体上与天然的效应子相同的效应 子。所述的效应分子和抗体可以通过前文所述的化学方式或者重组方式进行缀合。化学修饰包括，例如为了将所述的效应分子和抗体彼此连接的目的而进行衍生，所述的衍生是直接的或者通过连接的化合物，其通过蛋白质化学的领域中公知的方法进行。将效应分子连接到抗体的步骤依所连接到抗体的部分的化学结构而不同。多肽一般地含有多个官能团；例如羧酸(COOH)、游离的氨基(-NH2)或者巯基(-SH)基团，其可以与抗体上的适合官能团反应，导致其与效应分子的结合。可选地，可以将所述的抗体进行衍生化，从而使其暴露或者接上额外的反应性官能团，例如通过多种接头分子的任意连接，所述的接头分子如可得自Pierce Chemical Company, Rockford 111的那些。所述的接头能够与所述的抗体和所述的效应分子形成共价键。对于本领域的技术人员来说，适合的接头是公知的，其包括但不限于直链的或者支链的碳接头、杂环的碳接头或者肽接头。当抗体和效应分子是多肽时，可以通过其侧链将所述的接头连接到所述的组成型氨基酸上(例如通过半胱氨酸的二硫键连接)。然而，在优选的实施方案中，所述的接头连接到a碳的氨基上，和末端的氨基酸的羧基上。在一些情况下，在免疫缀合物达到其靶向位点时，希望将效应分子从抗体上释放。因此，在这些情况下，免疫缀合物包含在靶向位点的附近可切割的连接。为了从抗体释放效应分子，该接头的切割可以通过酶活性或者该免疫缀合物处于易受影响的环境引起，所述的环境为在靶向的细胞内部，或者在靶向的位点的附近。当所述的靶向位点是肿瘤时，可以使用在肿瘤位点处存在的环境下(例如当暴露于肿瘤相关的酶或者酸性的pH)可切割的接头。本发明的效应分子和抗体的典型化学修饰还包括使用聚乙二醇进行衍生化，从而延长在循环系统中的滞留时间并降低免疫原性，所述的衍生化根据公知的方法进行(参见例如 Lisi,等人.，Applied Biochem. 4 :19 (1982) ;Beauchamp,等人 Anal Biochem. 131 25(1982);以及 Goodson 等人，Bio/Technology 8:343(1990)).本发明预期将疫苗用于主动免疫和被动免疫的实施方案中。建议适于用作疫苗的免疫原性组合物可以最容易地直接从激发免疫原性的T细胞的肽，按照本文中所公开的方式进行制备。将最终的接种材料进行粗略的透析，从而除去不想要的小分子量的分子，和/或冻干，从而更方便地配制到想要的载体中。在本发明特定的实施方案中，本发明的组合物和方法用于生产细胞疫苗，例如该抗体的递送抗原的抗-CD40结合部分用于指导所述的抗原(或多种抗原)到达抗原呈递细胞，所述的抗原呈递细胞随后将所述的抗原“加载”到MHC蛋白上用于呈递。因此所述的细胞疫苗是使用本发明的组合物加载的抗原呈递细胞，从而产生加载了抗原的抗原呈递细胞。当所述的疫苗是抗-CD40结合蛋白自身的时候，例如是完整的抗体或其片段时，则这些“活性组分”可以使用现有技术中已知的方法制成疫苗，所述的现有技术如第4，608，251,4, 601，903,4, 599，231,4, 599，230 和 4，578，770 号美国专利，其相关的部分在此结合作为参考。一般地来说，该疫苗制备成可注射的，例如制备成液态的溶液或者悬浮液，或者适于在注射前再悬浮于液体中的固体形式。所述的制备也可以是乳化。活性的免疫原性组分通常与药学上可接受的并且与所述的活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂为如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等或者其组合。除此之外，所述的疫苗也可以按照需要地含有少量的辅料，如润湿剂或者乳化剂，PH缓冲剂，或者提高所述疫苗的效果的佐剂。
将疫苗以与其剂型制剂相容的方式给予，并且其量是治疗上有效的和产生免疫性的。所给予的量取决于所治疗的受试者，包括，例如个体的免疫系统产生免疫应答的能力。所需给予的细胞和活性组分的精确量取决于从业医师的判断。然而，对于细胞疫苗来说，适用的剂量范围大约在数千个细胞(到数百万个细胞)。对于标准的表位或者表位递送疫苗来说，该疫苗可以是每次接种数百微克的活性组分。对于初次给予和加强注射而言，适用的治疗方案也是可以变化的，但是定式为进行初次给予，接着是进行随后的接种(subsequentinoculation)或者其他的给予。本申请的方式可以在大范围内变化，然而，本文中的特定实施方案最可能是经静脉内递送，或者直接地递送到肿瘤或者感染的位点。无论如何，任意给予疫苗的传统方法都是可行的。疫苗的剂量取决于给药的途径，以及随着宿主的大小发生变化。在许多情况下，希望将多次给予该疫苗，例如每周或者每隔一周进行四次到六次接种。正常的接种治疗方案通常以两周到十二周的间隔，或者三周到六周的间隔进行。为了维持免疫应答的保护水平或者保持疾病缓解或者重新感染的可能性，可以希望采取1-5年间隔，通常地3年间隔的定期加强。免疫疗程可以随后进行检测，所述的检测如测量T细胞活化、细胞因子分泌或者甚至是抗体的产生，该检测最经常地在体外完成。这些免疫应答检测是公知的，并且可见于大量的专利中，并如本文所教导的。本发明的疫苗可以以一个或者多个“单位剂量”提供，这取决于使用的是核酸载体、最终的经纯化的蛋白质还是最终的疫苗形式。单位剂量定义为含有预先确定量的治疗组合物，所述的治疗组合物按计算产生预期的，与其给予相关联的想要的响应，所述的给予也即通过合适的途径和治疗方案。所给予的量，其具体的途径和制剂是临床领域的技能范围之内的。也可以对所治疗的受试者进行评估，具体地，评估该受试者的免疫系统的状态，和所期待的保护的状态。单位剂量不需要在单次的注射中进行给予，而是可以在一段时间内进行连续的输注。本发明的单位剂量可以方便地用DNA/kg(或者蛋白质/Kg)体重来表示，范围在约 0. 05,0. 10,0. 15,0. 20,0. 25,0. 5、I、10、50、100、1000 或者更多的 mg/DNA/kg或者蛋白质/Kg体重进行给予。
类似地，所递送的抗-⑶40抗原疫苗可以为约0.2到约8. Omg/kg体重。因此，在特定的实施方案中，可以将 0. 4mg、0. 5mg、0. 8mg、l. Omg、l. 5mg、2. 0mg、2. 5mg、3. 0mg、4. Omg、
5.0mg、5. 5mg、6. 0mg、6. 5mg、7. Omg和7. 5mg的该疫苗递送到个体的体内。给予的疫苗的剂量在很大的程度上取决于所治疗的受试者的体重和身体状态，以及给药途径和治疗的频率。包括预先连接到脂质体或者病毒递送载体的裸露的多核苷酸的药物组合物可以按照从I y g到Img的多核苷酸对I y g到IOOmg蛋白质的范围的量进行给予。因此,具体的组合物可以包括独立地与 I u g>5 u g> 10 u g>20 u g>3. 0 u g、40 u g>50 u g、60 u g>70 u g、80 u g、100 u g、150 u g、200 u g、250 u g、500 u g、600 u g、700 u g、800 u g、900 Hg、Img、I. 5mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 或者 IOOmg 的载体结合的 I U g、5 ii g、10 u g>20 u g>30 u g>40 u g>50 u g>60 u g>70 u g>80 u g、100 u g> 150 u g、200 u g、250 u g、500 u g、600 u g、700 u g、800 u g、900 u g或者1000 u g的多核苷酸或者蛋白质。本发明的抗体任选地可以共价或者非共价地连接到可检测的标记上。适合于该用途的可检测标记包括任意的可以由光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或者化学方法检测的组合物。在本发明中有用的标记包括磁性珠(例如DYNABEADS )，荧光 染料(如异硫氰酸荧光素、德州红、罗丹明、绿色荧光蛋白等等)，放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或者32P)，酶(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶及其它在ELISA中常用的酶)，以及比色标记如胶体金，或者有色玻璃或者塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等等)的珠。检测该标记的方法对于本领域技术人员而言是公知的。因此，例如放射性标记可以使用感光胶片或者闪烁计数器进行检测，荧光标记物可以使用光电探测器检测发射光进行检测。酶标记一般通过向该酶提供底物，并检测由酶对底物的活性所产生的反应产物进行检测，以及比色的标记通过简单地观看有色的标记进行检测。本发明的抗体和/或免疫缀合物尤其地对于肠胃外给药是有用的，所述肠胃外给药如经静脉给药或者给药到体腔中。用于给药的组合物一般地包含溶于药学上可接受的载体的所述抗体和/或免疫缀合物溶液，所述的载体优选地为含水载体。可以使用多种含水载体，例如缓冲的盐水等等。这些溶液是无菌的，并且一般地不含有不想要的物质。这些组合物可以通过传统的、公知的灭菌技术进行灭菌。为了满足合适的生理条件的要求，该组合物可以含有药学上可接受的辅料，如PH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。在这些制剂中，融合蛋白的浓度可以在很大范围内变化并主要基于流体的体积、粘度、体重等等，以及所选择的具体给药方式以及患者的需求进行选择。因此，本发明的用于经静脉注射的一般的药物免疫缀合物的组合物为约0. I到IOmg每例患者每天。可以使用每例患者每天0. I到高达约IOOmg的剂量。用于制备可给药的组合物的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或者显而易见的，并描述于出版物如REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCE,19th ED. ， Mack Publishing Company, Easton,Pa. (1995)。本发明的组合物可以为了治疗性的治疗给药。在治疗应用中，组合物以足以治愈或者至少部分地缓解疾病及其并发症的量给药患病的患者。将对于完成此目的而言充足的量定义为“治疗上有效的剂量”。对于此应用有效的量取决于疾病的严重程度和患者健康的大致状态。该化合物的有效量是提供症状主观上的缓解，或者在由医师或者其他有资格的观测者的记载中，提供客观上可确认的改善的量。所给药的组合物的一次或多次给药取决于所需要的剂量和频率，以及患者的耐受性。无论如何，该组合物都应该提供足量的本发明的蛋白质，从而有效地治疗患者。优选地，该剂量给药一次，但是可以周期地施用，直到达到治疗效果或者直到副作用使得疗法中止。一般来说，所述的剂量足以治疗或者缓解疾病的症状或者体征，而不产生不想要的对患者的毒性。本发明的免疫缀合物组合物的控释的肠胃外制剂可以制成植入物、油性注射剂或者颗粒系统。蛋白质递送系统的广泛概述，参见Banga，A. J.，THERAPEUTIC PEPTIDESAND PROTEINS F0RMULATI0N,PROCESSING,AND DELIVERY SYSTEMS,Technomic PublishingCompany, Inc. , Lancaster, Pa. , (1995),其在此结合作为参考。颗粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有作为中间芯的治疗蛋白。在微球中，治疗剂分布在该颗粒中。小于I Pm颗粒、微球和微胶囊一般地分别称作纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管具有约5 的直径，从而只有纳米颗粒是经静脉给药的。微颗粒一般地直径在100 u m左右，并经皮下或者经肌肉内给药。 可以将聚合物用于本发明的免疫缀合物组合物的离子控释。本领域已知有多种可降解的和不可降解的聚合物基质可以用于控释药物递送(Langer, R. , Accounts Chem.Res. 26 :537-542(1993))。Res. 26和1993。例如，嵌段共聚物，帕洛沙姆407 作为在低温下以黏的却可流动的液体形式存在，但是在体温下形成半固体的凝胶，已经将羟基磷灰石用作蛋白质控释的微载体，和/或脂质体可以用作控释以及脂类包裹的药物的药物靶向。已知此外有多种用于将治疗性的蛋白质进行受控的递送的系统。参见例如第5，055，303、5，188，837,4, 235，871,4, 501，728,4, 837，028,4, 957，735 和 5，019，369,5, 055，303、5，514，670、5，413，797、5，268，164、5，004，697、4，902，505、5，506，206、5，271，961、5，254，342和5，534，496号美国专利，其各个的相关部分在此结合作为参考。在本发明的免疫缀合物的多种不同用途当中，包括由特定的人类细胞引起的多种的疾病症状，其可以由所述融合蛋白的毒性作用缓解。例如，人源化抗-CD40_12E12. 3F3(ATCC 登记号 PTA-9854)，抗-CD40_12B4. 2C10(ATCC 登记号PTA-10653,提交号 AB13-22. 12B4. 2C10(HS446))和抗-CD4011B6. 1C3 (ATCC 登记号PTA-10652，提交号AB13-22. 11B6. 1C3 (HS440))，在本文中公开的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了递送抗原的试剂盒，所述抗原如CD40或者其免疫反应性的片段，其为缀合的或者为与一个或多个T细胞或者B细胞表位的融合蛋白的形式。如本文中所使用的，“生物样品”是生物组织或者流体的样品，其含有抗原。该样品包括但不限于来自活组织检查、血液和血细胞(如白细胞)的组织。优选地，所述的细胞是淋巴细胞，如树突细胞。生物样品还包括组织的片段，如出于组织学的目的取得的冷冻的片段。生物样品一般地得自多细胞的真核生物，优选地哺乳动物如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或者兔，以及更优选地为灵长类动物，例如猕猴、黑猩猩或者人类。最优选地，该样品来自人类，本发明的抗体也可以在体内使用，例如作为用于体内成像的诊断性工具。试剂盒一般地包括编码本发明的抗体(或其片段)的核酸序列，所述的抗体在羧基末端具有一个或多个构架部分或者多克隆位点，在该处可以插入一个或多个抗原的编码序列。在一些实施方案中，所述的抗体是人源化抗-⑶40Fv片段,如scFv或者dsFv片段。除此之外，该试剂盒一般地包括说明材料，该说明材料公开本发明的抗体的使用方法(例如在使用树突细胞进行免疫之前，将其加载到树突细胞中，所述的树突细胞可以是自身的树突细胞)。所述的试剂盒还可以包括附加的部分，从而便于将其用于设计试剂盒的具体应用。因此，例如该试剂盒可以额外地包括检测标记的方法(例如用于酶标记的酶底物，用于检测荧光珠的滤器设备，如羊抗小鼠HPP的合适的二级标记等等)。该试剂盒可以额外地包括缓冲液和其他成熟地用于具体方法的操作的试剂。该试剂盒和合适的组成对于本领域技术人员而目是已知的。在本发明的另一系列用途中，可以将本发明的由抗体靶向的免疫缀合物用于将靶向的细胞从培养物中的细胞群中清除。例如，如果优选特定群体的T细胞，可以使用本发明的免疫缀合物来富集具有进行的免疫应答的相反效果的T细胞群体。因此，例如可以通过向患者提供加载了抗原的树突细胞，从培养自具有癌症的患者的细胞中清除癌细胞，所述的树突细胞使用本发明的抗体作为触发针对该癌症、病毒或者其他病原体的抗原的靶向部分。类似地，所述的免疫缀合物可以用于增加调节T细胞的群体，或者将其免疫应答朝着接近或者远离细胞毒性的T细胞响应方向发展或者甚至驱使B细胞响应。实施例I :杭-CD40-HIV狀疮苗 从大量的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位中选取五个19到32个氨基酸长的序列，所述的表位是在不同的I类MHC分子的环境下，在HIV-I Nef、Gag和Env蛋白中识别出来的。已经报道了在小鼠中、在灵长类中以及在人类中可以使用脂肽疫苗有效地诱导CTL响应。将所述的五个HIV肽随后在C末端位置使用(Palm)-NH2基团进行修饰，并且所述的五个HIV妝序列已经在科技文献中[例如Characterization of a multi-lipopeptidesmixture used as an HIV-I vaccine candidate (1999) Klinguer 等人，Vaccine, Volume18,259-267],以及在专利申请中[Cytotoxic T lymphocyte-inducing lipopeptidesand use as vaccines. Gras-Masse H.等人，专利号为 EP0491628 (1992-06-24) ；US5871746(1999-02-16)]有充分描述。非常想要的HIV疫苗由与上述HIV肽融合的重组的抗-树突细胞受体抗体构成。本发明包括有效地产生蛋白和HIV疫苗的组合物和方法。以下显示的序列是五个选择的HIV肽的氨基酸序列并且在每个HIV蛋白质内的氨基酸位置在括号中。Nef (66-97)是VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO. 1)Nef (116-145)是HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO. 2)Gag pl7 (17-35)是EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO. :3)Gag pl7-p24(253-284)是NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)Pol 325-355 (RT 158-188)是AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO.
5)下面的序列是hIgG4重链(H)-HIV gag 17融合蛋白，其中Gag pl7 (17-35)区域以粗体表示。下划线的AS残基是连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-gagl7]C655 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS EKIRLRPGGKKK\rKLKHI￥ AS- (SEQ ID NO. :6)下面的序列是H链-HIV gag253融合蛋白，其中Gag pl7_p24 (253-284)区以粗体显示。下划线的AS残基是连接序列。 [mAnti-DCIR_9E8_H-LV_hIgG4H-C-Pep-gag253]C656 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS NI4Pi rw; I
I YkKV ⑴,I,i.NK議 VR(SEQ ID NO 7)下面的序列是H链-HIV nefl 16融合蛋白，其中Nef (116-145)区以粗体显示。下划线的AS残基是连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nefl 16]C680 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS HTQGYFPDWQKlr'TPCPGVRYrLIFCWLYKL AS- (SEQ ID NO :8)下面的序列是H链-HIV nef66融合蛋白，其中Nef(66_97)区以粗体显示。下划线的AS残基是连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep_nef66]C679 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS VGFPVTPQVPLRPMTYKilAVDLSHFLKEKGGL AS- (SEQ ID NO. :9)下面的序列是H链-HIV pol 158融合蛋白，其中Pol 325-355 (RT158-188)区以粗体显示。下划线的AS残基是连接序列。QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AIFQSSMTKII. I■ IM K kM'I)I \ -1YQYlM I)I)I.^ AS (SEQ ID NO. :10)图I显示了融合到不同的HIV肽的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第I到第5泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，并经还原性SDSPAGE和考马斯亮蓝染色分析。将与不同的C-端HIV肽融合的H链表达载体的编码区域与匹配的轻链(L)质粒共转染到293F细胞中，3天后收集上清用于后续的纯化。各转染之间的细胞数量和DNA的量是不变的。由于使用了过量的蛋白质A亲和基质，SDS PAGE分析确定了产率和不同的疫苗构建体 的H链完整性。第1、4和5泳道(上方的条带)显示，直接与HIV gag 17、nef66和poll58肽融合的H链分泌良好，第2泳道显示直接与HIV gag253肽融合的H链表达低下。第3泳道显示直接与HIV nefll6肽融合的H链完全不表达。出人意料地发现了使用柔性的可能糖基化的内部肽编码区接头序列改进了整个重组抗体-HIV肽融合蛋白的分泌。所使用的柔性接头序列得自纤维素酶体锚定支架蛋白B前体[溶纤维素拟杆菌]并且已经由本发明人在共同待决的第61/081，234号美国专利申请中描述，其相关的部分在此结合作为参考。下面所示的序列是所选择的四种肽接头的25-氨基酸长的序列。下划线的序列是推测的N-连接糖基化位点。Flexl 是SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. :11)Flex2 是PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. :12)Flex3 是TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. :13)Flex4 是TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. :14)这些序列[接头以加粗以及下划线区显示，其得自整合素]得自细菌蛋白的凝集蛋白内功能域间隔子> gi I 50656899 |gb IAAI79550. I纤维素酶体锚定支架蛋白B前体[溶纤维素拟杆菌]:MQSPRLKRKILSVILAVCYIISSFSIQFAATPQVNIIIGSAQGIPGSTVKVPINLQNVPEIGINNCDFTIKFDSDILDFNSVEA⑶IVPLPVASFSSNNSKDIIKFLFSDATQGNMPINENGLFAVISFKIKDNAQKGISNIKVSSYGSFSGMSGKEMQSLSPTFFSGSIDVSDVSTSKLDVKVGNVEGIAGTEVNVPITFENVPDNGINNCNFTLSYDSNALEFLTTEAGNIIPLAIADYSSYRSMEGKIKFLFSDSSQGTRSIKNDGVFANIKFKIKGNAIRDTYRIDLSELGSFSSKQNNNLKSIATQFLSGSVNVKDIE ssv,spn .SVIir rn s\ rn i11 K.ssi* GNKMKIQI⑶VKANQ⑶TVIVPITFNEVPVMGVNNCNFTLAYDKNIMEFISADAGDIVTLPMANYSYNMPSDGLVKFLYNDQAQGAMSIKEDGTFANVKFKIKQSAAFGKYSVGIKAIGSISALSNSKLIPIESIFKDGSITVTNKPIVNIEIGKVKVKA⑶KIKVPVEIKDIPSIGINNCNFTLKYNSNVLKYVSNEAGTIVPAPLANLSINKPDEGIIKLLFSDASQGGMPIKDNGIFVNLEFQAVNDANIGVYGLELDTIGAFSGISSAKMTSIEPQFNNGSIEIFNSAQTPVPSNTEV QHjTM ISV 11*
I NNS l P IANS I PKPNP LYNLNVNIGEISGEAGGVIEVPIEFKNVPDFGINNCDFSVKYDKSIFEYVTYEAGSIVKDSIVNLACMENSGIINLLFNDATQSSSPIKNNGVFAKLKFKINSNAASGTYQINAEGYGKFSGNLNGKLTSINPIFENGIINIGNVTVK PI STFAD.sSTlTPTA I P l ,vI P J IK(； TPTVTPIYWMNVLIGNMNAAIGEEVVVPIEFKNVPPFGINNCDFKLVYDSNALELKKVEA⑶IVPEPLANLSSNKSEGKIQFLFNDASQGSMQIENGGVEAKITFKVKSTAASGIYNIRKDSVGSFSGLIDNKMTSIGPKFTDGSIVVG I \ Tn ATAI PSAlV I 11 I P I A I t KIM ATPTIKGTPTATPMYffMNVVIGKMNAEVGGEVVVPIEFNNVP SFGINNCDFKLVYDATALELKNVEA⑶11KTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVFAKITFKVKSTTATGVYDLRKDLVGSFSGLKDNKMTSIGAEF TNGSlTVA.vi'AFrvnM—VNAThAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTVTATPSDTIPTVTPTATATPSAIVTTITPTATAKPIATPTIKGTPTATPMYWMNVVIGKMNAEVGGEVVVPIEFKNVPSFGINNCDFKLVYDATALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVSAKITFKVKSTTAIGVYDIRKDLIGSFSGLKDSKMTSIGAEFTNGSITVATTAPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPGTATGTATPTATATPGAATPTETATPSVMIPTVTPTATATPTATATPTVKGTPTIKPVYKMNVVIGRVNVVAGEEVVVPVEFKNIPAIGVNNCNFVLEYDANVLEVKKVDAGEIVPDALINFGSNNSDEGKVYFLFNDALQGRMQIANDGIFANITFKVKSSAAAGIYNIRKDSVGAFSGLVDKLVPISAEFTDGSISVESAKSTPTATATGTNVTPTVAATVTPTATPASTTPTATPTATSTVKGTPTATPLYSMNVIIGKVNAEASGEVVVPVEFKDVPSIGINNCNFILEYDASALELDSAEAGEIVPVPLGNFSSNNKDEGKIYFLFSDGTQGRMQIVNDGIFAKIKFKVKSTASDGTYYIRKDSVGAFSGLIEKKI IKIGAEFTDGSITVRSLTPTPTVTPNVASPTPTKVVAEPTSNQPAGPGPITGTIPTATTTATATPTKASVATATPTATPIVVVEPTIVRPGYNKDADLAVFISSDKSRYEESSIITYSIEYKNIGKVNATNVKIAAQIPKFTKVYDAAKGAVKGSEIVWMIGNLAVGESYTKEYKVKVDSLTKSEEYTDNTVTISSDQTVDIPENITTGNDDKSTIRVMLYSNRFTPGSHSSYILGYKDKTFKPKQNVTRAEVAAMFARIMGLTVKDGAKSSYKDVSNKHWALKYIEAVTKSGIFKGYKDSTFHPNAPITRAELSTVIFNYLHLNNIAPSKVHFTDINKHWAKNYIEEIYRFKLIQGYSDGSFKPNNNITRAEVVTMINRMLYRGPLKVKVGSFPDVSPKYWAYGDIEEASRNHKYTRDEKDGSEILIE(SEQ ID NO. 15).下面的序列是重链(K)-HIV gagl7-nef66-nefl 16肽融合蛋白，其中HIVgag 17、nef66、nefl 16肽序列为粗体。下划线的AS序列是连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-gagl7-nef66-nefl 16]C694 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASEKIRLRJH.C,kKK\ KLKIIIV AS￥GFP￥TPQ￥PLMPMTYKAA\rDLSII] LKLKGGLAS ii I I'liW QN'i rr(irt;\ RNIA Ki AS (SEQ ID NO :16).下面的序列是H链-HIV gagl7-nefl 16肽融合蛋白，其中HIV gag 17和nefl 16肽序列[斜体]通过间隔子fl [以粗体显示]连接。下划线的AS残基为连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-gagl7-fl-nefl 16]C692 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSL SLGKAS EK!R LRfG KK KYKLKHiV AS SS VSPTTSVII PT PTS\-' P P TPTK SSPAS lITQG￥FPDf￥QNYTPaPaVRYPfn'(JlV[ J'A'Z, AS (SEQ ID NO. :17).图2显示了融合到不同的HIV肽的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第I和第2泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，并经还原性SDSPAGE和考马斯亮蓝染色分析。将与不同的C-端HIV肽融合的H链表达载体的编码区域与匹配的轻链(L)质粒共转染到293F细胞中，3天后收集上清用于后续的纯化。第I和第2泳道(上方的条带)显示，直接与HIV肽链gagl7-nef66-nef I 16融合的H链分泌良好。同时，含有HIV肽链gagl7和nef116，由柔性间隔子fl隔开的H链产物也表达良好。因此当直接与H链单独融合时作为分泌产物不表达的HIV nef 116肽可以在加到某些其他肽和柔性链的环境下时良好地表达。注意直接融合到gag 17-fl-nef 116[82个残基]的H链比具有gag 17-nef 66-nef 116[89个残基]的H链迁移更慢,这说明了柔性接头fl是糖基化的，与gagl7-nef66-nef 116融合抗体相比，其可能提高了分泌的gag 17-fl-nef 116融合抗体的产生。
下面的序列是H链-HIV肽链gagl7-gag253_nef66融合蛋白，其中各个HIV肽序列[以粗斜体表示]由肽内间隔子f [以粗体显示]隔开。在这种情况下，得自纤维素酶体锚定支架蛋白B前体[溶纤维素拟杆菌区为粗斜体下划线]的27个氨基酸长的flex-vl (vl)接头被插入到H链的C末端和HIV肽柔性间隔子链之间。下划线的AS残基为连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Pep-gagl7-fl-gag253-f2-nef66]C711 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (>JJLOLJJSI LLr\\\rr/ \\v、rhr\r As i. K!!:!k! !]!!iA s ssvsi r isvH rrrrsvPPTrrKSSP A s \fmn-又;hiykrw!!!又;！,:\:kr m.snsiu)AS P IS I FAIlSS rn P l A I P l ATPTIKG AS I'UFPVrPVrpLRPMTYKAA VnLSUtiKtKGGL AS (SEQID NO. 18).下面的序列是H 链-HIV 肽链 poll58-gagl7-nef66_nefl 16_gag253 融合蛋白，其中肽的序列以灰色粗体表示。下划线的AS残基为连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hlgG4H-C-Pep-poll58-gagl7-nef66-nefll6-gag253]C713 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS-LSLSLGKAS AlF0SSMTKIL1 I*I■ kKQNI'I)I\ IV(^MI)DLY AS I-Mill kMGGKKKYKLKHIV AS V(.I l>\ I I1ON PLkI1M I YI、.V\' Dl.SIII I.KI.k<,(；l. AS_ HTQ(i> I I1DW V I Tt1TCVRVI1I I IrGWl> kl AS MjIMI1N CII1V KKWlII (il>KI\ K\n Slj I S11 I) AS(SEQ ID NO. 19).图3显示了融合到不同的HIV肽链的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第I到第5泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，然后经还原性SDS PAGE和考马斯亮蓝染色分析。将与不同的C-端HIV肽融合的H链表达载体的编码区域与匹配的轻链(L)质粒共转染到293F细胞中，3天后收集上清用于后续的纯化。第1、2和第3泳道(上方的条带)显示，通过柔性接头flex-vl与H链融合的4个HIV肽的柔性间隔子可以良好地表达。然而，直接与H链融合的4个HIV肽完全不表达(第4泳道，上方的条带)。同时，第5泳道(上方的条带)显示直接与H链融合的5个HIV肽完全不表达。结果说明了特定的组合，以及柔性接头和HIV肽编码序列可以增加重组抗体-HIV肽融合蛋白的分泌。(第1、2和3泳道)下面的序列是H 链-HIV 肽链 gagl7-gag253-nef66_nef 116_poll58 融合蛋白，其中各个HIV肽序列[以斜体显示]由肽内间隔子f[以粗体显示]隔开。柔性接头 flex-vl (vl)[以粗斜体显示]插入在H链的C末端和HIV肽-柔性间隔子链之间。下划线的AS残基为连接序列。[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-hIgG4H-Flex-vl-Pep-gagl7-fl-gag253-f2-nefl 16-f3-nef66-f4-poll58]C825 是QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQiriMisi n>r\ \siPi.\\s\rhr\rKf/:/.;<'dKKKYKuaiivfiS ssvsi 丨t.sv iiPTPPTPTKSSP AS SPP!FVI；FJ}'KR IIU1LNK!I 'RMYSPTSf!.D AS PTSTPADSSTITPTATPTATPTIK(i AS IIRKjYFPDU'i—fXYTPUPUI 'R YPL TfXi WL).KL AS TVTPTATATPSAI\ TTLTPTATTKP AS I GFPViPiJ I fJLRfJ.Vfn K. 11J DLSiif LKfiKUilL AS TNGSI TV_.\AT.\PTVTPTV'NATPSAA
AS A(F(jss\!rKiuii-mij^rr)(t^yg￥Mi)f)Li- as. (seq id no. 20)图4显示了融合到不同的HIV肽链的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第I到第6泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，并经还原性SDSPAGE和考马斯亮蓝染色分析。将与不同的C-端HIV肽融合的H链表达载体的编码区域与匹配的轻链(L)质粒共转染到293F细胞中，3天后收集上清用于后续的纯化。第1、3和第5泳道(上方的条带)显示,通过柔性接头flex-vl与H链融合的4个HIV肽链-柔性间隔子可以良好地表达。第2和6泳道(上方的条带)显示通过柔性flex-vl接头融合到H链的5个HIV肽链-柔性间隔子表达低下。然而，特定的组合，以及HIV肽编码序列可以增加重组抗体-HIV肽融合蛋白的分泌(第3和4泳道)。因此，通过柔性接头flex-vl与5个HIV肽链-柔性间隔子融合的H链当附加到某些其他的肽及在柔性链的情况下可以良好表达(第4泳道)。本发明包括组合物和方法，其用于柔性的潜在糖基化肽链间编码区接头序列及该HIV肽编码区的组合，该编码区对于重组抗-DC受体抗体-HIV肽融合疫苗的有效分泌尤其有利。得自纤维素降解细菌(cellulose-degrading bacteria)的结构域间接头序列作为优选的功能域间接头序列，在蛋白质工程中的用途，尤其是那些具有高度可能的糖基化位点的序列。这些序列的期待的特征为i)固有的柔性，从而便于所连接的功能域的分离，这在很大程度上帮助其正确折叠并维持B细胞受体接触依赖构象的抗原表位；ii)糖基化，从而帮助所生产的完整融合蛋白的分泌和溶解性，并且还保护接头序列免遭培养基中蛋白酶的降解。有利于分泌的HIV肽编码区和插入到HIV肽的编码序列之间的特定的柔性接头序列的特定组合也可以帮助完整的HIV肽链疫苗的分泌——对于其他优选的肽抗原而言，该原理也可以应用于解决类似的问题。优选的接头的DNA序列和抗原编码序列。连接序列密码子和终止密码子以粗体表 示[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-gagl7]C655 是<;< TA(r r GAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTGGCTAGC TGA (SEQ ID NO. :21)[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef66]C679 是GCTAGT GTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGCCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGC TGA (SEQ ID NO. :22)[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-P印-poll58]C667 是GCTAGT GCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGCT CA (SEQ ID NO. :23)[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Pep-gag253]C681 是 GCTAGT CAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCC GCTAGT AACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGACGCTAGC TGA (SEQ ID NO. :24)[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-Flex-vl-P印-gag 17-nefl 16]C686 是GCTAGT CAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCC QCTAGT GAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTG (,( I A(；T CACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCTGGCTAGC TGA (SEQ ID NO. :25)[mAnti-DCIR_9E8_H_LV_hIgG4H_C_hIgG4H_Flex-vl-Pep-gag17_fl-gag2 53_f2_nefl 16-^ -nef66-f4-poll58]C825 是GCTACT CAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCC G(I (:T GAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTG GCTAGT AGCAGCGTGAGCCCCACCACCAGCGTGCACCCCACCCCCACCAGCGTGCCCCCCACCCCCACCAAGAGCAGCCCC cCTAGT AACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGAC GCTAGT CCCACCAGCACCCCCGCCGACAGCAGCACCATCACCCCCACCGCCACCCCCACCGCCACCCCCACCATCAAGGGC GCTAGT CACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCTGGCTAGT ACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCC GCT AC. I GTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGCCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTG ( ( TA(, T ACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCC GCTAGT GCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGC TGA.(SEQ ID NO. 26)优选的接头的DNA序列和抗原编码序列。连接序列密码子和终止密码子以粗体表示Nef (66-97)是GCTAGT GTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGCCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTG GCTACC (SEQ ID NO. :27) Nef (116-145)是GCTAGT CACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCTG GCTACC (SEQ ID NO. :28)Gag pl7 (17-35)是:(；；( T u. I. GAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTG(.C I s(,( (SEQ ID NO. 29)Gag pl7_p24 (253-284)是GCTAGT AACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGAC GCTAGC (SEQ ID NO. :30)Pol 325-355 (RT 158-188)是CCTAGT GCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTAC CCTAGC (SEQ ID NO. :31)Flexl 是CCTAGT AGCAGCGTGAGCCCCACCACCAGCGTGCACCCCACCCCCACCAGCGTGCCCCCCACCCCCACCAAGAGCAGCCCC GC'TAGC (SEQ ID NO. :32)Flex2 是(；( I u, I CCCACCAGCACCCCCGCCGACAGCAGCACCATCACCCCCACCGCCACCCCCACCGCCACCCCCACCATCAAGGGC (j(. I \(.c (SEQ ID NO. :33)Flex3 是GCI U. I ACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCC GCTACC (SEQ ID NO. :34)Flex4 是GCTAGT ACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCC CCTAGC (SEQ ID NO. :35)本发明包括组装编码HIV肽和柔性接头序列的构建体的组合物和方法。H链表达载体一般地具有附加到H链的C末端残基密码子上的Nhe I位点[g I ctagc]，或者附加到flex-vl序列的C末端密码子的[对于flex-vl载体]。柔性接头序列或者HIV肽序列在N-末端柔性接头或者HIV肽密码子之前具有Spe I位点[a | ctagt]，附加到C-末端柔性接头或者HIV肽密码子的Nhe I位点，随后为TGA终止密码子，接着为Eco RI位点，随后为NotI位点。将该柔性接头或者HIV肽Spe I-Not I片段插入到使用Nhe I-Not I消化制备的H链载体中。Nhe I和Spe I是相容的位点,但是当连接时，[g|ctagt]不再是Nhe I或者Spe I位点。因此可以将额外的Spe I-Not I柔性接头或者HIV肽片段插入到新的Nhe
I-Not I的间隔中，所述的新的Nhe I-Not I的间隔位于起始的柔性接头或者HIV肽的远端。以这种方式，可以将HIV肽链和/或柔性接头编码区附加到表达载体H链的编码区。实施例2. HIV狀疮苗——体外杭原靶向牛物学在体外对HIV患者进行抗-⑶40. LIP05HIV肽疫苗测试。为了研究a⑶40.LIP05HIV肽融合重组抗体(a⑶40. LIP05rAb)介导抗原呈递的能力，将融合的rAb加入到来自感染了 HIV的个体的血细胞中，并测量来自外周血液单核细胞(PBMC)的细胞因子产
生。 图5描述了在体外使用的方案，该方案用于检测a⑶40. LIP05HIV肽融合重组抗体(a⑶40. LIP05rAb)在PBMC培养物的环境下，引发抗原特异性T细胞增殖的效力。总地来说，将来自HIV患者的单采(apheresis)的PBMC(2x106细胞/ml)与一定剂量范围的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗进行温育。在第2天，在培养物中加入100U/ml IL-2并且随后每两天使用100U/ml IL-2更换培养基。在第10天时，使用单个的长肽激发扩增的细胞48小时，所述的长肽对应于a⑶40. LIP05HIV肽融合rAb中掺入的5个HIV肽序列。随后，收集培养物上清，并使用多珠检测(multiplex beads assay) (Luminex)评估细胞因子的产生(所述产生通过对肽序列具有T细胞受体[TCR]特异性的T细胞进行)。如果产生依赖于抗-CD40. LIP05HIV肽疫苗的存在，在此检测中测得的抗原特异性的细胞因子产量反映了在培养物中通过抗原呈递细胞(APC)的疫苗摄取，以及肽的加工[蛋白酶降解]和呈递到MHC上。具有TCR的T细胞识别抗原-MHC复合物，所述的TCR仅识别特定的HIV抗原-MHC复合物。在HIV患者中，该细胞可能是在患者中作为对HIV感染的响应而扩增的记忆T细胞。APC可以呈递来自疫苗中所有5个HIV肽区中的表位。图5中的方案用于检测HIV特异性的T细胞作为对抗-CD40. LIP05肽疫苗的响应，在体外的扩增。在图6中显示了来自7个个体中的结果，该结果表明，a CD40. LIP05HIV肽融合rAb在所研究的全部患者中引发HIV肽特异性的IFN y响应。因此，所述的a -⑶40. LIP05HIV肽融合rAb使DC能将疫苗中5个肽中的I个或者2个不同的肽交叉呈递到各个个体的T细胞。然而，这一组激发了 IFNy产生的HIV肽对于各个患者而言是不同的一很可能反映了对HIV特异性的记忆T细胞的不同池。图6显示了在来自HIV患者的PBMC中，HIV肽特异性的IFN Y的产生，所述的PBMC与不同浓度的抗CD40. LIP05肽链疫苗进行温育。C是对照组，其未接受疫苗，并且限定了培养物对各个肽的基线响应。图7是a⑶40. LIP05肽疫苗针对来自8例HIV患者的5个肽区域的响应的总结。该数据基于肽特异性的IFNy产生。图7显示了在8 了 HIV患者中观察到的抗原特异性的响应。该数据证实了该疫苗的所有HIV肽区具有被加工并呈递到T细胞的能力——假定仅当合适的TCR-耐受细胞存在时，才能观察到对这些肽的响应这一可能的情况。因此，各个患者有该细胞的特征谱。a⑶40. LIP05肽抗体可以引起能分泌广谱的细胞因子的抗原特异性T细胞的增殖。图8显示了 a⑶40. LIP05HIV肽疫苗引起HIV肽特异性的T细胞的扩增，所述的T细胞能够分泌多种细胞因子——在疫苗中想要的特征。在图8中，a⑶40. LIP05HIV肽疫苗引发gag253、nef66、nefl 16和pol325肽特异性的响应，其特征在于多种细胞因子的产生。这是患者A5。抗-CD40.LIP05HIV 肽体外接种 DC。图9显示了检测a⑶40. LIP05HIV肽疫苗指导抗原特异性T细胞扩增的方案，所述的抗原特异性T细胞得自DC靶向摄取，并将肽表位呈递到其表面的MHC复合物上。总地来说，HIV患者的单核细胞通过与IFN a和GM-CSF培养2天，分化成DC。随后加入不同剂量的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗或者5种肽的混合物并持续18小时。第3天，在共培养物中 加入自体T细胞(比例为I : 20)。在第5天，在培养物中加入100U/ml IL-2，并且随后每2天使用100U/ml IL-2更换培养基。在第10天，使用单个的长肽再激发扩增的细胞48小时，所述的长肽对应于在a⑶40. LIP05HIV肽融合rAb中掺入的5个HIV肽序列。随后，收集培养物上清，并使用Luminex评估细胞因子的产生。图10显示了对HIV肽响应的细胞因子分泌，所述的HIV肽来自使用不同剂量的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗处理的DC-T细胞共培养物。这是患者A10。显示于图10中的患者AlO中的结果证实了抗原特异性T细胞的扩增对应于在gagl7、gag253和pol325HIV抗原区中的表位。在多数的情况下，a⑶40.LIP05HIV肽疫苗和非-LIP05疫苗[5种非脂质化的HIV肽的混合物，其序列对应于a⑶40. LIP05HIV肽序列中的序列]的响应之间有一致性。因此，在这里a⑶40. LIP05HIV肽疫苗在体外的环境下发挥良好的作用，其中经培养的DC有效地加工HIV抗原并将其呈递到T细胞。这例证了 a⑶40.LIP05HIV肽疫苗用于体外接种的用途，由此“经接种疫苗的DC”经冷藏用于未来再次注射到同一例患者中。a⑶40. LIP05HIV肽疫苗——柔性接头区可能的免疫效果。使HIV肽序列散布于a⑶40. LIP05HIV肽疫苗自身中的柔性接头序列可能含有T细胞表位。图11显示了患者A4似乎没有显著的记忆T细胞池，所述的记忆T细胞对与a⑶40. LIP05HIV肽疫苗内的5个接头序列具有特异性。在图11中，来自使用aCD40.LIP05HIV肽疫苗处理的患者A4的PBMC引发抗原特异性T细胞的扩增，所述的T细胞对gag253区有特异性，而对柔性接头序列没有特异性。使用了在图9中描述的方案，其中柔性接头长肽依次对应于加粗区，HIV肽为粗斜体，其示于下文的序列中。a⑶40. LIP05HIV肽疫苗重链序列以粗体显示柔性接头区，以下划线显示连接序列，以及HIV肽区以粗斜体显示。QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS QTPTNTISVTPTKNSTPTNINSNPKPNP AS EKIRLRPGGXKKYKIKHIVA S SS\ SPTTSV I)PTPTSVPPTP1 K^SP A S NPP/PV(illYKRWill. 1,1.AAVI RMISPTSILDA S PISl PADSS IlTPTA TPTATP11 K(, AS_ MTQGYFPOU a\)TP(,P(,\ RYP!. Ti LYKL
AS IA I P l A l A l PSA1VTT1TP TATTKF AS VdFPVTPQVPLRPMTYS. I lJLKLiMdl
AS TMC,SI.'I'VAATAPTVTPTVNA TPSAA AS. AIFQSSMTKILEPFSKQNPDIVIYQYMD3LYAS- (SEQ ID NO. 36).在图12A中，来自使用a⑶40. LIP05HIV肽疫苗处理的患者A3的PBMC引发抗原特异性T细胞的扩增，所述的T细胞对gag253、nef66和nef I 16区有特异性，而对柔性接头序列没有特异性。使用了在图I中描述的方案，其中柔性接头长肽依次对应于图8的粗体区。图12B显示了由HIV患者A17PBMC与30nM的三种不同的HIV5肽DC靶向疫苗温育所引起的HIV抗原特异性T细胞响应。将细胞与IL-2培养10天，并随后使用单个的长 肽进行刺激，所述的单个的长肽对应于DC靶向疫苗中所包括的5个HIV肽序列。I小时后，加入布雷菲德菌素A(brefeldin A)，并继续温育另外5小时，然后染色进行FACS分析。FACS图显示了对CD3+T细胞进行染色的IFNy和CD8。圆圈标明了与来自无疫苗培养的PBMC的细胞相比，IFN Y +细胞发生显著的疫苗引发的扩增。⑶8-细胞是⑶4+T细胞。数据显示抗-⑶40. HIV5pep疫苗引发nef66(N66)_特异性的⑶8+T细胞的强烈扩增，这一点在其他DC靶向载体中未见到。这些是基于LIP05HIV肽链的数据-仅仅改变了其名称_抱歉带来了混乱。例如所述的抗-CD40H 链是抗-CD40_12E12. 3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Pep-gagl7-f l-gag25
3-f2-nefll6-f3-nef66-f4-poll58]，其序列为EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS(SEQ ID NO :37)图12C是与图12B中类似的研究，除了 PBMC是来自不同的HIV患者(A2)夕卜。该数据显示了由抗-⑶40. HIV5p印，而非其他的DC靶向疫苗，或者由肽自身的混合物引发的抗原特异性⑶4+和⑶8+T细胞响应。图12D显示了基于对15个不同的HIV肽[取自3例患者的5个肽区]响应的分析，在引发广谱的HIV肽特异性的⑶8+和⑶4+T响应方面，抗-⑶40. HIV5pep疫苗明显优于抗-DCIR. HIV5p印、抗-L0X-1. HIV5pep 和非-LIP05 的混合物。柔性接头序列的免疫原性对a CD40. LIP05HIV肽疫苗的设计有很大关系。前文中所示的有限的数据集，测试对柔性接头序列内的表位有特异性的T细胞的记忆(recall)表明抗这些序列的人类全部抗体(human repertoire)是可变的。同时，这些序列从头引发响应的能力未经测试。可以使用本发明测试在猴子中对a⑶40. LIP05HIV肽疫苗的响应。如果有必要的话，在这些区中特定的较不想要的表位可以通过预测的计算方式和肽激发扫描确定，并随后通过引入破坏TCR相互作用的突变变化将其消除。
所述的抗-⑶40结合分子包括具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO. 38)的轻链。该抗体轻链的可变区加下划线，并且将CDR加粗。(分别地为SEQ ID N0S. :42、43和44)。MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC SASOGISN Yl-NffYQQKPDGTVKLLIY vtsii.hsg VPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYC oofnki..ph-i- FGGGTKLEIKRTYAAPSYFIFPPSDEQLKSGTASYVCLLNNFYPREAKVQffKVDNAIQSGNSQESYTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO. :38)抗-⑶40结合分子包括具有以下序列的重链。抗体轻链的可变区加下划线，并且将 CDR 加粗。(分别地 SEQ ID NO. :45，46 和 47)。MNLGLSL IFLVLVLKGVQCEVKLVE SGGGLVQPGGSLKLSCAT S(,[-11-SDWM YffVRQTPEKRLEffV A\[NS(,(,(r.STVVPDTVK GRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCA RR(,HtFHAML) YffGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQ ID NO. :39).在一个方面，编码轻链的核酸包含SEQ ID NO.。抗体轻链可变区的核酸序列标以下划线,并且将⑶R加粗。ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGC \(. !(■( \A(. l( \t.(,<.C'A I I \(( \ \ IlAl IlA \ \< KiGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATT AC AC AU AATl I IU K A GGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTACTATTG
tcagcagtttaataagcttcctccgacgttcggtggaggcaccamctcgagatcmacgaactgtggct
GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO. 40).在一个方面，编码重链的核酸包含SEQ ID NO. :40。抗体重链核酸序列的可变区加下划线，以及将⑶R加粗。ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGT GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCT f.(. A I IC AC I I K A(.H；AC I AT I A( AU ； .I AT TCiGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCCiCA I AC Al I AAl U !(■(■ K.t； IC.C. I Af.t A C ( I A I I A T< C A (■ A (. A( TC ■ T A A Af ■ < (； C CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGA (:C;GGt;(.TTACt (；TTt f AT(.( TAT(.C；A( TAT TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGCTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA(SEQ ID NO. 41). 人源化抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区和轻链可变区的构架区来自供体的人类抗体，并且其中所述的轻链互补决定区与具有氨基酸序列 SASQGISNYLN(SEQ ID NO. 41)的 CDR1L、具有氨基酸序列 YTSILHS (SEQ ID NO. 42)的CDR2L、具有氨基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO. :43)的CDR3L相比具有至少80 %、90 %、95%或者更高的同源性；并且其中所述的重链互补决定区与⑶R1h、⑶R2h和⑶R3H相比包含至少80%、90%、95%或者更高的同源性，所述的CDRIh具有氨基酸序列GFTFSDYYMY(SEQID NO. :45)，所述的 0 211具有氨基酸序列 HNSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO. :46)，以及所述的⑶1 311具有氨基酸序列RGLPFHAMDY(SEQ ID NO. :47)。例如，所述的人化抗体可以包含与SEQ ID NO. :38的构架相比具有至少95%的同源性的VL构架，且包含与SEQ ID NO.39的构架相比具有至少95%的同源性的VL构架。在另一个方面，所述的供体CDR序列来自抗-⑶40 12E12. 3F3，并且进一步地，其中该抗体或其片段特异性地结合于⑶40。实施例3.前列腺特异件抗原(PSA),细胞周期蛋白Dl, MART-1,流感病毒核蛋白(NP)和流感病毒血凝素的HAl亚基(H1N1, PR8)和肽筛诜。抗-CD40mAb的内在化将1x106IL_4DC在冰中与3mg/ml的人类、球蛋白在PBS中温育I小时，所述的PBS含有3% BSA，从而阻止非特异性的结合。将细胞在冰上与Alexa 568标记的抗-⑶40mAb震荡30分钟(在非特异性的封闭液中，最终浓度都是20ng/ml)。随后洗涤细胞，并使表面结合抗体在37°C下内在化不同的次数，持续0到90分钟。在内在化之后，将细胞使用冰冷的PBS洗涤两次，所述的PBS含有I %的BSA和0. 05%的叠氮化钠(PBA)，并且在冰冷的I %无甲醇的甲醛(MFF)的PBS溶液中4°C下固定过夜。将细胞在PBS中4°C下渗析20分钟，所述的PBS含有3%的BSA和0. 5%的皂角苷(PBAS)，并且转移到96孔的圆底聚丙烯微滴定板中。使用冰冷的PBAS洗涤两次之后，将细胞在冰上与3mg/ml人类、球蛋白在PBAS中温育I小时。BODIPY-鬼笔环肽在PBAS中稀释，并与细胞在冰中温育I小时。将细胞进一步地用核复染剂TOPRO-II染色。在Leica SPl共聚焦显微镜上对载玻片进行成像。
细胞。用于细胞表面染色的单克隆抗体购自BD Biosciences (CA)。将来自健康供体的单核细胞(IXlOVml)在含有GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)或者GM-CSF (IOOng/ml)和 IFN a (500 单位/ml) (R&D，CA)的 Cellgenics 培养基中培养(法国)。对于IFNDC而言，在第I天，供给细胞IFN a和GM-CSF。对于IL-4DC而言，在第I天和第3天，在培养基中补充同样量的细胞因子。使用Percoll gradients通过密度梯度离心从血沉掠黄层中分离 PBMC(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 使用 StemCellkits CCA)纯化全部的⑶4+和⑶8+T细胞。肽。合成了前列腺特异性抗原(PSA)、细胞周期蛋白D1、MART-I、流感病毒核蛋白(NP)和流感病毒血凝素的HAl亚基(H1N1 PR8)的15聚体(有11个氨基酸重叠)(Mimotopes)。DC和T细胞的共培养和细胞因子的表达。将加载了重组融合蛋白(抗-CD40-HA1，对照 Ig-HAl，抗-CD40-PSA，抗-CD40-细胞周期蛋白 Dl，抗-CD40-MART-1，抗-MARC0-MART-1，和对照 Ig-MART-I)的 5xl03DC 与 2xl05CFSE_ 标记的 CD4+T 细胞共培养8天。在使用APC标记的抗-⑶4抗体对细胞染色后，通过测量CFSE的稀释测试其增殖。 为了测量细胞内的IFNy的表达，将⑶4+T细胞使用l_5uM标记的肽在布雷菲德菌素甲A的存在下再激活5小时。在独立的实验中，将CD4+T细胞与标记的肽再激活36小时，并且随后通过Luminex测量由⑶4+T细胞所分泌的细胞因子。将CD8+T细胞与DC在20单位/ml IL-2和20单位/ml IL-7的存在下共培养10天。在培养的第10天，使用抗-CD8和标记的四聚体对CD8+T细胞进行染色。CTL检测。在培养的第10天，进行5-h的51Cr释放检测。首先将T2细胞与51Cr进行震荡，并随后使用MART-I的IOuM HLA-A2表位或者流感病毒Ml的InM表位进行标记。使用无肽的T2细胞作为对照。计算三份样品的平均值，并且使用下式确定特异性裂解的百分比特异性裂解的百分比=IOOx (实验中51Cr的释放-对照51Cr的释放)/(51Cr释放的最大值-对照51Cr的释放)。最大的释放指来自2. 5% Triton X-100的祀标中的读数。对人的CD40特异性的mAb的制备。为了对鼠进行免疫及筛选mAb，制备了受体外功能域hlgG(人类的IgGlFc)和AP(人类胎盘碱性磷酸酶)的融合蛋白。按照[J. Immunol. 163 :1973-1983(1999)]所描述对人类IgFc融合蛋白的哺乳动物载体进行了改造。所述的用于受体胞外功能域AP蛋白的哺乳动物表达载体采用PCR扩增AP残基133-1581 (gb IBC009647 |)的cDNA生成，同时加入了框内附近的Xho I位点和远端的6C-末端的His残基及随后的TGA终止密码子和Not I位点。该Xho I-Not I片段在上述的受体胞外功能域IgG载体中替代了人类的IgG Fe编码序列。使用FreeStyle 293ExpressionSystem (Invitrogen, CA)按照生产商的指南制备融合蛋白(Img总质粒DNA力口 1.3ml 293Fectin试剂/L的转染物)。使用Iml HiTrap蛋白质A亲和层析(GE Healthcare, CA),以
0.IM甘氨酸，pH 2. 7下洗脱，对受体胞外功能域hlgG进行纯化。使用2M Tris中和馏分，并随后对PBS进行透析。通过传统的技术产生鼠mAb。总地来说，对六周龄的BALB/c小鼠皮下注射(i. p. )20 ii g受体胞外功能域.hlgGFc融合蛋白及Ribi佐剂进行接种，随后在10天及15天之后使用20 y g的抗原进行加强。三个月后，在取得脾脏之前三天对所述的小鼠再一次进行加强。在最终的加强之后三到四天，收获小鼠的引流淋巴结(draining lymph nodes)(LN)。将来自脾脏的B细胞或者LN细胞与SP2/0-Ag 14细胞(ATCC)进行融合。筛查杂交瘤的上清，从而分析与单独的融合组分相比，或者与融合到碱性磷酸酶的受体胞外功能域相比，受体胞外功能域融合蛋白有特异性的mAb [J. Immunol. 163 :1973-1983 (1999)]。随后使用短暂感染了编码全长受体cDNA的表达质粒的293F细胞在FACS中筛查阳性细胞。所选择的杂交瘤是单个细胞克隆的，并在细胞系烧瓶(celline flask) (Integra,CA)中扩增。将杂交瘤上清与等体积的1.5M甘氨酸、3M NaClUx PBS,pH 7.8(结合缓冲液)混合，并与MabSelect树脂(GE Healthcare, CA) (800 U l/5ml上清一起震荡。将该树脂使用结合缓冲液进行洗涤，并使用PH 2. 7的0. IM甘氨酸进行洗脱。随后使用2M Tris进行中和，将mAb对PBS进行透析。重组mAb的表达和纯化。使用RNeasy试剂盒(Qiagen,CA)从杂交瘤细胞中制备总RNA,并将其用于cDNA的合成和PCR(SMART RACE试剂盒，BD Biosciences)，所述的PCR使用提供的5’引物和基因特异性的3’引物(mlgGK ,5' ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3' (SEQ ID NO. :48) ；mIgG2a,5' ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3' )(SEQ IDNO. :49)。随后将PCR产物进行克隆(pCR2. ITA试剂盒，Invitrogen)并通过DNA测序进行 表征(MC Lab, CA)。将所得到的序列用作小鼠的重链(H)和轻链(L)可变(V)区的cDNA，使用特定的引物将信号肽和V区PCR扩增，同时加入侧翼的限制性位点，从而克隆至编码下游的人类IgGK或者IgG4H区的表达载体。通过扩增侧翼为Xho I和Not I位点的残基401-731 (gi|63101937 |)，并将其插入到 pIRES2-DsRed2(BD Biosciences)的 Xho I-Not I的间隔区构建用于表达嵌合的mV K -hlg K的载体。使用PCR从起始密码子扩增mAb VK区，将Nhe I或者Spe I以及随后CACC附加到编码(例如gi | 76779294 |的残基126)的区域及附加了远端Xho I位点的区。该PCR片段随后克隆到前述的载体的Nhe I-Not I间隔区。对照人类IgG K序列对应于gi I 49257887 |残基26-85和gi | 21669402 |残基67-709。对照的人类IgG4H载体对应于具有S229P和L236E取代的gi|l9684072|的残基12-1473，其使得二硫键稳定化，并且防止剩余的FcR相互作用[J. Immunol. 164 :1925-1933 (2000)]，其插入在pIRES2_DsRed2的BgI II和Not I位点之间，与此同时加入序列5' gctagctgattaattaa3'而不是中止密码子。使用PCR从起始密码子开始扩增mAb VH区，在编码gi 119684072的残基473的区中附加CACC随后BgI II位点。随后将该PCR片段克隆到上述载体的BgI
II-Apa I间隔中。Flu HAl融合蛋白的表达和纯化。所述的Flu HAl抗原的编码序列是CipA蛋白质[热纤梭菌(Clostridium thermocellum) ] gi | 479126 的残基 147-160 上游的血凝素。将具有P321L改变和具有6个C-端组氨酸残基的[甲型流感病毒(A/PuertoRico/8/34 (HlNl)) ] gi | 26599271 的残基 18-331 插入到 H 链载体的 Nhe I 和 Not I 位点之间，从而编码重组抗体-HAl融合蛋白(rAb. HAl)。类似地，重组抗体-PSA融合蛋白(rAb. PSA)通过将近端序列为 GCTAGCGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACACTTCTAGCGC(SEQ ID NO. 50) (Nhe I 位点和 CipA 间隔区)和远端 Not I 位点的gi I 34784812前列腺特异性抗原残基101-832插入到相同的H链载体中进行编码。按照上文对hFc融合蛋白的描述，表达并纯化重组抗体蛋白。在一些情况下rAb的抗原编码区和相对应的L链编码区转移到分开的cetHS-puro UCOE载体中(Millipore，CA)。UCOE载体与预适应性的无血清的悬浮细胞系联合使用使得能够快速地生产大量的蛋白[Cytotechnology38,43-46(2002)] o将生长在具有GlutaMAX和HT的补充培养基(Invitrogen)的CD-CH0中的CHO-S细胞以5xl05ml进行接种，24小时后，转染到500ml的Corning Ehrlenmyer烧瓶中，并在125rpm下，在8% CO2中进行温育。在转染的当天，将存活率至少为95%的I. 2x107细胞加入到125ml的烧瓶中，最终体积为30ml的具有GlutaMAX的⑶-CHO中。将0. 6ml的OptiPRO SFM(Invitrogen)中的 48 U I 的 FreeStyle Max 试剂(Invitrogen)在温和混合下加入到0. 6ml的OptiPRO SFM中混合并经无菌过滤的24 y g See I线性化的轻链载体和24 ii g的See I-线性化的H链载体中。在20分钟之后，将DNA-脂类复合物在涡旋震荡下缓慢加入到125ml CHO-S培养烧瓶中。将细胞温育24小时，随后加入30ml的⑶-CHO与CH0-M5合并的培养基溶液(Sigma，C0363 component of CHO Kit I)，所述的培养基溶液含有 5 u g/ml 嘌呤霉素(A. G. Scientific, CA)，2xGlutaMAX和 0. 25xPen/Strep (Invitrogen)。在第2天，将另外的5 u g/ml嘌呤霉素直接加到培养物中并在转染后第六天开始，在细胞存活之后，使选择进行 10-14天。存活的细胞计数下降，并且存活密度是 2-3xl06/ml时，将该细胞以lE6/ml转移到的新鲜的选择培养基中(具有2X GlutaMAX,0. 25xPen/Str印，IOii g/ml嘌呤霉素的⑶CH0-S+CH0 M5)。当存活率达到> 90%时，制备冷冻细胞原种。当在500ml的烧瓶中细胞密度超过2x107ml，直至4X 250ml时，在选择培养基中将细胞分开。当细胞存活率下降到80%以下并且最大的最终细胞密度 7x107ml时，收集上 清。内毒素水平低于0.2单位/ml。重组的Flu Ml和MART-I蛋白的表达和纯化。在将Nhe位点I掺入到起始密码子的远端及将Not I掺入到终止密码子的远端的同时，使用PCR来扩增流感A/PuertoRico/8/34/Mount Sinai (HlNl)Ml 基因的 ORF。将经切割的片段克隆到 pET_28b (+)(Novagen)中，将所述的Ml ORF与His6的标签置于框内，从而编码His. Flu Ml蛋白。编码来自热纤梭菌(C. thermocellum)(未公开)的N-末端169个残基的黏连蛋白功能域的pET28b (+)衍生物表达Coh. His，所述的N-末端169个残基的黏连蛋白功能域插入在Nco I和 Nhe I 位点之间。为了表达 Cohesin-Flex-hMART-1-P印tideA-His，将序列 GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG(SEQ ID NO. 51)(编码 DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGT TAE IiLAGiGffJVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEQ ID NO. :52)-斜体的残基是免疫显性的 HLA-A2-限制性肽，并且围绕该肽的下划线的残基来自MART-I)插入到上述载体的Nhe I和Xho I位点之间。该蛋白质在大肠杆菌株BL21(DE3) (Novagen)或者17 Express (NEB)中进行表达，在LB中在37°C下生长，同时进行卡那霉素抗性选择(40 u g/ml)，并且当加入120mg/L的IPTG时，以200转/分震荡直到对数生长中期。三小时之后，通过离心收获该细胞，并于-80°C下储藏。将得自各个IL的发酵物中的大肠杆菌细胞重新悬浮在20ml的含有0.1ml of蛋白酶抑制剂 Cocktail II(Calbiochem，CA)的冰冷的 50mM 的 Tris，ImM EDTA pH8. 0 中(缓冲液B)。将细胞在冰上于设定18 (Fisher Sonic Dismembrator 60)下超声降解2X5分钟，在该设定下有5分钟的停止期并随后于4°C下17，OOOr. p. m (Sorval I SA-600)进行20分钟。为了纯化His. Flu Ml，将50ml细胞裂解液上清部分通过5ml Q琼脂糖珠，并在琼脂糖的流出液中加入pH 7. 9的6. 25ml 160mM Tris，40mM咪唑和4M NaCl。该细胞裂解液以4ml/min加载到5ml HiTrap螯合带有Ni++电荷的HP柱上。将柱结合的蛋白使用20mMNaP0/t,300mM NaCl pH 7. 6 (缓冲液D)清洗，随后再次使用IOOmM H3COONa pH 4.0进行清洗。结合蛋白使用100mMH3C00Na pH 4. 0进行洗脱。收集峰组分，并以4ml/min将其加载至lj5mlHiTrap S柱上，所述的柱子使用IOOmM H3COONa pH 5. 5进行平衡，并使用平衡缓冲液进行清洗，随后使用50mM NaPO4 pH 5. 5中0_1M NaCl的梯度进行洗脱。收集位于约500mMNaCl的峰组分。为了进行Coh. Flu Ml. His的纯化，按照上文将来自2L培养物的细胞进行裂解。在离心之后，在上清中加入2.5ml的Triton X 114并在冰上温育5分钟。进一步地在25°C下温育5分钟之后，将上清从Triton Xl 14中分离，随后在25°C下进行离心。重复此提取，并将上清通过5ml Q琼脂糖，并且在流出液中加入pH7. 9的6. 25ml 160mM Tris,40mM咪唑，4M NaCl0将蛋白质随后通过Ni++螯合色谱按照上文所述进行纯化，并且使用缓冲液D中的0-500mM咪唑进行洗脱。图13 显示了抗-CD40mAb :IL_4DC 的内在化。将 IL-4DC 使用 500ng/ml 的抗-CD40-Alexa 568进行处理。 图14显示了由抗-⑶40HA1靶向的DC增殖⑶4和⑶8T细胞。将加载了 2ug/ml抗-CD40-HA或者对照Ig-Hal的5xl0e3IFNDC与CFSE-标记的自体CD4+或者CD8+T细胞(2xl0e5)共培养7天。将细胞随后使用抗-⑶4或者抗-⑶8抗体进行染色。通过CFSE稀释测量细胞的增殖。图15显示了 HAl融合蛋白对⑶4+T增殖的滴定。将加载了融合蛋白的IFNDC(5K)与标记了 CFSE的⑶4+T细胞(200k)共培养7天。图16显示了由抗-⑶40-HA1靶向的IFNDC激活HAl-特异性的⑶4+T细胞。使用加载了 5uM标记的肽的DC重新激发⑶4+T细胞，并且随后将IFN y进行染色。图17显示了由抗-⑶40-HA1靶向的IFNDC激活HAl-特异性的⑶4+T细胞。使用加载了 =标记的肽的DC重新激发CD4+T细胞36小时，并且随后分析培养物上清，从而测量IFNy。图18显示了靶向⑶40导致MART-I特异性的CD8+T细胞的增强的交叉敏化。将加载了融合蛋白的IFNDC (5K/孔)与经纯化的CD8+T细胞共培养10天。将细胞使用抗-CD8和四聚体进行染色。细胞来自健康的供体(HLA-A*0201+)。图19显示了了靶向⑶40导致MART-I特异性的⑶8+T细胞的增强的交叉敏化(使用来自不同的健康供体的8次重复的实验的总结)。图20显示了使用抗-⑶40-MART-1靶向的IFNDC诱导的⑶8+CTL是有功能的。与使用融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+T细胞与加载了 IOuM肽表位的T2细胞进行混
八
口 o图21显示了使用IFNDC诱导的⑶8+CTL是有功能的，所述的IFNDC使用抗-CD40-Flu Ml进行靶向。与以融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+T细胞与加载了
I.OnM肽表位的T2细胞进行混合。图22显示了测试由连接到PSA(前列腺特异性抗原)的抗-⑶4012E12组成的疫苗引发原态T细胞群体扩增的能力的方案的概括。对应于光谱的PSA表位的PSA特异性CD4+T细胞。总地来说，将与健康供体的单核细胞的IFNa和GM-CSF培养得到的DC与该疫苗进行温育。第二天，将细胞置于新鲜的培养基中，并加入来自同一供体的纯⑶4+T细胞。几天之后，加入PSA肽，并且在4小时之后测定在培养物上清中分泌的Y -IFN水平。图23显示了多种PSA肽引发强烈的Y-IFN产生反应，这表明抗-⑶4012E12和类似的抗-CD40剂能有效地将抗原递送到DC，导致引发针对该抗原的多个表位的免疫应答的敏化。PSA抗原的肽定位。将加载了 2ug/ml的抗-⑶40-PSA的5xl0e3 IFNDC与经纯化的自体⑶4+T cells (2xl0e5)共培养8天。随后将细胞与5uM的得自PSA的单个肽一起重新激活36小时。通过Luminex测量IFN y的量。细胞来自健康的供体。图24显示了抗-CD40-PSA靶向的DC诱导PSA-特异性的CD8+T细胞响应。使用lug mAb融合蛋白将IFNDC与PSA进行靶向。将经纯化的自体⑶8+T细胞共培养10天。将细胞使用抗-⑶8和PSA (KLQCVDLHV)-四聚体进行染色。细胞来自HLA_A*0201阳性的健康供体。该结果证实了抗-⑶40将PSA递送到DC，其则引发PSA特异性的⑶8+T细胞的扩增。总地来说，将加载了 2ug/ml的抗-⑶40-PSA与经纯化的自体⑶8+T细胞(2xl0e5)共培养10天。随后使用四聚体将细胞染色。细胞来自HLA-0*201阳性的健康供体。
图25示意图(左侧)和肽池的T细胞的IFN y产生，以及对照供体2。将加载了2ug/ml抗-CD40-细胞周期蛋白Dl的5xl0e3IFNDC与经纯化的自体CD4+T细胞(2xl0e5)共培养8天。随后将细胞由得自细胞周期蛋白Dl的5uM的单个的肽在布雷菲德菌素甲A的存在下，进行重新刺激5小时。将细胞进行染色，从而测量细胞内的IFNy表达。图26显示了肽扫描和T细胞的IFN Y产生，所述的T细胞得自图25中所示的各批肽，以及对照为供体2。将加载了 2ug/ml抗-⑶40-细胞周期蛋白Dl的5xl0e3IFNDC与经纯化的自体CD4+T细胞(2xl0e5)共培养8天。随后将细胞由得自细胞周期蛋白Dl的5uM的单个的肽在布雷菲德菌素甲A的存在下，进行重新刺激5小时。将细胞进行染色，从而测量细胞内的IFNy表达。总之，通过⑶40将抗原递送到最为有效的抗原呈递细胞DC是有效地诱导和激活抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞介导的免疫的方式。因此，由抗_CD40mAb制备的疫苗能诱导针对癌症和感染的有效免疫。肽信息HAl 序列MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCR(SEQ IDNO. 53)LKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYP⑶FIDYEELRE(SEQ IDNO. 54)QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNS(SEQ IDNO. 55)YVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQA(SEQ IDNO. 56)GRMNYYffTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLG(SEQ IDNO. 57)AINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSI(SEQ ID NO. 58)图17中的肽序列肽22 :SSFERFEIFPKESSWPN(SEQ ID NO. :59)
肽45 :GNLIAPWYAFALSRGFG(SEQ ID NO. :50)肽46 :WYAFALSRGFGSGIITS(SEQ ID NO. :61)NP 序列MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNS(SEQ IDNO. 62)LTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKffMRELILYDKEEIRRIff(SEQ IDNO. 63)RQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAG(SEQ IDNO. 64)
AAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMD(SEQ IDNO. 65)QVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVG(SEQ IDNO. 66)IDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLST(SEQ IDNO. 67)RGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPF(SEQ IDNO. 68)DRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFD(SEQ IDNO. 69)MSNEGSYFFGDNAEEYDA (SEQ ID NO. :70)图23中肽的序列肽22 :GKWVRELVLYDKEEIRR(SEQ ID NO. :71)肽33 :RTGMDPRMCSLMQGSTL(SEQ ID NO. :72)肽46 :MCNILKGKFQTAAQKAM(SEQ ID NO. :73)前列腺特异性抗原(PSA序列)MffVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPffQVLVASRGRAVCGGVLVHPQffV(SEQ IDNO. 74)LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRP⑶DSSHD(SEQ IDNO. 75)LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ IDNO. 76)NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCS⑶SGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ IDNO. 77)SLYTKVVHYRKffIKDTIVANP(SEQ ID NO. :78)图23中肽的序列肽I =APLILSRIVGGffECE(SEQ ID NO. :79)肽4 :ECEKHSQPWQVLVAS(SEQ ID NO. :80)肽25 :⑶DSSHDLMLLRLSE(SEQ ID NO. :81)肽26 :SHDLMLLRLSEPAEL(SEQ ID NO. :82)
肽49 :S⑶SGGPLVCNGVLQ(SEQ ID NO. :83)肽54 :GSEPCALPERPSLYT(SEQ ID NO. :84)肽56 :ERPSLYTKWHYRKW(SEQ ID NO. :85)肽58 :WHYRKWIKDTIVAN(SEQ ID NO. :86)
细胞周期蛋白Dl的序列MRSYRFSDYLHMSVSFSNDMDLFCGEDSGVFSGESTVDFSSSEVDSWP⑶SIACFIEDER(SEQ IDNO. 87)HFVPGHDYLSRFQTRSLDASAREDSVAWILKVQAYYNFQPLTAYLAVNYMDRFLYARRLP(SEQ IDNO 88)ETSGffPMQLLAVACLSLAAKMEEILVPSLFDFQVAGVKYLFEAKTIKRMELLVLSVLDWR(SEQ IDNO. 89) LRSVTPFDFISFFAYKIDPSGTFLGFFISHATE11LSNIKEASFLEYffPSSIAAAAILCV(SEQ IDNO. 90)ANELPSLSSVVNPHESPETWCDGLSKEKIVRCYRLMKAMAIENNRLNTPKVIAKLRVSVR(SEQ IDNO. 91)ASSTLTRPSDESSFSSSSPCKRRKLSGYSWVGDETSTSN(SEQ ID NO. :92)图26中肽的序列肽7 :DRVLRAMLKAEETCA(SEQ ID NO. :93)肽8 :RAMLKAEETCAPSVS(SEQ ID NO. :94)肽10 :TCAPSVSYFKCVQKE(SEQ ID NO. :95)MART-I抗原。MART-I是与肿瘤关联的黑色素细胞分化抗原。使用MART-1抗原进行接种可以刺激宿主针对表达黑色素细胞分化抗原的肿瘤细胞的细胞毒性T-细胞响应，导致肿瘤细胞的裂解。图27显示了抗-⑶40-MART-1肽抗体的表达和构建体设计。图28是MART-I的对⑶4+和⑶8+免疫显性的表位的总结。图27和28显示了柔性接头技术的应用，该技术使得能够成功地表达与人类MART-I的大部分( 2/3)融合的重组抗-DC受体靶向抗原。融合到整个MART-I的编码区域的H链的C末端的重组抗体完全不从生产哺乳动物细胞中分泌[未显示]。Flex-vl-hMART-1-P印-3-f4-P印-I加合物的表达尤其好，并且是MART-I靶向的疫苗的一个优选实施方案，最大地负载MART-I表位的Flex-vl-hMART-1-P印-3-f4-P印-l-f3-Pep-2也是如此。MART-I的幻灯片演示的第2页显示这些加合物可以成功地附加到多种抗-DC受体载体上。下面的序列pep3-pepl_pep2融合蛋白的H链_hMART_l肽链,其中各个hMARTl肽序列[粗体一斜体]由肽链问间隔子打以粗体显示]隔开。在这种情况下，将得自纤维素酶体锚定支架蛋白B前体[溶纤维素拟杆菌-在gag-nef疫苗的发明内容中描述]的27个氨基酸长的接头flex-vl (vl)[斜体]插入到H链的C端和hMARTl肽柔性间隔子链之间。下划线的AS残基为连接序列。[mAnti-CD40_12E12. 3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-l]C981 是EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRuy
QXAHNHlVaHWAS3SHAN9aQMS)iaAnHSAliMS9asaiAddXXMNNadQ9NSaAiaAViaSdAH9)!A13nSAQN)!XWaaQSdcnXAAQdaHdQ9W)ISIX)!aiSScn9MSA)!3)!Aa)!9NlAiaQHlAnASAAHAXSNHQaaHd)!XWNHAaA9aAAMHQAadQSAaAAA0XAadXHSIWlXa)!d)!dcMlHASd99aHadVd3dd3dd9A)!SaAH)!aA)!XNSd)!HaAN3XAX)!X91SSSdAXAASSlSA19SSQlAVcMXHA9SnV9SNAlSAXAdacMAaM1391VVXSaSXSHS0dVlcMASd9)!XWSSAXAXX9V9MaHA99A9A9AAHSSHV3AAXVVaVXaAIXI)nHAQNSSXa)!SinHS)nSdNAH)iaaaMIHVlAiai9)!9SdQHIAlS19W9SXSlSH9SHS3nSlXQSdQlI9d9Sa)nXAQ [8600]
:w CTOTO
(86: .on ai Qas) sv
row ///i f/ /.V^a sv vvsh.i.n、\ 1 a.\ \ m\ 1 \ \ A l is；)\ 1 sv dsxdddso /i s7v /1Vdd
^ Vc/ IV7d /ySV cf S-\\ idLIS'i.f.\- /d/O SV)!91S1S1S)!QXA
HNHlVaHWAS3SHAN9aQMS)iaAnHSAliMS9asaiAddXXMNNadQ9NSaAiaAViaSdAH9M13nSAQN)!XWaaQSdcnXAAQdaHdQ9W)ISIX)!aiSScn9MSA)!3Ma)!9NlAiaQHlAnASAAHAXSNHQaaHd)!X)!VNHAaA9aAAMHQAadaaQSAaAAA0XAadXHSIWlXa)!d)!dcMlHASd99aHadVd3dd3dd9A)!SaAH)!aA)!XNSd)!HaAN3XAX)!X91SSSdAXAASSlSA19SSQlAVcMXHA9SnV9SNAlSAXAdacMAa)!A1391VVXSaSXSHS0dVlcMASd9)!XWSSAXAXX9V9MaA99A9A9AAHSSHV3AAXVVaVXaAIXI)nHAQNSSXa)!SinHS)nSdNAH)iaaaMIHVlAiai9)!9SdQHXAlS19W9SXSlSH9SHS3nSlXQSdQlI9d9Sa)nXAQ [9600]
:W
CTOTO [I-dad-W-C-dad-I-XHVWM-IA-x^^IH-O-H^jn-Al-H'gae^IOa-nuvra] [9600]
(Z6: 'ON ai Qas) sv Da&dJMVj,irjd// is>fon
7VWA9MSMM.M』MXMTl%i SV fTSilVid丄'lii.41VSdr￥lV.[.<.[.l..\.l. SVI I Jll LI
ASWDHDMMdAfUMHVamdM SV VVSdlVNAidiAiJVlVV.VI」V>Wl. SV dSA(!<iilSOi\ SlM3AVdJVMdAAd33MM3(ilNAMSamaJD SV dNd^dNSNmdlSNX.UiflSUNlJl QSV)!91S1S1S)!QXAHNHlVaHWAS3SHAN9aQMS)!aAnHSAliMS9asaiAddXXMNNadQ9NSaAiaAViaSdAH9M13XlSAQN)!XWaaQSdcnXAAQdaHdQ9W)ISIX)!aiSScn9MSA)!3Ma)!9NlAiaQHlAnASAAMXSNHQaaH
cMUVNHAHAOaAAMNiTOAMCmGSAaAAACUAMI^SiruaMMdirUAScKOMMVcDdcDdcKAMSH 八
H)iaA)!XNSd)!HaAN3XAX)!X91SSSdAXAASSlSA19SSQlAVcMXHA9SnV9SNAlSAXAdacMAa)!A1391VVXSaSXSHS3dVlcMASd9)!XWSSAXASX9Q9MaWVHHcn9MV3AAWVXaaS)nHSWQlAlXNWNaHSIXHH9MXadAAXS999SNIAVAiaiH)iadXQHAMWAAaSHXH9SXV3Sl)nS99dQA1999SaAlMa [1^600]
:w 8Z63[C-d3d-
Cj_T_d8d-W-c-d8d-i-XHVMM-IA-X8[￡6￡0]
(96: 'on ai Qas) snm/u,immyvmni
\SIlf)II!)>iyiJADAMHV€imJ^ SV ￥￥Sd.IA'JvAU.LAldVIW.VJJS；)NI SV ,!S.UhSdSO!I S lM1.{ I m \<f iA JMJNMSdlSAmaMHaJf) SV n.\ VW.VW'.Li、7./A LdL(' SV)!91S1S1S)!QXAHNHlVaHWAS3SHAN9aQMS)!aAnHSAliMS9asaiAddXXMNNadQ9NSaAiaAViaSdAH9M13XlSAQN)!XWaaQSdcnXAAQdaHdQ9W)ISIX)!aiSScn9MSA)!3Ma)!9NlAiaQHlAnASAAHAXSNHQaaHdM)!VNHA3Af)aAAMNdi5A3da肋SAaAAAOlAadI^SiruaMMdiTUAScKOMadVcDdcDdcKAMSaAH)iaA)!XNSd)!HaAN3XAX)!X91SSSdAXAASSlSA19SSQlAVcMXHA9SnV9SNAlSAXAdacMAaM1391VKSLSLSLGKAS QTPTNTfSVTPTNNSTPTNNSNPKPNP, AS GFDHRDSKVSLQEKNCEP^'PNAPPA} rfil.S. tEQSPPPYSP: AS TNGSIWaATAPTVTPWNATPSAA. AS MPREDAHFIYG￥PKKGff(；HSm AL I. UaiGlUVIM； AS TVTPTATATPSAlVTTiTPTATTKF AS VLLUGlli YCRMUM；) RIL.yn^Sf.HI (, TiH . !￡,TRRCPQEG AS (SEQ ID NO. :99)MART-I DNA 序列具有3个 肽，使起始/终止位点的MART-1构建体加下划线，肽I为粗体，肽2为粗斜体并且肽3为粗体下划线 AACACCGACAACAACAGATGATCTGGATGCAGCTAGT GCG I T I CaTCA ICCGG U'.VG€AA K, FCI < I I ( AA<i.\(, \AAAAf 1<； I (；AA( ( I (； I (；(, I I ( ( f AA I <；(K < AC'r11'CCTTAIt.K K I (i< \(.AAC K \( (A< ( A( (II Al I ( AO ' I (; C T A G T A C C A A C G G C
AGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGT/frccf .I \g.k, i irv r",r" K i n\ni \ K,(,n \( < rr ilggggoio；
GCCff f ( I l k t( < {( (,(,( Hi f f(r i(,(,( ( (,( / (,(,(, I ii (,(,< 'ATCCTGAf ff, /(, Mi ( {(,(,GA
GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGT (■ I ( I l A(K.C I ( A IC (；(■( I(■ IK；(. I A I K； [M1AA(. AC < ,AAA I (.f.A I A(Cl 1(. A I (.CA I AAAAt. K I I ( A 1(. I I (■(.( A( I ( AA 1(. I (■
((.T T A ACWCW (■ A T( ■ ( ( CM AM A A C (； (； u-a(iC(i(iCC(iCATC(iAAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC(SEQ IDNO. :100)肽3是粗体，随后为下划线的Flex-4的氨基酸序列。gfdiirdskvslqekncepvvpnappayeklsaeqspppysi,
ASTNGSITVAATAPTVTPT(SEQ ID NO. :101)肽I是粗体，随后是下划线的Flex-3的氨基酸序列VNATPSAAAS MP:REDAHF[Y(mK(;IK;llSYTTAl-:KAA(,K;lLTVILti
ASTVTPTATATP(SEQ ID NO. :102)肽3是粗体SAIVTTTTPTATTKPAS M.I. I.I(,CWYCRkkN(iYRAI.MI)KSI.H N GTQCAl.TRRt PQK(i(SEQID NO. 103)MART I_肽3，斜体的部分是⑶4+免疫显性的表位。GFDHRDSKVSLQE KXL 'tn VP^APftA YtiKLSAtj QSPPPYSP (SEQ ID NO. :104)Flex-4ASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS(SEQ ID NO. :105)MARTI-肽1，斜体的部分是⑶4+免疫显性的表位，并且下划线-斜体的部分是⑶8+免疫显性的表位.MPRh/14HFf YCYiiKKGHOHS YTT AtfA.4GfG!LTViLG (SEQ ID NO. :106)Flex-3 ASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS(SEQ ID NO. :107)MARTI-肽2斜体的部分是⑶4+免疫显性的表位VLLUGCfftCKBJffGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEG(SEQ ID NO. :108)具有两个肽的MARTl构建体肽3是粗体-斜体-下划线的，flex-4是粗体的并且肽I是粗体_斜体_下划线的
Ut DURDSKI SfOhK \ ( tri I I1 \ 17* 厂 I Yh Kl S {tlOSFrrVS r VST.NGSITVAATAPTVTPTWAI rs、、vsUfjjjj1) rhh(rfi<r//Sr\t,h \ I(,tdu f i H O AS (SEQ ID NO. 109)蛋白质序列C978. rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12. 3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vI-hMART-1-Pep-3 (粗体-斜体-下划线)-f4 (粗体)-Pep-I (粗体-斜体)~f3 (斜体)_Pep_2 (粗体-下划线)]MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAG Uf "HtWSh' S!.
Oi h\Ci ri I r \Arr-i} i hi.s^/.osrrrysrxs i ngsi I v v vi \.i, I \ 11* r\ \ \ I i^saaasmpm'
/>-1 Hf G)rKKOHGiiSvn a/ / -f AGiOft- n .ii.OASi I n、！.A i.-t" n!na dsvu.i.ic
CW \ CUUUNG^ kAI \H)KSI.II\ C I QC Vl I RkCI1Ol GAS (SIiC1) 11) \(). :11())蛋白序列C981.rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12. 3F3_H-LV-hIgG4H-C_Flex-vl-hMART-l-Pep-3 (粗体-斜体-下划线)-f4-(粗体)-Pep-1](粗体-下划线)MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS GmHRDSKl SI.
OLh\CL'Fll TYirr,iyLKLSAL'(KSrrFYSF\Siy(.,SVr\ \\r AVTV YV Y\yi\T￥SAA\S\irR\LDAHFLYGYPKKC.UC.I^^ r [ ALEAAGIGILTVILGAS (SEQ ID NO. :111)GPlOO抗原。GPlOO抗原是黑色素瘤关联的抗原。当其在疫苗制剂中给药时，gplOO可以激发针对表达该抗原的，细胞毒性的T cell HLA-A2. I限制的免疫应答，这可以导致肿瘤大小的减少。与重组的抗体H链编码区融合的GP100胞外功能域编码区域在哺乳动物生产细胞中完全不分泌[未显示]。全部的序列如下显示斜体的残基是前导序列和跨膜域，肽为粗体-斜体，并且跨膜域是斜体-下划线的。MDL VLKRCLLHLA VJCALU VCA TKVPRNQDffLGVSRQLRTKAffNRQLYPEffTEAQRLDCffRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVW MTWGQYWQV LGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFT ITDQVPFSV SVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRALVVTHT
\ UJGPVTA qvvlqaaipltscgsspvpgttdghrptaeapnttagqvpttevvgttpgqaptaepsgttsvqvpTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGE⑶AFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQEAGLGQ lT!Ji—(JlLU'L\!M'VLASU YRRRLMKQDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV(SEQ ID NO. :112)已知的HLA-A0201 限制性的肽序列为GP100 M :209-217 (2M) IMDQVPFSV (SEQ IDNO. 113) ；209-217WT ITDQVPFSV(SEQ ID NO. :114)GP100M :280-288(9V) YLEPGPVTV(SEQID NO. 115)280-288WT YLEPGPVTA(SEQ ID NO. 116)GPlOOffT :154-162 =KTffGQYffQV(SEQID NO. 117) o图29-33显示了 gplOO加合物，其成功地作为分泌的抗-DC受体靶向疫苗分泌。其采取了柔性接头序列、gpioo胞外功能域编码区的断裂和改组的应用。描述了 gplOO疫苗加合物的优选的实施方案。
图29显示了抗-⑶40-gp 100肽抗体的表达和构建体设计。图30显示了附加的抗-⑶40-gpl00肽抗体的设计。图31显示了附加的抗-⑶-gplOO肽抗体的表达和构建体设计。图32是gplOO中对⑶4+和⑶8+免疫显性表位的总结。图33显示了附加的抗-⑶40-gpl00肽抗体的表达和构建体设计。rAB-cetHS-puro[manti_CD40_12E12. 3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-hgp100-Pep-l-f
4-P印-3-f3-P印-4-f4-P印-5-f3-P印-2]C1285，肽是粗体-斜体，柔性接头是粗体，并且下划线的AS序列是连接序列EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS DTTEPA TPTTPVTTPTTmVPRNQDWLfiVSRQlRTKA WNRQl YFCiVTl UJRI.IH
n Si hi s\t (irn,f(, i \ istsr i/.i.ri)(ro\ /IfiaV\rtf m vnj
ttr/)(,(,r( rsfisusohnsi- i ) i n Km oi i.{r(；pvs(rt s/(,i(rf{ i MtamI\n.\
nSfJSVi /7.. I//乂V.V. II I/TOQJ TI S\ SI .SYJ/. RAUXt(t.\hHFLR.\(J AS_ I [ \ AA IAP
IA IPIA NA IPSAA AJi. (HI LK,H Rn TL. if\\nH,Q\ PTTtf VGTTPCifiPTALPSGTTSVQVPT/Li iSi. in onr/ MSf C.MirLK I TVShi m(, ) Il. u.MStrh nr,Mir. ti. \ Sn \ LSdi i i i /\_s_ rVl IAIA II1SAIN I Tl I r I Al I Kl) Aii. v\ } 111: " I \!{hS.Fn'Li'iA,ri) \SSr\fS! LSt
pu d(；t I n.Rwi^toi rf-Dd I. iv vrars) rron o As tncsitv a\tapt\tpt\ natpsaa asGins, inlq. I r psar.an trr.Ln scQaai.PKr. \('.\旧ssp(;cqpp. tgRu gn lpsp. tcoi. i ’/..//
QILKGGSGTYCLNVSLA D T\SL. 11 J STOUl 'PGILLTGQEACLCQ. AS_ TVTPTATATPSAIVTTITPTAT Ik I* AS. PlTFAiQf.linrSGYl. I/ 1 DfSHit Ol ODSS(y/i.lSR tfJ-fFTH iM I. /iGPVTAQVVUJ f. urn Si (rssn F AS (SEQ ID NO. :118)rAB-cetHS-puro[hIgG4H-C~FIex-hgpI00-Pep-l-f4-Pep-3-^ -Pep-4-f4_Pep-5-3 -Pep-2]C1286
RLQLQESGPGLLKPSVTLSLTCTVS⑶SVASSSYYWGWVRQPPGKGLEWIGTINFSGNMYYSPSLRSRVTMSADMSENSFYLKLDSVTAADTAVYYCAAGHLVMGFGAHWGQGKLVSVSPASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS mn.PA rniTVnTTTTKVPR \ODWLGVSRQLRTh. H M^QI. Ylfln T/4QRL
DCWRGGUVSLkVSNDGPTLlGANASFSlALNFPGSgKVLriXiil' W I HfAGSQFWGGQPVY.PffETMl t CifTD(f(；PCPSGSWSQKRSr\ } J WKIWCQni Of L GOT I 'SGLSIGTGMAMLGTHTME VTVYim R(, S(JS). I PLiHSSSAFTITDQ I TISl SI SQLRALD(,(,.\KniLRNQ AS_ TPnGSITVAAT\r I % rr I \ \a I i'saa A S (, JTDftURrnr. \p\n \(,o\ mi: \ k// rf'(,n \n \frsGrrsi ()\rr/ Vf I /s/ IP\ UMn U STGMTri hY VM V/ [ 1/6 / 7/ I/ I/S7/7 I !(JMti1M I Sll I / VG77 1 I
AS r\ I p i \ I \ i I1SAiv i in I11 \ i i ki> As oy in/ n i i n [Rn PiPi rraro issi.ms h sit(.,sl(;!、U /)(；! Yil itl.l KifOl 7V./K i I ) /HO,V/SI Tf.nilfJ /\_S_.I.V \ A T \ P I \ Il1 IV \ A IPS A A
A s G/IS it N Q I f VjSY,//,DM I t ! \ 0(,(, / I1KfI 11 //■ fSSIr(,IVf1P IORf CfJI11 i r\r. IC Ot I !/KJIt h(,(,S(,T￥a ^VSf-tnTVSf 4VVSTOf JVP(r!f I J(,0! U1IX1Q /\_S_ rv | |> | vi A l f*S \l\ I l II I* I A I I KP /\_S_ i! \! Ot HDrsaVi U \t)l S\ /Ml Dl (,/ISStr/ilSfi if I I if! iV!ir(,r\ I \ (JVI {.(JUfn. TSCOSSin P AS (SEQ ID NO. :119)gplOO -核酸序列。肽I-下划线，肽2-斜体，肽3-粗体，肽4-粗体-下划线，肽5粗体-斜体GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAAAAGTACCCAGAAACCAGGACTGGCTTGGTGTCTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGAACAGGCAGCTGTATCCAGAGTGGACAGAAGCCCAGAGACTTGACTGCTGGAGAGGTGGTCAAGTGTCCCTCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAAATGCCTCCTTCTCTATTGCCTTGAACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCAACAATACCATCATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAACTGACGATGCCTGCATCTTCCCTGATGGTGGACCTTGCCCATCTGGCTCTTGGTCTCAGAAGAGAAGCTTTGTTTATGTCTGGAAGACCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCTGGGCTGAGCATTGGGACAGGCAGGGCAATGCTGGGCACACACACCATGGAAGTGACTGTCTACCATCGCCGGGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCATTACTGACCAGGTGCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGGAACAAGCACTTCCTGAGAAATCAGGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGT (.,(,(-u.(. u_ 'AUJHKr
iri . IC (Ad_ I L-1171,( :1 C:;I i(,Gt (.(—(. 1.141M(—C 'A(. -10LI G'G( (.. ,I i011,C 'Cl. it IAL\ l0,1.16./ 7UTl；
G(rl\ U 7.11 'K f..('.i.fCTUC. I(j. I (,(X Y .7.( T(;“.'U(.('Al WR Ti,Rd ' I r( K (: 1.1
c (.; j ('Ta in.. Ti. I r. i,u,('-ica,i'j c'(. i a n, cjc i iac r u (ivc: i o.i (a , r. i m ich'i .. r (r. I a iK r(, ju '<: i(; if Ti ■ I a j (；(, n \ I rxAJG j. i ('i —. I (.. j r n.i, cu.j, (.,. i n; hmai .<: i c,a ggcl i
(',iid.JATi.Ai 4i ( 7(,(\UrA{KiTA J( 'AATRrK^rK.t TfTl 'f(；(L-L-U f :U .4(,( ..UA A GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGTCA(.C； I AA(A.VCTACAGAGTGGGTGGAC.At ( .4CAI '\GAGA
权利要求
1.一种融合蛋白，其包括式 Ab- (PL-Ag) X ；Ab- (Ag-PL)X ；Ab-(PL-Ag-PL) X ； Ab- (Ag-PL-Ag) X ；Ab- (PL-Ag) x-PL ;或者Ab- (Ag-PL)x-Ag ； 其中Ab是抗体或者其片段； PL是包含至少一个糖基化位点的至少一个肽接头； Ag是至少一种病毒抗原；以及 X是从I到20的整数，
2.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的PL具有更高的稳定性。
3.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag包括来自腺病毒、逆转录酶病毒、细小核糖核酸病毒、疱疫病毒、轮状病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、冠状病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(f Iavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒(orthomyxovirus)、本扬病毒(bunyavirus)、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒(papilomavirus)、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒的肽。
4.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag包括肽，所述的肽来自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、脊髓灰质炎、天花、风疹、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感或感冒病毒的至少一种。
5.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag选自Nef(66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAA VDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. :1)、Nef (116-145) HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gag pl7 (17-35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3)、Gag pl7-p24 (253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO. :4)、或者Pol 325-355 (RT 158-188)为AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO. :5)。
6.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag为19到32个残基。
7.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag选自在HIV-lNef、Gag和Env蛋白质中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，所述的HIV-INef、Gag和Env蛋白质以MHC-I类分子呈现。
8.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag选自HIVgpl20、gp41、Gag、pl7、p24、p2、p7、pi、p6、Tat、ReV, PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx, Vpu 和 Nef。
9.如权利要求所述的融合蛋白，其中x包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、.16、17、18 或者 19。
10.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag包括来自不同抗原的病毒肽，所述的病毒肽由不同的肽接头隔开。
11.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag由至少一个含有丙氨酸和丝氨酸的PL隔开。
12.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白选自SEQID NO. :21、22、23、24、25、26 或者 36。
13.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白从包括多核苷酸载体的细胞中分离，所述的多核苷酸载体编码所述的融合蛋白，所述的多核苷酸载体包括SEQ ID NO.21、22、23、24、25、26 或者 36。
14.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ab包括SEQID NO. 37和38。
15.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ab至少包括抗-⑶40_12E12.3F3 (ATCC登记号 PTA-9854)、抗-CD40_12B4. 2C10 (ATCC 提交号 HS446,登记号 PTA-10653)和抗-CD40_11B6. 1C3 (ATCC 提交号 HS440，登记号_ PTA-10652)的可变区。
16.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ab包括至少一个可变区，该可变区与SEQ ID NO. :148、150和153的重链可变区，或者与SEQ ID NO. 149、151、152或者154的轻链可变区或者与SEQ ID NO. :148、150和153的重链可变区和SEQ ID NO. 149、151、152或者154的轻链可变区两者具有90%、95%、99%或者100%的序列同源性。
17.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白从包含多核苷酸载体的细胞中分离，所述的多核苷酸载体表达融合蛋白，并且所述的Ab部分包括SEQ ID NO. :39和40。
18.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag选自SEQID NO. :52-56、58_60、61-69,70-72或者73-77中的至少一个。
19.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag为17到60个残基。
20.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag包括至少一个脂肽。
21.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的Ag位于羧基末端，并进一步地包括羧基末端(Palm)-NH2基团。
22.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的PL选自SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO. :11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO. :12)、TVTPTALATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. 13)或者TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO. :14)。
23.如权利要求I所述的融合蛋白，其中所述的PL包括丙氨酸和丝氨酸。
24.一种病毒抗原递送载体，所述的载体包括 融合蛋白，所述的融合蛋白包括抗-CD40抗体或其片段及在该抗-CD40抗体的羧基末端上的一个或者多个病毒肽，其中当存在两个或多个病毒肽时，所述的病毒肽由一个或多个肽接头隔开，所述的肽接头包括至少一个潜在的糖基化位点。
25.一种抗原递送载体，其表达抗-⑶40抗体或其片段及位于所述的抗-⑶40抗体的轻链、重链或者轻链和重链两者的羧基末端的两个或者更多个病毒肽，其中两个或更多个病毒肽由一个或多个肽接头隔开，所述的肽接头包含至少一个潜在的糖基化位点。
26.—种稳定病毒肽的方法,所述的方法包括 将一个或者更多个不稳定或者不可溶的病毒肽与抗体一起掺入到融合蛋白中，所述的抗体和所述的病毒肽由一个或多个肽接头隔开，所述的肽接头包括一个或多个糖基化位点。
27.一种增强T细胞响应的方法，所述的方法包括使用有效量的疫苗对需要接种的受试者进行免疫，所述的疫苗包括式Ab- (PL-Ag) X 或者 Ab- (Ag-PL) x ； 其中Ab是抗体或其片段； PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头； Ag是至少一种病毒抗原；并且 X是从I到20的整数。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述的至少一种病毒抗原包括来自腺病毒、逆转录酶病毒、细小核糖核酸病毒、疱疫病毒、轮状病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、冠状病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒(orthomyxovirus)、本扬病毒(bunyavirus)、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒(papilomavirus)、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒的肽。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述的至少一种病毒抗原包括肽，所述的肽来自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、脊髓灰质炎、天花、风疹、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感或感冒病毒中的至少一种。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag选自Nef(66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAA VDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. :1)、Nef (116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gag pl7 (17-35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3)、Gag pl7-p24(253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO. :4)和 /或 Pol325-355(RT 158-188)为AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag为19到32个残基，并且选自在HIV-INef、Gag和Env蛋白质中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，所述的HIV-INef、Gag和Env蛋白质以MHC-I类分子呈现。
33.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag选自HIVgpl20、gp41、Gag、pl7、p24、p2、p7、pl、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu 和 Nef。
34.如权利要求27 所述的方法，其中 x 包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或者 19。
35.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag包括两个或多个来自不同病毒的病毒抗原。
36.如权利要求27所述的方法，其中所述的PL包括丙氨酸和丝氨酸。
37.如权利要求27所述的方法，其中所述的疫苗选自SEQID NO. :21、22、23、24、25、26或者36。
38.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ab选自SEQID NO. :37和38。
39.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag选自SEQID NO 52-56、58-60、61_69、70-72或者73-77中的至少一种。
40.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag为17到60个残基。
41.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag包括脂肽。
42.如权利要求27所述的方法，其中所述的Ag位于羧基末端，并包括羧基末端(Palm) -NH2 基团。
43.如权利要求27所述的方法，其中所述的PL选自 SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO. :11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO. :12)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. :13)、或者TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO. :14)。
44.一种制备对HIV肽特异性的、产生IFN Y的T细胞的方法，所述的方法包括 使用融合蛋白对受试者进行免疫，所述的融合蛋白包括抗-CD40抗体或其片段，在所述抗体的羧基末端具有一个或多个HIV肽；并且 从所述的受试者分离外周血液单核细胞，其中将所述的经分离的外周血液单核细胞浓缩以得到产生抗HIV IFNy的T细胞，其中所述的抗-⑶40抗体包括SEQ ID NOS. :37和38或其片段。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述的受试者是怀疑具有HIV感染的患者。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述的融合蛋白包括两个或者更多个HIV肽，并且所述的肽由一个或者多个肽接头隔开。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述的融合蛋白包括两个或更多个HIV肽并且所述的肽由一个或更多个包括糖基化序列的肽接头隔开。
48.如权利要求44所述的方法，其中所述的融合蛋白包括两个或者多个HIV肽，并且所述的肽由一个或多个含有丙氨酸和丝氨酸的肽接头隔开。
49.如权利要求44所述的方法，其中所述的一个或多个HIV肽包括至少一个脂肽。
50.如权利要求44所述的方法，其中所述的一个或多个HIV肽包括羧基末端的(Palm) -NH2 基团。
51.如权利要求44所述的方法，其中所述的一个或多个HIV肽为19到32个氨基酸长，并且选自在HIV-lNef、Gag和Env蛋白质中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，所述的HIV-lNef, Gag和Env蛋白质以MHC-I类分子呈现。
52.如权利要求44所述的方法，其中所述的一个或多个HIV肽选自HIVgpl20、gp41、Gag、pl7、p24、p2、p7、pi、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif > Vpr> Vpx、Vpu 和 Nef。
53.如权利要求44所述的方法，其中所述的一个或多个病毒肽选自以下的至少一个 Nef (66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. :1)、Nef (116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ IDN0. :2)、Gag pl7 (17-35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3)；Gag pl7-p24 (253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)和 /或 Pol 325-355(RT 158-188)为AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)。
54.一种包括抗-CD40抗体或其片段的融合蛋白，其在抗体的羧基末端具有一个或多个病毒肽，所述的病毒肽由包括至少一个丙氨酸和一个丝氨酸的PL隔开。
55.如权利要求54所述的融合蛋白，其中所述的一个或多个病毒肽是HIV肽。
56.如权利要求54所述的融合蛋白，其中所述的一个或多个病毒肽选自以下的至少一个Nef(66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAA VDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. :1)、Nef (116-145) HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gag pl7(17-35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3)、Gag pl7-p24(253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)或 Pol 325-355(RT 158-188)为AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)。
57.—种制备融合蛋白的方法，所述的方法包括 向表达载体中插入核酸构建体，所述的核酸构建体包含编码具有下式的蛋白质的多核苷酸Ab- (PL-Ag) X 或者 Ab- (Ag-PL) x ； 其中Ab是抗体或其片段； PL是包括至少一个糖基化位点的至少一个肽接头； Ag是至少一种病毒抗原；并且 X是从I到20的整数；并且 将该载体在足以允许所述融合蛋白表达的条件下进行培养。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述的融合蛋白在溶液中比没有糖基化位点的相同的融合蛋白具有更高的稳定性。
59.如权利要求57所述的方法,其中所述的至少一种病毒抗原包括来自腺病毒、逆转录酶病毒、细小核糖核酸病毒、疱疫病毒、轮状病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、冠状病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒(orthomyxovirus)、本扬病毒(bunyavirus)、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒(papilomavirus)、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒的肽。
60.如权利要求57所述的方法，其中所述的至少一种病毒抗原包括肽，所述的肽来自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、脊髓灰质炎、天花、风疹、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感或感冒病毒中的至少一种。
61.如权利要求57所述的方法，其中所述的融合蛋白是Ab的轻链、Ab的重链或者Ab的轻链和重链两者，并且所述的Ab至少包括抗-⑶40_12E12. 3F3 (ATCC登记号 PTA-9854)、抗-CD40_12B4. 2C10 (ATCC 提交号 HS446, ATCC 登记号 PTA-10653)和抗-CD40_11B6. 1C3 (ATCC 提交号 HS440，ATCC 登记号 PTA-10652)的可变区。
62.如权利要求57所述的方法，其中所述的Ag选自Nef(66-97) VGFPVTPQVPLRPMTYKAA VDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO. :1)、Nef (116-145) =HTQGYFPDffQNYTPGPGVRYPLTFGffLYKL(SEQ ID NO. :2)、Gag pl7 (17-35) EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO. :3)、Gag pl7-p24(253-284) NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO. :4)或Pol 325-355 (RT 158-188)为AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO. :5)。
63.如权利要求57所述的方法，其中所述的Ag为19到32个残基，并且选自在HIV-lNef, Gag和Env蛋白质中鉴别的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，所述的HIV_lNef、Gag和Env蛋白质以MHC-I类分子呈现。
64.如权利要求57所述的方法，其中所述的Ag选自HIVgpl20、gp41、Gag、pl7、p24、p2、p7、pl、p6、Tat、ReV、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu 和 Nef。
65.如权利要求57 所述的方法，其中 x 包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或者 19。
66.如权利要求57所述的方法，其中所述的载体包括两个或多个来自不同病毒的病毒抗原，所述的病毒抗原由不同的肽接头隔开。
67.如权利要求57所述的方法，其中所述的载体包含两个或多个病毒肽，所述的病毒肽由一个或多个含有丙氨酸和丝氨酸的肽接头隔开。
68.如权利要求57所述的方法，其中所述的融合蛋白选自SEQID NO. :21、22、23、24、25,26 或者 36。
69.如权利要求57所述的方法，其中所述的融合蛋白从包括多核苷酸载体的细胞中分离，所述的多核苷酸载体编码所述的融合蛋白，所述的多核苷酸载体包括SEQ ID NO. :21、22、23、24、25、26 或者 36。
70.如权利要求57所述的方法，其中所述的Ab选自SEQID NO. 37和38。
71.如权利要求57所述的方法，其中所述的融合蛋白从细胞中分离，所述的细胞包含编码Ab的多核苷酸载体，所述的Ab包含至少一个可变区或者SEQ ID NO. 39和40，所述可变区与SEQ ID NO. :148、150和153的重链可变区或者SEQ ID NO. 149、151、152或者154的轻链可变区具有90 %、95 %、99 %或者100 %的序列同源性。
72.如权利要求57所述的方法，其中所述的Ag选自SEQID NOS. :53-57、59-61、62_70、71-73或者74-78中的至少一种。
73.如权利要求57所述的方法，其中所述的至少一种病毒抗原为17到60个残基。
74.如权利要求57所述的方法，其中所述的一个或多个病毒肽包括至少一个脂肽。
75.如权利要求57所述的方法，其中所述的一个或多个病毒肽还包括羧基末端(Palm) -NH2 基团。
76.如权利要求57所述的方法，其中所述的PL选自SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO. :11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO. :12)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. :13)或者TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO. :14)。
77.一种在体外扩增抗原特异性的T细胞的方法，所述的方法包括:从HIV患者分离PBMC ； 将该经分离的PBMC与有效量的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗温育； 在有效量的IL-2的存在下扩增所述的PBMC ；收获细胞；并且 评估该细胞的细胞因子产量，从而确定抗-HIV特异性的T细胞的存在。
78.通过下述方法制备的HIV抗原特异性的T细胞，所述的方法包括 从HIV患者分离PBMC ； 将该经分离的PBMC与有效量的a⑶40. LIP05HIV肽疫苗温育； 在有效量的IL-2的存在下扩增所述的PBMC ； 收获细胞；并且 评估该细胞的细胞因子产量，从而确定抗-HIV特异性的T细胞的存在。
79.—种制备治疗性疫苗的方法，所述的方法包括 将树突细胞加载a⑶40. LIP05HIV肽疫苗，其包括 分离HIV患者的单核细胞； 使用IFNa和GM-CSF将所述的单核细胞分化成为树突细胞；并且将经分化的树突细胞暴露于a CD40. LIP05HIV肽，其中所加载的树突细胞能够在体外刺激自体HIV-肽特异性的T细胞。
80.一种通过包括如下步骤的方法制备的治疗性疫苗 将树突细胞加载a⑶40. LIP05HIV肽疫苗，其包括 分离HIV患者的单核细胞； 使用IFNa和GM-CSF将所述的单核细胞分化成为树突细胞；并且将经分化的树突细胞暴露于a CD40. LIP05HIV肽，其中所加载的树突细胞能够在体外刺激自体HIV-肽特异性的T细胞。
81.一种治疗性疫苗，所述的疫苗包括多肽，该多肽包括SEQ ID NO. :21、22、23、24、25、26或者36中的至少一种。
82.—种包含权利要求I所述的融合蛋白的治疗性疫苗。
全文摘要
本发明包括用于表达、分泌及使用新组合物的组合物和方法，所述的新组合物用作例如疫苗和抗体递送载体，从而将抗原递送到抗原呈递细胞中。在一个实施方案中，所述的载体是抗-CD40抗体或其片段，以及一种或多种连接到所述的抗-CD40抗体或者其片段的抗原性肽，所述抗体包括人源化抗体。
文档编号C12N15/62GK102741295SQ201080020430
公开日2012年10月17日 申请日期2010年3月4日 优先权日2009年3月10日
发明者A-L·弗拉玛, G·祖拉夫斯基, J·F·班彻罗, M·蒙特斯, Y·莱维 申请人:贝勒研究院