壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗及其制备和应用的制作方法
专利名称：壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，尤其涉及一种用于预防或治疗结核病的疫苗及其制备方法和应用，特别是一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗及其制备和应用。
背景技术：
结核分枝杆菌感染导致的结核病的死灰复燃是当今全球重大的健康问题，由于人口密集度和流动性日益增加、常规BCG疫苗的无效性、结核耐药菌株的出现、以及AIDS病导致的结核并发感染，目前结核发病及死亡非常严重，全球每年有800万活动性结核患者并导致300万死亡；我国约有5. 5亿人口曾经感染结核，每年13万人死于结核，每月约有12万新发病人。2006年结核已一跃成为我国感染性疾病发病的首位，研制新型结核预防疫苗非常迫切。研究表明，结核分枝杆菌主要感染肺部巨噬细胞。诱导⑶4+Thl细胞及其分泌的高水平的IFNy，不仅能够增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力，还可以通过促进⑶8+CTL的诱导发挥特异性杀伤结核感染细胞，对于清除结核杆菌至关重要。基因疫苗或称DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达质粒、直接注射动物的第三代疫苗，由于可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈激活DC细胞，有效激活⑶4+Thl和⑶8+T细胞，因此特别有利于诱导Thl型免疫应答。然而，在机体的什么部位诱导Thl型免疫应答同样是一个关键问题，虽然诱导脾脏和淋巴结(全身性)Thl型免疫应答是传统疫苗的重点，但是，有关抗粘膜感染病原体免疫的国际前沿研究表明诱导肺粘膜局部的粘膜T细胞免疫应答对于清除粘膜感染病原体更为重要。结核杆菌主要通过呼吸道粘膜入侵机体，粘膜免疫是人体免疫的第一道防线，可在感染的早期和最初感染部位有效控制感染，防止感染扩散。诱导呼吸道和肺部特异性粘膜免疫应答，可有效控制结核早期感染，防止细菌播散，因此诱生特异性粘膜免疫成为新型结核疫苗研制的热点和重点。通过呼吸道给予粘膜疫苗可更好地模拟结核杆菌天然感染，诱导特异性粘膜免疫，在粘膜感染的第一时间清除病原体，产生更为有效的抗结核免疫保护作用。然而，粘膜部位接种抗原通常很难诱导免疫应答，由于粘膜局部纤毛的频繁摆动、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使得外来抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通过粘膜递送系统来对DNA疫苗进行组装，而后行粘膜免疫。因此，申请人以已公开的基于T细胞表位的结核基因疫苗(基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。专利申请号200710171416.X)为基础，以一种特定性质
的天然多糖------壳寡糖(oligo-chitosan)通过共聚沉淀的方法与结核基因疫苗形成壳
寡糖-DNA纳米颗粒复合物，而后进行滴鼻免疫，诱导结核特异性全身和肺部粘膜Thl型细胞免疫应答
发明内容
本发明的目的在于提供一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗及其制备和应用，所述的这种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗要解决现有技术中由于常规BCG疫苗的无效性、以及结核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核并发感染使得现有疫苗预防和治疗结核病的效果不佳的技术问题。本发明提供了一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，由壳寡糖与结核抗原编码质粒共聚交联复合而成，所述的结核抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO 8所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。在结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因和结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的Ag85B蛋白的420 459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO 12所示。进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3. 1质粒、或pVAXl质粒。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37RV株来源结核杆菌ESAT-6蛋白的189 2 位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 9所示。进一步的，嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 11 所示。进一步的，所述的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度为75% -85%。进一步的，本发明的结核抗原编码质粒的构建方法，包括以下步骤1)提取结核分枝杆菌H37Rv株DNA作为模板，用SEQ ID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO :14所示的下游引物通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编
码基因；2)以结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1、片段2、片段3 ；3)以SEQID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQID NO 15所示的Tl引物，通过PCR扩增片段1，所述的片段1的双链DNA的序列为atggccaagacaattgcgtacgacgaagaggcccgtcgcggcctcgagcggggcttgaac
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gcgatttcggcgggtgaccagtccatcg
cgctaaagccgcccactggtcaggtagc 4)以SEQ ID NO 16所示的T2引物和SEQ ID NO 17所示的El引物通过PCR扩增片段2，所述的片段2的双链DNA的序列为gggtgaccagtccatcggtgacctgatcgccgagggtctttcgatggct
cccactggtcaggtagccactggactagcggctcccagaaagctaccga
gcttcttcggcgctgacgctggcgatggacaaggtgggcaacgagggcgtcatcaccgtc
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5)以 SEQ ID NO 18 所示的 E2 引物和 SEQ ID NO 14所示的HSP65下游引物通过PCR扩增片段3，所述的片段3的双链DNA的序列为
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ctcttccgaaccgaagggccaccgccgctgtacccaccgtacctaaag ；
6)将上述的3段片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，以SEQ ID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO 14所示的HSP65下游引物作为引物，通过PCR方法扩增获得嵌合了 4个T细胞表位的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经EcoRI和Hind III双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得所述的结核抗原编码质粒。具体的，是将上述的片段1和片段2混合，热变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，热变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，用SEQ ID NO :13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO:14所示的下游引物经PCR可扩增获得片段(1+2+3)，即嵌合了 4个T细胞表位的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65外源目的基因。进一步的，所述的载体选自pcDNA3. 1质粒、或pVAXl质粒。本发明还提供了上述的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)构建结核抗原编码质粒pECANS ；(2)将0. 1 0. 4%浓度、PH5. 2-5. 5的壳寡糖溶液，与18 25 μ g/ml编码结核抗原的质粒pECANS溶液在55-60°C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的壳寡糖溶液中，所述的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度75% 85%，所述的质粒DNA溶解在IOmM的磷酸盐缓冲液(PBQ中，通过共聚交联作用，获得的壳寡糖-DNA复合物呈球形纳米颗粒，直径在150 300nm之间。冷冻干燥，_70°C冷冻保存。本发明使用前，以无菌PBS溶解壳寡糖-DNA复合物，使DNA浓度为lmg/ml。本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，以及药学上接受的载体或者赋形剂。本发明还提供了上述的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。本发明通过DNA预测软件，从结核分枝杆菌H37Rv株来源的已知的4种关键抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP-10中各自筛选了一个T细胞表位，共4个T细胞表位，构建含有4个T细胞表位的结核靶抗原编码质粒。由于表位仅有8-20个氨基酸，结构太小和简单，免疫原性很弱。因此选择一种载体基因，将4个T细胞表位插入载体基因中，共同构成结核外源目的基因。本发明选择结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白65 (HSP65)作为嵌入T细胞表位的基因载体。HSP65是热休克蛋白60家族成员，在细菌到人体细胞有很高的同源性。全长162;3bp，编码540个氨基酸，分子量65kD。选择结核杆菌来源HSP65作为嵌入T细胞表位的基因载体的原因有两点1、HSP内含有多个结核T细胞和B细胞表位，本身就是重要的免疫保护性抗原，已证实HSP65作为目的抗原免疫小鼠可产生抗结核强保护性免疫应答，且与产生IFN-Y的⑶87⑶44hi细胞有关。2、HSP作为细胞内伴侣蛋白，参与蛋白质转位、折叠和装配，可帮助嵌入的表位更好地折叠形成空间结构。本发明选择的4个T细胞表位来自以下4种结核抗原l)Ag85A，295氨基酸。结核分枝杆菌H37Rv株的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体(antigen 85complex)，由Ag85A、Ag85B、Ag85C组成的相对分子质量为38000蛋白家族。Ag85A可刺激机体产生体液免疫，也可激发Thl型细胞免疫，诱导⑶8+T细胞增殖和IL-2及IFN- γ等上升。》Ag85B，蛋白质全长285氨基酸，分子量34. 6KD。又称MPT59、Rvl886，是一种分枝杆菌转移酶，与细菌细胞壁合成有关，具有多个τ细胞表位，能诱导Thl反应、IFN- γ的产生。3) ESAT-6，又称Rv3875，全长^8bp，95个氨基酸，分子量9. 9KD，仅在结核分枝杆菌H37Rv株等强毒株中有这种抗原。含有多个T细胞表位，能激活CD4+、CDS+T细胞，在抗结核保护性免疫应答中起重要作用。ESAT-6还可刺激Mtb病人的外周血T细胞增殖，促进IFN-Y释放。用ESAT-6和佐剂制成的亚单位疫苗免疫小鼠具有较好的保护性。4) CFP-10,低分子量结核杆菌培养滤液蛋白，全长30!3bp，100个氨基酸，分子量10000,与结核分枝杆菌H37Rv株毒力有关，刺激机体产生强烈的T细胞免疫应答并释放高水平的IFN- y。BCG传代过程中ESAT-6和CFP-10基因丢失，而在绝大多数毒株中这两个基因都存在。本发明通过BLAST网络数据库比对、DNAstar生物软件分析以及亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性等参数的分析，选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗表位区段；然后通过网络数据库(http://www. syfpeithi. com/scripts/MHCServer. dll/home, htm)分析预测这些区段中存在的T细胞抗原表位、同时与HLAI、II类分子可高亲和力结合的表位。经过计算机分子预测最后获得的4个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因(ESAT_6189_228)；结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A369_4Q5)；结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_2(17)；结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42C1_459)。分别插入到结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65基因的第438位碱基、第486位碱基、第1185位碱基后，构建结核靶抗原编码质粒。本发明在pcDNA3. 1质粒中，插入一段结核外源目的基因，作为靶抗原编码质粒，该结核外源目的基因由4个结核T细胞表位嵌合到结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65蛋白的3个非关键结构位置所共同构成，经分析，4个表位的嵌入不会影响HSP65本身的正常三级、四级空间结构，因此将这一嵌合有4个T细胞表位的HSP65基因的靶抗原编码质粒称为 ECANS(Epitope Cast in A Natural Structure，ECANS)。本发明的疫苗可以以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。进一步的，所述的结核粘膜基因疫苗的粘膜免疫方法如下1)首先对动物进行轻度麻醉；2)在鼻腔、口腔或生殖道内逐滴注入壳寡糖-pECANS纳米颗粒，3) 二周后重复1)+2)的免疫过程，4)共免疫 3 4 次，pECANS DNA 总量在 150 200 μ g。本发明采用的壳寡糖(oligo-chitosan)，是甲壳类动物来源的天然生物多糖几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物。chitin(几丁质，N-乙酰氨基葡萄糖多聚体)是一种广泛存在于虾、蟹外壳中的天然多糖。chitin与DNA复合可生成不溶于水的微米颗粒(microparticle)，是一种强有效的巨噬细胞激活剂，并上调Thl型细胞免疫。chitin经脱乙酰化后可衍生为分子量从120000 400000的chitosan多糖(壳多糖/壳聚糖，β _ (1 — 4) -2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)，无毒，具有生物可容性和生物可降解性，天然带正电荷，可与带负电荷的粘膜天然静电吸附，具有增强粘膜黏附吸收作用，还具有促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被广泛用于药物赋形剂与缓释剂。壳寡糖(oligo-chitosan)又名壳聚糖寡糖(chitosan oligosaccharide)，由壳聚糖(chitosan)经酶解或水解制得，成分为3 10个β-(1 — 4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖寡糖。其最大的特点是具有水溶性，使容易被肠道吸收。此外，它具有激活巨噬细胞、T、NK细胞，诱导TNF-α、活性氮、氧中间体(R0I、RNI)产生的特性，因此具有增强Thl型细胞免疫应答和抗胞内菌感染潜能。以合适分子量和脱乙酰度的壳寡糖与质粒DNA在特定的浓度、温度、pH值、振荡速度条件下，可形成大小不一的共聚复合物。本发明以特定性质的壳寡糖制备特定溶液，与特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制备了直径在150-300nm的纳米颗粒复合物。优选的选择是0. 4%浓度、PH. 5. 5的壳寡糖(分子量约3000-6000，脱乙酰度75% 85% )溶液，与25 μ g/ml编码靶抗原的质粒DNA(pcDNA3. 1-ECANS)溶液(IOmM PBS)，在55°C下，以15000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，制备了壳寡糖-结核靶抗原DNA (pECANS)纳米颗粒。经冷冻干燥，置_70°C冻存备用。使用时以无菌PBS溶解，使DNA浓度为lmg/ml。本发明中，将oligo-chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行以常规小鼠麻醉方法轻度麻醉小鼠，将小鼠鼻孔向上，以枪头吸取< 20μ 1液体直接逐滴滴入鼻腔内，待液滴随小鼠呼吸自主进入呼吸道后，再滴下一滴液体。可交替滴入两个鼻孔。液体总体积不宜超过50 μ 1。本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于pcDNA3. UpVAX以及常见和市售的真核质粒载体。本发明中，“药学上接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、变态反应)、有合理效益/风险比的物质。本发明中，“药学上接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，PH值通常约5-8。综上所述，本发明公开的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，具有以下三大特性1)其核心是一种已申请并公开的多表位靶抗原编码质粒一一pECANS结核基因疫苗(基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。专利申请号200710171416.X)，其中编码靶抗原包括结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65蛋白基因，和嵌入其中的4个结核分枝杆菌H37Rv株来源的优势抗原的4个T细胞表位，理论上含有至少5种结核抗原，可诱导多抗原特异性的、更有效的抗结核免疫保护作用。2)通过具有特定化学性质的有市售的壳寡糖(oligo-chitosan)，与上述pECANS质粒DNA形成共聚复合物后，再通过粘膜途径接种该井壳聚糖递送的结核粘膜基因疫苗，具有安全无毒性、缓释性、亲粘膜性等多种优势，可促进粘膜局部特异性免疫应答的诱导。3)该结核粘膜基因疫苗通过优化免疫途径、免疫程序、免疫剂量、间隔时间，能更有效地诱导全身和粘膜T细胞和抗体应答。本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明的oligo-chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗通过滴鼻途径免疫小鼠，有效诱导针对载体HSP65结核抗原的特异性抗体应答和全身(脾脏和淋巴结)特异性Thl性免疫应答；更重要的是，能诱导肺粘膜局部很强的结核特异性分泌性SIgA和分泌高水平IFN γ的Thl应答，效果显著优于传统BCG结核疫苗和裸露的pECANS基因疫苗，因此具有作为新型结核预防和治疗性疫苗的潜力。
图1显示了 pECANS结核基因疫苗的构建示意图。图2显示了通过HSP65上游引物/Tl、T2/E1、E2/HSP65下游引物三对引物分别扩增得到的双链DNA片段1 (l-508bp)、片段2 (491-1315bp)、片段3 (1298-1788bp)，而后通过彼此重叠的17个碱基互补相连得到嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因，其中，粗体带下划线的序列是插入的4个T细胞表位序列。图3显示了本发明中嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因的质粒PCR (图3A)、酶切(图3B)及部分测序鉴定结果(图3C)。图4显示了壳寡糖(oligo-chitosan)与pECANS质粒形成的共聚复合物的示意图；其中，图A显示了壳寡糖oligo-chitosan与pECANS质粒形成共聚复合物示意图；图B显示了壳寡糖-pECANS纳米颗粒的扫描电镜图。图5显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫小鼠诱生结核特异性抗体血清IgG水平，其中，图A显示HSP65抗原特异性IgG的水平；图B显示HSP65抗原特异性特异性IgG效价；图C显示HSP65抗原特异性特异性IgG亚类情况；图D显示特异性IgG亲和力。图6显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗诱导肺灌洗液中SlgA的水平。图7显示了 ELISP0T试验检测的壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗诱导的⑶4+IFN-γ+T细胞数目。其中，图A显示了免疫小鼠脾细胞经结核抗原刺激后分泌IFN-Y的水平，图B显示了肺脏单个核细胞经结核抗原刺激后分泌IFN- γ的水平。图8显示了以流式细胞术检测的壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫诱导的免疫小鼠脾细胞和肺脏淋巴细胞中IFN-γ+⑶4+Thl细胞的比例。图9显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠经大剂量BCG攻毒后肺脏组织HE染色病理结果图。图10显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫小鼠经大剂量BCG攻毒后肺脏组织、脾脏组织菌落计数结果图。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。
实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下结核分枝杆菌标准H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结防科提供)。质粒pcDNA3. 1 (-)、pVAX、宿主细菌DH5 α (Invitrogen公司)。基因合成(上海赛百盛公司)。oligo-chitosan (分子量在3000 6000之间，脱乙酰度为75% -85% )购自合肥博美生物有限公司、小鼠IFN- y ELISA检测试剂盒购自R&D公司；HRP标记羊抗小鼠IgG/IgA多克隆抗体(Southern Biothech公司)；。HSP65蛋白为本实验室自行表达(见200610027572. 4号专利)、多肽委托上海吉尔公司合成、Lipofectamin-2000购自invitrogen公司。限制性核酸内切酶 EcoR I,Hind III、T4DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP (TaKaRa 公司)；RNaseA (Ameresco公司)；LB培养基(英国0X0ID公司)，Tris (USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen)。6-8周龄雌性BALB/c (H_2d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。实施例1 :pcDNA3. I-ECANS结核基因疫苗的构建1、ECANS结核基因疫苗的目的T细胞表位的预测通过BLAST网络数据库、DNAstar生物软件、网络数据库(http://www. syfpeithi.com/scripts/MHCServer. dll/home. htm)分析，综合亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性、与HLAI、II类分子结合、等参数，预测获得的4个T细胞表位结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228 位基因(ESAT-6189_228)；结核杆菌 Ag85A 蛋白的 369 405 位基因(Ag85A369_4。5)；结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_2Q7)；结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42Q_459)。以pcDNA3. 1或pVAX为质粒载体，以结核分枝杆菌HSP65基因作为嵌合表位的基因载体，在计算机预测其二级结构的基础上，在其中不影响关键结构的位置第438位碱基后插入ESAT-6189 2 表位基因、第486位碱基后插入Ag85A369 405、第1185位碱基后插入 CFP-10162 207 和 Ag85B420 459，CFP-10 和 Ag85B 之间以 gccgcctac 相连接，如图1所示。实施例2pcDNA3. I-ECANS结核基因疫苗的构建为了不在HSP65基因和T细胞表位基因之间引入酶切位点，本发明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，从5 ‘和3’端依次扩增三段彼此部分重叠的包含部分HSP65基因和T细胞表位的基因片段，变性后通过彼此重叠的互补序列连接，最后用5 ‘和3’两端HSP65引物PCR扩增出嵌合有4个T细胞表位的HSP65全长基因。同时在基因两端分别带上EcoRI和Hind III酶切位点，经双酶切后可连接入载体pcDNA3. 1(_)或原核表达载体pET3h。首先提取结核分枝杆菌H37Rv株DNA，作为模板，用HSP65上游引物(SEQ ID NO 13)和下游引物(SEQ ID N0 14)通过PCR方法扩增获得HSP65片段，回收并纯化PCR产物。以HSP65基因作为模板，分别以引物HSP65上游引物(SEQ ID NO 13)和Tl引物(SEQ ID NO 15)通过PCR扩增片段1 (如图2所示HSP65上游引物和Tl相对，经PCR扩增得到的l_508bp双链DNA片段)，所述的片段1的双链DNA的序列为atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaactaccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttggccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaacgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt
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以 T2 引物(SEQ ID NO 16)和 El 引物(SEQ ID NO17)通过PCR扩增片段2(如
图2所示T2引物和El相对，经PCR扩增得到的491-1315bp双链DNA片段)，所述片段2的双链DNA的序列为
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将上述的片段1和片段2混合，变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱
基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再以HSP65上游引物和El引物通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以HSP65上游引物(SEQ ID N0:13)和HSP65下游引物(SEQ ID NO :14)作为引物，通过PCR方法扩增获得获得片段(1+2+3)，即嵌合了 4个T细胞表位的HSP目的基因即ECANS编码基因(如图2所示)。PCR鉴定结果显示产物为1807bp，如图3A所示。再将扩增产物经EcoRI和HindIII双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体PCDNA3. 1(_)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经酶切(图3Β)及测序鉴定(图3C)，成功构建了 pcDNA3-ECANS真核表达质粒。
将重组质粒ECANS转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，经LB(Ampl00l·! g/ml)液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGENPlasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。
实施例3分离小鼠肺脏淋巴细胞取末次免疫后10天小鼠肺组织，称重约IOOmg/只，每组3只小鼠肺脏混合，剪碎置于IOml消化液中(胶原酶(lmg/ml)、DNA酶(5U/ml)、1640-10%胎牛血清)，于37°C摇床180rpm振摇120min。将混悬液过尼龙指套去除碎块，1500rpm离心5min，细胞重悬于細140% Percoll中，轻柔加至等体积70% Percoll上方，2400rpm离心30min，吸取淋巴细胞，IOml PBS洗涤1次，重悬于1640-10%胎牛血清培养液中，调整浓度为5X106/ml备用。实施例4壳寡糖-pECNAS结核黏膜基因疫苗的制备1)质粒DNA的大量制备依照QIAGEN Plasmid Mega Kit进行。2)分别制备oligo-chitosan溶液和pcDNA3. 1-pECANS溶液，方法如下首先制备0. 4%,pH5. 5 的 oligochitosan 溶液，称取 0. 4g 壳寡糖 oligo-chitosan(MW约 3000-6000，脱乙酰度75% -85% )，先以100ml IOmM的PBS (PH7. 4)将其缓慢溶解，37 °C放置Ihr。0.4ym的滤膜过滤而后保存备用。pcDNA3. Ι-pECANS质粒以IOmM PBS溶解，DNA浓度为25yg/ml，-20°C 保存备用。3)采用共沉淀法(共凝聚法)制备oligochitosan-DNA纳米颗粒，方法如下在55°C水浴中，将0. 4%,pH5. 2的oligochitosan溶液逐滴滴入25ug/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡30秒，即可形成均一略带混浊的oligochitosan-DNA纳米颗粒(图4A)。扫描电镜证实该复合物颗粒的直径约为150-300nm(图4B)。而后将该溶液冷冻干燥，继而用无菌PBS溶解为lmg/ml的浓度，按50 μ gDNA/50ul的量滴鼻免疫小鼠。实施例5壳寡糖-pECNAS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠将6-8 周 BALB/c 雌鼠分为 6 组，分别为oligochitosan-pECANS、oligochitosan-pHSP65、pcDNA3. 1-ECANS (简称 pECANS)、pcDNA3. l_pHSP65 (简称 pHSP65)；BCG, mock组，每组8只小鼠。滴鼻免疫程序如下以0. 75%戊巴比妥钠80-120 μ 1经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。以含有50 μ g质粒DNA的oligochitosan-pECANS等疫苗溶液逐滴滴入小鼠两侧鼻腔。BCG采用皮下免疫，程序如下以含有BCG(1X IO5CFU)的PBS于小鼠背部皮下多点接种，总量100 μ 1。每两周经眼眶后眦静脉采血，37°C静置30min，4000rpmX IOmin,收集血清，分装冻存于_70°C。实施例6壳寡糖-pECANS滴鼻免疫可增强结核特异性SlgA抗体应答间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异IgG水平。以5 μ g/ml HSP65蛋白包被聚苯乙烯微孔板(co-star)(包被液0. IM Na2CO3, pH9. 6)4°C过夜。以5% milk-PBS封闭板，200μ 1/孔，37°C lh。依次加 1 1000 ； 1 10000 ； 1 100000 稀释血清、100 μ 1/孔，37 0C lh，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG 37 °C lh，洗板后以TMB显色15min，2N H2SO4终止反应后测A45tl值。如图5显示0lig0-chit0San-pECANS结核粘膜基因疫苗免疫一次以后在小鼠体内诱生了 HSP65特异性IgG，在免疫第4周即可检测到HSP65特异性血清IgG，其水平随时间不断增高，于第10周达到OD值1.4，抗体滴度为1 100000，显著高于mock对照组，同时也高于 chitosan-pECANS 和 chitosan_pHSP65 组。但 IgG 水平低于 pECANS、pHSP65 滴鼻组和BCG皮下注射组(图5A)。BCG免疫组在第8w诱导的IgG已达峰值，滴度为1 4 X IO5 (图5B)；此外，诱导的IgG均以IgGh为主，提示为Thl型免疫(图5C)；抗体亲和力方面，oligochitosan-pECANS诱导的数值为40，高于BCG对照组的34，但无显著性差异(图5D)。
肺灌洗液中SlgA的分泌代表肺局部黏膜分泌型抗体的诱导。发现仅有壳聚糖组装的结核基因疫苗诱导了 SlgA的分泌。Oligo-chitosan-pECANS诱导的SlgA效价水平最高，达到1 1250，显著高于其他组(图6)，这将在肺粘膜局部早期阻断M.tb感染起到关键作用。总之，壳寡糖-PECANS疫苗滴鼻免疫诱导了较强的结核抗原特异性全身和黏膜抗体应答。实施例7壳寡糖-pECANS滴鼻免疫可增强脾、肺脏淋巴细胞中特异性IFN y +Thl型细胞免疫的诱导(1)小鼠脾脏和肺淋巴细胞IFN- γ +Thl细胞的ELISP0T检测以ELISP0T方法直接检测末次免疫4周后淋巴细胞中分泌IFNy的Thl细胞。以5 μ g/ml IFN- γ包被抗体100 μ 1/孔4°C包被过夜，吸去孔内液体，用200 μ 1完全164037°C封闭》ir。去液体，取末次免疫后#小鼠脾脏，重悬于含20U/ml IL-2的完全1640中，以1 X IO6细胞/孔加入ELISP0T板，随后分别加入灭活的BCG、特异性抗原HSP65蛋白(20 μ g/ml)、表位多肽 Ag85A/B、ESAT-6 和 CFP-10 混合刺激物(20 μ g/ml)、瞬转 pHSP65 质粒24小时的SP2/0细胞(标记为SP2/0-HSP65)、阳性对照ConA(10 μ g/ml)，置37°C，5%CO2培养60hr。吸弃各孔液体，加200 μ 1冰预冷的去离子水，在冰上放置lOmin，PBST洗3次。加100 μ 1生物素标记的抗小鼠IFN-Y检测抗体Qy g/ml)，37°C放置lhr。去液体，PBST 洗 3 次。加 100 μ 1 HRP 标记链亲和素(Streptavidin-HRP)，37°C lhr, PBST 洗 4 次，PBS洗2次，拍干。WlOOyl AEC底物避光显色30min，用自来水冲洗终止反应，室温下干燥板，在免疫斑点成像分析仪下计数斑点。结果显示，与其他各组相比，oligo-chitosan-pECANS粘膜疫苗滴鼻免疫诱导的BCG特异性IFN- y +T细胞数目最高，达310/106脾淋巴细胞(图7A)，显著高于BCG和其他各组；该组诱导的HSP65特异性IFN- y +T细胞数目达155/106脾细胞(图7A)，显著高于其他各组(P < 0. 05)。SP2/0-pHSP65和四肽混合物的刺激效果较低。提示chitosan-pECANS可诱生强烈的结核特异性脾脏淋巴细胞IFN-Y+Thl细胞免疫。更有意义的是，分离肺脏淋巴细胞，进行ELISP0T检测，发现仅有壳寡糖-pECANS滴鼻免疫和BCG皮下免疫诱导了较高水平的IFN- y +Thl细胞免疫，HSP65和BCG特异性Thl细胞超过200/106肺淋巴细胞(图7B)，显著高于其他各组(ρ < 0. 05)，提示壳寡糖-pECANS黏膜基因疫苗有效增强了肺局部黏膜Thl细胞应答的诱导。有助于在感染早期和感染局部有效清除结核杆菌。(2)小鼠脾脏和肺脏⑶4+IFN- y +T细胞的胞内染色和流式检测取末次免疫后4周小鼠脾脏，制备淋巴细胞悬液，重悬于含有20U/ml IL_2和HSP65蛋白O0g/ml)的完全1640中，37°C 5% C02培养12h。收集细胞，调整浓度为3 X IO6/ml，用Percp-抗小鼠⑶4单抗4°C避光染色30min，洗涤、固定、穿膜。用FITC-抗小鼠IFN- γ的单抗在染色30min后，上流式细胞仪检测。流式检测脾脏淋巴细胞内分泌IFN γ的⑶4+Thl细胞比例发现与mock组和BCG免疫小鼠相比，oligo-chitosan-pECANS滴鼻免疫组诱导的HSP65特异性CD4+IFN- γ +T细胞数目最高，达到了 2. 15%，5倍于pECANS组(0. 48% )0 (图8)。肺脏淋巴细胞同样经HSP65蛋白刺激后，发现肺脏淋巴细胞内正^^+^4+1111细胞比例显著高于脾脏淋巴细胞，仍旧是oligo-chitosan-pECANS复合物滴鼻组诱导了最高
16比例的Thl细胞，达到7. 31%，显著高于pECANS裸露基因疫苗组和BCG组的6. 3-6. 4% (ρ< 0. 005，图 8)。以上实验标明0lig0-chit0San递送组装的pECANS结核基因疫苗，与裸露pECANS基因疫苗相比，在脾脏和肺脏中均显著增强了结核抗原特异性IFNY+CD4+Thl应答的诱导。与其他各组相比，诱导了相对最强的全身和黏膜特异性Thl细胞应答，有助于更好地清除肺内感染的结核分枝杆菌。实施例8壳寡糖-pECNAS结核黏膜基因疫苗诱导的抗结核免疫保护效果(1)肺组织H&E病理切片末次免疫后4周，以大剂量IX IO7CFU BCG(100 μ 1)鼻腔内攻毒。4周后处死小鼠，取小鼠肺脏组织做石蜡切片，行Η&Ε染色。发现不免疫小鼠(mock)攻毒后产生了严重的肺部炎症灶和组织损伤，提示产生了肺结核。各免疫组相比，裸质粒疫苗滴鼻免疫的保护效果有限，肺脏中可见炎性病灶，肺泡间隔增厚，肺泡结构有扩张性改变。经壳聚糖递送的粘膜基因疫苗的免疫保护显著增强，特别是oligo-chitosan-pECANS组，仅发现极小炎症灶和肺泡间隔增厚(图9)。(2) BCG攻毒后小鼠脾脏和肺脏结核杆菌数目取攻毒后4周的部分肺脏和脾脏勻菜，倍比稀释后接种7H9培养基，培养21- 天，进行BCG菌落计数试验。结果显示对照组的脾脏和肺脏结核杆菌数达到IO5-6CFU,显示严重的结核杆菌增殖；BCG皮下免疫组使结核杆菌数目降至6000-8000CFU/g组织，具有一定的控制结核杆菌生长效应。裸质粒基因疫苗免疫组小鼠有3000-4000CFU/g组织的结核杆菌，显示了一定保护效果；而oligochitosan-pECANS组在肺组织内没有细菌生长，仅在脾脏组织中发现100CFU以内的结核杆菌生长，显示了最好的免疫保护效果(图10)。免疫病理和菌落计数结果强烈提示结核基因疫苗pECANS具有一定的免疫保护效果，而以壳聚糖组装形成共聚复合物后进行滴鼻免疫，显著增强了肺粘膜Thl细胞和SlgA的诱导，从而有效提高了对脾脏和肺内感染的结核分枝杆菌的清除，显著增强了抗结核免疫保护力。
权利要求
1.一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于由壳寡糖与结核抗原编码质粒共聚交联复合而成，所述的结核抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO 8所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。在结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因、第486位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因和结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的Ag85B蛋白的420 459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO 12所示。
2.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3. 1质粒或pVAXl质粒中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列SEQ ID如NO :1所 示。
4.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的氨基酸序列如SEQID NO 3 所示。
5.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 5所示。
6.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因的氨基酸序列如SEQID NO 7 所示。
7.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 9所示。
8.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
9.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所用的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度为75% -85%。
10.权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)构建结核抗原编码质粒；(2)将0.1 0. 4%浓度、PH5. 2-5. 5的壳寡糖溶液，与18 25 μ g/ml编码结核抗原的质粒的溶液在55-60°C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的壳寡糖溶液中，所述的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度75% 85%，所述的质粒DNA溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，通过共聚交联作用，获得的壳寡糖-结核抗原质粒纳米颗粒为球形，直径在150 300nm之间。
11.一种药物组合物，其特征在于含有有效量的权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗以及药学上接受的载体或者赋形剂。
12.权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。
全文摘要
一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，由壳寡糖与结核抗原编码质粒共聚交联复合而成，结核抗原编码质粒中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因，HSP65全长基因中插入来自结核杆菌分枝杆菌H37Rv株来源的抗原中的4个T细胞表位基因ESAT-6189-228、Ag85A369-405、CFP10162-207和Ag85B420-459。本发明还公开了这种结核粘膜基因疫苗的制备方法和应用。本发明的结核黏膜基因疫苗可诱导结核特异性血清抗体和全身Th1型免疫应答；能诱导肺粘膜局部增强的结核特异性分泌型SIgA和IFNγ+Th1应答，效果显著优于裸露的pECANS基因疫苗。
文档编号C07K14/35GK102580115SQ20111000523
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者徐薇, 熊思东, 艾文清 申请人:复旦大学
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，尤其涉及一种用于预防或治疗结核病的疫苗及其制备方法和应用，特别是一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗及其制备和应用。
背景技术：
结核分枝杆菌感染导致的结核病的死灰复燃是当今全球重大的健康问题，由于人口密集度和流动性日益增加、常规BCG疫苗的无效性、结核耐药菌株的出现、以及AIDS病导致的结核并发感染，目前结核发病及死亡非常严重，全球每年有800万活动性结核患者并导致300万死亡；我国约有5. 5亿人口曾经感染结核，每年13万人死于结核，每月约有12万新发病人。2006年结核已一跃成为我国感染性疾病发病的首位，研制新型结核预防疫苗非常迫切。研究表明，结核分枝杆菌主要感染肺部巨噬细胞。诱导⑶4+Thl细胞及其分泌的高水平的IFNy，不仅能够增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力，还可以通过促进⑶8+CTL的诱导发挥特异性杀伤结核感染细胞，对于清除结核杆菌至关重要。基因疫苗或称DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达质粒、直接注射动物的第三代疫苗，由于可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈激活DC细胞，有效激活⑶4+Thl和⑶8+T细胞，因此特别有利于诱导Thl型免疫应答。然而，在机体的什么部位诱导Thl型免疫应答同样是一个关键问题，虽然诱导脾脏和淋巴结(全身性)Thl型免疫应答是传统疫苗的重点，但是，有关抗粘膜感染病原体免疫的国际前沿研究表明诱导肺粘膜局部的粘膜T细胞免疫应答对于清除粘膜感染病原体更为重要。结核杆菌主要通过呼吸道粘膜入侵机体，粘膜免疫是人体免疫的第一道防线，可在感染的早期和最初感染部位有效控制感染，防止感染扩散。诱导呼吸道和肺部特异性粘膜免疫应答，可有效控制结核早期感染，防止细菌播散，因此诱生特异性粘膜免疫成为新型结核疫苗研制的热点和重点。通过呼吸道给予粘膜疫苗可更好地模拟结核杆菌天然感染，诱导特异性粘膜免疫，在粘膜感染的第一时间清除病原体，产生更为有效的抗结核免疫保护作用。然而，粘膜部位接种抗原通常很难诱导免疫应答，由于粘膜局部纤毛的频繁摆动、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使得外来抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通过粘膜递送系统来对DNA疫苗进行组装，而后行粘膜免疫。因此，申请人以已公开的基于T细胞表位的结核基因疫苗(基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。专利申请号200710171416.X)为基础，以一种特定性质
的天然多糖------壳寡糖(oligo-chitosan)通过共聚沉淀的方法与结核基因疫苗形成壳
寡糖-DNA纳米颗粒复合物，而后进行滴鼻免疫，诱导结核特异性全身和肺部粘膜Thl型细胞免疫应答
发明内容
本发明的目的在于提供一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗及其制备和应用，所述的这种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗要解决现有技术中由于常规BCG疫苗的无效性、以及结核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核并发感染使得现有疫苗预防和治疗结核病的效果不佳的技术问题。本发明提供了一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，由壳寡糖与结核抗原编码质粒共聚交联复合而成，所述的结核抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO 8所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。在结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因和结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的Ag85B蛋白的420 459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO 12所示。进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3. 1质粒、或pVAXl质粒。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37RV株来源结核杆菌ESAT-6蛋白的189 2 位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 9所示。进一步的，嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 11 所示。进一步的，所述的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度为75% -85%。进一步的，本发明的结核抗原编码质粒的构建方法，包括以下步骤1)提取结核分枝杆菌H37Rv株DNA作为模板，用SEQ ID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO :14所示的下游引物通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编
码基因；2)以结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1、片段2、片段3 ；3)以SEQID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQID NO 15所示的Tl引物，通过PCR扩增片段1，所述的片段1的双链DNA的序列为atggccaagacaattgcgtacgacgaagaggcccgtcgcggcctcgagcggggcttgaac
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cgctaaagccgcccactggtcaggtagc 4)以SEQ ID NO 16所示的T2引物和SEQ ID NO 17所示的El引物通过PCR扩增片段2，所述的片段2的双链DNA的序列为gggtgaccagtccatcggtgacctgatcgccgagggtctttcgatggct
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5)以 SEQ ID NO 18 所示的 E2 引物和 SEQ ID NO 14所示的HSP65下游引物通过PCR扩增片段3，所述的片段3的双链DNA的序列为
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6)将上述的3段片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，以SEQ ID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO 14所示的HSP65下游引物作为引物，通过PCR方法扩增获得嵌合了 4个T细胞表位的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经EcoRI和Hind III双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得所述的结核抗原编码质粒。具体的，是将上述的片段1和片段2混合，热变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，热变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，用SEQ ID NO :13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO:14所示的下游引物经PCR可扩增获得片段(1+2+3)，即嵌合了 4个T细胞表位的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65外源目的基因。进一步的，所述的载体选自pcDNA3. 1质粒、或pVAXl质粒。本发明还提供了上述的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)构建结核抗原编码质粒pECANS ；(2)将0. 1 0. 4%浓度、PH5. 2-5. 5的壳寡糖溶液，与18 25 μ g/ml编码结核抗原的质粒pECANS溶液在55-60°C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的壳寡糖溶液中，所述的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度75% 85%，所述的质粒DNA溶解在IOmM的磷酸盐缓冲液(PBQ中，通过共聚交联作用，获得的壳寡糖-DNA复合物呈球形纳米颗粒，直径在150 300nm之间。冷冻干燥，_70°C冷冻保存。本发明使用前，以无菌PBS溶解壳寡糖-DNA复合物，使DNA浓度为lmg/ml。本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，以及药学上接受的载体或者赋形剂。本发明还提供了上述的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。本发明通过DNA预测软件，从结核分枝杆菌H37Rv株来源的已知的4种关键抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP-10中各自筛选了一个T细胞表位，共4个T细胞表位，构建含有4个T细胞表位的结核靶抗原编码质粒。由于表位仅有8-20个氨基酸，结构太小和简单，免疫原性很弱。因此选择一种载体基因，将4个T细胞表位插入载体基因中，共同构成结核外源目的基因。本发明选择结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白65 (HSP65)作为嵌入T细胞表位的基因载体。HSP65是热休克蛋白60家族成员，在细菌到人体细胞有很高的同源性。全长162;3bp，编码540个氨基酸，分子量65kD。选择结核杆菌来源HSP65作为嵌入T细胞表位的基因载体的原因有两点1、HSP内含有多个结核T细胞和B细胞表位，本身就是重要的免疫保护性抗原，已证实HSP65作为目的抗原免疫小鼠可产生抗结核强保护性免疫应答，且与产生IFN-Y的⑶87⑶44hi细胞有关。2、HSP作为细胞内伴侣蛋白，参与蛋白质转位、折叠和装配，可帮助嵌入的表位更好地折叠形成空间结构。本发明选择的4个T细胞表位来自以下4种结核抗原l)Ag85A，295氨基酸。结核分枝杆菌H37Rv株的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体(antigen 85complex)，由Ag85A、Ag85B、Ag85C组成的相对分子质量为38000蛋白家族。Ag85A可刺激机体产生体液免疫，也可激发Thl型细胞免疫，诱导⑶8+T细胞增殖和IL-2及IFN- γ等上升。》Ag85B，蛋白质全长285氨基酸，分子量34. 6KD。又称MPT59、Rvl886，是一种分枝杆菌转移酶，与细菌细胞壁合成有关，具有多个τ细胞表位，能诱导Thl反应、IFN- γ的产生。3) ESAT-6，又称Rv3875，全长^8bp，95个氨基酸，分子量9. 9KD，仅在结核分枝杆菌H37Rv株等强毒株中有这种抗原。含有多个T细胞表位，能激活CD4+、CDS+T细胞，在抗结核保护性免疫应答中起重要作用。ESAT-6还可刺激Mtb病人的外周血T细胞增殖，促进IFN-Y释放。用ESAT-6和佐剂制成的亚单位疫苗免疫小鼠具有较好的保护性。4) CFP-10,低分子量结核杆菌培养滤液蛋白，全长30!3bp，100个氨基酸，分子量10000,与结核分枝杆菌H37Rv株毒力有关，刺激机体产生强烈的T细胞免疫应答并释放高水平的IFN- y。BCG传代过程中ESAT-6和CFP-10基因丢失，而在绝大多数毒株中这两个基因都存在。本发明通过BLAST网络数据库比对、DNAstar生物软件分析以及亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性等参数的分析，选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗表位区段；然后通过网络数据库(http://www. syfpeithi. com/scripts/MHCServer. dll/home, htm)分析预测这些区段中存在的T细胞抗原表位、同时与HLAI、II类分子可高亲和力结合的表位。经过计算机分子预测最后获得的4个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因(ESAT_6189_228)；结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A369_4Q5)；结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_2(17)；结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42C1_459)。分别插入到结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65基因的第438位碱基、第486位碱基、第1185位碱基后，构建结核靶抗原编码质粒。本发明在pcDNA3. 1质粒中，插入一段结核外源目的基因，作为靶抗原编码质粒，该结核外源目的基因由4个结核T细胞表位嵌合到结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65蛋白的3个非关键结构位置所共同构成，经分析，4个表位的嵌入不会影响HSP65本身的正常三级、四级空间结构，因此将这一嵌合有4个T细胞表位的HSP65基因的靶抗原编码质粒称为 ECANS(Epitope Cast in A Natural Structure，ECANS)。本发明的疫苗可以以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。进一步的，所述的结核粘膜基因疫苗的粘膜免疫方法如下1)首先对动物进行轻度麻醉；2)在鼻腔、口腔或生殖道内逐滴注入壳寡糖-pECANS纳米颗粒，3) 二周后重复1)+2)的免疫过程，4)共免疫 3 4 次，pECANS DNA 总量在 150 200 μ g。本发明采用的壳寡糖(oligo-chitosan)，是甲壳类动物来源的天然生物多糖几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物。chitin(几丁质，N-乙酰氨基葡萄糖多聚体)是一种广泛存在于虾、蟹外壳中的天然多糖。chitin与DNA复合可生成不溶于水的微米颗粒(microparticle)，是一种强有效的巨噬细胞激活剂，并上调Thl型细胞免疫。chitin经脱乙酰化后可衍生为分子量从120000 400000的chitosan多糖(壳多糖/壳聚糖，β _ (1 — 4) -2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)，无毒，具有生物可容性和生物可降解性，天然带正电荷，可与带负电荷的粘膜天然静电吸附，具有增强粘膜黏附吸收作用，还具有促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被广泛用于药物赋形剂与缓释剂。壳寡糖(oligo-chitosan)又名壳聚糖寡糖(chitosan oligosaccharide)，由壳聚糖(chitosan)经酶解或水解制得，成分为3 10个β-(1 — 4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖寡糖。其最大的特点是具有水溶性，使容易被肠道吸收。此外，它具有激活巨噬细胞、T、NK细胞，诱导TNF-α、活性氮、氧中间体(R0I、RNI)产生的特性，因此具有增强Thl型细胞免疫应答和抗胞内菌感染潜能。以合适分子量和脱乙酰度的壳寡糖与质粒DNA在特定的浓度、温度、pH值、振荡速度条件下，可形成大小不一的共聚复合物。本发明以特定性质的壳寡糖制备特定溶液，与特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制备了直径在150-300nm的纳米颗粒复合物。优选的选择是0. 4%浓度、PH. 5. 5的壳寡糖(分子量约3000-6000，脱乙酰度75% 85% )溶液，与25 μ g/ml编码靶抗原的质粒DNA(pcDNA3. 1-ECANS)溶液(IOmM PBS)，在55°C下，以15000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，制备了壳寡糖-结核靶抗原DNA (pECANS)纳米颗粒。经冷冻干燥，置_70°C冻存备用。使用时以无菌PBS溶解，使DNA浓度为lmg/ml。本发明中，将oligo-chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行以常规小鼠麻醉方法轻度麻醉小鼠，将小鼠鼻孔向上，以枪头吸取< 20μ 1液体直接逐滴滴入鼻腔内，待液滴随小鼠呼吸自主进入呼吸道后，再滴下一滴液体。可交替滴入两个鼻孔。液体总体积不宜超过50 μ 1。本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于pcDNA3. UpVAX以及常见和市售的真核质粒载体。本发明中，“药学上接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、变态反应)、有合理效益/风险比的物质。本发明中，“药学上接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，PH值通常约5-8。综上所述，本发明公开的一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，具有以下三大特性1)其核心是一种已申请并公开的多表位靶抗原编码质粒一一pECANS结核基因疫苗(基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。专利申请号200710171416.X)，其中编码靶抗原包括结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65蛋白基因，和嵌入其中的4个结核分枝杆菌H37Rv株来源的优势抗原的4个T细胞表位，理论上含有至少5种结核抗原，可诱导多抗原特异性的、更有效的抗结核免疫保护作用。2)通过具有特定化学性质的有市售的壳寡糖(oligo-chitosan)，与上述pECANS质粒DNA形成共聚复合物后，再通过粘膜途径接种该井壳聚糖递送的结核粘膜基因疫苗，具有安全无毒性、缓释性、亲粘膜性等多种优势，可促进粘膜局部特异性免疫应答的诱导。3)该结核粘膜基因疫苗通过优化免疫途径、免疫程序、免疫剂量、间隔时间，能更有效地诱导全身和粘膜T细胞和抗体应答。本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明的oligo-chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗通过滴鼻途径免疫小鼠，有效诱导针对载体HSP65结核抗原的特异性抗体应答和全身(脾脏和淋巴结)特异性Thl性免疫应答；更重要的是，能诱导肺粘膜局部很强的结核特异性分泌性SIgA和分泌高水平IFN γ的Thl应答，效果显著优于传统BCG结核疫苗和裸露的pECANS基因疫苗，因此具有作为新型结核预防和治疗性疫苗的潜力。
图1显示了 pECANS结核基因疫苗的构建示意图。图2显示了通过HSP65上游引物/Tl、T2/E1、E2/HSP65下游引物三对引物分别扩增得到的双链DNA片段1 (l-508bp)、片段2 (491-1315bp)、片段3 (1298-1788bp)，而后通过彼此重叠的17个碱基互补相连得到嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因，其中，粗体带下划线的序列是插入的4个T细胞表位序列。图3显示了本发明中嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因的质粒PCR (图3A)、酶切(图3B)及部分测序鉴定结果(图3C)。图4显示了壳寡糖(oligo-chitosan)与pECANS质粒形成的共聚复合物的示意图；其中，图A显示了壳寡糖oligo-chitosan与pECANS质粒形成共聚复合物示意图；图B显示了壳寡糖-pECANS纳米颗粒的扫描电镜图。图5显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫小鼠诱生结核特异性抗体血清IgG水平，其中，图A显示HSP65抗原特异性IgG的水平；图B显示HSP65抗原特异性特异性IgG效价；图C显示HSP65抗原特异性特异性IgG亚类情况；图D显示特异性IgG亲和力。图6显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗诱导肺灌洗液中SlgA的水平。图7显示了 ELISP0T试验检测的壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗诱导的⑶4+IFN-γ+T细胞数目。其中，图A显示了免疫小鼠脾细胞经结核抗原刺激后分泌IFN-Y的水平，图B显示了肺脏单个核细胞经结核抗原刺激后分泌IFN- γ的水平。图8显示了以流式细胞术检测的壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫诱导的免疫小鼠脾细胞和肺脏淋巴细胞中IFN-γ+⑶4+Thl细胞的比例。图9显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠经大剂量BCG攻毒后肺脏组织HE染色病理结果图。图10显示了壳寡糖-pECANS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫小鼠经大剂量BCG攻毒后肺脏组织、脾脏组织菌落计数结果图。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。
实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下结核分枝杆菌标准H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结防科提供)。质粒pcDNA3. 1 (-)、pVAX、宿主细菌DH5 α (Invitrogen公司)。基因合成(上海赛百盛公司)。oligo-chitosan (分子量在3000 6000之间，脱乙酰度为75% -85% )购自合肥博美生物有限公司、小鼠IFN- y ELISA检测试剂盒购自R&D公司；HRP标记羊抗小鼠IgG/IgA多克隆抗体(Southern Biothech公司)；。HSP65蛋白为本实验室自行表达(见200610027572. 4号专利)、多肽委托上海吉尔公司合成、Lipofectamin-2000购自invitrogen公司。限制性核酸内切酶 EcoR I,Hind III、T4DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP (TaKaRa 公司)；RNaseA (Ameresco公司)；LB培养基(英国0X0ID公司)，Tris (USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen)。6-8周龄雌性BALB/c (H_2d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。实施例1 :pcDNA3. I-ECANS结核基因疫苗的构建1、ECANS结核基因疫苗的目的T细胞表位的预测通过BLAST网络数据库、DNAstar生物软件、网络数据库(http://www. syfpeithi.com/scripts/MHCServer. dll/home. htm)分析，综合亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性、与HLAI、II类分子结合、等参数，预测获得的4个T细胞表位结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228 位基因(ESAT-6189_228)；结核杆菌 Ag85A 蛋白的 369 405 位基因(Ag85A369_4。5)；结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_2Q7)；结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42Q_459)。以pcDNA3. 1或pVAX为质粒载体，以结核分枝杆菌HSP65基因作为嵌合表位的基因载体，在计算机预测其二级结构的基础上，在其中不影响关键结构的位置第438位碱基后插入ESAT-6189 2 表位基因、第486位碱基后插入Ag85A369 405、第1185位碱基后插入 CFP-10162 207 和 Ag85B420 459，CFP-10 和 Ag85B 之间以 gccgcctac 相连接，如图1所示。实施例2pcDNA3. I-ECANS结核基因疫苗的构建为了不在HSP65基因和T细胞表位基因之间引入酶切位点，本发明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，从5 ‘和3’端依次扩增三段彼此部分重叠的包含部分HSP65基因和T细胞表位的基因片段，变性后通过彼此重叠的互补序列连接，最后用5 ‘和3’两端HSP65引物PCR扩增出嵌合有4个T细胞表位的HSP65全长基因。同时在基因两端分别带上EcoRI和Hind III酶切位点，经双酶切后可连接入载体pcDNA3. 1(_)或原核表达载体pET3h。首先提取结核分枝杆菌H37Rv株DNA，作为模板，用HSP65上游引物(SEQ ID NO 13)和下游引物(SEQ ID N0 14)通过PCR方法扩增获得HSP65片段，回收并纯化PCR产物。以HSP65基因作为模板，分别以引物HSP65上游引物(SEQ ID NO 13)和Tl引物(SEQ ID NO 15)通过PCR扩增片段1 (如图2所示HSP65上游引物和Tl相对，经PCR扩增得到的l_508bp双链DNA片段)，所述的片段1的双链DNA的序列为atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaactaccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttggccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaacgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt
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ttcttcaccccacgggggtgctagtggttgctaccacacaggtagcggttcctctagctc
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ctactgcagcggccactgccgtggtgctgccggtggcacgaccgggtccgcaaccaagcg
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gcgatttcggcgggtgaccagtccatcg
cgctaaagccgcccactggtcaggtagc
以 T2 引物(SEQ ID NO 16)和 El 引物(SEQ ID NO17)通过PCR扩增片段2(如
图2所示T2引物和El相对，经PCR扩增得到的491-1315bp双链DNA片段)，所述片段2的双链DNA的序列为
0165]gggtgaccagtccatcggtgacctgatcgccgagggtctttcgatggct0166]cccactggtcaggtagccactggactagcggctcccagaaagctaccga0167]gcttcttcggcgctgacgctggcgatggacaaggtgggcaacgagggcgtcatcaccgtc0168]cgaagaagccgcgactgcgaccgctacctgggccacccgttgctcccgcagtagtggcag0169]gaggagtccaacacctttgggctgcagctcgagctcaccgagggtatgcggttcgacaag0170]ctcctcaggttgtggaaacccgacgtcgagctcgagtggctcccatacgccaagctgttc0171]ggctacatctcggggtacttcgtgaccgacccggagcgtcaggaggcggtcctggaggac0172]ccgatgtagagccccatgaagcactggctgggcctcgcagtcctccgccaggacctcctg0173]ccctacatcctgctggtcagctccaaggtgtccactgtcaaggatctgctgccgctgctc0174]gggstgtaggacgaccagtcgaggttccacaggtgacagttcctagacgacggcgacgag0175]gagaaggtcatcggagccggtaagccgctgctgatcatcgccgaggacgtcgagggcgag0176]ctcttccagtagcctcggccattcggcgacgactagtagcggctcctgcagctcccgctc0177]gcgctgtccaccctggtcgtcaacaagatccgcggcaccttcaagtcggtggcggtcaag0178]cgcgacaggtgggaccagcagttgttctaggcgccgtggaagttcagccaccgccagttc0179]gctcccggcttcggcgaccgccgcaaggcgatgctgcaggatatggccattctcaccggt0180]cgagggccgaagccgctggcggcgttccgctacgacgtcctataccggtaagagtggcca0181]ggtcaggtgatcagcgaagaggtcggcctgacgctggagaacgccgacctgtcgctgcta0182]ccagtccactagtcgcttctccagccggactgcgacctcttgcggctggacagcgacgat0183]ggcaaggcccgcaaggtcgtggtcaccaaggacgagaccaccatcgtcgagggcgccggt0184]CCgttCCgggcgyyccagcaccagtggttcctgctctggtggtagcagctcccgcggcca0185]gacaccgacgccatcgccggacgagtggcccagatccgccaggagatcgagaacagcgac0186]ctgtggctgcggtagcggcctgctcaccgggtctaggcggtcctctagctcttgtcgctg
tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcgaggctgatgc tggcactctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc accacagcgcgtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgagcactagttcc ggccacggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgtagctcgtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctacccaccacgcga aggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgagcggcg gatgg以 E2 引物(SEQ ID NO 18)和 HSP65 下游引物(SEQ ID NO 14)通过 PCR 扩增片段3 (如图2所示E2引物和HSP65下游引物相对，经PCR扩增得到的1298_1788bp双链DNA片段)，所述的片段3的双链DNA的序列为ggaactcgccgcctaccagcag
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将上述的片段1和片段2混合，变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱
基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再以HSP65上游引物和El引物通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以HSP65上游引物(SEQ ID N0:13)和HSP65下游引物(SEQ ID NO :14)作为引物，通过PCR方法扩增获得获得片段(1+2+3)，即嵌合了 4个T细胞表位的HSP目的基因即ECANS编码基因(如图2所示)。PCR鉴定结果显示产物为1807bp，如图3A所示。再将扩增产物经EcoRI和HindIII双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体PCDNA3. 1(_)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经酶切(图3Β)及测序鉴定(图3C)，成功构建了 pcDNA3-ECANS真核表达质粒。
将重组质粒ECANS转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，经LB(Ampl00l·! g/ml)液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGENPlasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。
实施例3分离小鼠肺脏淋巴细胞取末次免疫后10天小鼠肺组织，称重约IOOmg/只，每组3只小鼠肺脏混合，剪碎置于IOml消化液中(胶原酶(lmg/ml)、DNA酶(5U/ml)、1640-10%胎牛血清)，于37°C摇床180rpm振摇120min。将混悬液过尼龙指套去除碎块，1500rpm离心5min，细胞重悬于細140% Percoll中，轻柔加至等体积70% Percoll上方，2400rpm离心30min，吸取淋巴细胞，IOml PBS洗涤1次，重悬于1640-10%胎牛血清培养液中，调整浓度为5X106/ml备用。实施例4壳寡糖-pECNAS结核黏膜基因疫苗的制备1)质粒DNA的大量制备依照QIAGEN Plasmid Mega Kit进行。2)分别制备oligo-chitosan溶液和pcDNA3. 1-pECANS溶液，方法如下首先制备0. 4%,pH5. 5 的 oligochitosan 溶液，称取 0. 4g 壳寡糖 oligo-chitosan(MW约 3000-6000，脱乙酰度75% -85% )，先以100ml IOmM的PBS (PH7. 4)将其缓慢溶解，37 °C放置Ihr。0.4ym的滤膜过滤而后保存备用。pcDNA3. Ι-pECANS质粒以IOmM PBS溶解，DNA浓度为25yg/ml，-20°C 保存备用。3)采用共沉淀法(共凝聚法)制备oligochitosan-DNA纳米颗粒，方法如下在55°C水浴中，将0. 4%,pH5. 2的oligochitosan溶液逐滴滴入25ug/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡30秒，即可形成均一略带混浊的oligochitosan-DNA纳米颗粒(图4A)。扫描电镜证实该复合物颗粒的直径约为150-300nm(图4B)。而后将该溶液冷冻干燥，继而用无菌PBS溶解为lmg/ml的浓度，按50 μ gDNA/50ul的量滴鼻免疫小鼠。实施例5壳寡糖-pECNAS结核粘膜基因疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠将6-8 周 BALB/c 雌鼠分为 6 组，分别为oligochitosan-pECANS、oligochitosan-pHSP65、pcDNA3. 1-ECANS (简称 pECANS)、pcDNA3. l_pHSP65 (简称 pHSP65)；BCG, mock组，每组8只小鼠。滴鼻免疫程序如下以0. 75%戊巴比妥钠80-120 μ 1经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。以含有50 μ g质粒DNA的oligochitosan-pECANS等疫苗溶液逐滴滴入小鼠两侧鼻腔。BCG采用皮下免疫，程序如下以含有BCG(1X IO5CFU)的PBS于小鼠背部皮下多点接种，总量100 μ 1。每两周经眼眶后眦静脉采血，37°C静置30min，4000rpmX IOmin,收集血清，分装冻存于_70°C。实施例6壳寡糖-pECANS滴鼻免疫可增强结核特异性SlgA抗体应答间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异IgG水平。以5 μ g/ml HSP65蛋白包被聚苯乙烯微孔板(co-star)(包被液0. IM Na2CO3, pH9. 6)4°C过夜。以5% milk-PBS封闭板，200μ 1/孔，37°C lh。依次加 1 1000 ； 1 10000 ； 1 100000 稀释血清、100 μ 1/孔，37 0C lh，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG 37 °C lh，洗板后以TMB显色15min，2N H2SO4终止反应后测A45tl值。如图5显示0lig0-chit0San-pECANS结核粘膜基因疫苗免疫一次以后在小鼠体内诱生了 HSP65特异性IgG，在免疫第4周即可检测到HSP65特异性血清IgG，其水平随时间不断增高，于第10周达到OD值1.4，抗体滴度为1 100000，显著高于mock对照组，同时也高于 chitosan-pECANS 和 chitosan_pHSP65 组。但 IgG 水平低于 pECANS、pHSP65 滴鼻组和BCG皮下注射组(图5A)。BCG免疫组在第8w诱导的IgG已达峰值，滴度为1 4 X IO5 (图5B)；此外，诱导的IgG均以IgGh为主，提示为Thl型免疫(图5C)；抗体亲和力方面，oligochitosan-pECANS诱导的数值为40，高于BCG对照组的34，但无显著性差异(图5D)。
肺灌洗液中SlgA的分泌代表肺局部黏膜分泌型抗体的诱导。发现仅有壳聚糖组装的结核基因疫苗诱导了 SlgA的分泌。Oligo-chitosan-pECANS诱导的SlgA效价水平最高，达到1 1250，显著高于其他组(图6)，这将在肺粘膜局部早期阻断M.tb感染起到关键作用。总之，壳寡糖-PECANS疫苗滴鼻免疫诱导了较强的结核抗原特异性全身和黏膜抗体应答。实施例7壳寡糖-pECANS滴鼻免疫可增强脾、肺脏淋巴细胞中特异性IFN y +Thl型细胞免疫的诱导(1)小鼠脾脏和肺淋巴细胞IFN- γ +Thl细胞的ELISP0T检测以ELISP0T方法直接检测末次免疫4周后淋巴细胞中分泌IFNy的Thl细胞。以5 μ g/ml IFN- γ包被抗体100 μ 1/孔4°C包被过夜，吸去孔内液体，用200 μ 1完全164037°C封闭》ir。去液体，取末次免疫后#小鼠脾脏，重悬于含20U/ml IL-2的完全1640中，以1 X IO6细胞/孔加入ELISP0T板，随后分别加入灭活的BCG、特异性抗原HSP65蛋白(20 μ g/ml)、表位多肽 Ag85A/B、ESAT-6 和 CFP-10 混合刺激物(20 μ g/ml)、瞬转 pHSP65 质粒24小时的SP2/0细胞(标记为SP2/0-HSP65)、阳性对照ConA(10 μ g/ml)，置37°C，5%CO2培养60hr。吸弃各孔液体，加200 μ 1冰预冷的去离子水，在冰上放置lOmin，PBST洗3次。加100 μ 1生物素标记的抗小鼠IFN-Y检测抗体Qy g/ml)，37°C放置lhr。去液体，PBST 洗 3 次。加 100 μ 1 HRP 标记链亲和素(Streptavidin-HRP)，37°C lhr, PBST 洗 4 次，PBS洗2次，拍干。WlOOyl AEC底物避光显色30min，用自来水冲洗终止反应，室温下干燥板，在免疫斑点成像分析仪下计数斑点。结果显示，与其他各组相比，oligo-chitosan-pECANS粘膜疫苗滴鼻免疫诱导的BCG特异性IFN- y +T细胞数目最高，达310/106脾淋巴细胞(图7A)，显著高于BCG和其他各组；该组诱导的HSP65特异性IFN- y +T细胞数目达155/106脾细胞(图7A)，显著高于其他各组(P < 0. 05)。SP2/0-pHSP65和四肽混合物的刺激效果较低。提示chitosan-pECANS可诱生强烈的结核特异性脾脏淋巴细胞IFN-Y+Thl细胞免疫。更有意义的是，分离肺脏淋巴细胞，进行ELISP0T检测，发现仅有壳寡糖-pECANS滴鼻免疫和BCG皮下免疫诱导了较高水平的IFN- y +Thl细胞免疫，HSP65和BCG特异性Thl细胞超过200/106肺淋巴细胞(图7B)，显著高于其他各组(ρ < 0. 05)，提示壳寡糖-pECANS黏膜基因疫苗有效增强了肺局部黏膜Thl细胞应答的诱导。有助于在感染早期和感染局部有效清除结核杆菌。(2)小鼠脾脏和肺脏⑶4+IFN- y +T细胞的胞内染色和流式检测取末次免疫后4周小鼠脾脏，制备淋巴细胞悬液，重悬于含有20U/ml IL_2和HSP65蛋白O0g/ml)的完全1640中，37°C 5% C02培养12h。收集细胞，调整浓度为3 X IO6/ml，用Percp-抗小鼠⑶4单抗4°C避光染色30min，洗涤、固定、穿膜。用FITC-抗小鼠IFN- γ的单抗在染色30min后，上流式细胞仪检测。流式检测脾脏淋巴细胞内分泌IFN γ的⑶4+Thl细胞比例发现与mock组和BCG免疫小鼠相比，oligo-chitosan-pECANS滴鼻免疫组诱导的HSP65特异性CD4+IFN- γ +T细胞数目最高，达到了 2. 15%，5倍于pECANS组(0. 48% )0 (图8)。肺脏淋巴细胞同样经HSP65蛋白刺激后，发现肺脏淋巴细胞内正^^+^4+1111细胞比例显著高于脾脏淋巴细胞，仍旧是oligo-chitosan-pECANS复合物滴鼻组诱导了最高
16比例的Thl细胞，达到7. 31%，显著高于pECANS裸露基因疫苗组和BCG组的6. 3-6. 4% (ρ< 0. 005，图 8)。以上实验标明0lig0-chit0San递送组装的pECANS结核基因疫苗，与裸露pECANS基因疫苗相比，在脾脏和肺脏中均显著增强了结核抗原特异性IFNY+CD4+Thl应答的诱导。与其他各组相比，诱导了相对最强的全身和黏膜特异性Thl细胞应答，有助于更好地清除肺内感染的结核分枝杆菌。实施例8壳寡糖-pECNAS结核黏膜基因疫苗诱导的抗结核免疫保护效果(1)肺组织H&E病理切片末次免疫后4周，以大剂量IX IO7CFU BCG(100 μ 1)鼻腔内攻毒。4周后处死小鼠，取小鼠肺脏组织做石蜡切片，行Η&Ε染色。发现不免疫小鼠(mock)攻毒后产生了严重的肺部炎症灶和组织损伤，提示产生了肺结核。各免疫组相比，裸质粒疫苗滴鼻免疫的保护效果有限，肺脏中可见炎性病灶，肺泡间隔增厚，肺泡结构有扩张性改变。经壳聚糖递送的粘膜基因疫苗的免疫保护显著增强，特别是oligo-chitosan-pECANS组，仅发现极小炎症灶和肺泡间隔增厚(图9)。(2) BCG攻毒后小鼠脾脏和肺脏结核杆菌数目取攻毒后4周的部分肺脏和脾脏勻菜，倍比稀释后接种7H9培养基，培养21- 天，进行BCG菌落计数试验。结果显示对照组的脾脏和肺脏结核杆菌数达到IO5-6CFU,显示严重的结核杆菌增殖；BCG皮下免疫组使结核杆菌数目降至6000-8000CFU/g组织，具有一定的控制结核杆菌生长效应。裸质粒基因疫苗免疫组小鼠有3000-4000CFU/g组织的结核杆菌，显示了一定保护效果；而oligochitosan-pECANS组在肺组织内没有细菌生长，仅在脾脏组织中发现100CFU以内的结核杆菌生长，显示了最好的免疫保护效果(图10)。免疫病理和菌落计数结果强烈提示结核基因疫苗pECANS具有一定的免疫保护效果，而以壳聚糖组装形成共聚复合物后进行滴鼻免疫，显著增强了肺粘膜Thl细胞和SlgA的诱导，从而有效提高了对脾脏和肺内感染的结核分枝杆菌的清除，显著增强了抗结核免疫保护力。
权利要求
1.一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于由壳寡糖与结核抗原编码质粒共聚交联复合而成，所述的结核抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO 8所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。在结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因、第486位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因和结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的Ag85B蛋白的420 459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO 12所示。
2.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3. 1质粒或pVAXl质粒中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列SEQ ID如NO :1所 示。
4.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的氨基酸序列如SEQID NO 3 所示。
5.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85A蛋白的369 405位基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 5所示。
6.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的CFP-10蛋白的162 207位基因的氨基酸序列如SEQID NO 7 所示。
7.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的420 459位基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 9所示。
8.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的4个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
9.根据权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，其特征在于所用的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度为75% -85%。
10.权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)构建结核抗原编码质粒；(2)将0.1 0. 4%浓度、PH5. 2-5. 5的壳寡糖溶液，与18 25 μ g/ml编码结核抗原的质粒的溶液在55-60°C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的壳寡糖溶液中，所述的壳寡糖的分子量在3000 6000之间，脱乙酰度75% 85%，所述的质粒DNA溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，通过共聚交联作用，获得的壳寡糖-结核抗原质粒纳米颗粒为球形，直径在150 300nm之间。
11.一种药物组合物，其特征在于含有有效量的权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗以及药学上接受的载体或者赋形剂。
12.权利要求1所述的壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。
全文摘要
一种壳寡糖递送系统组装的结核粘膜基因疫苗，由壳寡糖与结核抗原编码质粒共聚交联复合而成，结核抗原编码质粒中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白HSP65的全长基因，HSP65全长基因中插入来自结核杆菌分枝杆菌H37Rv株来源的抗原中的4个T细胞表位基因ESAT-6189-228、Ag85A369-405、CFP10162-207和Ag85B420-459。本发明还公开了这种结核粘膜基因疫苗的制备方法和应用。本发明的结核黏膜基因疫苗可诱导结核特异性血清抗体和全身Th1型免疫应答；能诱导肺粘膜局部增强的结核特异性分泌型SIgA和IFNγ+Th1应答，效果显著优于裸露的pECANS基因疫苗。
文档编号C07K14/35GK102580115SQ20111000523
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者徐薇, 熊思东, 艾文清 申请人:复旦大学
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