金乌贼胚胎细胞染色体标本制备方法
专利名称：金乌贼胚胎细胞染色体标本制备方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，具体的涉及一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法。
背景技术：
染色体标本的制备操作简单、价格低廉、实验场地要求低的特点，一直是传统的生物遗传学研究技术，染色体标本制备包括前处理、低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片等步骤，在生物遗传学的许多领域得到了广泛应用。但是由于金乌贼成熟个体获取困难、 成本较高、制作染色体标本效果差等原因，利用成熟个体制备染色体显得不尽人意。胚胎作为制备染色体标本的材料之一，获取相对容易、成本低，被广泛应用于染色体标本的制备， 在金乌贼胚胎制备染色体标本过程中常采用常规的冷滴片法，玻片干燥所需时间长、易发生重复滴片、细胞难破裂，影响染色体观察。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够很好的利用金乌贼胚胎制备染色体标本的方法，该方法通过热滴片法，合理控制滴片的温度和滴片时的高度，缩短了制片时间， 改善了染色体制片效果，解决了染色体标本制备时细胞破裂程度掌握困难、染色体丢失、染色体形态差等方面问题。
本发明是按以下技术方案实现的
一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法，它的操作程序是剥膜、前处理、 低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片；所述的滴片采用热滴片法，温度40°C -60滴片高度1. 8m-2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。
作为本发明的一种优选的技术方案，上述金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法包括以下步骤
剥膜使用镊子固定卵，用解剖针挑破卵膜；然后双手各持一镊子从破膜开口处外翻卵膜，逐渐剥离卵膜，露出胚胎；
前处理剥膜后的胚胎采用秋水仙素进行前处理，将胚胎细胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中处理30min ；
低渗处理采用浓度为5%的KCl作为低渗液，处理45min，低渗处理前去净秋水仙素；
固定采用卡诺氏液(甲醇冰醋酸=3 1，体积比)固定，间隔15min更换固定液一次，共更换3次固定液，第一次加固定液前需移除一半低渗液；
解离采用浓度为50%冰醋酸进行解离45min，解离前去净固定液；
滴片采用热滴片法，温度40°C _60°C，滴片高度1. 8m_2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体；
染色采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液lml,PH 6. 8的磷酸缓冲液9ml，染色时间30min ；
洗片用自来水冲洗玻片，冲洗时有液滴的面朝上，玻片向下倾斜，玻片下端与水平面成30°，玻片磨砂面与水流接触，水流以滴刚成线状，慢慢冲洗，至冲洗后的水不再带有颜色为止。
本发明与现有技术对比的有益效果是
本发明采用热滴片方法，滴片温度40°C -60°C，在此温度范围内，细胞能够很好破裂，同时保证液滴不会因为温度过高而干燥过快，有利于液滴延展；液滴经过1. 8m-2m的下落高度，与玻片接触时细胞破裂，能够充分释放染色体；在液滴滴到玻片上后，立即用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体，使分裂相集中分布在液滴边缘有利于观察，且在吸除多余液体后液滴干燥较快，轮廓清晰，有利于把握液滴下落的方向，避免重复滴片。
图1、金乌贼染色体中期分裂相
具体实施例方式
下面通过实际例子结合附图详细叙述本发明的技术方法
金乌贼胚胎细胞制作染色体标本步骤包括剥膜、前处理、低渗处理、固定、解离、 滴片以及染色。本发明在染色体标本制备过程中，进行了剥膜方法的确定、前处理时间的确定、低渗液的选择和低渗时间的确定、固定程序的确定、解离时间的确定、滴片方法的改进、 染色时间的确定以及洗片步骤的改进。
剥膜方法的确定胚胎细胞制备染色体标本一般用于鱼类，由于鱼类的卵一般都较小，无法进行剥膜处理来获得胚胎，所以都采用直接前处理的方式进行。但是金乌贼卵膜厚，秋水仙素难浸透，且卵大有利于剥膜获得胚胎。剥膜时使用镊子固定卵，用解剖针挑破卵膜，然后双手各持一镊子从破膜开口处外翻卵膜，逐渐剥离卵膜，露出胚胎，大大减短了下步的前处理时间。
前处理时间样品采用秋水仙素进行前处理，前处理时间过短或过长均会使染色体形态不利于观察，本实施例将胚胎细胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中处理30min。
低渗液的选择和低渗时间的确定常规方法采用过滤海水做为低渗液，由于海水浓度较难确定导致低渗时间不确定，我们采用KCl作为低渗液，浓度为5%，处理45min。低渗处理前去净秋水仙素。
固定程序的确定在实验过程中发现固定液固定3次后，可在_4°C长期保存样品。 我们采用卡诺氏液(甲醇冰醋酸=3 1，体积比)固定，间隔15min更换固定液一次，共更换3次固定液。由于固定液中有冰醋酸会对样品有一定的解离作用，会影响固定效果，因此在第一次加固定液前只移除一半低渗液作为缓冲，第二、三次则需将旧液完全移除后再加新的固定液。
解离时间采用冰醋酸进行解离，浓度为50%，解离时间过短或过长都会影响滴片效果，我们将解离时间设定为45min，滴片效果良好，无大组织块干扰。解离前去净固定液，否则影响解离液浓度。
滴片方法常规的冷滴片法容易发生重复滴片，影响染色体观察，且需要干燥过夜，所需时间较长。我们采用热滴片法滴片，温度40°C -60°C，滴片高度1.8m-aii，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。
染色时间采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液(GIBC0公司生产)1ml，PH 6.8的磷酸缓冲液(PBS)9ml，染色时间最终影响了染色体标本的质量，染色时间过短染色体形态不清晰，染色时间过长背景色加深，我们采用的染色时间为30min，然后用自来水清洗玻片。
洗片步骤用自来水冲洗玻片，冲洗时有液滴的面朝上，玻片向下倾斜，玻片下端与水平面成30°，玻片磨砂面与水流接触，水流以滴刚成线状，慢慢冲洗，至冲洗后的水不再带有颜色为止。
采用上述方法，我们在中国水产科学研究院黄海水产研究所进行了实际应用，对金乌贼胚胎染色体进行制片，结果表明，采用本发明的方法可以获得良好的染色体标本，染色体中期分裂相多、形态清晰、分散良好，具体效果见图1。
权利要求
1.一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法，它的操作程序是剥膜、前处理、 低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片，其特征在于所述的滴片采用热滴片法，温度 400C -60°C，滴片高度1. 8m-2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的剥膜使用镊子固定卵，用解剖针挑破卵膜；然后双手各持一镊子从破膜开口处外翻卵膜，逐渐剥离卵膜，露出胚胎；所述的前处理剥膜后的胚胎采用秋水仙素进行前处理，将胚胎细胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中处理30min ；所述的低渗处理采用KCl作为低渗液，浓度为5%，处理45min，低渗处理前去净秋水仙素；所述的固定采用卡诺氏液，即甲醇冰醋酸=3 1(体积比)固定，间隔15min更换固定液一次，共更换3次固定液，第一次加固定液前需移除一半低渗液；所述的解离采用浓度为50%冰醋酸进行解离45min，解离前去净固定液； 所述的滴片采用热滴片法，温度40°C _60°C，滴片高度1. 8m-aii，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体；所述的染色采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液1ml，PH 6. 8的磷酸缓冲液 9ml，染色时间30min ；所述的洗片用自来水冲洗玻片，冲洗时有液滴的面朝上，玻片向下倾斜，玻片下端与水平面成30°，玻片磨砂面与水流接触，水流以滴刚成线状，慢慢冲洗，至冲洗后的水不再带有颜色为止。
全文摘要
一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法，它的操作程序是剥膜、前处理、低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片，其特征在于所述的滴片采用热滴片法，温度40℃-60℃，滴片高度1.8m-2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。该方法通过热滴片法，合理控制滴片的温度和滴片时的高度，缩短了制片时间，改善了染色体制片效果，解决了染色体标本制备时细胞破裂程度掌握困难、染色体丢失、染色体形态差等方面问题。利用该发明对金乌贼胚胎细胞染色体进行制片，获得良好的染色体标本，染色体中期分裂相多、形态清晰、分散良好，具体效果见。
文档编号G09B23/36GK102509504SQ20111028411
公开日2012年6月20日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者刘克奉, 刘长琳, 吴彪, 孙建明, 庄志猛, 燕敬平, 王晓华, 王琛, 陈四清 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，具体的涉及一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法。
背景技术：
染色体标本的制备操作简单、价格低廉、实验场地要求低的特点，一直是传统的生物遗传学研究技术，染色体标本制备包括前处理、低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片等步骤，在生物遗传学的许多领域得到了广泛应用。但是由于金乌贼成熟个体获取困难、 成本较高、制作染色体标本效果差等原因，利用成熟个体制备染色体显得不尽人意。胚胎作为制备染色体标本的材料之一，获取相对容易、成本低，被广泛应用于染色体标本的制备， 在金乌贼胚胎制备染色体标本过程中常采用常规的冷滴片法，玻片干燥所需时间长、易发生重复滴片、细胞难破裂，影响染色体观察。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够很好的利用金乌贼胚胎制备染色体标本的方法，该方法通过热滴片法，合理控制滴片的温度和滴片时的高度，缩短了制片时间， 改善了染色体制片效果，解决了染色体标本制备时细胞破裂程度掌握困难、染色体丢失、染色体形态差等方面问题。
本发明是按以下技术方案实现的
一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法，它的操作程序是剥膜、前处理、 低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片；所述的滴片采用热滴片法，温度40°C -60滴片高度1. 8m-2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。
作为本发明的一种优选的技术方案，上述金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法包括以下步骤
剥膜使用镊子固定卵，用解剖针挑破卵膜；然后双手各持一镊子从破膜开口处外翻卵膜，逐渐剥离卵膜，露出胚胎；
前处理剥膜后的胚胎采用秋水仙素进行前处理，将胚胎细胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中处理30min ；
低渗处理采用浓度为5%的KCl作为低渗液，处理45min，低渗处理前去净秋水仙素；
固定采用卡诺氏液(甲醇冰醋酸=3 1，体积比)固定，间隔15min更换固定液一次，共更换3次固定液，第一次加固定液前需移除一半低渗液；
解离采用浓度为50%冰醋酸进行解离45min，解离前去净固定液；
滴片采用热滴片法，温度40°C _60°C，滴片高度1. 8m_2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体；
染色采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液lml,PH 6. 8的磷酸缓冲液9ml，染色时间30min ；
洗片用自来水冲洗玻片，冲洗时有液滴的面朝上，玻片向下倾斜，玻片下端与水平面成30°，玻片磨砂面与水流接触，水流以滴刚成线状，慢慢冲洗，至冲洗后的水不再带有颜色为止。
本发明与现有技术对比的有益效果是
本发明采用热滴片方法，滴片温度40°C -60°C，在此温度范围内，细胞能够很好破裂，同时保证液滴不会因为温度过高而干燥过快，有利于液滴延展；液滴经过1. 8m-2m的下落高度，与玻片接触时细胞破裂，能够充分释放染色体；在液滴滴到玻片上后，立即用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体，使分裂相集中分布在液滴边缘有利于观察，且在吸除多余液体后液滴干燥较快，轮廓清晰，有利于把握液滴下落的方向，避免重复滴片。
图1、金乌贼染色体中期分裂相
具体实施例方式
下面通过实际例子结合附图详细叙述本发明的技术方法
金乌贼胚胎细胞制作染色体标本步骤包括剥膜、前处理、低渗处理、固定、解离、 滴片以及染色。本发明在染色体标本制备过程中，进行了剥膜方法的确定、前处理时间的确定、低渗液的选择和低渗时间的确定、固定程序的确定、解离时间的确定、滴片方法的改进、 染色时间的确定以及洗片步骤的改进。
剥膜方法的确定胚胎细胞制备染色体标本一般用于鱼类，由于鱼类的卵一般都较小，无法进行剥膜处理来获得胚胎，所以都采用直接前处理的方式进行。但是金乌贼卵膜厚，秋水仙素难浸透，且卵大有利于剥膜获得胚胎。剥膜时使用镊子固定卵，用解剖针挑破卵膜，然后双手各持一镊子从破膜开口处外翻卵膜，逐渐剥离卵膜，露出胚胎，大大减短了下步的前处理时间。
前处理时间样品采用秋水仙素进行前处理，前处理时间过短或过长均会使染色体形态不利于观察，本实施例将胚胎细胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中处理30min。
低渗液的选择和低渗时间的确定常规方法采用过滤海水做为低渗液，由于海水浓度较难确定导致低渗时间不确定，我们采用KCl作为低渗液，浓度为5%，处理45min。低渗处理前去净秋水仙素。
固定程序的确定在实验过程中发现固定液固定3次后，可在_4°C长期保存样品。 我们采用卡诺氏液(甲醇冰醋酸=3 1，体积比)固定，间隔15min更换固定液一次，共更换3次固定液。由于固定液中有冰醋酸会对样品有一定的解离作用，会影响固定效果，因此在第一次加固定液前只移除一半低渗液作为缓冲，第二、三次则需将旧液完全移除后再加新的固定液。
解离时间采用冰醋酸进行解离，浓度为50%，解离时间过短或过长都会影响滴片效果，我们将解离时间设定为45min，滴片效果良好，无大组织块干扰。解离前去净固定液，否则影响解离液浓度。
滴片方法常规的冷滴片法容易发生重复滴片，影响染色体观察，且需要干燥过夜，所需时间较长。我们采用热滴片法滴片，温度40°C -60°C，滴片高度1.8m-aii，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。
染色时间采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液(GIBC0公司生产)1ml，PH 6.8的磷酸缓冲液(PBS)9ml，染色时间最终影响了染色体标本的质量，染色时间过短染色体形态不清晰，染色时间过长背景色加深，我们采用的染色时间为30min，然后用自来水清洗玻片。
洗片步骤用自来水冲洗玻片，冲洗时有液滴的面朝上，玻片向下倾斜，玻片下端与水平面成30°，玻片磨砂面与水流接触，水流以滴刚成线状，慢慢冲洗，至冲洗后的水不再带有颜色为止。
采用上述方法，我们在中国水产科学研究院黄海水产研究所进行了实际应用，对金乌贼胚胎染色体进行制片，结果表明，采用本发明的方法可以获得良好的染色体标本，染色体中期分裂相多、形态清晰、分散良好，具体效果见图1。
权利要求
1.一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法，它的操作程序是剥膜、前处理、 低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片，其特征在于所述的滴片采用热滴片法，温度 400C -60°C，滴片高度1. 8m-2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的剥膜使用镊子固定卵，用解剖针挑破卵膜；然后双手各持一镊子从破膜开口处外翻卵膜，逐渐剥离卵膜，露出胚胎；所述的前处理剥膜后的胚胎采用秋水仙素进行前处理，将胚胎细胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中处理30min ；所述的低渗处理采用KCl作为低渗液，浓度为5%，处理45min，低渗处理前去净秋水仙素；所述的固定采用卡诺氏液，即甲醇冰醋酸=3 1(体积比)固定，间隔15min更换固定液一次，共更换3次固定液，第一次加固定液前需移除一半低渗液；所述的解离采用浓度为50%冰醋酸进行解离45min，解离前去净固定液； 所述的滴片采用热滴片法，温度40°C _60°C，滴片高度1. 8m-aii，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体；所述的染色采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液1ml，PH 6. 8的磷酸缓冲液 9ml，染色时间30min ；所述的洗片用自来水冲洗玻片，冲洗时有液滴的面朝上，玻片向下倾斜，玻片下端与水平面成30°，玻片磨砂面与水流接触，水流以滴刚成线状，慢慢冲洗，至冲洗后的水不再带有颜色为止。
全文摘要
一种利用金乌贼胚胎细胞制备染色体标本的方法，它的操作程序是剥膜、前处理、低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片，其特征在于所述的滴片采用热滴片法，温度40℃-60℃，滴片高度1.8m-2m，每滴完一滴后用吸水纸在液滴中间位置吸除多余的液体。该方法通过热滴片法，合理控制滴片的温度和滴片时的高度，缩短了制片时间，改善了染色体制片效果，解决了染色体标本制备时细胞破裂程度掌握困难、染色体丢失、染色体形态差等方面问题。利用该发明对金乌贼胚胎细胞染色体进行制片，获得良好的染色体标本，染色体中期分裂相多、形态清晰、分散良好，具体效果见。
文档编号G09B23/36GK102509504SQ20111028411
公开日2012年6月20日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者刘克奉, 刘长琳, 吴彪, 孙建明, 庄志猛, 燕敬平, 王晓华, 王琛, 陈四清 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所
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