大花罗布麻叶提取物及其中两个化学成分的降血脂作用的制作方法
专利名称：大花罗布麻叶提取物及其中两个化学成分的降血脂作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大花罗布麻叶水提取物及其两个化学成分——罗布麻甲素与丁香树脂醇-双-O-β-D-比喃葡萄糖苷，采用新的药效学实验方法，即利用分子生物学的酵母双杂交系统实验，结果显示明显的降血脂作用。
背景技术：
罗布麻为传统中药，其药用部位为叶，具有清热利水，平肝安神之功效，供药用的罗布麻常见的有两种罗布麻属植物罗布麻(Apocynum venteum Linn)和白麻属植物大花罗布麻(Poacynumhendersonii(Hook.F.)Woodson)，新疆的罗布麻大都属于大花罗布麻，野生资源分布面积达270万亩，有关药理作用研究的报道，较有影响的有以下几篇。
1.大花罗布麻叶药理学研究的系列报道共三篇，分别探讨了它对血小板聚集、延缓衰老和心血管的影响(顾振纶等，中成药，1989，11(11)28-30；1990，12(3)28-30；1991，13(7)27-29)2.罗布麻叶浸膏对脑内单胺类递质含量及细胞膜流动性的影响(潘建新等，中草药，1999，30(7)517-519)3.新疆大花罗布麻叶治疗高血压病临床观察(洪秀芳等，实用中西医结合杂志，1991，4(1)33)4.罗布麻叶水浸膏降血脂作用的研究(杨守业等，中药通报，1986，11(6)50-52)以上文献表明，对大花罗布麻叶的药理作用有多方面的报道，但未涉及降血脂作用，虽然中国中医研究院杨守业等人报告了降血脂作用，但其品种不是大花罗布麻，研究的方法是采用大鼠、小鼠分别形成高脂血症模型后给药，并未指出提取物作用的化学物质基础，本文以大花罗布麻提取物及其两个主要化学成分——罗布麻甲素和丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为研究对象，从分子生物学研究角度出发，揭示它们能增强对高密度脂蛋白(HDL)中主要成分载脂蛋白apoAI与其受体B族I型清道夫受体(SR-BI)之间的相互作用，从而提示罗布麻的降脂功效。
现代研究表明，增加血清中apoAI的含量可降低动脉粥样硬化的风险，(Koji.M.et al.J BioChem，1998，273(30)18959-18965)SR-BI在参与胆固醇逆转运过程中，起着关键性作用，(Marisa Vi als etal.J Bio Chem，2003278(7)5325-5332)；在胆固醇逆转运中HDL(apoAI)与其受体SR-BI的相互作用是降脂药物筛选的新靶点。
发明内容
本发明内容包括应用酵母双杂交方法(yeast two-hybrid)筛选大花罗布麻提取物及其众多化合物单体的降脂作用，结果发现大花罗布麻叶的水提取物以及它的两个化学成分——罗布麻甲素和丁香树脂醇-双-O-β-D-比喃葡萄糖苷，有较强的降血脂作用，为罗布麻保健品或药物制剂提供新的功能定位。
发明是通过如下方法实现的酵母双杂交方法(yeast two-hybrid)是近年发展起来的在细胞内研究蛋白质相互作用的方法，我们选用Clontech公司得以GAL4为基础的双杂交系统III为实验体系，用占大鼠HDL65％的apoAI及HDL受体SR-BI的全长cDNA构建成相应的酵母表达载体，以报告基因所表达的β-半乳糖苷酶酶活定量检测了apoAI和SR-BI间存在相互作用的强弱，如果某一化合物促进了这对蛋白的相互作用，就必定会提高报告基因的活性，即检测到报告基因活力上升就说明该化合物可能促进这对蛋白的相互作用，具有一定的降血脂作用。罗布麻叶水提取物和罗布麻甲素与丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，能增强对高密度脂蛋白(HDL)中主要成分载脂蛋白apo-AI与其受体B族I型清道夫受体(SR-BI)之间的相互作用，显示具有降血脂作用。
具体实施例方式实验方法1.接种共转化了载脂蛋白AI(apo-AI)和清道夫受体(SR-BI)的AHl09菌株或交配的二倍体菌株；2．培养基中分别加入待测药品，在相同条件下进行培养；3．测定OD600判断药品的毒性。以不加药物组分的共转化菌株为空白对照。
只有对酵母菌株生长影响不大时才能用此系统进行检测。
β-半乳糖甘酶的活力检测方法
以硝基苯吡喃半乳糖(ONPG)为底物的液体分析法检测B-半乳糖昔酶的活力可测得含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒的酵母菌表达的β-半乳糖苷酶的活力在20-80U左右。具体方法如下1)在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基中加入含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒菌斑，在30℃摇动(250rpm)24-30h活化菌种。
2)取出菌液20-50μl于5mlYPDA培养基混合后30℃摇动(250rpm)16-18h，此时，OD600＝0.4-1.2。
3)取0.5-1.5ml菌液于1.5ml离心管中，离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清。
4)再用0.1mlZ-buffer重悬细胞。
5)在液氮中裂解5次以上。
6)加入0.7ml Z-buffer疏基乙醇、0.16ml ONPG(4mg/ml)混匀后30℃保温记时至溶液变黄。
7)在加入0.4ml 1M Na2CO3混匀后14000rpm离心10min。
8)用上清比色测定OD420值，计算β-半乳糖苷酶的活力。
计算公式如下β-半乳糖苷酶单位数[1]＝1000×OD420/(t×V×OD600)t＝反应开始到溶液变黄的时间V＝0.1ml×浓缩因子 OD600＝600nm吸光值 OD420＝420nm吸光值[1]Miller，J.H.In a short course in bacterial genetics.Cold spring harbor laboratory press.cold spring harbor；p74检测各组分对报告基因β-半乳糖苷酶的影响，从而判断它们对载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(sR-BI)间存在相互作用的影响，以找出能够加强载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(sR-BI)间存在相互作用的组分。
实验结果表1 样品β-半乳糖苷酶活力值
空白组样本n＝3，样品组样本n＝9，自由度v＝10表2样品组与空白组均数t检验结果
t0.005，10＝3.581t0.001，10＝4.587***p＜0.001**p＜0.005
从表2内数据可以看出，经两组均数t检验处理后的统计结果显示样品与空白的β-半乳糖苷酶活力值差异有统计学意义。
样品编号分别为1大花罗布麻叶水提取物，2罗布麻甲素，3丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，4大花罗布麻花水提取物，空白为不加样品，加与样品相同量溶剂。
测试过程中采用携带有大鼠载脂蛋白apo-AI及清道夫受体SR-BI基因质粒的酵母菌株AH109-030613为测试菌株，在空白对照中加入了与测试样溶液等量溶剂以扣除溶剂对大鼠载脂蛋白apo-AI与清道夫受体SR-BI之间相互作用的影响。
从表1中的β-半乳糖苷酶活力值可看出，大花罗布麻花水提取物的三个试验剂量均显示使载脂蛋白apo-AI与清道夫受体SR-BI之间相互作用减弱的负作用，大花罗布麻叶水提取物和罗布麻甲素在浓度为0.108ug/ml、0.216ug/ml时，都有明显的增强apo-AI与SR-BI之间相互作用的效果，丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在浓度为0.216ug/ml也有较明显的活性，为今后将其作为降脂药物开发奠定一个良好的基础。
权利要求
利用分子生物学中酵母双杂交系统实验，对大花罗布麻叶水提取物及其中两个化学成分——罗布麻甲素与丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷进行药效学实验，结果显示明显的降血脂作用，机理是它们能增强对高密度脂蛋白(HDL)中主要成分载脂蛋白apoAI与其受体B族I型清道夫受体(SR-BI)之间的相互作用[文献增加血清中apoAI的含量可降低动脉粥样硬化的风险，Koji.M.et al.J BioChem，1998，273(30)18959-18965；SR-BI在参与胆固醇逆转运过程中，起着关键性作用，Marisa et a1.JBio Chem，2003278(7)5325-5332；在胆固醇逆转运中HDL(apoAI)与其受体SR-BI的相互作用是降脂药物筛选的新靶点]。本发明的新颖性在于首次提出大花罗布麻水提取物的降血脂作用，与前人发现罗布麻水浸膏降血脂作用的区别在于研究对象属于不同属的罗布麻，实验方法也不同；并首次报告了大花罗布麻水提物降血脂作用的物质基础。本项研究结果可为大花罗布麻保健品或药物制剂提供新的功能定位。
全文摘要
本发明涉及大花罗布麻叶水提取物及其两个化学成分——罗布麻甲素与丁香树脂醇－双－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，新的药效学实验方法，即利用分子生物学中酵母双杂交系统实验，结果显示明显的降血脂作用。经现代分子生物学实验研究表明，增加血清中高密度脂蛋白(HDL)主要成分载脂蛋白apoAI的含量可降低动脉粥样硬化的风险，其受体B族I型清道夫受体SR－BI在参与胆固醇逆转运过程中，起着关键性作用，在胆固醇逆转运中HDL(apoAI)与其受体SR－BI的相互作用是降脂药物筛选的新靶点。罗布麻叶水提取物和罗布麻甲素与丁香树脂醇－双－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，能增强对载脂蛋白apoAI与其受体SR－BI之间的相互作用，显示具有降血脂作用，为大花罗布麻保健品或药物制剂提供新的功能定位。
文档编号A61P3/00GK1748723SQ20041007991
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月16日 优先权日2004年9月16日
发明者堵年生, 马成, 张烜 申请人:新疆医科大学
技术领域：
本发明涉及大花罗布麻叶水提取物及其两个化学成分——罗布麻甲素与丁香树脂醇-双-O-β-D-比喃葡萄糖苷，采用新的药效学实验方法，即利用分子生物学的酵母双杂交系统实验，结果显示明显的降血脂作用。
背景技术：
罗布麻为传统中药，其药用部位为叶，具有清热利水，平肝安神之功效，供药用的罗布麻常见的有两种罗布麻属植物罗布麻(Apocynum venteum Linn)和白麻属植物大花罗布麻(Poacynumhendersonii(Hook.F.)Woodson)，新疆的罗布麻大都属于大花罗布麻，野生资源分布面积达270万亩，有关药理作用研究的报道，较有影响的有以下几篇。
1.大花罗布麻叶药理学研究的系列报道共三篇，分别探讨了它对血小板聚集、延缓衰老和心血管的影响(顾振纶等，中成药，1989，11(11)28-30；1990，12(3)28-30；1991，13(7)27-29)2.罗布麻叶浸膏对脑内单胺类递质含量及细胞膜流动性的影响(潘建新等，中草药，1999，30(7)517-519)3.新疆大花罗布麻叶治疗高血压病临床观察(洪秀芳等，实用中西医结合杂志，1991，4(1)33)4.罗布麻叶水浸膏降血脂作用的研究(杨守业等，中药通报，1986，11(6)50-52)以上文献表明，对大花罗布麻叶的药理作用有多方面的报道，但未涉及降血脂作用，虽然中国中医研究院杨守业等人报告了降血脂作用，但其品种不是大花罗布麻，研究的方法是采用大鼠、小鼠分别形成高脂血症模型后给药，并未指出提取物作用的化学物质基础，本文以大花罗布麻提取物及其两个主要化学成分——罗布麻甲素和丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为研究对象，从分子生物学研究角度出发，揭示它们能增强对高密度脂蛋白(HDL)中主要成分载脂蛋白apoAI与其受体B族I型清道夫受体(SR-BI)之间的相互作用，从而提示罗布麻的降脂功效。
现代研究表明，增加血清中apoAI的含量可降低动脉粥样硬化的风险，(Koji.M.et al.J BioChem，1998，273(30)18959-18965)SR-BI在参与胆固醇逆转运过程中，起着关键性作用，(Marisa Vi als etal.J Bio Chem，2003278(7)5325-5332)；在胆固醇逆转运中HDL(apoAI)与其受体SR-BI的相互作用是降脂药物筛选的新靶点。
发明内容
本发明内容包括应用酵母双杂交方法(yeast two-hybrid)筛选大花罗布麻提取物及其众多化合物单体的降脂作用，结果发现大花罗布麻叶的水提取物以及它的两个化学成分——罗布麻甲素和丁香树脂醇-双-O-β-D-比喃葡萄糖苷，有较强的降血脂作用，为罗布麻保健品或药物制剂提供新的功能定位。
发明是通过如下方法实现的酵母双杂交方法(yeast two-hybrid)是近年发展起来的在细胞内研究蛋白质相互作用的方法，我们选用Clontech公司得以GAL4为基础的双杂交系统III为实验体系，用占大鼠HDL65％的apoAI及HDL受体SR-BI的全长cDNA构建成相应的酵母表达载体，以报告基因所表达的β-半乳糖苷酶酶活定量检测了apoAI和SR-BI间存在相互作用的强弱，如果某一化合物促进了这对蛋白的相互作用，就必定会提高报告基因的活性，即检测到报告基因活力上升就说明该化合物可能促进这对蛋白的相互作用，具有一定的降血脂作用。罗布麻叶水提取物和罗布麻甲素与丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，能增强对高密度脂蛋白(HDL)中主要成分载脂蛋白apo-AI与其受体B族I型清道夫受体(SR-BI)之间的相互作用，显示具有降血脂作用。
具体实施例方式实验方法1.接种共转化了载脂蛋白AI(apo-AI)和清道夫受体(SR-BI)的AHl09菌株或交配的二倍体菌株；2．培养基中分别加入待测药品，在相同条件下进行培养；3．测定OD600判断药品的毒性。以不加药物组分的共转化菌株为空白对照。
只有对酵母菌株生长影响不大时才能用此系统进行检测。
β-半乳糖甘酶的活力检测方法
以硝基苯吡喃半乳糖(ONPG)为底物的液体分析法检测B-半乳糖昔酶的活力可测得含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒的酵母菌表达的β-半乳糖苷酶的活力在20-80U左右。具体方法如下1)在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基中加入含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒菌斑，在30℃摇动(250rpm)24-30h活化菌种。
2)取出菌液20-50μl于5mlYPDA培养基混合后30℃摇动(250rpm)16-18h，此时，OD600＝0.4-1.2。
3)取0.5-1.5ml菌液于1.5ml离心管中，离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清。
4)再用0.1mlZ-buffer重悬细胞。
5)在液氮中裂解5次以上。
6)加入0.7ml Z-buffer疏基乙醇、0.16ml ONPG(4mg/ml)混匀后30℃保温记时至溶液变黄。
7)在加入0.4ml 1M Na2CO3混匀后14000rpm离心10min。
8)用上清比色测定OD420值，计算β-半乳糖苷酶的活力。
计算公式如下β-半乳糖苷酶单位数[1]＝1000×OD420/(t×V×OD600)t＝反应开始到溶液变黄的时间V＝0.1ml×浓缩因子 OD600＝600nm吸光值 OD420＝420nm吸光值[1]Miller，J.H.In a short course in bacterial genetics.Cold spring harbor laboratory press.cold spring harbor；p74检测各组分对报告基因β-半乳糖苷酶的影响，从而判断它们对载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(sR-BI)间存在相互作用的影响，以找出能够加强载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(sR-BI)间存在相互作用的组分。
实验结果表1 样品β-半乳糖苷酶活力值
空白组样本n＝3，样品组样本n＝9，自由度v＝10表2样品组与空白组均数t检验结果
t0.005，10＝3.581t0.001，10＝4.587***p＜0.001**p＜0.005
从表2内数据可以看出，经两组均数t检验处理后的统计结果显示样品与空白的β-半乳糖苷酶活力值差异有统计学意义。
样品编号分别为1大花罗布麻叶水提取物，2罗布麻甲素，3丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，4大花罗布麻花水提取物，空白为不加样品，加与样品相同量溶剂。
测试过程中采用携带有大鼠载脂蛋白apo-AI及清道夫受体SR-BI基因质粒的酵母菌株AH109-030613为测试菌株，在空白对照中加入了与测试样溶液等量溶剂以扣除溶剂对大鼠载脂蛋白apo-AI与清道夫受体SR-BI之间相互作用的影响。
从表1中的β-半乳糖苷酶活力值可看出，大花罗布麻花水提取物的三个试验剂量均显示使载脂蛋白apo-AI与清道夫受体SR-BI之间相互作用减弱的负作用，大花罗布麻叶水提取物和罗布麻甲素在浓度为0.108ug/ml、0.216ug/ml时，都有明显的增强apo-AI与SR-BI之间相互作用的效果，丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在浓度为0.216ug/ml也有较明显的活性，为今后将其作为降脂药物开发奠定一个良好的基础。
权利要求
利用分子生物学中酵母双杂交系统实验，对大花罗布麻叶水提取物及其中两个化学成分——罗布麻甲素与丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷进行药效学实验，结果显示明显的降血脂作用，机理是它们能增强对高密度脂蛋白(HDL)中主要成分载脂蛋白apoAI与其受体B族I型清道夫受体(SR-BI)之间的相互作用[文献增加血清中apoAI的含量可降低动脉粥样硬化的风险，Koji.M.et al.J BioChem，1998，273(30)18959-18965；SR-BI在参与胆固醇逆转运过程中，起着关键性作用，Marisa et a1.JBio Chem，2003278(7)5325-5332；在胆固醇逆转运中HDL(apoAI)与其受体SR-BI的相互作用是降脂药物筛选的新靶点]。本发明的新颖性在于首次提出大花罗布麻水提取物的降血脂作用，与前人发现罗布麻水浸膏降血脂作用的区别在于研究对象属于不同属的罗布麻，实验方法也不同；并首次报告了大花罗布麻水提物降血脂作用的物质基础。本项研究结果可为大花罗布麻保健品或药物制剂提供新的功能定位。
全文摘要
本发明涉及大花罗布麻叶水提取物及其两个化学成分——罗布麻甲素与丁香树脂醇－双－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，新的药效学实验方法，即利用分子生物学中酵母双杂交系统实验，结果显示明显的降血脂作用。经现代分子生物学实验研究表明，增加血清中高密度脂蛋白(HDL)主要成分载脂蛋白apoAI的含量可降低动脉粥样硬化的风险，其受体B族I型清道夫受体SR－BI在参与胆固醇逆转运过程中，起着关键性作用，在胆固醇逆转运中HDL(apoAI)与其受体SR－BI的相互作用是降脂药物筛选的新靶点。罗布麻叶水提取物和罗布麻甲素与丁香树脂醇－双－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，能增强对载脂蛋白apoAI与其受体SR－BI之间的相互作用，显示具有降血脂作用，为大花罗布麻保健品或药物制剂提供新的功能定位。
文档编号A61P3/00GK1748723SQ20041007991
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月16日 优先权日2004年9月16日
发明者堵年生, 马成, 张烜 申请人:新疆医科大学
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