一种用于脑缺血性中风病急性期的中药复方的制作方法
专利名称：一种用于脑缺血性中风病急性期的中药复方的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗脑缺血性中风病的现代中药复方及其生产工艺，主要是针对脑缺血级联反应病理过程中内生毒性物质损害和微灌流障碍等环节发挥作用，而药效物质基本清楚的中药复方制剂。
背景技术：
目前，临床治疗缺血性中风病，中医主要是应用平肝熄风、化痰通络、行气活血、开窍醒神等方药。由于受口服给药途径等方面的限制，在急性期难以发挥治疗优势。即使有一些注射剂如脉络宁、川芎嗪、血栓通(血塞通)、葛根注射液等，作用途径是以活血化瘀见长，但对于导致脑络瘀阻不通的级联因素影响甚微，临床疗效并未获得显著提高。西医治疗除常规对症处理外，根据近年来脑缺血损伤机理研究结果创制了系列针对性的药物与治疗方案。例如，阻抑缺血再灌注所致兴奋性氨基酸(EAA)毒性对神经细胞损伤的药物NMDA受体拮抗剂(MK-801)、钙离子通道拮抗剂(尼莫地平)等，能够减少缺血性损伤病变的范围，但是不加区别地阻断EAA介导的神经传递、影响一些正常生理功能，包括修复所必须的神经可塑性，为预后康复带来了不利影响。急性期的缺血性脑水肿是一个重要病理过程，由于其为细胞毒性和血管源性两类因素的混合，前者是膜离子泵衰竭，治疗应针对逆转能量耗竭，提供氧合血以恢复泵功能，此时，高渗剂效果有限。缺血数小时后血脑屏障崩溃产生血管源性水肿，按理高渗剂应该奏效，然而CT扫描观察到高渗剂对脑梗塞性肿胀效果并不显著，甘露醇有并发水肿反跳的副作用；试用地塞米松疗效尚难估价，类固醇激素即使大量应用似乎也无裨益，甚至可能对缺血神经元有害；甘油在脑血管病幸存者中有一定效果，但导致糖尿病控制困难。
针对上述困难，深入剖析病机演变规律(病理过程)，探索新的治疗思路是解决疗效问题的根本途径之一。本发明思路的依据背景是1、中医学“毒损脑络”病机理论我们的研究发现，缺血性中风病病情深重，凶险难愈，脑神难复的深层病机乃为“毒损脑络”。其实质为风火上扰，气逆血乱，上冲于脑，或风火夹内生瘀血、痰浊上犯于脑，交结阻于脑络，脑络受损，并终致营卫失和而壅滞，则毒邪内生。毒邪反损脑络，络脉破损，或络脉拘挛瘀闭，气血渗灌失常，致脑神失养，神机失守，形成神昏闭厥、半身不遂的病理状态。在此，营卫失和，卫气壅遏不得宣通，火毒自生而损络，是较严重的微观病机，较之壅塞于脑络之中的风火、痰瘀等毒邪形成更严重的损害且不易疏解。“毒损脑络”病机体现于脑缺血级连反应中自由基、代谢毒损害与微灌流障碍的病理过程。因此，解毒、通络是针对本病病机关键的核心治疗大法。
2、现代病理生理学依据目前，对于缺血性中风病理机制的深入研究认为，中风病脑缺血级联反应中，产生了大量的自由基和代谢物质，超过了机体自身对这些物质的清除能力而成为有害的毒性物质。它们通过脂质过氧化反应等各自特有的途径，一方面损伤血管内皮细胞，导致相关脑区微血管灌流障碍，微循环瘀滞。微循环是维持机体内稳态的重要环节，微循环的血流出入自由，精密协调着微血管内外环境中众多的细胞因子、介质、生长因子、粘附因子及细胞生命活动的基本营养物质等。毒性物质导致的相关脑区微循环瘀滞破坏了其对上述活性物质的协调，势必造成神经元等功能单位的生理机能损伤，反映了中医学“络损神伤”的生物学特性。另一方面，毒性物质造成神经胶质细胞和神经元的严重损害。胶质细胞受损肿胀，特别是星形胶质细胞肿胀，使其终足包被的毛细血管受到更为严重的压迫而加重微灌流障碍。一些神经递质过度堆积(如谷氨酸、乙酰胆碱、NO等)，成为神经毒性物质，导致神经细胞、血管内皮细胞进一步损害，而且这些损害因素难以疏解。这些局部环境变化是形成中风病缺血级联反应不断加重，神经元及其信息联系功能难以恢复的重要原因之一。另外，进一步产生的细胞毒性因素，如从堵塞的微血管游出的白细胞释放的蛋白酶、活性氧成分和脂衍生物等损伤神经细胞，尤其神经胶质细胞出现中毒性水肿，进而加重组织的毛细血管灌流障碍，形成脑微循环功能进一步损害的恶性循环从而进一步使缺血性半暗带血流受到威胁，促进缺血性损害。
可以认为，上述诸方面的变化，导致内生毒性物质发挥着加重脑微循环障碍和神经细胞损伤的作用，是缺血性中风病理损害不断加重的生物学基础。阻断缺血级联反应过程，改善脑微循环，是有效控制神经细胞损伤和恢复受损神经细胞功能的重要治疗途径。
而现有中西药物尚不能有效地阻抑上述缺血级联反应损伤这一核心病理过程。
发明内容
本发明研制了一种阻抑脑缺血级联反应损伤，改善脑微灌流，以保护神经细胞，且药效物质和作用机理相对清楚的现代化中药复方制剂。
本发明力图针对缺血性中风病的缺血级联反应这一核心病理过程，解决对脑神(神经元)的保护作用问题。所采用的技术方案是从毒论治以“解毒通络”立法，建立凉血解毒、化瘀通络的药物配伍原则，解毒以祛除内生毒性物质损害，则络脉易和，脑神可复；通络以改善缺血脑区的微灌流状态，畅通气血的渗灌使毒易祛，从而阻断脑缺血级联反应的恶性循环损伤病理过程。
本发明的中药复方包括栀子和三七，二者的重量比为栀子∶三七＝1-10∶1-10，优选3-7∶3-7，更优选5-7∶3-6，还更优选约5∶3-5。
另外，三七优选可以用市购三七总皂苷来代替，它的总皂苷含量一般在50％以上，优选60％以上，更优选70％以上。在这种情况下，栀子与三七总皂苷的重量比为60-400∶1-20，更优选120-300∶2-12，还更优选150-200∶4-6。
本发明的组方可以按照本领域的常规方法制成任何一种适用于临床使用的剂型，例如丸剂，颗粒剂，口服液，胶囊，注射剂等。本发明的优选制剂形式是注射剂和口服颗粒剂。
例如一种制备方法包括将栀子粉碎成粗粉，用乙醇渗漉，渗漉液浓缩成清膏，过活性炭柱，用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，获得栀子半成品；将栀子半成品与三七总皂苷按比例混匀即可，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀即可。
还有一种制备方法包括将栀子用水煎煮1-3次，合并煎液，过滤，浓缩成清膏，烘干，粉碎，得栀子半成品；再与三七总皂苷混合均匀即可，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀即可。
本发明的中药复方可制成用于脑缺血性中风病急性期的注射剂，用于脑缺血性中风病急性期、恢复早期的固体口服制剂。
药理效应特点本处方制剂可明显降低MCAT大鼠脑组织MDA的含量，升高SOD含量，发挥抗自由基损伤保护脑组织的作用；降低MCAT大鼠梗塞脑组织梗塞灶Glu、NMDA的表达；减轻MCAT大鼠脑组织含水量；减轻脑缺血所致的神经细胞损伤。显示了其凉血解毒之功效。另外，能够迅速而显著地提高麻醉犬脑血流量，对MCAT大鼠缺血后脑组织血流有明显改善作用，并且，可明显降低血瘀症大鼠全血粘度，降低红细胞压积与聚集性，增强红细胞变形性，显示了其化瘀通络的作用。呈现为对大鼠大脑中动脉血栓模型术后12h、24h、48h神经症状有不同程度的改善，发挥了保护脑神的综合效应。这些作用，均显著优于以活血化瘀功效表达的血栓通注射液。
本发明技术方案的有益效果是，有效祛除缺血产生的代谢毒性物质对缺血灶及缺血半暗带神经细胞的继发性损害；阻抑缺血级联反应中脑组织微血管的恶性循环损害而改善缺血半暗带微灌流。从而解除细胞中毒性脑水肿，减轻迟发性神经细胞死亡，消除或减轻后遗症的病理基础。
具体实施例以下通过实施例来进一步说明本发明，应该指出的是，这些实施例仅用于说明的目的，不构成对本发明的范围的限制。本领域的技术人员清楚，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以做出一些变化和改良，这些均包括在本发明的范畴内。
实施例1参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将150g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。在取得栀子半成品后，将其用适量注射用水溶解，滤过。另取4g的处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，过滤，将三七药液与栀子药液混匀，调节PH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小时，0.45μm滤膜过滤，加注射用水于滤液中至1000ml，再用0.22μm滤膜过滤，滤液灌装成于注射液安瓿，110℃热压灭菌30分钟，制成1000ml注射剂。
实施例2参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将150g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。在取得栀子半成品后，将其用适量纯水溶解，另取处方量的三七总皂苷，加适量纯水溶解。将三七药液与栀子药液充分混匀，低温真空浓缩为清膏，喷雾干燥，制成细粉，以1∶1比例加糊精，混匀，制粒，干燥，分装入袋，制成50袋口服颗粒剂。
实施例3参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将200g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。
将120g三七粉碎为粗粉，加3倍量的75％乙醇，加热回流7次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，以2倍于生药的水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗至无糖反应，再用乙醇解析，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙。将上述栀子半成品和三七总皂苷加注射用水溶解，再用0.22μm滤膜过滤，滤液灌装成于注射液安瓿，110℃热压灭菌30分钟，制成1000ml注射剂。
实施例4参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将200g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。
将200g三七粉碎为粗粉，加4倍量的75％乙醇，加热回流7次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，以3倍于生药的水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗至无糖反应，再用乙醇解析，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙。将栀子半成品和三七总皂苷用适量纯水溶解，将三七药液与栀子药液充分混匀，低温真空浓缩为清膏，喷雾干燥，制成细粉，以1∶1比例加糊精，混匀，制粒，干燥，分装入袋，制成50袋口服颗粒剂。
栀子、三七复方制剂的主要药效学试验1、对MCAT大鼠神经症状的影响实验采用了三氯化铁致大脑中动脉血栓形成的大鼠脑缺血模型，造模后MCAT大鼠神经症状评定的结果显示试验药83.2、41.6、20.8mg/kg组(分别相当临床人用量的20、10、5倍)的大鼠在术后12h，24h，48h其神经症状均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)。
2、对MCAT大鼠脑组织含水量的影响造模后48h，试验药83.2、41.6、20.8mg/kg组的大鼠手术侧脑含水量明显低于模型组，与模型组相比较差异具有显著性(P＜0.01，p＜0.05)。
3、对MCAT大鼠脑组织形态学的影响脑组织病理形态学HE、Nissl染色显示，模型组大鼠脑皮质缺血灶细胞数量明显减少，胞体萎缩，变性，着色浅。试验药三个剂量组大鼠脑缺血灶细胞数量较模型组明显增多，细胞萎缩变性较模型组明显减轻。图像分析表明试验药组阳性细胞面密度与模型组比较具有统计学意义(P＜0.01)，提示试验药具有减轻脑缺血所至的神经细胞损害的作用。
4、对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响试验药83.2、41.6mg/kg组可明显降低MCAT大鼠脑组织MDA的含量，升高SOD含量(P＜0.01)。提示试验药具有抗自由基损伤，保护脑组织的作用。
5、MCAT大鼠梗塞脑组织Glu和NMDA表达的影响采用三氯化铁致大脑中动脉血栓形成的大鼠脑缺血模型和免疫组织化学方法，结果显示试验药能明显降低Glu、NMDA在梗塞灶的表达。
6、对MCAT大鼠脑血流量的影响MCAT大鼠脑组织血流量明显减少，试验药83.2、41.6mg/kg组造模48h的脑组织血流量均明显高于模型组(P＜0.01)，说明本药对缺血后脑组织血流有明显改善作用。
7、对麻醉犬脑血流量的影响实验在33只健康杂种犬进行，试验表明试验药可以显著提高麻醉犬脑血流量(P＜0.05或P＜0.01)。其作用于注射药物后10分钟开始起效，药效维持到给药后50分钟。试验药83.2、41.6mg/kg组与阳性药血栓通比较没有显著性差异；试验药低剂量组与阳性药血栓通比较，在注射药物后45分钟和50分钟有显著性差异(P＜0.05)。
8、对急性血瘀大鼠血液流变学的影响试验药中剂量(41.6mg/kg)与小剂量(20.8mg/kg)可明显降低血瘀症大鼠全血粘度(与模型组比较P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001)，血浆粘度呈下降趋势(但未见统计学差异)，小剂量组明显降低红细胞压积(与模型组比较P＜0.0001)。小剂量组可使红细胞变形性增强，聚集性下降(P＜0.01，P＜0.001)。
一、本发明的试验药对大脑中动脉血栓形成模型大鼠神经症状的影响实验材料
1、药品与试剂受试药试验药外观呈淡黄色，含量10.39mg/ml，具有凉血解毒，化瘀通络之功能，主治急性缺血性脑中风。
阳性对照药血栓通注射液呈白色，含量50mg/ml，具有活血祛瘀之功能，主治急性缺血性脑中风。
试剂与药品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工厂产品，用1mol/L盐酸配制。
2、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；SHZ-22型恒温水浴振荡器，江苏太仓医疗器械厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品。
方法与结果1、分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)，每组10只。造模后尾静脉给药，一日剂量分两次给予，共给药五次。
2、造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。按Tamura[4]等的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片中空塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
3、MCAT大鼠神经症状的评定在术后不同时间(12h，24h，48h)，按Bederson等的方法并加以改进，对动物进行行为评分。1.提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘的屈曲又有内旋者，记为1、2、3和4分。2.将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力者记为0分；如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重3度，分别记为1、2、3分。3.将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分；同样根据手术对侧前肢肌张力下降程度不同记为1、2、3分。4.提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分。根据以上标准评分，满分为11分，分数越高，动物的行为障碍越严重。对行为检测打分值进行组间比较，t检验。结果见表1。
表1 试验药对MCAT大鼠神经症状的影响(X±SD)剂量精神症状评分组别 Nmg/kg12h 24h 48h假手术组 - 100 0 0T模型组- 105.5±0.55 4.67±0.524±0.63试验药组 83.2104.33±0.82** 3.83±0.41** 3.17±0.75*41.6104.4±0.55** 3.83±0.75** 3.33±0.82*20.8104.67±0.554±0.63* 3.33±1.03血栓通组 50 103.67±0.52** 4±0.63* 3.33±0.52*注各组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示，除假手术组未见行为异常改变，MCAT模型组大鼠在术后12h、24h、48h均出现偏瘫样症状，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。试验药20.8mg/kg组在术后48h神经症状改善不明显外，试验药各剂量组与血栓通组的大鼠在术后12h、24h、48h其神经症状均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)。
二、本发明的试验药对MCAT大鼠脑组织含水量的影响实验材料1、药品与试剂受试药、阳性对照药同试验1。
2、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，71只，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品；Df-206型鼓风干燥箱，北京西城医疗器械厂产品。
方法与结果分组、给药及手术同试验20.1。术后48小时断头取脑，切取大脑中间部分(前后各去除3毫米)，左右分开，用滤纸吸干表面水分，分别称量左右脑片湿重。再置于烘箱中，105℃烘烤48小时至恒重，精确称量干重，计算含水量[8]，与同组对照侧比较，和组间比较，进行t检验。结果见表2。
表2 试验药对MCAT大鼠脑组织含水量的影响(X±SD)剂量含水量(％)组别 N(mg/kg)左脑含水量 右脑含水量假手术组 - 1077.30±0.7977.09±0.57ΔΔ模型组 - 1077.04±0.48** 78.90±0.96试验药组 83.21076.55±1.33** 78.09±1.0341.61076.77±0.78** 77.96±0.9120.81077.51±2.16** 75.11±2.03ΔΔ血栓通组 50 1077.04±0.48** 78.90±0.96注与模型组相比ΔΔP＜0.01；与同组对侧脑组织含水量相比**P＜0.01。
结果显示，术后48h，假手术组未见左右两侧大脑含水量异常改变，模型组大鼠手术侧脑组织含水量明显增加，试验药各剂量组、血栓通组的大鼠手术侧脑含水量明显少于模型组，与模型组相比具有显著差异(P＜0.01)，但各给药组手术侧脑组织含水量与左脑相比却明显增加(P＜0.01)。
三、本发明的试验药对MCAT大鼠脑组织形态的影响实验材料1、药品与试剂受试药、阳性对照药同试验12、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重190～210g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器POLYVAR万能显微镜，美国产品；C8真彩病理图像分析仪，北京航空航天大学产品。
方法与结果实验用大鼠60只，随机分为6组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)。造模方法见实验20.1，造模后给药，一日剂量分两次给与，共给药五次，末次给药后一小时(即术后48小时)，断头取脑，分别以10％中性甲醛和Carnoy氏液固定，石蜡包埋，切片(取视交叉前后脑片)，作HE及NISSL染色，显微观测组织形态变化。并对NISSL染色的结果进行图像分析(每个样本于梗死灶取三个视野，每组5个样本)。结果见表3。
表3 试验药对MCAT大鼠大脑皮层尼氏体染色后阳性细胞的影响(X±SD)剂量组别 N 阳性细胞面密度(mg/kg)假手术组- 15 0.24±0.02**模型组 - 15 0.11±0.04试验药组 83.215 0.22±0.03**41.615 0.21±0.02**20.815 0.14±0.03血栓通组 50 15 0.22±0.04**注与模型组相比**P＜0.01镜下可见假手术组大鼠脑皮质细胞层次清晰，细胞构筑清楚，模型组大鼠损伤侧皮质可见大量变性神经元，核固缩、胞质呈萎缩变性，尼氏染色病灶区可见少量小胶质细胞浸润。阳性药血栓通组大鼠皮质损伤侧可见少量变性神经元，且散在正常神经元之中，萎缩样变性减轻。试验药83.2mg/kg组大鼠损伤侧皮质可见少量变性神经元，萎缩样变性减轻，突起延长，散在少量小胶质细胞；41.6mg/kg组大鼠损伤侧皮质仍见大量变性神经元，并呈萎缩样变性，在变性神经元中散在有正常神经元。尼氏体染色病灶区小胶质细胞增多。图像分析表明给药组阳性细胞面密度增大，提示本药具有减轻脑缺血所至的神经细胞损伤变性的作用。
四、本发明的试验药对MCAT大鼠脑血流量的影响实验材料1、药品与试剂受试药、阳性对照药同试验12、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，60只，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；LS-III型组织血流仪，由北京立科研究所、北京神经外科研究所研制；脑立体定位仪，日本产品。
方法与结果
1、分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当临床人用量的20，10，5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)。尾静脉注射给药，一日剂量分两次给予，共给药五次。
2、造模及检测方法末次给药后1h实施手术测定，手术方法同试验20.1，暴露大鼠右侧大脑中动脉，在大鼠头顶骨部位，前囟中心向前1mm、右4mm处，用牙科钻打一直径约2mm的骨窗(安放测量电极用)；检测原理根据氢气清除法，将大鼠用脑立体定位仪固定，将测量电极插入软脑膜下0.8mm，参比电极置于颈部皮下，极电压值(PS)为650mV，电解电流值(EDI)为250μA，电解时间为3秒钟。测量脑组织血流量。结果直接输入计算机，血流量以ml/100g/min计，组间比较，进行t检验。结果见表4。
表4 试验药对MCAT大鼠脑组织血流量的影响(X±SD)剂量组别N 造模48小时脑血流量mg/kg假手术组- 10146.83±23.25**模型组 - 1064±9.32试验药组 83.21080.5±7.23**41.610103.33±7.74**20.81068±8.79血栓通组 50 1098.67±8.31**注各组与模型组相比**P＜0.01。
结果显示大鼠经凝闭大脑中动脉，脑组织血流量均减少，模型组降低幅度约为假手术组脑血流量的44％左右。试验药83.2mg/kg、41.6mg/kg、血栓通组造模后48h的脑血流量均明显高于模型组，说明本药对脑血流有明显改善作用，此与药物保护脑组织、改善脑缺血性病理损伤有关。
五、试验药对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响实验材料1、药品与试剂受试药试验药、阳性对照药同实验1。
MDA、SOD试剂合购自南京建成生物工程研究所。批号20011031。
2、动物Wistar大鼠，雄性，体重190～210g，60只，为中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器721型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品。
方法与结果分组、给药、造模方法同实验20.1。造模、给药24小时断头取脑，去小脑、嗅球及脑干，加9倍生理盐水制备成10％脑匀浆，备用。
1、SOD的测定按SOD试剂合说明测定SOD活力，结果见表5。
2、MDA的测定按MDA试剂合说明测定MDA含量，结果见表5。
表5 试验药对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响(X±SD)组别 剂量N MDAmmol/g脑组织SODnu/mg脑组织mg/kg假手术组 - 10 0.54±0.11** 144±20.20**模型组 - 10 0.87±0.2192.17±21.54试验药组 83.210 0.56±0.1** 127.67±20.55**41.610 0.59±0.12** 138.33±27.27**20.810 0.79±0.2198.5±29.04血栓通组 50 10 0.57±0.07** 114.5±21.86**注各组与模型组相比，**P＜0.01。
结果显示，大鼠经凝闭大脑中动脉后，其超氧化歧化酶(SOD)、MDA均有明显变化，模型组大鼠MDA含量明显高于假手术组，SOD明显低于假手术组，试验药可明显降低MDA含量，升高SOD活力(P＜0.01)。提示本药具有抗自由基损伤保护脑组织的作用。
六、本发明的试验药对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu和NMD表达的影响实验材料1、药品与试剂受试药试验药、阳性对照药同试验1。
试剂与药品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工厂产品，用1mol/L盐酸配制。
免疫组织化学试剂兔抗Glu、NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物(1∶200，Histostatn-sp试剂盒，ZYMED公司)。
2、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器POLYVAR万能显微镜，美国产品；C8真彩病理图像分析仪，北京航空航天大学产品。
试验方法1、分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)，每组10只。造模后尾静脉给药，一日剂量分两次给予，共给药五次。
2、造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。按Tamura[3]等的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片中空塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
3、动物处理末次给药后一小时(即术后48小时)，断头取脑，分别以10％中性甲醛固定，石蜡包埋，切片(取视交叉前后脑片)，作免疫组织化学染色，显微观测组织形态变化，并做图像分析。
4、免疫组化染色方法采用ABC法，步骤如下①.切片入1％甲醇H2O2掖，室温30min ②.蛋白酶K消化，37℃ 30min ③.正常羊血清，室温30min ④.兔抗Glu，NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，4℃过夜 ⑤.生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物(1∶200，Histostatn-sp试剂盒，ZYMED公司)，37℃2h⑥.0.05％DAB-0.1％H2O2液显色。在①、②、③、⑤、⑥步骤之前都用0.01MPBS洗3次，每次洗5min。阴性对照，省去一抗或用正常羊血清代替一抗。
5、图像分析及统计学处理对Glu、NMDA免疫组化结果，用CMIAS8真彩病理图像分析系统(中国航空航天大学图像分析中心)进行分析，统计每个场的面密度。组间资料统计用t检验。
实验结果1、试验药对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu表达的影响正常大鼠脑皮质Glu表达在细胞的胞质内，核区呈阴性，细胞形态多呈锥体形，且带有突起，细胞层次清楚；模型组大鼠脑皮质梗塞灶内Glu细胞数量比正常大鼠明显增多，Glu表达也明显增强，细胞形态呈萎缩变性的锥体形；阳性药组、大剂量组、中剂量组大鼠脑内Glu表达比模型组明显减弱，其中中剂量组Glu表达最弱，且细胞数量最少；小剂量组Glu的表达同模型组。图像分析统计结果见表6。
表6 试验药对MCAT大鼠大脑皮层梗塞灶Glu表达的影响(X±SD)剂量组别 N阳性细胞面密度(mg/kg假手术组 -90.09±0.02**模型组 -90.13±0.02试验药组83.2 90.09±0.02**41.6 90.07±0.02**20.8 90.06±0.02**血栓通组5090.10±0.10**注与模型组相比**P＜0.012、本发明的试验药对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶NMDA表达的影响正常大鼠脑皮质NMDA表达在细胞的胞质内，核区呈阴性，细胞形态多呈锥体形和圆形，细胞层次清楚；模型大鼠脑皮质梗塞灶内NMDA的表达明显比正常大鼠强，细胞形态呈肿胀和萎缩变形形态；阳性药组和大剂量组、中剂量组、小剂量组大鼠NMDA表达比模型组减弱，其中大剂量组、中剂量组NMDA的表达最弱，大剂量组NMDA细胞呈锥体形，且萎缩变性；中剂量组NMDA阳性细胞多呈小圆形。统计结果见表7。
表7 试验药对MCAT大鼠大脑皮层NMDA表达的影响(X±SD)组别 剂量(mg/kg)N阳性细胞面密度假手术组 - 9 0.08±0.02*模型组- 9 0.11±0.02试验药 83.2 9 0.09±0.02**41.6 9 0.07±0.02**20.8 9 0.05±0.01**血栓通组 50 9 0.07±0.01*注与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01结论试验药通过降低Glu、NMDA在梗塞灶的表达，逆转细胞的肿胀、变性，从而达到治疗目的。
七、本发明的试验药对急性血瘀大鼠血液流变学影响的实验观察实验材料和方法1、动物与试剂动物Wistar大鼠雌雄各半，72只。体重200-230g，清洁级。由军事医学科学院动物实验中心提供。合格证号医动字005号。
药品与试剂受试药试验药、阳性对照药同试验1。
盐酸肾上腺素注射液，1mg/ml，北京市永康药业有限公司提供。批号20020129红细胞变形试剂，北京市世帝科学仪器公司提供。批号200205。
肝素140μ/mg，北京双旋生物制品厂。
仪器LG-R-80血液流变仪。LG-B-190。RBC变形/聚集测试仪。北京市世帝科学仪器公司产品2k-380高速冷冻离心机，德国。
2、分组与给药实验用大鼠随机分为6组空白对照组，血瘀模型对照组，阳性药对照组(血栓通注射液)，给药浓度50mg/kg，试验药组(给药浓度分别为83.2mg/kg，41.6mg/kg，20.8mg/kg)按上述药物剂量每日分两次给药。造模当天，于造模前后各尾静脉给药一次。造模后24小时(次日晨)尾静脉给药一次，给药后1小时以10％水合氯醛0.35ml/100g腹腔麻醉，腹主A取血5ml，肝素抗凝20u/ml。
造模实验用大鼠于首次给药后1小时皮下注射肾上腺素0.1ml/100g，共2次。间隔4小时，中间(前后各间隔2小时)将大鼠浸入4℃冰水5分钟。当天下午继续给药，次日晨末次给药后1小时以10％水合氯醛0.35ml/100g腹腔麻醉，腹主A取血5ml，肝素抗凝20u/ml。
表8 试验药对急性血淤大鼠全血粘度的影响(X±SD)组别 剂量 全血粘度(mpa.s)血浆粘度 压积(％)n＝12 mg/kg200s-130s-15s-11s-1100s-1压积正常组--4.36±0.41*6.21±0.65Δ11.87±1.75**29.66±5.96Δ1.30±0.12 47.33±5.16模型组--4.83±0.45 7.10±0.87 14.92±2.95 39.75±11.78 1.50±0.36 50.17±3.8621.57±44.75±试验药组 11.7 3.81±0.34***5.17±0.45****9.23±0.88****1.37±0.252.54****3.39****10.71±23.3 4.28±0.43**5.89±0.54**25.41±2.52***1.41±0.30 48.83±2.750.95****46.7 4.74±0.77 6.99±1.68 14.13±5.13 37.26±17.89 1.57±0.49 49.83±3.01阳性药组 504.37±0.35*6.22±0.71*11.94±2.10**29.92±7.22Δ1.19±0.27*48.00±2.52与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，ΔP＜0.02表9 试验药对急性血淤大鼠红细胞变形性和聚集性的影响(X±SD)组别 剂量 红细胞变形性 红细胞聚集性n＝12 (mg/kg MA×DI SSS MA×DSS)0.387±对照组 -- 0.491±0.032 246.27±15.12 75.409±16.061****0.084****模型组 -- 0.480±0.023 242.08±10.861.021±0.483 208.035±92.934试验药组 11.7 0.516±0.028*263.99±17.78**0.870±0.190 174.802±36.29423.3 0.485±0.035 243.10±18.780.986±0.209 194.759±45.18346.7 0.481±0.043 239.74±18.830.938±0.138 188.485±25.036阳性药组 50 0.485±0.027 245.62±14.110.808±0.208*165.236±40.438*与模型组比较*P＜0.01，**P＜0.001，****P＜0.0001实验结果1、血液粘度测定全血粘度测定取抗凝血0.8ml采用LG-R-80血液流变仪检测，以高切200s-1，中切30s-1，低切5s-1，1s-1时血液粘度表示全血粘度。另取血浆0.8ml检测血浆粘度，见表8。数据统计采用单因素方差分析，继以LSD检验，以P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001为显著性差异标准。
2、红细胞变形性和聚集性测定取抗凝血40ul加红细胞悬浮液1ml摇匀，取样0.8ml，采用红细胞变形/聚集测试仪检测，以红细胞最大变形指数(MA×DI)和曲线下面积(SSS)表示红细胞变形性。另取抗凝血0.8ml以红细胞最大聚集指数(MA×D)和曲线下面积(SS)表示红细胞聚集性。见表2。数据统计采用单因素方差分析。继以LSD检验测定结果表明模型组与对照组比较，各切变率下的全血粘度与血浆粘度明显增高，红细胞聚集性增高，变形能力下降。血液的粘度、浓度、聚集状态明显表现出血瘀证的特征。与正常对照组比较，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.02。见表9。试验药46.7mg/kg，23.3mg/kg，11.7mg/kg。中剂量与小剂量可明显降低血瘀症大鼠全血粘度(与模型组比较P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001)血浆粘度呈下降趋势，但未见统计学差异。小剂量组红细胞压积明显降低(与模型组比较P＜0.0001)。见表8。结果还显示模型组与正常对照组比较，红细胞变形能力下降，聚集性增强；而小剂量组可使红细胞变形性增强，聚集性下降(P＜0.01，P＜0.001)。见表9。
综合上述结果，试验药对急性应激造成的大鼠血瘀症有明显的改善作用，小剂量的作用最为明显。
八、对麻醉犬脑血流量的影响实验材料1、动物健康杂种犬33只，雌雄兼用，体重12～15kg，由北京市海淀区通利实验动物养殖场提供，动物合格证编号第024-069号。
2、药物受试药试验药、阳性对照药同试验1。
空白对照药生理盐水。
3、药物配制在每次实验开始时，根据动物体重进行药物配制血栓通注射液0.5ml原液/kg；(25mg/kg)试验药低剂量组0.394ml原液/kg(5.18mg人参皂甙/kg)；试验药中剂量组0.788ml原液/kg(10.4mg人参皂甙/kg)；试验药高剂量组1.577ml原液/kg(20.7mg人参皂甙/kg)；吸取相应毫升数的原液，与适量的生理盐水混合成总体积为100ml的静脉滴注用液，水浴加热至37℃后进行静脉滴注。
4、实验仪器和器械TA-4000多道生理记录仪(美国GouldInc公司产品)，MF-27电磁流量计(日本光电公司产品)，动物手术器械一套。
5、实验步骤实验动物手术动物称重后腹腔注射5％戊巴比妥钠30mg/kg，麻醉后背位固定，分离左侧股静脉备用。颈部切口，分离右颈总动脉，插管(肝素溶液管内抗凝)直接记录颈动脉血压。分离左颈总动脉，分离结扎颈外动脉，将颈总动脉嵌入电磁流量计探头(φ＝2mm)，垂直于颈总动脉固定，备测颈内动脉血流量用。为防止探头干燥，滴加生理盐水保持湿润。安放心电图电极，记录标准肢体II导联心电图。将呼吸探头置于鼻孔处记录呼吸频率和呼吸深度。
6、实验动物给药手术后稳定30分钟，记录各项指标，作为给药前对照。实验开始时，按照前述方法进行药液的配制。犬经左侧股静脉匀速滴注相应的研究药物，记录滴注开始时间，控制药物在20分钟内匀速滴完。
7、观察指标滴注开始时立即进行测定(0分钟)，每隔5分钟记录一次，每次记录15～30秒，记录时走纸速度为10mm/s，记录间期走纸速度为50mm/h，多道生理记录仪监视器同步进行监测。观察记录药物作用至滴注开始后60分钟结束。同步记录以下生理指标1)颈内动脉血流量2)动脉血压实验结果TA-4000多道生理记录仪将实验数据记录在专用的记录纸上，通过人工计数，将记录的图形转换为数字，以表格的形式附在每次实验记录后面。
实验结果使用SAS统计软件，就各组间的各项指标进行t检验以确定是否有显著性差异。
1、试验药对麻醉犬脑血流量的影响参见表10。
表10 试验药对麻醉犬脑血流量的影响(ml/min)给药后时 试验药试验药 试验药生理盐水血栓通(n＝6)间(分) 高剂量(n＝7) 中剂量(n＝7) 低剂量(n＝6) (n＝7)0 110.7±2.2 109.1±2.6 106.6±6.1 110.8±3.4111.9±2.05 117.5±6.6 116.7±5.0 112.0±7.3 116.7±5.2111.8±2.910124.2±8.8**121.7±7.3**119.4±9.4*120.8±8.6*110.3±5.915126.7±10.8**128.3±16.7**122.7±11.3**122.2±7.1**110.3±4.520128.3±13.7**131.4±16.0**125.4±12.7**123.8±8.6**111.3±6.625130.8±16.6**130.7±12.1**127.6±11.7**124.0±7.9**110.9±6.630115.3±53.5131.4±8.9**126.9±10.9**125.5±7.4**110.6±5.635132.2±14.5**130.4±8.1**122.9±15.5123.8±6.0**111.3±8.340129.2±10.2**126.9±6.9**126.1±8.5**120.2±2.6113.3±8.745130.0±8.4**126.1±8.7**126.7±6.9**115.8±4.9Δ113.0±7.950130.2±7.8**126.1±12.8**125.6±6.8**115.3±11.9Δ110.9±7.955122.5±13.6119.3±13.7122.3±10.2112.8±7.5**110.3±6.160119.2±17.4118.4±14.6106.4±39.7108.7±11.9 110.9±7.2*与对照组比较P＜0.05；**与对照组比较P＜0.01；Δ与血栓通比较P＜0.05。
实验表明试验药可以显著提高麻醉犬脑血流量(P＜0.05或P＜0.01)。其作用于注射药物后10分钟开始起效，药效维持到给药后50分钟。试验药高剂量组和中剂量组与阳性药血栓通比较没有显著性差异；试验药低剂量组与阳性药血栓通比较，在注射药物后45分钟和50分钟有显著性差异(P＜0.05)。
权利要求
1.一种治疗脑缺血性中风病的中药复方，包括栀子和三七或三七总皂苷，其中栀子与三七的重量比为1-10∶1-10，栀子与三七总皂苷的重量比为60-400∶1-20。
2.根据权利要求1的中药复方，其中栀子与三七的重量比为3-7∶3-7。
3.根据权利要求2的中药复方，其中栀子与三七的重量比为5∶3-5。
4.根据权利要求1的中药复方，其中栀子与三七总皂苷的重量比为120-300∶2-12。
5.根据权利要求1的中药复方，其中栀子与三七总皂苷的重量比为150-200∶4-6。
6.根据权利要求1的中药复方，其中三七总皂苷的总皂苷含量为50％或50％以上。
7.根据权利要求1的中药复方，其中三七总皂苷的总皂苷含量为60％或60％以上。
8.根据权利要求1的中药复方，其中三七总皂苷的总皂苷含量为70％或70％以上。
9.制备权利要求1的中药复方的方法，包括将栀子粉碎成粗粉，用乙醇渗漉，渗漉液浓缩成清膏，过活性炭柱，用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，获得栀子半成品；将栀子半成品与三七总皂苷按比例混匀，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀；再制成颗粒剂和注射剂。
10.制备权利要求1的中药复方的方法，包括将栀子用水煎煮1-3次，合并煎液，过滤，浓缩成清膏，烘干，粉碎，得栀子半成品；再与三七总皂苷混合均匀，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀；再制成颗粒剂和注射剂。
全文摘要
一种用于脑缺血性中风病急性期的中药复方。它是由栀子、三七配伍而成的具有解毒通络作用的复方，其制剂采用现代提取、分离工艺，以栀子苷、三七总皂苷含量作为质量控制指标和标示主要药效物质的含量。该复方可有效祛除脑缺血产生的代谢毒性物质对缺血灶及缺血半暗带神经细胞的继发性损害；阻抑脑缺血级联反应中脑组织微血管的恶性循环损害而改善缺血半暗带微灌流。从而解除细胞中毒性脑水肿，减轻迟发性神经细胞死亡，消除或减轻后遗症的病理基础。主要用于脑栓塞等脑缺血性中风病急性期的治疗。
文档编号A61P9/10GK1539444SQ0312207
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月24日 优先权日2003年4月24日
发明者李澎涛, 王玥琦, 牛欣, 司银楚, 贾旭 申请人:北京中医药大学
技术领域：
本发明涉及一种治疗脑缺血性中风病的现代中药复方及其生产工艺，主要是针对脑缺血级联反应病理过程中内生毒性物质损害和微灌流障碍等环节发挥作用，而药效物质基本清楚的中药复方制剂。
背景技术：
目前，临床治疗缺血性中风病，中医主要是应用平肝熄风、化痰通络、行气活血、开窍醒神等方药。由于受口服给药途径等方面的限制，在急性期难以发挥治疗优势。即使有一些注射剂如脉络宁、川芎嗪、血栓通(血塞通)、葛根注射液等，作用途径是以活血化瘀见长，但对于导致脑络瘀阻不通的级联因素影响甚微，临床疗效并未获得显著提高。西医治疗除常规对症处理外，根据近年来脑缺血损伤机理研究结果创制了系列针对性的药物与治疗方案。例如，阻抑缺血再灌注所致兴奋性氨基酸(EAA)毒性对神经细胞损伤的药物NMDA受体拮抗剂(MK-801)、钙离子通道拮抗剂(尼莫地平)等，能够减少缺血性损伤病变的范围，但是不加区别地阻断EAA介导的神经传递、影响一些正常生理功能，包括修复所必须的神经可塑性，为预后康复带来了不利影响。急性期的缺血性脑水肿是一个重要病理过程，由于其为细胞毒性和血管源性两类因素的混合，前者是膜离子泵衰竭，治疗应针对逆转能量耗竭，提供氧合血以恢复泵功能，此时，高渗剂效果有限。缺血数小时后血脑屏障崩溃产生血管源性水肿，按理高渗剂应该奏效，然而CT扫描观察到高渗剂对脑梗塞性肿胀效果并不显著，甘露醇有并发水肿反跳的副作用；试用地塞米松疗效尚难估价，类固醇激素即使大量应用似乎也无裨益，甚至可能对缺血神经元有害；甘油在脑血管病幸存者中有一定效果，但导致糖尿病控制困难。
针对上述困难，深入剖析病机演变规律(病理过程)，探索新的治疗思路是解决疗效问题的根本途径之一。本发明思路的依据背景是1、中医学“毒损脑络”病机理论我们的研究发现，缺血性中风病病情深重，凶险难愈，脑神难复的深层病机乃为“毒损脑络”。其实质为风火上扰，气逆血乱，上冲于脑，或风火夹内生瘀血、痰浊上犯于脑，交结阻于脑络，脑络受损，并终致营卫失和而壅滞，则毒邪内生。毒邪反损脑络，络脉破损，或络脉拘挛瘀闭，气血渗灌失常，致脑神失养，神机失守，形成神昏闭厥、半身不遂的病理状态。在此，营卫失和，卫气壅遏不得宣通，火毒自生而损络，是较严重的微观病机，较之壅塞于脑络之中的风火、痰瘀等毒邪形成更严重的损害且不易疏解。“毒损脑络”病机体现于脑缺血级连反应中自由基、代谢毒损害与微灌流障碍的病理过程。因此，解毒、通络是针对本病病机关键的核心治疗大法。
2、现代病理生理学依据目前，对于缺血性中风病理机制的深入研究认为，中风病脑缺血级联反应中，产生了大量的自由基和代谢物质，超过了机体自身对这些物质的清除能力而成为有害的毒性物质。它们通过脂质过氧化反应等各自特有的途径，一方面损伤血管内皮细胞，导致相关脑区微血管灌流障碍，微循环瘀滞。微循环是维持机体内稳态的重要环节，微循环的血流出入自由，精密协调着微血管内外环境中众多的细胞因子、介质、生长因子、粘附因子及细胞生命活动的基本营养物质等。毒性物质导致的相关脑区微循环瘀滞破坏了其对上述活性物质的协调，势必造成神经元等功能单位的生理机能损伤，反映了中医学“络损神伤”的生物学特性。另一方面，毒性物质造成神经胶质细胞和神经元的严重损害。胶质细胞受损肿胀，特别是星形胶质细胞肿胀，使其终足包被的毛细血管受到更为严重的压迫而加重微灌流障碍。一些神经递质过度堆积(如谷氨酸、乙酰胆碱、NO等)，成为神经毒性物质，导致神经细胞、血管内皮细胞进一步损害，而且这些损害因素难以疏解。这些局部环境变化是形成中风病缺血级联反应不断加重，神经元及其信息联系功能难以恢复的重要原因之一。另外，进一步产生的细胞毒性因素，如从堵塞的微血管游出的白细胞释放的蛋白酶、活性氧成分和脂衍生物等损伤神经细胞，尤其神经胶质细胞出现中毒性水肿，进而加重组织的毛细血管灌流障碍，形成脑微循环功能进一步损害的恶性循环从而进一步使缺血性半暗带血流受到威胁，促进缺血性损害。
可以认为，上述诸方面的变化，导致内生毒性物质发挥着加重脑微循环障碍和神经细胞损伤的作用，是缺血性中风病理损害不断加重的生物学基础。阻断缺血级联反应过程，改善脑微循环，是有效控制神经细胞损伤和恢复受损神经细胞功能的重要治疗途径。
而现有中西药物尚不能有效地阻抑上述缺血级联反应损伤这一核心病理过程。
发明内容
本发明研制了一种阻抑脑缺血级联反应损伤，改善脑微灌流，以保护神经细胞，且药效物质和作用机理相对清楚的现代化中药复方制剂。
本发明力图针对缺血性中风病的缺血级联反应这一核心病理过程，解决对脑神(神经元)的保护作用问题。所采用的技术方案是从毒论治以“解毒通络”立法，建立凉血解毒、化瘀通络的药物配伍原则，解毒以祛除内生毒性物质损害，则络脉易和，脑神可复；通络以改善缺血脑区的微灌流状态，畅通气血的渗灌使毒易祛，从而阻断脑缺血级联反应的恶性循环损伤病理过程。
本发明的中药复方包括栀子和三七，二者的重量比为栀子∶三七＝1-10∶1-10，优选3-7∶3-7，更优选5-7∶3-6，还更优选约5∶3-5。
另外，三七优选可以用市购三七总皂苷来代替，它的总皂苷含量一般在50％以上，优选60％以上，更优选70％以上。在这种情况下，栀子与三七总皂苷的重量比为60-400∶1-20，更优选120-300∶2-12，还更优选150-200∶4-6。
本发明的组方可以按照本领域的常规方法制成任何一种适用于临床使用的剂型，例如丸剂，颗粒剂，口服液，胶囊，注射剂等。本发明的优选制剂形式是注射剂和口服颗粒剂。
例如一种制备方法包括将栀子粉碎成粗粉，用乙醇渗漉，渗漉液浓缩成清膏，过活性炭柱，用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，获得栀子半成品；将栀子半成品与三七总皂苷按比例混匀即可，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀即可。
还有一种制备方法包括将栀子用水煎煮1-3次，合并煎液，过滤，浓缩成清膏，烘干，粉碎，得栀子半成品；再与三七总皂苷混合均匀即可，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀即可。
本发明的中药复方可制成用于脑缺血性中风病急性期的注射剂，用于脑缺血性中风病急性期、恢复早期的固体口服制剂。
药理效应特点本处方制剂可明显降低MCAT大鼠脑组织MDA的含量，升高SOD含量，发挥抗自由基损伤保护脑组织的作用；降低MCAT大鼠梗塞脑组织梗塞灶Glu、NMDA的表达；减轻MCAT大鼠脑组织含水量；减轻脑缺血所致的神经细胞损伤。显示了其凉血解毒之功效。另外，能够迅速而显著地提高麻醉犬脑血流量，对MCAT大鼠缺血后脑组织血流有明显改善作用，并且，可明显降低血瘀症大鼠全血粘度，降低红细胞压积与聚集性，增强红细胞变形性，显示了其化瘀通络的作用。呈现为对大鼠大脑中动脉血栓模型术后12h、24h、48h神经症状有不同程度的改善，发挥了保护脑神的综合效应。这些作用，均显著优于以活血化瘀功效表达的血栓通注射液。
本发明技术方案的有益效果是，有效祛除缺血产生的代谢毒性物质对缺血灶及缺血半暗带神经细胞的继发性损害；阻抑缺血级联反应中脑组织微血管的恶性循环损害而改善缺血半暗带微灌流。从而解除细胞中毒性脑水肿，减轻迟发性神经细胞死亡，消除或减轻后遗症的病理基础。
具体实施例以下通过实施例来进一步说明本发明，应该指出的是，这些实施例仅用于说明的目的，不构成对本发明的范围的限制。本领域的技术人员清楚，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以做出一些变化和改良，这些均包括在本发明的范畴内。
实施例1参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将150g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。在取得栀子半成品后，将其用适量注射用水溶解，滤过。另取4g的处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，过滤，将三七药液与栀子药液混匀，调节PH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小时，0.45μm滤膜过滤，加注射用水于滤液中至1000ml，再用0.22μm滤膜过滤，滤液灌装成于注射液安瓿，110℃热压灭菌30分钟，制成1000ml注射剂。
实施例2参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将150g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。在取得栀子半成品后，将其用适量纯水溶解，另取处方量的三七总皂苷，加适量纯水溶解。将三七药液与栀子药液充分混匀，低温真空浓缩为清膏，喷雾干燥，制成细粉，以1∶1比例加糊精，混匀，制粒，干燥，分装入袋，制成50袋口服颗粒剂。
实施例3参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将200g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。
将120g三七粉碎为粗粉，加3倍量的75％乙醇，加热回流7次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，以2倍于生药的水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗至无糖反应，再用乙醇解析，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙。将上述栀子半成品和三七总皂苷加注射用水溶解，再用0.22μm滤膜过滤，滤液灌装成于注射液安瓿，110℃热压灭菌30分钟，制成1000ml注射剂。
实施例4参照《中国药典》2000年版一部附录IO)流浸膏剂项下的渗漉法，将200g的栀子，粉碎成过24目筛的粗粉，用70％的乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，将滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏。然后，利用活性炭柱，先用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品。
将200g三七粉碎为粗粉，加4倍量的75％乙醇，加热回流7次，每次1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，以3倍于生药的水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗至无糖反应，再用乙醇解析，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙。将栀子半成品和三七总皂苷用适量纯水溶解，将三七药液与栀子药液充分混匀，低温真空浓缩为清膏，喷雾干燥，制成细粉，以1∶1比例加糊精，混匀，制粒，干燥，分装入袋，制成50袋口服颗粒剂。
栀子、三七复方制剂的主要药效学试验1、对MCAT大鼠神经症状的影响实验采用了三氯化铁致大脑中动脉血栓形成的大鼠脑缺血模型，造模后MCAT大鼠神经症状评定的结果显示试验药83.2、41.6、20.8mg/kg组(分别相当临床人用量的20、10、5倍)的大鼠在术后12h，24h，48h其神经症状均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)。
2、对MCAT大鼠脑组织含水量的影响造模后48h，试验药83.2、41.6、20.8mg/kg组的大鼠手术侧脑含水量明显低于模型组，与模型组相比较差异具有显著性(P＜0.01，p＜0.05)。
3、对MCAT大鼠脑组织形态学的影响脑组织病理形态学HE、Nissl染色显示，模型组大鼠脑皮质缺血灶细胞数量明显减少，胞体萎缩，变性，着色浅。试验药三个剂量组大鼠脑缺血灶细胞数量较模型组明显增多，细胞萎缩变性较模型组明显减轻。图像分析表明试验药组阳性细胞面密度与模型组比较具有统计学意义(P＜0.01)，提示试验药具有减轻脑缺血所至的神经细胞损害的作用。
4、对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响试验药83.2、41.6mg/kg组可明显降低MCAT大鼠脑组织MDA的含量，升高SOD含量(P＜0.01)。提示试验药具有抗自由基损伤，保护脑组织的作用。
5、MCAT大鼠梗塞脑组织Glu和NMDA表达的影响采用三氯化铁致大脑中动脉血栓形成的大鼠脑缺血模型和免疫组织化学方法，结果显示试验药能明显降低Glu、NMDA在梗塞灶的表达。
6、对MCAT大鼠脑血流量的影响MCAT大鼠脑组织血流量明显减少，试验药83.2、41.6mg/kg组造模48h的脑组织血流量均明显高于模型组(P＜0.01)，说明本药对缺血后脑组织血流有明显改善作用。
7、对麻醉犬脑血流量的影响实验在33只健康杂种犬进行，试验表明试验药可以显著提高麻醉犬脑血流量(P＜0.05或P＜0.01)。其作用于注射药物后10分钟开始起效，药效维持到给药后50分钟。试验药83.2、41.6mg/kg组与阳性药血栓通比较没有显著性差异；试验药低剂量组与阳性药血栓通比较，在注射药物后45分钟和50分钟有显著性差异(P＜0.05)。
8、对急性血瘀大鼠血液流变学的影响试验药中剂量(41.6mg/kg)与小剂量(20.8mg/kg)可明显降低血瘀症大鼠全血粘度(与模型组比较P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001)，血浆粘度呈下降趋势(但未见统计学差异)，小剂量组明显降低红细胞压积(与模型组比较P＜0.0001)。小剂量组可使红细胞变形性增强，聚集性下降(P＜0.01，P＜0.001)。
一、本发明的试验药对大脑中动脉血栓形成模型大鼠神经症状的影响实验材料
1、药品与试剂受试药试验药外观呈淡黄色，含量10.39mg/ml，具有凉血解毒，化瘀通络之功能，主治急性缺血性脑中风。
阳性对照药血栓通注射液呈白色，含量50mg/ml，具有活血祛瘀之功能，主治急性缺血性脑中风。
试剂与药品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工厂产品，用1mol/L盐酸配制。
2、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；SHZ-22型恒温水浴振荡器，江苏太仓医疗器械厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品。
方法与结果1、分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)，每组10只。造模后尾静脉给药，一日剂量分两次给予，共给药五次。
2、造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。按Tamura[4]等的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片中空塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
3、MCAT大鼠神经症状的评定在术后不同时间(12h，24h，48h)，按Bederson等的方法并加以改进，对动物进行行为评分。1.提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘的屈曲又有内旋者，记为1、2、3和4分。2.将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力者记为0分；如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重3度，分别记为1、2、3分。3.将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分；同样根据手术对侧前肢肌张力下降程度不同记为1、2、3分。4.提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分。根据以上标准评分，满分为11分，分数越高，动物的行为障碍越严重。对行为检测打分值进行组间比较，t检验。结果见表1。
表1 试验药对MCAT大鼠神经症状的影响(X±SD)剂量精神症状评分组别 Nmg/kg12h 24h 48h假手术组 - 100 0 0T模型组- 105.5±0.55 4.67±0.524±0.63试验药组 83.2104.33±0.82** 3.83±0.41** 3.17±0.75*41.6104.4±0.55** 3.83±0.75** 3.33±0.82*20.8104.67±0.554±0.63* 3.33±1.03血栓通组 50 103.67±0.52** 4±0.63* 3.33±0.52*注各组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示，除假手术组未见行为异常改变，MCAT模型组大鼠在术后12h、24h、48h均出现偏瘫样症状，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。试验药20.8mg/kg组在术后48h神经症状改善不明显外，试验药各剂量组与血栓通组的大鼠在术后12h、24h、48h其神经症状均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)。
二、本发明的试验药对MCAT大鼠脑组织含水量的影响实验材料1、药品与试剂受试药、阳性对照药同试验1。
2、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，71只，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品；Df-206型鼓风干燥箱，北京西城医疗器械厂产品。
方法与结果分组、给药及手术同试验20.1。术后48小时断头取脑，切取大脑中间部分(前后各去除3毫米)，左右分开，用滤纸吸干表面水分，分别称量左右脑片湿重。再置于烘箱中，105℃烘烤48小时至恒重，精确称量干重，计算含水量[8]，与同组对照侧比较，和组间比较，进行t检验。结果见表2。
表2 试验药对MCAT大鼠脑组织含水量的影响(X±SD)剂量含水量(％)组别 N(mg/kg)左脑含水量 右脑含水量假手术组 - 1077.30±0.7977.09±0.57ΔΔ模型组 - 1077.04±0.48** 78.90±0.96试验药组 83.21076.55±1.33** 78.09±1.0341.61076.77±0.78** 77.96±0.9120.81077.51±2.16** 75.11±2.03ΔΔ血栓通组 50 1077.04±0.48** 78.90±0.96注与模型组相比ΔΔP＜0.01；与同组对侧脑组织含水量相比**P＜0.01。
结果显示，术后48h，假手术组未见左右两侧大脑含水量异常改变，模型组大鼠手术侧脑组织含水量明显增加，试验药各剂量组、血栓通组的大鼠手术侧脑含水量明显少于模型组，与模型组相比具有显著差异(P＜0.01)，但各给药组手术侧脑组织含水量与左脑相比却明显增加(P＜0.01)。
三、本发明的试验药对MCAT大鼠脑组织形态的影响实验材料1、药品与试剂受试药、阳性对照药同试验12、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重190～210g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器POLYVAR万能显微镜，美国产品；C8真彩病理图像分析仪，北京航空航天大学产品。
方法与结果实验用大鼠60只，随机分为6组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)。造模方法见实验20.1，造模后给药，一日剂量分两次给与，共给药五次，末次给药后一小时(即术后48小时)，断头取脑，分别以10％中性甲醛和Carnoy氏液固定，石蜡包埋，切片(取视交叉前后脑片)，作HE及NISSL染色，显微观测组织形态变化。并对NISSL染色的结果进行图像分析(每个样本于梗死灶取三个视野，每组5个样本)。结果见表3。
表3 试验药对MCAT大鼠大脑皮层尼氏体染色后阳性细胞的影响(X±SD)剂量组别 N 阳性细胞面密度(mg/kg)假手术组- 15 0.24±0.02**模型组 - 15 0.11±0.04试验药组 83.215 0.22±0.03**41.615 0.21±0.02**20.815 0.14±0.03血栓通组 50 15 0.22±0.04**注与模型组相比**P＜0.01镜下可见假手术组大鼠脑皮质细胞层次清晰，细胞构筑清楚，模型组大鼠损伤侧皮质可见大量变性神经元，核固缩、胞质呈萎缩变性，尼氏染色病灶区可见少量小胶质细胞浸润。阳性药血栓通组大鼠皮质损伤侧可见少量变性神经元，且散在正常神经元之中，萎缩样变性减轻。试验药83.2mg/kg组大鼠损伤侧皮质可见少量变性神经元，萎缩样变性减轻，突起延长，散在少量小胶质细胞；41.6mg/kg组大鼠损伤侧皮质仍见大量变性神经元，并呈萎缩样变性，在变性神经元中散在有正常神经元。尼氏体染色病灶区小胶质细胞增多。图像分析表明给药组阳性细胞面密度增大，提示本药具有减轻脑缺血所至的神经细胞损伤变性的作用。
四、本发明的试验药对MCAT大鼠脑血流量的影响实验材料1、药品与试剂受试药、阳性对照药同试验12、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，60只，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；LS-III型组织血流仪，由北京立科研究所、北京神经外科研究所研制；脑立体定位仪，日本产品。
方法与结果
1、分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当临床人用量的20，10，5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)。尾静脉注射给药，一日剂量分两次给予，共给药五次。
2、造模及检测方法末次给药后1h实施手术测定，手术方法同试验20.1，暴露大鼠右侧大脑中动脉，在大鼠头顶骨部位，前囟中心向前1mm、右4mm处，用牙科钻打一直径约2mm的骨窗(安放测量电极用)；检测原理根据氢气清除法，将大鼠用脑立体定位仪固定，将测量电极插入软脑膜下0.8mm，参比电极置于颈部皮下，极电压值(PS)为650mV，电解电流值(EDI)为250μA，电解时间为3秒钟。测量脑组织血流量。结果直接输入计算机，血流量以ml/100g/min计，组间比较，进行t检验。结果见表4。
表4 试验药对MCAT大鼠脑组织血流量的影响(X±SD)剂量组别N 造模48小时脑血流量mg/kg假手术组- 10146.83±23.25**模型组 - 1064±9.32试验药组 83.21080.5±7.23**41.610103.33±7.74**20.81068±8.79血栓通组 50 1098.67±8.31**注各组与模型组相比**P＜0.01。
结果显示大鼠经凝闭大脑中动脉，脑组织血流量均减少，模型组降低幅度约为假手术组脑血流量的44％左右。试验药83.2mg/kg、41.6mg/kg、血栓通组造模后48h的脑血流量均明显高于模型组，说明本药对脑血流有明显改善作用，此与药物保护脑组织、改善脑缺血性病理损伤有关。
五、试验药对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响实验材料1、药品与试剂受试药试验药、阳性对照药同实验1。
MDA、SOD试剂合购自南京建成生物工程研究所。批号20011031。
2、动物Wistar大鼠，雄性，体重190～210g，60只，为中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器721型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品。
方法与结果分组、给药、造模方法同实验20.1。造模、给药24小时断头取脑，去小脑、嗅球及脑干，加9倍生理盐水制备成10％脑匀浆，备用。
1、SOD的测定按SOD试剂合说明测定SOD活力，结果见表5。
2、MDA的测定按MDA试剂合说明测定MDA含量，结果见表5。
表5 试验药对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响(X±SD)组别 剂量N MDAmmol/g脑组织SODnu/mg脑组织mg/kg假手术组 - 10 0.54±0.11** 144±20.20**模型组 - 10 0.87±0.2192.17±21.54试验药组 83.210 0.56±0.1** 127.67±20.55**41.610 0.59±0.12** 138.33±27.27**20.810 0.79±0.2198.5±29.04血栓通组 50 10 0.57±0.07** 114.5±21.86**注各组与模型组相比，**P＜0.01。
结果显示，大鼠经凝闭大脑中动脉后，其超氧化歧化酶(SOD)、MDA均有明显变化，模型组大鼠MDA含量明显高于假手术组，SOD明显低于假手术组，试验药可明显降低MDA含量，升高SOD活力(P＜0.01)。提示本药具有抗自由基损伤保护脑组织的作用。
六、本发明的试验药对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu和NMD表达的影响实验材料1、药品与试剂受试药试验药、阳性对照药同试验1。
试剂与药品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工厂产品，用1mol/L盐酸配制。
免疫组织化学试剂兔抗Glu、NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物(1∶200，Histostatn-sp试剂盒，ZYMED公司)。
2、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号。
3、仪器POLYVAR万能显微镜，美国产品；C8真彩病理图像分析仪，北京航空航天大学产品。
试验方法1、分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、试验药83.2mg/kg组、试验药41.6mg/kg组、试验药20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)，每组10只。造模后尾静脉给药，一日剂量分两次给予，共给药五次。
2、造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。按Tamura[3]等的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片中空塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
3、动物处理末次给药后一小时(即术后48小时)，断头取脑，分别以10％中性甲醛固定，石蜡包埋，切片(取视交叉前后脑片)，作免疫组织化学染色，显微观测组织形态变化，并做图像分析。
4、免疫组化染色方法采用ABC法，步骤如下①.切片入1％甲醇H2O2掖，室温30min ②.蛋白酶K消化，37℃ 30min ③.正常羊血清，室温30min ④.兔抗Glu，NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，4℃过夜 ⑤.生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物(1∶200，Histostatn-sp试剂盒，ZYMED公司)，37℃2h⑥.0.05％DAB-0.1％H2O2液显色。在①、②、③、⑤、⑥步骤之前都用0.01MPBS洗3次，每次洗5min。阴性对照，省去一抗或用正常羊血清代替一抗。
5、图像分析及统计学处理对Glu、NMDA免疫组化结果，用CMIAS8真彩病理图像分析系统(中国航空航天大学图像分析中心)进行分析，统计每个场的面密度。组间资料统计用t检验。
实验结果1、试验药对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu表达的影响正常大鼠脑皮质Glu表达在细胞的胞质内，核区呈阴性，细胞形态多呈锥体形，且带有突起，细胞层次清楚；模型组大鼠脑皮质梗塞灶内Glu细胞数量比正常大鼠明显增多，Glu表达也明显增强，细胞形态呈萎缩变性的锥体形；阳性药组、大剂量组、中剂量组大鼠脑内Glu表达比模型组明显减弱，其中中剂量组Glu表达最弱，且细胞数量最少；小剂量组Glu的表达同模型组。图像分析统计结果见表6。
表6 试验药对MCAT大鼠大脑皮层梗塞灶Glu表达的影响(X±SD)剂量组别 N阳性细胞面密度(mg/kg假手术组 -90.09±0.02**模型组 -90.13±0.02试验药组83.2 90.09±0.02**41.6 90.07±0.02**20.8 90.06±0.02**血栓通组5090.10±0.10**注与模型组相比**P＜0.012、本发明的试验药对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶NMDA表达的影响正常大鼠脑皮质NMDA表达在细胞的胞质内，核区呈阴性，细胞形态多呈锥体形和圆形，细胞层次清楚；模型大鼠脑皮质梗塞灶内NMDA的表达明显比正常大鼠强，细胞形态呈肿胀和萎缩变形形态；阳性药组和大剂量组、中剂量组、小剂量组大鼠NMDA表达比模型组减弱，其中大剂量组、中剂量组NMDA的表达最弱，大剂量组NMDA细胞呈锥体形，且萎缩变性；中剂量组NMDA阳性细胞多呈小圆形。统计结果见表7。
表7 试验药对MCAT大鼠大脑皮层NMDA表达的影响(X±SD)组别 剂量(mg/kg)N阳性细胞面密度假手术组 - 9 0.08±0.02*模型组- 9 0.11±0.02试验药 83.2 9 0.09±0.02**41.6 9 0.07±0.02**20.8 9 0.05±0.01**血栓通组 50 9 0.07±0.01*注与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01结论试验药通过降低Glu、NMDA在梗塞灶的表达，逆转细胞的肿胀、变性，从而达到治疗目的。
七、本发明的试验药对急性血瘀大鼠血液流变学影响的实验观察实验材料和方法1、动物与试剂动物Wistar大鼠雌雄各半，72只。体重200-230g，清洁级。由军事医学科学院动物实验中心提供。合格证号医动字005号。
药品与试剂受试药试验药、阳性对照药同试验1。
盐酸肾上腺素注射液，1mg/ml，北京市永康药业有限公司提供。批号20020129红细胞变形试剂，北京市世帝科学仪器公司提供。批号200205。
肝素140μ/mg，北京双旋生物制品厂。
仪器LG-R-80血液流变仪。LG-B-190。RBC变形/聚集测试仪。北京市世帝科学仪器公司产品2k-380高速冷冻离心机，德国。
2、分组与给药实验用大鼠随机分为6组空白对照组，血瘀模型对照组，阳性药对照组(血栓通注射液)，给药浓度50mg/kg，试验药组(给药浓度分别为83.2mg/kg，41.6mg/kg，20.8mg/kg)按上述药物剂量每日分两次给药。造模当天，于造模前后各尾静脉给药一次。造模后24小时(次日晨)尾静脉给药一次，给药后1小时以10％水合氯醛0.35ml/100g腹腔麻醉，腹主A取血5ml，肝素抗凝20u/ml。
造模实验用大鼠于首次给药后1小时皮下注射肾上腺素0.1ml/100g，共2次。间隔4小时，中间(前后各间隔2小时)将大鼠浸入4℃冰水5分钟。当天下午继续给药，次日晨末次给药后1小时以10％水合氯醛0.35ml/100g腹腔麻醉，腹主A取血5ml，肝素抗凝20u/ml。
表8 试验药对急性血淤大鼠全血粘度的影响(X±SD)组别 剂量 全血粘度(mpa.s)血浆粘度 压积(％)n＝12 mg/kg200s-130s-15s-11s-1100s-1压积正常组--4.36±0.41*6.21±0.65Δ11.87±1.75**29.66±5.96Δ1.30±0.12 47.33±5.16模型组--4.83±0.45 7.10±0.87 14.92±2.95 39.75±11.78 1.50±0.36 50.17±3.8621.57±44.75±试验药组 11.7 3.81±0.34***5.17±0.45****9.23±0.88****1.37±0.252.54****3.39****10.71±23.3 4.28±0.43**5.89±0.54**25.41±2.52***1.41±0.30 48.83±2.750.95****46.7 4.74±0.77 6.99±1.68 14.13±5.13 37.26±17.89 1.57±0.49 49.83±3.01阳性药组 504.37±0.35*6.22±0.71*11.94±2.10**29.92±7.22Δ1.19±0.27*48.00±2.52与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，ΔP＜0.02表9 试验药对急性血淤大鼠红细胞变形性和聚集性的影响(X±SD)组别 剂量 红细胞变形性 红细胞聚集性n＝12 (mg/kg MA×DI SSS MA×DSS)0.387±对照组 -- 0.491±0.032 246.27±15.12 75.409±16.061****0.084****模型组 -- 0.480±0.023 242.08±10.861.021±0.483 208.035±92.934试验药组 11.7 0.516±0.028*263.99±17.78**0.870±0.190 174.802±36.29423.3 0.485±0.035 243.10±18.780.986±0.209 194.759±45.18346.7 0.481±0.043 239.74±18.830.938±0.138 188.485±25.036阳性药组 50 0.485±0.027 245.62±14.110.808±0.208*165.236±40.438*与模型组比较*P＜0.01，**P＜0.001，****P＜0.0001实验结果1、血液粘度测定全血粘度测定取抗凝血0.8ml采用LG-R-80血液流变仪检测，以高切200s-1，中切30s-1，低切5s-1，1s-1时血液粘度表示全血粘度。另取血浆0.8ml检测血浆粘度，见表8。数据统计采用单因素方差分析，继以LSD检验，以P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001为显著性差异标准。
2、红细胞变形性和聚集性测定取抗凝血40ul加红细胞悬浮液1ml摇匀，取样0.8ml，采用红细胞变形/聚集测试仪检测，以红细胞最大变形指数(MA×DI)和曲线下面积(SSS)表示红细胞变形性。另取抗凝血0.8ml以红细胞最大聚集指数(MA×D)和曲线下面积(SS)表示红细胞聚集性。见表2。数据统计采用单因素方差分析。继以LSD检验测定结果表明模型组与对照组比较，各切变率下的全血粘度与血浆粘度明显增高，红细胞聚集性增高，变形能力下降。血液的粘度、浓度、聚集状态明显表现出血瘀证的特征。与正常对照组比较，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.02。见表9。试验药46.7mg/kg，23.3mg/kg，11.7mg/kg。中剂量与小剂量可明显降低血瘀症大鼠全血粘度(与模型组比较P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001)血浆粘度呈下降趋势，但未见统计学差异。小剂量组红细胞压积明显降低(与模型组比较P＜0.0001)。见表8。结果还显示模型组与正常对照组比较，红细胞变形能力下降，聚集性增强；而小剂量组可使红细胞变形性增强，聚集性下降(P＜0.01，P＜0.001)。见表9。
综合上述结果，试验药对急性应激造成的大鼠血瘀症有明显的改善作用，小剂量的作用最为明显。
八、对麻醉犬脑血流量的影响实验材料1、动物健康杂种犬33只，雌雄兼用，体重12～15kg，由北京市海淀区通利实验动物养殖场提供，动物合格证编号第024-069号。
2、药物受试药试验药、阳性对照药同试验1。
空白对照药生理盐水。
3、药物配制在每次实验开始时，根据动物体重进行药物配制血栓通注射液0.5ml原液/kg；(25mg/kg)试验药低剂量组0.394ml原液/kg(5.18mg人参皂甙/kg)；试验药中剂量组0.788ml原液/kg(10.4mg人参皂甙/kg)；试验药高剂量组1.577ml原液/kg(20.7mg人参皂甙/kg)；吸取相应毫升数的原液，与适量的生理盐水混合成总体积为100ml的静脉滴注用液，水浴加热至37℃后进行静脉滴注。
4、实验仪器和器械TA-4000多道生理记录仪(美国GouldInc公司产品)，MF-27电磁流量计(日本光电公司产品)，动物手术器械一套。
5、实验步骤实验动物手术动物称重后腹腔注射5％戊巴比妥钠30mg/kg，麻醉后背位固定，分离左侧股静脉备用。颈部切口，分离右颈总动脉，插管(肝素溶液管内抗凝)直接记录颈动脉血压。分离左颈总动脉，分离结扎颈外动脉，将颈总动脉嵌入电磁流量计探头(φ＝2mm)，垂直于颈总动脉固定，备测颈内动脉血流量用。为防止探头干燥，滴加生理盐水保持湿润。安放心电图电极，记录标准肢体II导联心电图。将呼吸探头置于鼻孔处记录呼吸频率和呼吸深度。
6、实验动物给药手术后稳定30分钟，记录各项指标，作为给药前对照。实验开始时，按照前述方法进行药液的配制。犬经左侧股静脉匀速滴注相应的研究药物，记录滴注开始时间，控制药物在20分钟内匀速滴完。
7、观察指标滴注开始时立即进行测定(0分钟)，每隔5分钟记录一次，每次记录15～30秒，记录时走纸速度为10mm/s，记录间期走纸速度为50mm/h，多道生理记录仪监视器同步进行监测。观察记录药物作用至滴注开始后60分钟结束。同步记录以下生理指标1)颈内动脉血流量2)动脉血压实验结果TA-4000多道生理记录仪将实验数据记录在专用的记录纸上，通过人工计数，将记录的图形转换为数字，以表格的形式附在每次实验记录后面。
实验结果使用SAS统计软件，就各组间的各项指标进行t检验以确定是否有显著性差异。
1、试验药对麻醉犬脑血流量的影响参见表10。
表10 试验药对麻醉犬脑血流量的影响(ml/min)给药后时 试验药试验药 试验药生理盐水血栓通(n＝6)间(分) 高剂量(n＝7) 中剂量(n＝7) 低剂量(n＝6) (n＝7)0 110.7±2.2 109.1±2.6 106.6±6.1 110.8±3.4111.9±2.05 117.5±6.6 116.7±5.0 112.0±7.3 116.7±5.2111.8±2.910124.2±8.8**121.7±7.3**119.4±9.4*120.8±8.6*110.3±5.915126.7±10.8**128.3±16.7**122.7±11.3**122.2±7.1**110.3±4.520128.3±13.7**131.4±16.0**125.4±12.7**123.8±8.6**111.3±6.625130.8±16.6**130.7±12.1**127.6±11.7**124.0±7.9**110.9±6.630115.3±53.5131.4±8.9**126.9±10.9**125.5±7.4**110.6±5.635132.2±14.5**130.4±8.1**122.9±15.5123.8±6.0**111.3±8.340129.2±10.2**126.9±6.9**126.1±8.5**120.2±2.6113.3±8.745130.0±8.4**126.1±8.7**126.7±6.9**115.8±4.9Δ113.0±7.950130.2±7.8**126.1±12.8**125.6±6.8**115.3±11.9Δ110.9±7.955122.5±13.6119.3±13.7122.3±10.2112.8±7.5**110.3±6.160119.2±17.4118.4±14.6106.4±39.7108.7±11.9 110.9±7.2*与对照组比较P＜0.05；**与对照组比较P＜0.01；Δ与血栓通比较P＜0.05。
实验表明试验药可以显著提高麻醉犬脑血流量(P＜0.05或P＜0.01)。其作用于注射药物后10分钟开始起效，药效维持到给药后50分钟。试验药高剂量组和中剂量组与阳性药血栓通比较没有显著性差异；试验药低剂量组与阳性药血栓通比较，在注射药物后45分钟和50分钟有显著性差异(P＜0.05)。
权利要求
1.一种治疗脑缺血性中风病的中药复方，包括栀子和三七或三七总皂苷，其中栀子与三七的重量比为1-10∶1-10，栀子与三七总皂苷的重量比为60-400∶1-20。
2.根据权利要求1的中药复方，其中栀子与三七的重量比为3-7∶3-7。
3.根据权利要求2的中药复方，其中栀子与三七的重量比为5∶3-5。
4.根据权利要求1的中药复方，其中栀子与三七总皂苷的重量比为120-300∶2-12。
5.根据权利要求1的中药复方，其中栀子与三七总皂苷的重量比为150-200∶4-6。
6.根据权利要求1的中药复方，其中三七总皂苷的总皂苷含量为50％或50％以上。
7.根据权利要求1的中药复方，其中三七总皂苷的总皂苷含量为60％或60％以上。
8.根据权利要求1的中药复方，其中三七总皂苷的总皂苷含量为70％或70％以上。
9.制备权利要求1的中药复方的方法，包括将栀子粉碎成粗粉，用乙醇渗漉，渗漉液浓缩成清膏，过活性炭柱，用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，获得栀子半成品；将栀子半成品与三七总皂苷按比例混匀，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀；再制成颗粒剂和注射剂。
10.制备权利要求1的中药复方的方法，包括将栀子用水煎煮1-3次，合并煎液，过滤，浓缩成清膏，烘干，粉碎，得栀子半成品；再与三七总皂苷混合均匀，或者将三七粉碎为粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(25℃)的流浸膏，用水溶解过滤，滤液通过大孔树脂柱后，先用水洗，再用乙醇洗脱，乙醇溶液减压浓缩，去除溶剂，即得三七总皂甙，将所得三七总皂苷与上述栀子半成品按比例混合均匀；再制成颗粒剂和注射剂。
全文摘要
一种用于脑缺血性中风病急性期的中药复方。它是由栀子、三七配伍而成的具有解毒通络作用的复方，其制剂采用现代提取、分离工艺，以栀子苷、三七总皂苷含量作为质量控制指标和标示主要药效物质的含量。该复方可有效祛除脑缺血产生的代谢毒性物质对缺血灶及缺血半暗带神经细胞的继发性损害；阻抑脑缺血级联反应中脑组织微血管的恶性循环损害而改善缺血半暗带微灌流。从而解除细胞中毒性脑水肿，减轻迟发性神经细胞死亡，消除或减轻后遗症的病理基础。主要用于脑栓塞等脑缺血性中风病急性期的治疗。
文档编号A61P9/10GK1539444SQ0312207
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月24日 优先权日2003年4月24日
发明者李澎涛, 王玥琦, 牛欣, 司银楚, 贾旭 申请人:北京中医药大学
最新回复(0)