vMIP及其同类的E蛋白配体在制药中的应用的制作方法
专利名称：vMIP及其同类的E蛋白配体在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及能与SARS冠状病毒E蛋白假受体相结合的病毒趋化因子vMIP和其衍生物以及其它配体蛋白样因子在制药领域中的新用途，尤其涉及在制备防治人类SARS(严重急性呼吸道综合症)的相关冠状病毒感染的药物中的应用。
背景技术：
自从2002年11月开始，在短短的半年内SARS冠状病毒已迅速在全球蔓延，发病人数在8000多人，死亡500多人。
SARS流行开始，人们认为是富粘病毒，但很快由一张透射电镜照片开始人们开始相信SARS的元凶是冠状病毒，很快由加拿大、中国、美国等的实验室几乎同时证实并完成SARS冠状病毒的基因测序，目前已知的SARS病毒株有1个广东株，3个北京株，1个香港Tor株，加拿大株和Urbani株，并认识到此病毒不同于任何已知的人或动物冠状病毒。它的基因组大约29736bp(GI29826276)，也具有冠状病毒的基因构成，但各基因的序列完全是新的序列，而且与动物冠状病毒的相似性较多于人的冠状病毒。
SARS的主要病理变化，病人肺组织学检查为渗出性损害，形成透明膜，单个核细胞浸润，肺泡上皮细胞脱落。有些病例有局灶性肺泡间出血，小支气管有坏死性炎性物，伴有机化性肺炎。也有的病例在肺泡间隔处见多核巨细胞，这些细胞胞浆呈泡沫状，核呈裂解碎片状，未见明显病毒包涵体。病人血清学在有症状后1-2周时可呈阳性反应。目前对SARS的治疗主要靠非特异性治疗，包括大量糖质激素降低机体的炎症反应，以及吸氧、丙球等应用。
对于SARS的诊断主要靠病毒分离，双份血清补体结合试验比病毒分离要敏感，电镜检查也有一定诊断价值。目前已有全病毒直接抗原包被的Elisa法检测病人的抗体产生，以及荧光定量PCR的快速诊断法等。
SARS冠状病毒的培养与基因组测序病毒分离可用人胚肾细胞，分离阴性者可用人胚气管或鼻粘膜的器官培养。用于基因组测序的SARS病毒分离主要是从临床标本培养病毒，SARS病毒在人胚肾细胞系Vero E6细胞中生长，大约在5天时已可看到细胞病变，胞内明显包涵体，可见合胞体形成，一般培养14天即可收获病毒培养上清。然后分离病毒RNA，用RT-PCR方法获得不同的扩增片段，再进行PCR产物测序。PCR引物用SARS相关冠状病毒的保守序列引物，如所用的冠状病毒ORF1b片段(冠状病毒聚合酶基因)的保守序列引物。包括人冠状病毒229E和OC43(Caccession NO.X69721)、犬冠状病毒(AF124986)、猫腹膜炎病毒(AF124987)、猪冠状病毒(E34093 NC003436AF124988)、牛冠状病毒(NC003045)、腮腺炎病毒(AF124990)、小鼠肝炎病毒(NC001846)、火鸡冠状病毒(AF124991)、鸟类感染性支气管炎病毒(NC001451)等已知病毒的ORF1b保守区。以上这些引物用于扩增SARS标本的DNA，所扩增的序列用来设计左右SARS特异引物。由此扩增测序完成SARS全序列测定。
当SARS全序列测定后，对此与已知的人和动物冠状病毒SARS ORF1b核苷酸序列和氨基酸序列的相似性比较积分分别为0.56-0.63和0.57-0.74。其核苷酸序列对比的进化树分析显示此SARS相关冠状病毒明显不同于其他已知的冠状病毒。
人们虽已了解SARS冠状病毒的基因组序列，但目前对本病无特异性治疗和预防手段。目前对SARS冠状病毒的病变机制、主要靶细胞等均知甚少。为何SARS病人的白细胞急剧下降？何种病理机制形成病人肺部病变？由于对病毒入侵机制缺乏了解，所以特异有效的预防、治疗手段也无从谈起。
此次SARS病毒流行使人们清楚地认识到病毒在不断变异中求生存。从二十年前的艾滋病病毒到今日的SARS病毒均为全新病毒型。两个不同的病毒均可破坏免疫系统而致病。SARS新病毒的形成及给人类带来的危害使人们迫切需要了解其发病机制，尤其是破坏免疫系统的机制，这是SARS病毒危害的关键点。
发明内容
本发明的目的在于提供能与SARS冠状病毒E蛋白假受体相结合的病毒趋化因子vMIP和其衍生物以及其它配体蛋白样因子的新用途，尤其在制备防治SARS相关冠状病毒药物中的新用途。
SARS相关冠状病毒作为一个全新的人类冠状病毒，其流行的重要特征是该病毒株被赋予了新的靶向性，造成免疫系统急性受损并产生大量细胞因子(用皮质激素治疗有效)而诱发肺上皮和支气管上皮细胞分泌增多、急性肺水肿、急性呼衰而致死，同时伴有血管壁坏死而至多脏器病损。SARS相关冠状病毒感染靶细胞的分子机制是阐明SARS病变机制的中心环节。
发明人在解读和对比了六个SARS相关冠状病毒株的基因组(包括1个广东株，3个北京株，1个香港Tor株，加拿大株和Urbani株)，并用这些病毒株基因组与已知的冠状病毒的传染性支气管炎病毒、人呼吸道冠状病毒、猪、犬、猫、兔、鼠、牛、火鸡等动物的冠状病毒基因组作了对比。发现SARS相关冠状基因组中有两个致病基因具有人、猫免疫缺陷病毒(HIV和FIV)糖蛋白的同源序列，并具人免疫细胞等的表面七跨膜蛋白的主要结构域同源序列。
发明人通过计算机分子模拟技术显示，以上免疫缺陷病毒同源序列和人细胞表面跨膜蛋白同源序列均为功能性区域。很可能此为SASRS相关冠状病毒急性破坏人体免疫系统的分子机制。
本发明通过探索性试验发现，所述vMIP及其同类的E蛋白配体，具体包括病毒趋化因子vMIP、或vMIP的衍生物、或其它配体蛋白样因子可与SARS冠状病毒E蛋白基因编码假的受体相结合，具有防治SARS相关冠状病毒感染病变的作用。SARS冠状病毒所编码的类似于人七跨膜受体的假受体具有掠夺人细胞膜受体功能作用，可与有关的配体样因子结合，使某些配体样分子具有阻止SARS冠状病毒感染的作用。能与E蛋白结合的因子包括vMIP-I、II、III和其衍生物以及其它配体样分子。
本发明具有以下突出优点1、为制备预防与治疗SARS相关病毒感染的疾病的药物开辟了一条新途径。
2、实现本发明前景好，可以用基因工程方法和化学合成等方法得到纯的vMIP-I和vMIP-II蛋白，或通过诱变等方法制得它们的突变体以提高药用效果，这些基因工程等生物技术难度不大，根据目前技术水平在制药工业上能够工业化生产。
具体实施例方式通过如下实施例对本发明作进一步的描述。
实验证明E蛋白的基因表达产物具有结合七跨膜受体的配体vMIP的作用。
从以下试验过程的资料中得到结果1，应用计算机软件分析显示E蛋白与人七跨膜受体的同源性为E蛋白MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPTVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLVE蛋白19 LFLAFVV-FLL-VT---LAILTAL---RL 39
LFLAF+V +LL V+ L ILT L RL7跨膜受体148 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVLVDIRL 76(gi 21928315，人11号染色体)7跨膜受体252 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVLVDIRL 80(gi 20558770)7跨膜受体348 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVLVDIRL 76(gi 20884785)E蛋白 19 LFLAFVV-FLL-VT--LAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKP 54LFLAF+V +LL V+ L ILT L V+V L +P7跨膜受体427 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVL------VDVRLHRP 58(gi 27661057)E蛋白17 VLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLV 52VLLF V+FL+V L IL+ NIV V L+7跨膜受体525 VLLF---VIFLIVYLLILSG-------NIVIVILI 49(gi 27702941)E蛋白 21 LAFV-VFLLVTLA-ILTALRLCAYCC 44L F+ VF VTLA I+TA+ LC Y C7跨膜受体6101 LGFILVF-VTLALCIVTAIWLCFYSC 125 (gi 17535187，第二跨膜区)E蛋白全长氨基酸序列和主要相似性对比2、化学合成全长E蛋白，经鉴定HPLC纯度为100％，氨基酸测序为正确序列。
3、从一淋巴瘤细胞株BCBL(证实有HHV8病毒，而无EB病毒感染)基因组DNA中扩增出全长vMIP-I、vMIP-II或vMIP-III基因片断。
4、T/A法将vMIP-I、vMIP-II或vMIP-III基因片段克隆于扩增载体pUC19质粒。酶切纯化后的片段用ABI377测序仪自动测序。
5、将vMIP-I、vMIP-II或vMIP-III基因片段亚克隆于原核表达载体pET30得到pET-vMIP-I、pET-vMIP-II和pET-vMIP-III表达载体。
6、转化大肠杆菌DH5a，IPTG诱导，重组蛋白鉴定与纯化，得纯度为95％以上的重组蛋白。
7、配体-受体结合实验用E蛋白分别与重组的vMIP-I、II、III蛋白在体外进行铰链实验，用2.5mM的DSS为交联剂，然后将交联的和未交联的E、vMIP蛋白进行电泳，观察各蛋白的迁移距离。结果显示，E蛋白和三个vMIP蛋白分子均可发生铰链结合，其电泳迁移位置在各单一蛋白的加样孔侧。
8、vMIP的毒性试验用重组的vMIP按0.5mg/kg小鼠腹腔注射，连续14天，以及0.5mg/kg食蟹猴静脉注射，均未发现明显异常反应和脏器损伤性病变。说明vMIP未见明显毒副作用。
以上实验初步证明，重组的vMIP-I、II和vMIP-III均可以结合SARS冠状病毒的E蛋白，与其理论的同源性分析相一致。这种E蛋白与其配体样蛋白的结合可抑制SARS冠状病毒与其靶细胞的结合，阻止病毒感染入靶细胞对SARS冠状病毒感染性疾病具有预防和治疗的作用。而且vMIP具有体内应用安全的特性，所以可用于制备防治SARS冠状病毒感染的药物。
权利要求
1.vMIP在制药中的应用，其特征在于至少包括以HHV8的vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III为主要活性部位在制备防治SARS冠状病毒的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的vMIP在制药中的应用，其特征在于所述的HHV8的vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III有如下核苷酸序列和氨基酸序列的vMIP-I、vMIP-II、vMIP-III活性生物分子在制备防治SARS冠状病毒的药物中的应用vMIP-I核苷酸序列，长度为288bp1 atggcccccg tccacgtttt atgctgcgtt agcgtactgc ttgccacgtt ttacctgacg61 cccacagaaa gcgcggggtc actcgtgtcg tacacgccta atagctgctg ctacgggttc121 cagcagcacc caccgcccgt ccaaattcta aaagagtggt atcccacgtc cccagcgtgc181 ccaaaacccg gagttatttt gctgaccaag cgagggcgtc agatctgcgc agacccttcc241 aaaaactggg ttaggcagct gatgcagcgg ctgcctgcca tagcttagvMIP-I的氨基酸序列(95个氨基酸)MAPVHVLCCVSVLLATFYLTPTESAGSLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPACPKPGVILLTKRGRQICADPSKNWVRQLMQRLPAIAvMIP-II核苷酸序列，长度为285bp1 atggacacca agggcatcct gctcgtcgct gtgctgactg ccttgctttg tttgcaatct61 ggggacacgc tgggagcgtc ctggcataga ccggacaagt gctgtctcgg ttaccagaaa121 agaccattac cacaggtgct tctgtccagc tggtacccca cctcccaact gtgcagcaag181 ccgggtgtga tatttttgac aaagcgtggt cgccaggtgt gtgccgacaa atcgaaagac241 tgggtgaaga agctgatgca gcaattacca gtcactgctc gctgavMIP-II氨基酸序列(94个氨基酸)MDTKGILLVAVLTALLCLQSGDTLGASWHRPDKCCLGYQKRPLPQVLLSSWYPTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTARvMIP-III核苷酸序列，长度为345bpatgtggagca tgtgctgggt gttgcgcgc acatttggg gctgctcttc tgggtggccgtgattgagct atgtgcggcc agcggtcctg ccaccatcat ggcctcggat tgttgcgagaattccctgtc cagtgccaga ttgccaccgg ataagctgat atgcgggtgg tactggacgtccaccgtgta ttgtcgccag aaggcagtca tttttgtaac gcactcgggg cggaaagtatgcgggtcgcc tgcgaagcgg cgcacgcgtc ttctgatgga gaagcacacg gagatacctctcgcgaagcg cgtagcgctt cgcgccggta aagggttatg cccctagvMIP-III氨基酸序列(115个氨基酸)MWSMCWVLRAHLGLLFWVAVIELCAASGPATIMASDCCENSLSSARLPPDKLICGWYWTSTVYCRQKAVIFVTHSGRKVCGSPAKRRTRLLMEKHTEIPLAKRVALRAGKGLCPZ
3.vMIP的衍生物在制药中的应用，其特征在于以HHV8的vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III为主要活性部位的衍生物在制备防治SARS冠状病毒药物中的应用，所述衍生物是以vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III为主要活性部位的具有结合细胞膜受体样作用的加长或截断型的核酸序列、氨基酸多肽或蛋白质分子。
4.vMIP的其它配体蛋白样因子在制药中的应用，其特征在于vMIP的其它配体蛋白样因子作为E蛋白的配体蛋白样因子在制备防治SARS冠状病毒的药物中的应用，所述vMIP的其它配体蛋白样因子是以七跨膜受体—配体样作用机制对E蛋白有结合作用的核酸序列、氨基酸多肽或蛋白质分子。
全文摘要
本发明涉及HHV8的病毒趋化因子vMIP和其衍生物以及其它配体蛋白样因子在制药领域中的新用途，尤其涉及在防治人类SARS(严重急性呼吸道综合症)的相关冠状病毒感染的药物中的应用。本发明用重组的HHV8的vMIP－I、vMIP－II和vMIP－III可结合SARS冠状病毒的E蛋白具有阻止此病毒感染靶细胞的过程，在体外对SARS冠状病毒感染猴胚肾细胞Vero E6具有明显降低细胞感染率作用，用分子模拟显示其作用机制是与人细胞膜七跨膜受体同源的病毒E蛋白受体相结合而阻断了病毒感染靶细胞过程，这使有效控制人类SARS疾病成为可能。
文档编号A61P31/14GK1470284SQ0312695
公开日2004年1月28日 申请日期2003年6月24日 优先权日2003年6月24日
发明者孙晗笑, 利奕成, 刘俊云, 乔英飒 申请人:暨南大学
技术领域：
本发明涉及能与SARS冠状病毒E蛋白假受体相结合的病毒趋化因子vMIP和其衍生物以及其它配体蛋白样因子在制药领域中的新用途，尤其涉及在制备防治人类SARS(严重急性呼吸道综合症)的相关冠状病毒感染的药物中的应用。
背景技术：
自从2002年11月开始，在短短的半年内SARS冠状病毒已迅速在全球蔓延，发病人数在8000多人，死亡500多人。
SARS流行开始，人们认为是富粘病毒，但很快由一张透射电镜照片开始人们开始相信SARS的元凶是冠状病毒，很快由加拿大、中国、美国等的实验室几乎同时证实并完成SARS冠状病毒的基因测序，目前已知的SARS病毒株有1个广东株，3个北京株，1个香港Tor株，加拿大株和Urbani株，并认识到此病毒不同于任何已知的人或动物冠状病毒。它的基因组大约29736bp(GI29826276)，也具有冠状病毒的基因构成，但各基因的序列完全是新的序列，而且与动物冠状病毒的相似性较多于人的冠状病毒。
SARS的主要病理变化，病人肺组织学检查为渗出性损害，形成透明膜，单个核细胞浸润，肺泡上皮细胞脱落。有些病例有局灶性肺泡间出血，小支气管有坏死性炎性物，伴有机化性肺炎。也有的病例在肺泡间隔处见多核巨细胞，这些细胞胞浆呈泡沫状，核呈裂解碎片状，未见明显病毒包涵体。病人血清学在有症状后1-2周时可呈阳性反应。目前对SARS的治疗主要靠非特异性治疗，包括大量糖质激素降低机体的炎症反应，以及吸氧、丙球等应用。
对于SARS的诊断主要靠病毒分离，双份血清补体结合试验比病毒分离要敏感，电镜检查也有一定诊断价值。目前已有全病毒直接抗原包被的Elisa法检测病人的抗体产生，以及荧光定量PCR的快速诊断法等。
SARS冠状病毒的培养与基因组测序病毒分离可用人胚肾细胞，分离阴性者可用人胚气管或鼻粘膜的器官培养。用于基因组测序的SARS病毒分离主要是从临床标本培养病毒，SARS病毒在人胚肾细胞系Vero E6细胞中生长，大约在5天时已可看到细胞病变，胞内明显包涵体，可见合胞体形成，一般培养14天即可收获病毒培养上清。然后分离病毒RNA，用RT-PCR方法获得不同的扩增片段，再进行PCR产物测序。PCR引物用SARS相关冠状病毒的保守序列引物，如所用的冠状病毒ORF1b片段(冠状病毒聚合酶基因)的保守序列引物。包括人冠状病毒229E和OC43(Caccession NO.X69721)、犬冠状病毒(AF124986)、猫腹膜炎病毒(AF124987)、猪冠状病毒(E34093 NC003436AF124988)、牛冠状病毒(NC003045)、腮腺炎病毒(AF124990)、小鼠肝炎病毒(NC001846)、火鸡冠状病毒(AF124991)、鸟类感染性支气管炎病毒(NC001451)等已知病毒的ORF1b保守区。以上这些引物用于扩增SARS标本的DNA，所扩增的序列用来设计左右SARS特异引物。由此扩增测序完成SARS全序列测定。
当SARS全序列测定后，对此与已知的人和动物冠状病毒SARS ORF1b核苷酸序列和氨基酸序列的相似性比较积分分别为0.56-0.63和0.57-0.74。其核苷酸序列对比的进化树分析显示此SARS相关冠状病毒明显不同于其他已知的冠状病毒。
人们虽已了解SARS冠状病毒的基因组序列，但目前对本病无特异性治疗和预防手段。目前对SARS冠状病毒的病变机制、主要靶细胞等均知甚少。为何SARS病人的白细胞急剧下降？何种病理机制形成病人肺部病变？由于对病毒入侵机制缺乏了解，所以特异有效的预防、治疗手段也无从谈起。
此次SARS病毒流行使人们清楚地认识到病毒在不断变异中求生存。从二十年前的艾滋病病毒到今日的SARS病毒均为全新病毒型。两个不同的病毒均可破坏免疫系统而致病。SARS新病毒的形成及给人类带来的危害使人们迫切需要了解其发病机制，尤其是破坏免疫系统的机制，这是SARS病毒危害的关键点。
发明内容
本发明的目的在于提供能与SARS冠状病毒E蛋白假受体相结合的病毒趋化因子vMIP和其衍生物以及其它配体蛋白样因子的新用途，尤其在制备防治SARS相关冠状病毒药物中的新用途。
SARS相关冠状病毒作为一个全新的人类冠状病毒，其流行的重要特征是该病毒株被赋予了新的靶向性，造成免疫系统急性受损并产生大量细胞因子(用皮质激素治疗有效)而诱发肺上皮和支气管上皮细胞分泌增多、急性肺水肿、急性呼衰而致死，同时伴有血管壁坏死而至多脏器病损。SARS相关冠状病毒感染靶细胞的分子机制是阐明SARS病变机制的中心环节。
发明人在解读和对比了六个SARS相关冠状病毒株的基因组(包括1个广东株，3个北京株，1个香港Tor株，加拿大株和Urbani株)，并用这些病毒株基因组与已知的冠状病毒的传染性支气管炎病毒、人呼吸道冠状病毒、猪、犬、猫、兔、鼠、牛、火鸡等动物的冠状病毒基因组作了对比。发现SARS相关冠状基因组中有两个致病基因具有人、猫免疫缺陷病毒(HIV和FIV)糖蛋白的同源序列，并具人免疫细胞等的表面七跨膜蛋白的主要结构域同源序列。
发明人通过计算机分子模拟技术显示，以上免疫缺陷病毒同源序列和人细胞表面跨膜蛋白同源序列均为功能性区域。很可能此为SASRS相关冠状病毒急性破坏人体免疫系统的分子机制。
本发明通过探索性试验发现，所述vMIP及其同类的E蛋白配体，具体包括病毒趋化因子vMIP、或vMIP的衍生物、或其它配体蛋白样因子可与SARS冠状病毒E蛋白基因编码假的受体相结合，具有防治SARS相关冠状病毒感染病变的作用。SARS冠状病毒所编码的类似于人七跨膜受体的假受体具有掠夺人细胞膜受体功能作用，可与有关的配体样因子结合，使某些配体样分子具有阻止SARS冠状病毒感染的作用。能与E蛋白结合的因子包括vMIP-I、II、III和其衍生物以及其它配体样分子。
本发明具有以下突出优点1、为制备预防与治疗SARS相关病毒感染的疾病的药物开辟了一条新途径。
2、实现本发明前景好，可以用基因工程方法和化学合成等方法得到纯的vMIP-I和vMIP-II蛋白，或通过诱变等方法制得它们的突变体以提高药用效果，这些基因工程等生物技术难度不大，根据目前技术水平在制药工业上能够工业化生产。
具体实施例方式通过如下实施例对本发明作进一步的描述。
实验证明E蛋白的基因表达产物具有结合七跨膜受体的配体vMIP的作用。
从以下试验过程的资料中得到结果1，应用计算机软件分析显示E蛋白与人七跨膜受体的同源性为E蛋白MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPTVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLVE蛋白19 LFLAFVV-FLL-VT---LAILTAL---RL 39
LFLAF+V +LL V+ L ILT L RL7跨膜受体148 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVLVDIRL 76(gi 21928315，人11号染色体)7跨膜受体252 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVLVDIRL 80(gi 20558770)7跨膜受体348 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVLVDIRL 76(gi 20884785)E蛋白 19 LFLAFVV-FLL-VT--LAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKP 54LFLAF+V +LL V+ L ILT L V+V L +P7跨膜受体427 LFLAFLVIYLLTVSGNGLIILTVL------VDVRLHRP 58(gi 27661057)E蛋白17 VLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLV 52VLLF V+FL+V L IL+ NIV V L+7跨膜受体525 VLLF---VIFLIVYLLILSG-------NIVIVILI 49(gi 27702941)E蛋白 21 LAFV-VFLLVTLA-ILTALRLCAYCC 44L F+ VF VTLA I+TA+ LC Y C7跨膜受体6101 LGFILVF-VTLALCIVTAIWLCFYSC 125 (gi 17535187，第二跨膜区)E蛋白全长氨基酸序列和主要相似性对比2、化学合成全长E蛋白，经鉴定HPLC纯度为100％，氨基酸测序为正确序列。
3、从一淋巴瘤细胞株BCBL(证实有HHV8病毒，而无EB病毒感染)基因组DNA中扩增出全长vMIP-I、vMIP-II或vMIP-III基因片断。
4、T/A法将vMIP-I、vMIP-II或vMIP-III基因片段克隆于扩增载体pUC19质粒。酶切纯化后的片段用ABI377测序仪自动测序。
5、将vMIP-I、vMIP-II或vMIP-III基因片段亚克隆于原核表达载体pET30得到pET-vMIP-I、pET-vMIP-II和pET-vMIP-III表达载体。
6、转化大肠杆菌DH5a，IPTG诱导，重组蛋白鉴定与纯化，得纯度为95％以上的重组蛋白。
7、配体-受体结合实验用E蛋白分别与重组的vMIP-I、II、III蛋白在体外进行铰链实验，用2.5mM的DSS为交联剂，然后将交联的和未交联的E、vMIP蛋白进行电泳，观察各蛋白的迁移距离。结果显示，E蛋白和三个vMIP蛋白分子均可发生铰链结合，其电泳迁移位置在各单一蛋白的加样孔侧。
8、vMIP的毒性试验用重组的vMIP按0.5mg/kg小鼠腹腔注射，连续14天，以及0.5mg/kg食蟹猴静脉注射，均未发现明显异常反应和脏器损伤性病变。说明vMIP未见明显毒副作用。
以上实验初步证明，重组的vMIP-I、II和vMIP-III均可以结合SARS冠状病毒的E蛋白，与其理论的同源性分析相一致。这种E蛋白与其配体样蛋白的结合可抑制SARS冠状病毒与其靶细胞的结合，阻止病毒感染入靶细胞对SARS冠状病毒感染性疾病具有预防和治疗的作用。而且vMIP具有体内应用安全的特性，所以可用于制备防治SARS冠状病毒感染的药物。
权利要求
1.vMIP在制药中的应用，其特征在于至少包括以HHV8的vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III为主要活性部位在制备防治SARS冠状病毒的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的vMIP在制药中的应用，其特征在于所述的HHV8的vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III有如下核苷酸序列和氨基酸序列的vMIP-I、vMIP-II、vMIP-III活性生物分子在制备防治SARS冠状病毒的药物中的应用vMIP-I核苷酸序列，长度为288bp1 atggcccccg tccacgtttt atgctgcgtt agcgtactgc ttgccacgtt ttacctgacg61 cccacagaaa gcgcggggtc actcgtgtcg tacacgccta atagctgctg ctacgggttc121 cagcagcacc caccgcccgt ccaaattcta aaagagtggt atcccacgtc cccagcgtgc181 ccaaaacccg gagttatttt gctgaccaag cgagggcgtc agatctgcgc agacccttcc241 aaaaactggg ttaggcagct gatgcagcgg ctgcctgcca tagcttagvMIP-I的氨基酸序列(95个氨基酸)MAPVHVLCCVSVLLATFYLTPTESAGSLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPACPKPGVILLTKRGRQICADPSKNWVRQLMQRLPAIAvMIP-II核苷酸序列，长度为285bp1 atggacacca agggcatcct gctcgtcgct gtgctgactg ccttgctttg tttgcaatct61 ggggacacgc tgggagcgtc ctggcataga ccggacaagt gctgtctcgg ttaccagaaa121 agaccattac cacaggtgct tctgtccagc tggtacccca cctcccaact gtgcagcaag181 ccgggtgtga tatttttgac aaagcgtggt cgccaggtgt gtgccgacaa atcgaaagac241 tgggtgaaga agctgatgca gcaattacca gtcactgctc gctgavMIP-II氨基酸序列(94个氨基酸)MDTKGILLVAVLTALLCLQSGDTLGASWHRPDKCCLGYQKRPLPQVLLSSWYPTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTARvMIP-III核苷酸序列，长度为345bpatgtggagca tgtgctgggt gttgcgcgc acatttggg gctgctcttc tgggtggccgtgattgagct atgtgcggcc agcggtcctg ccaccatcat ggcctcggat tgttgcgagaattccctgtc cagtgccaga ttgccaccgg ataagctgat atgcgggtgg tactggacgtccaccgtgta ttgtcgccag aaggcagtca tttttgtaac gcactcgggg cggaaagtatgcgggtcgcc tgcgaagcgg cgcacgcgtc ttctgatgga gaagcacacg gagatacctctcgcgaagcg cgtagcgctt cgcgccggta aagggttatg cccctagvMIP-III氨基酸序列(115个氨基酸)MWSMCWVLRAHLGLLFWVAVIELCAASGPATIMASDCCENSLSSARLPPDKLICGWYWTSTVYCRQKAVIFVTHSGRKVCGSPAKRRTRLLMEKHTEIPLAKRVALRAGKGLCPZ
3.vMIP的衍生物在制药中的应用，其特征在于以HHV8的vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III为主要活性部位的衍生物在制备防治SARS冠状病毒药物中的应用，所述衍生物是以vMIP-I、vMIP-II、或vMIP-III为主要活性部位的具有结合细胞膜受体样作用的加长或截断型的核酸序列、氨基酸多肽或蛋白质分子。
4.vMIP的其它配体蛋白样因子在制药中的应用，其特征在于vMIP的其它配体蛋白样因子作为E蛋白的配体蛋白样因子在制备防治SARS冠状病毒的药物中的应用，所述vMIP的其它配体蛋白样因子是以七跨膜受体—配体样作用机制对E蛋白有结合作用的核酸序列、氨基酸多肽或蛋白质分子。
全文摘要
本发明涉及HHV8的病毒趋化因子vMIP和其衍生物以及其它配体蛋白样因子在制药领域中的新用途，尤其涉及在防治人类SARS(严重急性呼吸道综合症)的相关冠状病毒感染的药物中的应用。本发明用重组的HHV8的vMIP－I、vMIP－II和vMIP－III可结合SARS冠状病毒的E蛋白具有阻止此病毒感染靶细胞的过程，在体外对SARS冠状病毒感染猴胚肾细胞Vero E6具有明显降低细胞感染率作用，用分子模拟显示其作用机制是与人细胞膜七跨膜受体同源的病毒E蛋白受体相结合而阻断了病毒感染靶细胞过程，这使有效控制人类SARS疾病成为可能。
文档编号A61P31/14GK1470284SQ0312695
公开日2004年1月28日 申请日期2003年6月24日 优先权日2003年6月24日
发明者孙晗笑, 利奕成, 刘俊云, 乔英飒 申请人:暨南大学
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