分蘖葱头提出物及其应用的制作方法
专利名称：分蘖葱头提出物及其应用的制作方法
发明的所属领域本发明涉及百合科葱属植物分蘖葱头，特别是涉及分蘖葱头的非挥发性提出物、其制备方法及所说的提出物在生产用于减轻体重、调解血脂、抗血小板聚集和抗动脉硬化的药物中的应用。
发明的背景在中国，使用植物衍生的组合物(提出物)作为治疗剂已有数千年的历史。近几十年来，随着生物化学和药理学技术的不断进步以及中国传统医药现代化的深入与推广，人们已有可能从各种天然植物材料分离得到不同的化学物质，并在进一步研究所得物质的生理学和药理学活性的基础上，最终筛选出可用于预防和/或治疗疾病的药物，进而实现相关植物(天然药物资源)和由之衍生的提出物或单体成分的大规模工业化生产。
分蘖葱头(Allium cepa L. var.agrogatum Don.)是一种产于中国的东北地区的百合科葱属单子叶草本植物。在以前，民间只是将这种植物作为蔬菜食用并偶有小面积种植。
对分蘖葱头的研究只有不到二十年的时间。1984年，江漫涛等人首先从该植物中分离得到了15种挥发性成分并鉴定了8种具有血小板聚集和血栓素A2合成抑制活性的硫化物。在体外实验中证实，其中的甲基烯丙基三硫(MATS)对血小板花生四烯酸代谢具有干扰作用(江漫涛等，白求恩医科大学学报，10609，1984)。继后，孙启良等人又从分蘖葱头中分离出了具有血压降低活性的前列腺素A1单体(孙启良等，中草药，192，1988)。
上述这些和其他相关研究表明，与已进行了较充分研究的其他葱属植物一样，分蘖葱头可能也含有广泛的活性物质并同样具有较大的药用价值。为此，本发明人基于以前多年从事分蘖葱头研究的经验，利用活性追踪方法进一步分离并筛选出了分蘖葱头的多种非挥发性提出物，并成功地制备了以分蘖葱头的非挥发性提出物为基本活性成分的用于预防和治疗高脂血症和肥胖症，并具有抗动脉硬化和高血压作用的药物组合物，从而完成了本发明。
发明的目的本发明的一个目的是提供基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物的分蘖葱头的非挥发性提出物。
根据本发明提取物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头是分蘖葱头植物的鳞茎。
根据本发明提取物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头是分蘖葱头全株植物。
根据本发明提取物的一个优选实施方案，其中所说的黄酮类化合物选自槲皮素、山柰酚、槲皮素-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3，4′-二氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3′-甲氧基-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。
根据本发明提出物的一个优选实施方案，其中所说的甾体化合物选自(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、胡萝卜苷、β-谷甾醇。
根据本发明提出物的一个优选实施方案，其中所说的含氮化合物选自N-(2-(4-羟基苯基)乙基)-3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酰胺、1，6-己内酰胺。
本发明的另一个目的是提供制备分蘖葱头的非挥发性提出物的方法，该方法包括首先用乙醇浸渍或回流提取预处理的分蘖葱头全株植物和/或其鳞茎，或者直接用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液。收集浸泡液并回收乙醇后将残留物过吸附树脂层析柱，然后用乙醇洗脱得到基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成的分蘖葱头的非挥发性提出物。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的吸附树脂层析柱选自大孔吸附树脂、聚酰胺或聚丙烯酰胺树脂、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中用于洗脱的乙醇是20-95％的乙醇水溶液。
本发明的再一个目的是提供如上制备的分蘖葱头的非挥发性提出物在生产降低体重和调解血脂、抗血小板聚集，以及抗动脉硬化和高血压的药物中的应用。
根据本发明所说的应用的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头的非挥发性提出物基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物。
本发明的再一个目的是提供基本上由如上制备的分蘖葱头的非挥发性提取物以及一种或多种医药上可接受的载体或稀释剂组成的药物组合物。
根据本发明药物组合物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头的非挥发性提出物包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物。
本发明的再一个目的是提供分蘖葱头的粗提物作为添加剂在生产功能性食品或其他健康相关产品中的应用。
发明的详细描述本发明涉及百合科葱属植物分蘖葱头，特别是涉及分蘖葱头的非挥发性提出物，其制备方法及所说的提出物在生产降低体重和调解血脂、抗血小板聚集，以及抗动脉硬化和高血压的药物中的应用。
百合科葱属植物大多是具有调味剂功能的可食蔬菜。目前在中国发现的葱属植物品种大约有110多个。葱属植物的成分丰富而且具有广泛的生物学功能。例如与以洋葱为代表的葱属植物的药学性质有关的主要成分多达100多种，并且已知葱属植物的生物学活性包括但不只限于免疫调节活性、免疫刺激活性、抗病毒活性、抗细菌和抗真菌活性、血小板聚集抑制活性，以及降低血脂和降低血压活性等。葱属植物的这些生物学和药学性质为将葱属植物的有效成分提取物开发成临床可应用的药物提供了依据(参见美国专利6,340,483号)。
然而，对于百合科葱属植物的一个新近被发现的种——分蘖葱头，目前尚缺乏深入的研究与开发。在本发明之前，虽然以本发明人所在实验室为代表的课题组已分离并鉴定了分蘖葱头的某些成分，但对这些和其他成分或“有效部位”的生物学和药理学活性却缺乏足够的了解，特别是迄今完全没有将分蘖葱头的“有效部位”开发成一种可供临床应用的药物或功能性食品。
因此，本发明的一个目的是提供基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物的分蘖葱头的非挥发性提出物。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的黄酮类化合物包括但不只限于槲皮素、山柰酚、槲皮素-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3，4′-二氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3′-甲氧基-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；其中所说的甾体化合物包括但不只限于(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25 S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、胡萝卜苷、β-谷甾醇；并且其中所说的含氮化合物包括但不只限于N-(2-(4-羟基苯基)乙基)-3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酰胺、1，6-己内酰胺。
当然，本发明的提取物中除含有上述这些成分外，还可含有其他一些与提取物的药理学价值有关的成分，例如糖类化合物、其他糖苷化合物、含氧或硫化合物、有机酸或无机酸、脂质化合物、金属(例如硒和铁等)和非金属离子，以及果胶、蒜素和蒜苷等。然而，从它们在提取物中所占的比例看，这些化合物基本上可以忽略不计。
本发明的另一个目的是提供制备分蘖葱头的非挥发性提出物的方法，该方法包括首先用乙醇浸渍或回流提取预先清洗的分蘖葱头植物和/或其鳞茎，或者直接用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液。收集浸提液并回收乙醇后将残留物过吸附树脂层析柱，然后用乙醇洗脱即得到基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成的分蘖葱头的非挥发性提出物。
更具体地说，为了制备分蘖葱头非挥发性成分的提取物，首先用乙醇冷浸渍或加热回流提取预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎并过滤收集滤液。在使用乙醇冷浸渍的情况下，一般浸渍的时间为大约1-3天。而在使用乙醇加热回流提取的情况下，则只需要大约0.5-5小时的时间即可。回收乙醇后将此残留物过吸附树脂层析柱，例如大孔吸附树脂柱和/或聚酰胺树脂柱和/或聚丙烯酰胺树脂柱、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。样品上柱后，预先用去离子水洗柱直到流出液颜色变浅。然后在以薄层层析方法或紫外检测方法或高效液相色谱法监测洗脱液中的总黄酮大致含量的情况下，以大约0.1-5ml/分钟的流速使用20-95％乙醇洗脱，直至洗脱液中的总黄酮大致含量接近零为止。收集洗脱液并回收乙醇后即得到所需的提取物。
或者也可以首先用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液。然后将浸泡液直接过吸附树脂层析柱，例如大孔吸附树脂柱和/或聚酰胺树脂柱和/或聚丙烯酰胺树脂柱、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。样品上柱后，预先用去离子水洗柱直到流出液颜色变浅。然后在以薄层层析方法或紫外检测方法或高效液相色谱法监测洗脱液中的总黄酮大致含量的情况下，以大约0.1-5ml/分钟的流速使用20-95％乙醇洗脱，直至洗脱液中的总黄酮大致含量接近零为止。收集洗脱液并回收乙醇后即得到所需的提取物。
根据本发明方法的优选实施方案，其中所说的乙醇浸渍和水浸渍步骤均可以在超声波作用下完成。
根据本发明方法的另一个优选实施方案，其中所说的吸附树脂层析柱可以是大孔吸附树脂、聚酰胺树脂和聚丙烯酰胺树脂柱、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。
为了证实本发明提取物的药用价值和作为药物成分使用的可行性，我们进一步使用实验性营养性肥胖及高脂血症动物模型(大鼠)，观察了如上制备的分蘖葱头的非挥发性提出物的生物学活性。我们的实验结果强有力地表明，本发明的提出物可显著地降低两种模型动物的血脂水平并可使动物的体重明显减轻。例如，与模型对照组相比，实验治疗组动物的血清甘油三酯和胆固醇水平表现有明显的降低趋势。另外，与对照组相比，在观察期间内接受本发明的提取物的实验治疗组动物的平均体重显著降低，并且这些动物的肝重量系数也显示有降低趋势。
因此，基于我们的初步观察结果，推测很有可能使用本发明的提取物作为基本活性成分，制备用于降低体重、调解血脂、抗血小板聚集，以及抗动脉硬化和高血压的的药物。
本发明的再一个目的是提供一种基本上由如上制备的分蘖葱头的非挥发性提取物以及一种或多种医药上可接受的载体或稀释剂组成的药物组合物。
根据本发明药物组合物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头的非挥发性提取物包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物。
根据本发明药物组合物的另一个优选实施方案，所说的药物组合物还可含有一种或多种其他具有相同或辅助作用的天然或化学药物成分。例如所说的成分包括但不只限于人参、丹参、葛根、川芎、红花、山楂及水蛭等的有效部位和提取物，考来烯胺、安妥明、吉非贝特、洛伐他汀、苯扎贝特等化学合成的降血脂药物，以及羟基柠檬酸、L-肉碱、丙酮酸等促进脂肪酸氧化的药物。
本发明的药物组合物不仅可用于预防和治疗包括高胆固醇血症、高甘油三脂血症在内的高脂血症，而且还可用于预防和治疗某些与血脂异常升高相关的其他疾病。这些疾病包括但不仅限于肥胖症、动脉硬化、高血压病、冠心病、脂肪肝及糖尿病等。
另一方面，也可以使用分蘖葱头的粗提物，即分蘖葱头的乙醇和/或水的浸提物作为添加剂，用于生产各种功能性食品或其他健康相关产品。
可能按照制药工业中已知的方法将本发明的药物组合物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂以及溶液剂和悬浮剂。其中优选的是适于经胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适于口服给药的胶囊剂、片剂、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素等作为载体或赋形剂。
另外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本发明的药物组合物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或稀释剂。
可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型的制剂中，还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。
一般说来，本发明药物组合物的口服给药剂量为0.01至100mg/kg体重/天，较好为0.1至50mg/kg体重/天，最好为1至10mg/kg体重/天。然而，更确切的用药剂量应根据待治疗的疾病或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重、待治疗病人对所用药物的敏感性及给药方式等因素由临床医生确定。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围内。
实施例实施例1分蘖葱头非挥发性成分提出物的制备本实施举例描述制备本发明的分蘖葱头非挥发性成分提出物的方法。
用水将5kg新鲜分蘖葱头反复清洗3次并简单切碎后，向其中加入乙醇500ml。然后将此混合物在常温下放置72小时。浸提后，常规过滤并收集所得到的冷浸提液。于减压下蒸发回收乙醇直到浸提液几乎没有乙醇的气味为止。然后将残留物上大孔树脂柱，用蒸馏水将柱洗至流出液的颜色变浅后用70％乙醇洗脱(流速3ml/分钟)，同时以薄层层析法监测洗脱物中总黄酮的大致含量。待洗出液不再含有黄酮后即停止洗脱。收集洗脱液并回收乙醇后，干燥残留物得到200g淡黄色粉末。
使用标准品作为对照，以薄层层析法和紫外检测方法或高效液相色谱法对所得到的提取物进行定性和定量检测。结果表明，如上得到的提取物基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成，并且纯度至少50％。
实施例2本发明的分蘖葱头提取物对营养性肥胖模型大鼠的减肥作用将筛选合格的72只大鼠随机分成6组正常对照组、肥胖模型组、分蘖葱头提取物(小、中、大剂量)组及阳性对照组，每组12只。除正常对照组动物接受普通饲料外，其他各组动物均接受高脂高热量饲料(每100g基础饲料加入奶粉10g、猪油10g、鸡蛋1个、白糖8g)。喂养期间各组大鼠均自由饮水、饮食，每日供给饲料2次，45d后形成营养性肥胖模型。
之后，所有动物均恢复进食普通饲料并开始按如下方案给药分蘖葱头提取物小、中、大剂量组大鼠每天灌胃投用本发明的分蘖葱头提取物(25、50、100mg/kg)；阳性对照组灌饲已知的减肥降脂药物血康脂100mg/kg；正常对照组及肥胖模型组均灌胃投用等体积的蒸馏水。连续给药15天。第16天，测量各组大鼠体重，以3％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，分离血清并测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)及低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-c)含量。实验数据以均数±标准差(X±S)表示，采用两组比较t检验进行统计分析。结果如下列表1所示。
表1分蘖葱头提出物对营养性肥胖大鼠血脂的影响(X±S，n＝10)组别TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-c(mmol/L) LDL-c(mmol/L)正常对照组 1.08±0.52* 0.78±0.29* 0.43±0.07 0.77±0.23肥胖模型组 1.56±0.401.18±0.370.33±0.10 0.84±0.36分蘖葱头提出物25mg/kg 1.49±0.681.02±0.460.38±0.08 0.83±0.2750mg/kg 1.12±0.41* 0.95±0.580.36±0.11 0.80±0.31100mg/kg1.10±0.32* 0.81±0.23* 0.39±0.07 0.80±0.28阳性对照组100mg/kg1.17±0.670.93±0.490.35±0.05 0.79±0.34与肥胖模型组比较*p＜0.05由表1所示的结果可以看出，连续投用本发明的分蘖葱头提取物15天后，肥胖模型组动物的血清TC及TG较正常对照组明显升高(p＜0.05)，而HDL-c及LDL-c无明显变化(p＞0.05)。与肥胖模型组相比，分蘖葱头提取物大剂量组动物血清TC及TG均明显降低(p＜0.05)，中剂量组血清TC明显降低(p＜0.05)，并且血清TG亦有下降趋势。
实验结束后处死动物，分离各组动物的肾后及生殖器周围脂肪，并比较这些脂肪组织的重量。结果如下列表2所示。
表2分蘖葱头提出物对营养性肥胖大鼠组织脂肪重量的影响(g，X±S，n＝10)组别肾后 生殖器周 肾后脂 生殖器脂脂肪 围脂肪肪/体重 肪/体重正常对照组 3.10±1.08** 2.12±0.89** 0.013±0.008** 0.009±0.004**肥胖模型组 6.79±2.834.69±1.750.025±0.0090.017±0.005分蘖葱头提出物25mg/kg 4.53±1.53* 3.71±1.150.021±0.0120.014±0.00750mg/kg 4.52±1.64* 3.17±0.87* 0.017±0.006* 0.012±0.006*100mg/kg4.01±1.07** 2.96±0.69* 0.015±0.008* 0.011±0.003**阳性对照组100mg/kg4.70±1.12* 3.34±0.980.019±0.0070.012±0.003*与肥胖模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表2所示的结果可以看出，肥胖模型组动物的肾后脂肪、生殖器周围脂肪、肾后脂肪/体重及生殖器脂肪/体重比例均较正常对照组明显增高(P＜0.01)。与肥胖模型组相比，投用分蘖葱头提取物的中和大剂量组动物的上述四项指标均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，并且小剂量组动物的生殖器脂肪/体重、肾后脂肪及肾后脂肪/体重均有减少趋势。
本研究进一步观察并记录了分蘖葱头提取物对营养性肥胖大鼠体重及肝重量系数的影响，结果如下列表3所示。
表3分蘖葱头提取物对营养性肥胖大鼠体重及肝重系数的影响(X±S，n＝10)组 别 肝重量系数 动物体重(克肝重/100g体重) (g)正常对照组 3.774±0.805251±7.3***肥胖模型组 3.491±0.966310±8.7分蘖葱头提取物25mg/kg 3.574±0.704298±9.4**50mg/kg 3.672±0.564292±8.9***100mg/kg3.721±0.625281±9.3***阳性对照组100mg/kg3.623±0.816301±7.6*与肥胖模型组比较*p＜0.05由表3所示的结果可以看出，肥胖模型组动物的体重较正常对照组明显增加(p＜0.001)，并且肝重量系数有降低趋势(p＞0.05)。投用分蘖葱头提取物的小、中、大剂量组动物的体重较肥胖模型组明显降低(p＜0.01或p＜0.001)，肝重量系数则有增加趋势。
实施例3本发明的分蘖葱头提取物对实验性高脂血症模型大鼠的血脂调节作用取Wistar大鼠72只，随机分为6组，每组12只。正常对照组喂普通饲料，给生理盐水2ml/kg；高脂对照组喂高脂饲料，给生理盐水2ml/kg；阳性对照组喂高脂饲料并灌服洛伐他汀20mg/kg；分蘖葱头提取物小、中、大剂量组喂高脂饲料，分别灌服分蘖葱头提取物25、50、100mg/kg。高脂饮食组在给药前一天开始，每晚傍晚给予高脂饲料(配方2％胆固醇、0.2％丙基硫氧嘧啶、0.3％胆酸钠、7.5％猪油、90％普通饲料)，每只鼠平均20g，白天补充普通饲料，共15天。
各组动物均于上午灌胃投用上述饲料或药物，连续15天。于给药最后1天晚间禁食，不禁水。次日上午用3％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉动物，自腹主动脉采血3ml，分离血清并按试剂盒(由南京建成生物工程研究所提供)说明书所述方法测定甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、过氧化脂质(LPO)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。另采血4ml，以1％肝素抗凝，其中1ml加入LBY-N6A自清洗旋转式粘度计测定全血低切(10/s)、中切(40/s)、高切(120/s)粘度。其余3ml血以3000转/min离心10min，取上层血浆用放免法(试剂盒由中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所提供)测血浆6-酮-前列腺素F1α(PGI2)及血栓素B2(TXA2)。取1/2肝脏置10％甲醛液中固定以行脂肪染色，观察脂肪沉积情况。另1/2肝脏待测LPO及SOD。结果分别如下列表4-8所示。
表4分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血脂代谢的影响(X±S，n＝10)组别 TG(mmol/L)TC(mmol/L) LDL-c(mmol/L)正常对照组 0.62±0.27* 1.78±0.86***4.54±1.84*高脂对照组 1.07±0.457.70±2.38 7.21±2.34分蘖葱头提出物25mg/kg 0.93±0.186.85±2.02 6.34±2.0350mg/kg 0.67±0.31* 4.97±1.87** 5.81±1.23*100mg/kg 0.56±0.15** 4.08±1.01***4.69±1.12**洛伐他汀20mg/k 0.66±0.28* 4.98±1.20** 4.57±1.03**与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001表5分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血脂代谢的影响(X±S，n＝10)组别 HDL-c(mmol/L) TC/HDL-c(mmol/L) LDL-c/HDL-c(mmol/L)正常对照组 1.04±0.37* 1.71±0.56***4.37±1.41***高脂对照组 0.72±0.2410.69±3.68 10.01±3.82分蘖葱头提出物25mg/kg 0.83±0.278.25±1.28 7.64±2.0150mg/kg 0.99±0.16* 7.42±1.16** 5.87±1.86**100mg/kg 1.01±0.17** 7.28±1.29** 4.64±1.95***洛伐他汀20mg/kg 0.84±0.127.55±1.62* 5.44±2.08**与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由表4和5所示的数据可以看出，高脂对照组动物的血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c及LDL-c/HDL-c均显著高于正常对照组动物(P＜0.05或P＜0.001)，而HDL-c则显著降于正常对照组(P＜0.05)，表明高脂模型复制成功。与高脂对照组动物比较，动物口服大、中剂量蘖葱头提取物(50、100mg/kg)后血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c及LDL-c/HDL-c水平均明显降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，而血清HDL-c水平则明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。
表6分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血清及肝脏LPO及SOD的影响(X±S，n＝10)组别 血 清 肝 脏LPO(nmol/L) SOD(U/L) LPO(nmol/ml) SOD(nu/mg)正常对照组 7.06±1.14** 463.2±42.9* 5.60±1.05*9.26±0.91**高脂对照组 8.80±1.01404.4±55.8 6.98±1.30 7.61±1.39分蘖葱头提出物25mg/kg 8.53±0.47427.7±44.0 6.63±1.61 8.05±1.7850mg/kg 7.87±0.76* 452.8±35.8* 5.70±1.22*9.15±1.13*100mg/kg7.12±1.05** 457.8±51.4* 5.42±1.02** 9.18±1.25*洛伐他汀20mg/kg 7.10±1.07** 412.3±40.7 5.72±1.12*8.32±1.20与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表6所示的数据可以看出，与正常对照组比较，高脂对照组动物血清及肝脏LPO含量明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，而SOD活性明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，表明高脂血症大鼠伴有自由基脂质过氧化损伤。与高脂对照组比较，动物口服大、中剂量分蘖葱头提取物(50、100mg/kg)可使高脂血症大鼠血清及肝脏LPO含量明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，而SOD活性则明显升高(P＜0.05)。
表7分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠全血粘度的影响(X±S，n＝10)组别全血粘度10/s 40/s 120/s正常对照组 11.35±1.21* 4.56±0.39*3.83±0.31*高脂对照组 13.32±2.305.06±0.26 4.34±0.53分蘖葱头提出物25mg/kg12.16±1.494.83±0.36 3.90±0.27*50mg/kg11.42±1.38* 4.98±0.73 3.79±0.58*100mg/kg 11.25±1.21* 4.69±0.47*3.73±0.32**洛伐他汀20mg/kg12.55±1.165.11±0.55 4.14±0.29与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表7所示的数据可以看出，正常对照组比较，高脂对照组动物的全血低切、中切及高切粘度均明显增加(P＜0.05)，表明高脂血症大鼠伴有血液流变学的改变。与高脂对照组比较，大剂量分蘖葱头提取物(100mg/kg)能明显降低全血低切、中切及高切粘度(P＜0.05或P＜0.01)，中剂量分蘖葱头提取物(50mg/kg)能明显降低全血低切及高切粘度(P＜0.05)，而小剂量分蘖葱头提取物(25mg/kg)仅能降低全血高切粘度(P＜0.05)。
表8分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血浆PGI2及TXA2水平的影响(X±S，n＝10)组别PGI2(pg/mL) TXA2(pg/mL) PGI2/TXA2正常对照组 407.3±117.6* 264.9±79.4*1.75±1.13*高脂对照组 280.9±88.5433.7±176.70.73±0.32分蘖葱头提出物25mg/kg 311.3±78.4364.5±91.3 0.85±0.4150mg/kg 364.6±88.1* 276.3±95.6*1.43±0.48**100mg/kg383.8±76.6* 265.2±53.0** 1.52±0.78**洛伐他汀20mg/kg 315.2±58.2271.5±63.9*1.16±0.45*与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表8所示的数据可以看出，与正常对照组比较，高脂对照组动物的血浆TXA2水平明显增加(P＜0.05)，并且PGI2水平及PGI2/TXA2比值均明显降低(P＜0.05)，表明高脂模型可产生TXA2与PGI2之间的平衡失调。与高脂对照组比较，口服大、中剂量分蘖葱头提取物(50、100mg/kg)后动物的血浆PGI2水平明显增加，并且PGI2/TXA2比值亦明显提高(P＜0.05或P＜0.01)，而血浆TXA2水平则降低。
最后，本发明人使用组织学方法观察了分蘖葱头提取物对高脂血症大鼠肝组织脂肪沉积的影响。
各组织肝脏标本固定切片后行脂肪染色，观察肝组织脂肪沉积情况。结果可见，正常对照组10只动物的肝细胞均未见脂肪变性(0/10)；高脂对照组10只动物的肝细胞均可见脂肪变性(10/10)，而服用大、中和小分蘖葱头提取物的各组动物及服用洛伐他汀组动物的肝细胞脂肪变性分别为6/10、4/10、3/10、4/10，且脂肪空泡明显减少。经X2检验，分蘖葱头提取物三个剂量组及洛伐他汀组与高脂对照组比较差异显著(p＜0.05或p＜0.01)，表明分蘖葱头提取物可明显抑制高脂血症大鼠肝脏脂肪的沉积。
权利要求
1.基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物的分蘖葱头的非挥发性成分提出物。
2.根据权利要求1的提取物，其中所说的分蘖葱头是分蘖葱头植物或其鳞茎。
3.根据权利要求1的提取物，其中所说的黄酮类化合物选自槲皮素、山柰酚、槲皮素-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3，4′-二氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3′-甲氧基-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。
4.根据权利要求1的提取物，其中所说的甾体化合物选自(25R)-Ruscogenin1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、胡萝卜苷、β-谷甾醇。
5.根据权利要求1的提取物，其中所说的含氮化合物选自N-〔2-(4-羟基苯基)乙基〕-3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酰胺、1，6-己内酰胺。
6.制备分蘖葱头的非挥发性成分提出物的方法，该方法包括首先用乙醇浸渍或回流提取预处理的分蘖葱头全株植物和/或其鳞茎，或者直接用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液，回收乙醇后将残留物过吸附树脂层析柱，然后用乙醇洗脱得到基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成的分蘖葱头的非挥发性提出物。
7.根据权利要求6的方法，其中所说的吸附树脂层析柱选自大孔吸附树脂、聚酰胺或聚丙烯酰胺树脂、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。
8.根据本发明方法的一个优选实施方案，其中用于洗脱的乙醇是20-95％的乙醇水溶液。
9.根据权利要求1的提出物在生产用于减轻体重、调解血脂、抗血小板聚集和抗动脉硬化的药物中的应用。
10.分蘖葱头的粗提物作为添加剂在生产功能性食品或其他健康相关产品中的应用。
全文摘要
本发明涉及百合科葱属植物分蘖葱头，特别是涉及分蘖葱头的非挥发性提取物、其制备方法及所说的提取物在生产用于减轻体重、调节血脂、抗血小板凝集和抗动脉硬化的药物中的应用。
文档编号A61P3/04GK1548051SQ0312703
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月19日 优先权日2003年5月19日
发明者杨晓虹, 睢大员, 刘银燕, 周小平, 张沐新, 陈滴, 刘丽娟, 于小风, 曲绍春 申请人:杨晓虹
发明的所属领域本发明涉及百合科葱属植物分蘖葱头，特别是涉及分蘖葱头的非挥发性提出物、其制备方法及所说的提出物在生产用于减轻体重、调解血脂、抗血小板聚集和抗动脉硬化的药物中的应用。
发明的背景在中国，使用植物衍生的组合物(提出物)作为治疗剂已有数千年的历史。近几十年来，随着生物化学和药理学技术的不断进步以及中国传统医药现代化的深入与推广，人们已有可能从各种天然植物材料分离得到不同的化学物质，并在进一步研究所得物质的生理学和药理学活性的基础上，最终筛选出可用于预防和/或治疗疾病的药物，进而实现相关植物(天然药物资源)和由之衍生的提出物或单体成分的大规模工业化生产。
分蘖葱头(Allium cepa L. var.agrogatum Don.)是一种产于中国的东北地区的百合科葱属单子叶草本植物。在以前，民间只是将这种植物作为蔬菜食用并偶有小面积种植。
对分蘖葱头的研究只有不到二十年的时间。1984年，江漫涛等人首先从该植物中分离得到了15种挥发性成分并鉴定了8种具有血小板聚集和血栓素A2合成抑制活性的硫化物。在体外实验中证实，其中的甲基烯丙基三硫(MATS)对血小板花生四烯酸代谢具有干扰作用(江漫涛等，白求恩医科大学学报，10609，1984)。继后，孙启良等人又从分蘖葱头中分离出了具有血压降低活性的前列腺素A1单体(孙启良等，中草药，192，1988)。
上述这些和其他相关研究表明，与已进行了较充分研究的其他葱属植物一样，分蘖葱头可能也含有广泛的活性物质并同样具有较大的药用价值。为此，本发明人基于以前多年从事分蘖葱头研究的经验，利用活性追踪方法进一步分离并筛选出了分蘖葱头的多种非挥发性提出物，并成功地制备了以分蘖葱头的非挥发性提出物为基本活性成分的用于预防和治疗高脂血症和肥胖症，并具有抗动脉硬化和高血压作用的药物组合物，从而完成了本发明。
发明的目的本发明的一个目的是提供基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物的分蘖葱头的非挥发性提出物。
根据本发明提取物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头是分蘖葱头植物的鳞茎。
根据本发明提取物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头是分蘖葱头全株植物。
根据本发明提取物的一个优选实施方案，其中所说的黄酮类化合物选自槲皮素、山柰酚、槲皮素-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3，4′-二氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3′-甲氧基-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。
根据本发明提出物的一个优选实施方案，其中所说的甾体化合物选自(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、胡萝卜苷、β-谷甾醇。
根据本发明提出物的一个优选实施方案，其中所说的含氮化合物选自N-(2-(4-羟基苯基)乙基)-3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酰胺、1，6-己内酰胺。
本发明的另一个目的是提供制备分蘖葱头的非挥发性提出物的方法，该方法包括首先用乙醇浸渍或回流提取预处理的分蘖葱头全株植物和/或其鳞茎，或者直接用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液。收集浸泡液并回收乙醇后将残留物过吸附树脂层析柱，然后用乙醇洗脱得到基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成的分蘖葱头的非挥发性提出物。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的吸附树脂层析柱选自大孔吸附树脂、聚酰胺或聚丙烯酰胺树脂、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中用于洗脱的乙醇是20-95％的乙醇水溶液。
本发明的再一个目的是提供如上制备的分蘖葱头的非挥发性提出物在生产降低体重和调解血脂、抗血小板聚集，以及抗动脉硬化和高血压的药物中的应用。
根据本发明所说的应用的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头的非挥发性提出物基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物。
本发明的再一个目的是提供基本上由如上制备的分蘖葱头的非挥发性提取物以及一种或多种医药上可接受的载体或稀释剂组成的药物组合物。
根据本发明药物组合物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头的非挥发性提出物包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物。
本发明的再一个目的是提供分蘖葱头的粗提物作为添加剂在生产功能性食品或其他健康相关产品中的应用。
发明的详细描述本发明涉及百合科葱属植物分蘖葱头，特别是涉及分蘖葱头的非挥发性提出物，其制备方法及所说的提出物在生产降低体重和调解血脂、抗血小板聚集，以及抗动脉硬化和高血压的药物中的应用。
百合科葱属植物大多是具有调味剂功能的可食蔬菜。目前在中国发现的葱属植物品种大约有110多个。葱属植物的成分丰富而且具有广泛的生物学功能。例如与以洋葱为代表的葱属植物的药学性质有关的主要成分多达100多种，并且已知葱属植物的生物学活性包括但不只限于免疫调节活性、免疫刺激活性、抗病毒活性、抗细菌和抗真菌活性、血小板聚集抑制活性，以及降低血脂和降低血压活性等。葱属植物的这些生物学和药学性质为将葱属植物的有效成分提取物开发成临床可应用的药物提供了依据(参见美国专利6,340,483号)。
然而，对于百合科葱属植物的一个新近被发现的种——分蘖葱头，目前尚缺乏深入的研究与开发。在本发明之前，虽然以本发明人所在实验室为代表的课题组已分离并鉴定了分蘖葱头的某些成分，但对这些和其他成分或“有效部位”的生物学和药理学活性却缺乏足够的了解，特别是迄今完全没有将分蘖葱头的“有效部位”开发成一种可供临床应用的药物或功能性食品。
因此，本发明的一个目的是提供基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物的分蘖葱头的非挥发性提出物。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的黄酮类化合物包括但不只限于槲皮素、山柰酚、槲皮素-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3，4′-二氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3′-甲氧基-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；其中所说的甾体化合物包括但不只限于(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25 S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、胡萝卜苷、β-谷甾醇；并且其中所说的含氮化合物包括但不只限于N-(2-(4-羟基苯基)乙基)-3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酰胺、1，6-己内酰胺。
当然，本发明的提取物中除含有上述这些成分外，还可含有其他一些与提取物的药理学价值有关的成分，例如糖类化合物、其他糖苷化合物、含氧或硫化合物、有机酸或无机酸、脂质化合物、金属(例如硒和铁等)和非金属离子，以及果胶、蒜素和蒜苷等。然而，从它们在提取物中所占的比例看，这些化合物基本上可以忽略不计。
本发明的另一个目的是提供制备分蘖葱头的非挥发性提出物的方法，该方法包括首先用乙醇浸渍或回流提取预先清洗的分蘖葱头植物和/或其鳞茎，或者直接用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液。收集浸提液并回收乙醇后将残留物过吸附树脂层析柱，然后用乙醇洗脱即得到基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成的分蘖葱头的非挥发性提出物。
更具体地说，为了制备分蘖葱头非挥发性成分的提取物，首先用乙醇冷浸渍或加热回流提取预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎并过滤收集滤液。在使用乙醇冷浸渍的情况下，一般浸渍的时间为大约1-3天。而在使用乙醇加热回流提取的情况下，则只需要大约0.5-5小时的时间即可。回收乙醇后将此残留物过吸附树脂层析柱，例如大孔吸附树脂柱和/或聚酰胺树脂柱和/或聚丙烯酰胺树脂柱、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。样品上柱后，预先用去离子水洗柱直到流出液颜色变浅。然后在以薄层层析方法或紫外检测方法或高效液相色谱法监测洗脱液中的总黄酮大致含量的情况下，以大约0.1-5ml/分钟的流速使用20-95％乙醇洗脱，直至洗脱液中的总黄酮大致含量接近零为止。收集洗脱液并回收乙醇后即得到所需的提取物。
或者也可以首先用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液。然后将浸泡液直接过吸附树脂层析柱，例如大孔吸附树脂柱和/或聚酰胺树脂柱和/或聚丙烯酰胺树脂柱、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。样品上柱后，预先用去离子水洗柱直到流出液颜色变浅。然后在以薄层层析方法或紫外检测方法或高效液相色谱法监测洗脱液中的总黄酮大致含量的情况下，以大约0.1-5ml/分钟的流速使用20-95％乙醇洗脱，直至洗脱液中的总黄酮大致含量接近零为止。收集洗脱液并回收乙醇后即得到所需的提取物。
根据本发明方法的优选实施方案，其中所说的乙醇浸渍和水浸渍步骤均可以在超声波作用下完成。
根据本发明方法的另一个优选实施方案，其中所说的吸附树脂层析柱可以是大孔吸附树脂、聚酰胺树脂和聚丙烯酰胺树脂柱、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。
为了证实本发明提取物的药用价值和作为药物成分使用的可行性，我们进一步使用实验性营养性肥胖及高脂血症动物模型(大鼠)，观察了如上制备的分蘖葱头的非挥发性提出物的生物学活性。我们的实验结果强有力地表明，本发明的提出物可显著地降低两种模型动物的血脂水平并可使动物的体重明显减轻。例如，与模型对照组相比，实验治疗组动物的血清甘油三酯和胆固醇水平表现有明显的降低趋势。另外，与对照组相比，在观察期间内接受本发明的提取物的实验治疗组动物的平均体重显著降低，并且这些动物的肝重量系数也显示有降低趋势。
因此，基于我们的初步观察结果，推测很有可能使用本发明的提取物作为基本活性成分，制备用于降低体重、调解血脂、抗血小板聚集，以及抗动脉硬化和高血压的的药物。
本发明的再一个目的是提供一种基本上由如上制备的分蘖葱头的非挥发性提取物以及一种或多种医药上可接受的载体或稀释剂组成的药物组合物。
根据本发明药物组合物的一个优选实施方案，其中所说的分蘖葱头的非挥发性提取物包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物。
根据本发明药物组合物的另一个优选实施方案，所说的药物组合物还可含有一种或多种其他具有相同或辅助作用的天然或化学药物成分。例如所说的成分包括但不只限于人参、丹参、葛根、川芎、红花、山楂及水蛭等的有效部位和提取物，考来烯胺、安妥明、吉非贝特、洛伐他汀、苯扎贝特等化学合成的降血脂药物，以及羟基柠檬酸、L-肉碱、丙酮酸等促进脂肪酸氧化的药物。
本发明的药物组合物不仅可用于预防和治疗包括高胆固醇血症、高甘油三脂血症在内的高脂血症，而且还可用于预防和治疗某些与血脂异常升高相关的其他疾病。这些疾病包括但不仅限于肥胖症、动脉硬化、高血压病、冠心病、脂肪肝及糖尿病等。
另一方面，也可以使用分蘖葱头的粗提物，即分蘖葱头的乙醇和/或水的浸提物作为添加剂，用于生产各种功能性食品或其他健康相关产品。
可能按照制药工业中已知的方法将本发明的药物组合物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂以及溶液剂和悬浮剂。其中优选的是适于经胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适于口服给药的胶囊剂、片剂、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素等作为载体或赋形剂。
另外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本发明的药物组合物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或稀释剂。
可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型的制剂中，还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。
一般说来，本发明药物组合物的口服给药剂量为0.01至100mg/kg体重/天，较好为0.1至50mg/kg体重/天，最好为1至10mg/kg体重/天。然而，更确切的用药剂量应根据待治疗的疾病或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重、待治疗病人对所用药物的敏感性及给药方式等因素由临床医生确定。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围内。
实施例实施例1分蘖葱头非挥发性成分提出物的制备本实施举例描述制备本发明的分蘖葱头非挥发性成分提出物的方法。
用水将5kg新鲜分蘖葱头反复清洗3次并简单切碎后，向其中加入乙醇500ml。然后将此混合物在常温下放置72小时。浸提后，常规过滤并收集所得到的冷浸提液。于减压下蒸发回收乙醇直到浸提液几乎没有乙醇的气味为止。然后将残留物上大孔树脂柱，用蒸馏水将柱洗至流出液的颜色变浅后用70％乙醇洗脱(流速3ml/分钟)，同时以薄层层析法监测洗脱物中总黄酮的大致含量。待洗出液不再含有黄酮后即停止洗脱。收集洗脱液并回收乙醇后，干燥残留物得到200g淡黄色粉末。
使用标准品作为对照，以薄层层析法和紫外检测方法或高效液相色谱法对所得到的提取物进行定性和定量检测。结果表明，如上得到的提取物基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成，并且纯度至少50％。
实施例2本发明的分蘖葱头提取物对营养性肥胖模型大鼠的减肥作用将筛选合格的72只大鼠随机分成6组正常对照组、肥胖模型组、分蘖葱头提取物(小、中、大剂量)组及阳性对照组，每组12只。除正常对照组动物接受普通饲料外，其他各组动物均接受高脂高热量饲料(每100g基础饲料加入奶粉10g、猪油10g、鸡蛋1个、白糖8g)。喂养期间各组大鼠均自由饮水、饮食，每日供给饲料2次，45d后形成营养性肥胖模型。
之后，所有动物均恢复进食普通饲料并开始按如下方案给药分蘖葱头提取物小、中、大剂量组大鼠每天灌胃投用本发明的分蘖葱头提取物(25、50、100mg/kg)；阳性对照组灌饲已知的减肥降脂药物血康脂100mg/kg；正常对照组及肥胖模型组均灌胃投用等体积的蒸馏水。连续给药15天。第16天，测量各组大鼠体重，以3％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，分离血清并测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)及低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-c)含量。实验数据以均数±标准差(X±S)表示，采用两组比较t检验进行统计分析。结果如下列表1所示。
表1分蘖葱头提出物对营养性肥胖大鼠血脂的影响(X±S，n＝10)组别TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-c(mmol/L) LDL-c(mmol/L)正常对照组 1.08±0.52* 0.78±0.29* 0.43±0.07 0.77±0.23肥胖模型组 1.56±0.401.18±0.370.33±0.10 0.84±0.36分蘖葱头提出物25mg/kg 1.49±0.681.02±0.460.38±0.08 0.83±0.2750mg/kg 1.12±0.41* 0.95±0.580.36±0.11 0.80±0.31100mg/kg1.10±0.32* 0.81±0.23* 0.39±0.07 0.80±0.28阳性对照组100mg/kg1.17±0.670.93±0.490.35±0.05 0.79±0.34与肥胖模型组比较*p＜0.05由表1所示的结果可以看出，连续投用本发明的分蘖葱头提取物15天后，肥胖模型组动物的血清TC及TG较正常对照组明显升高(p＜0.05)，而HDL-c及LDL-c无明显变化(p＞0.05)。与肥胖模型组相比，分蘖葱头提取物大剂量组动物血清TC及TG均明显降低(p＜0.05)，中剂量组血清TC明显降低(p＜0.05)，并且血清TG亦有下降趋势。
实验结束后处死动物，分离各组动物的肾后及生殖器周围脂肪，并比较这些脂肪组织的重量。结果如下列表2所示。
表2分蘖葱头提出物对营养性肥胖大鼠组织脂肪重量的影响(g，X±S，n＝10)组别肾后 生殖器周 肾后脂 生殖器脂脂肪 围脂肪肪/体重 肪/体重正常对照组 3.10±1.08** 2.12±0.89** 0.013±0.008** 0.009±0.004**肥胖模型组 6.79±2.834.69±1.750.025±0.0090.017±0.005分蘖葱头提出物25mg/kg 4.53±1.53* 3.71±1.150.021±0.0120.014±0.00750mg/kg 4.52±1.64* 3.17±0.87* 0.017±0.006* 0.012±0.006*100mg/kg4.01±1.07** 2.96±0.69* 0.015±0.008* 0.011±0.003**阳性对照组100mg/kg4.70±1.12* 3.34±0.980.019±0.0070.012±0.003*与肥胖模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表2所示的结果可以看出，肥胖模型组动物的肾后脂肪、生殖器周围脂肪、肾后脂肪/体重及生殖器脂肪/体重比例均较正常对照组明显增高(P＜0.01)。与肥胖模型组相比，投用分蘖葱头提取物的中和大剂量组动物的上述四项指标均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，并且小剂量组动物的生殖器脂肪/体重、肾后脂肪及肾后脂肪/体重均有减少趋势。
本研究进一步观察并记录了分蘖葱头提取物对营养性肥胖大鼠体重及肝重量系数的影响，结果如下列表3所示。
表3分蘖葱头提取物对营养性肥胖大鼠体重及肝重系数的影响(X±S，n＝10)组 别 肝重量系数 动物体重(克肝重/100g体重) (g)正常对照组 3.774±0.805251±7.3***肥胖模型组 3.491±0.966310±8.7分蘖葱头提取物25mg/kg 3.574±0.704298±9.4**50mg/kg 3.672±0.564292±8.9***100mg/kg3.721±0.625281±9.3***阳性对照组100mg/kg3.623±0.816301±7.6*与肥胖模型组比较*p＜0.05由表3所示的结果可以看出，肥胖模型组动物的体重较正常对照组明显增加(p＜0.001)，并且肝重量系数有降低趋势(p＞0.05)。投用分蘖葱头提取物的小、中、大剂量组动物的体重较肥胖模型组明显降低(p＜0.01或p＜0.001)，肝重量系数则有增加趋势。
实施例3本发明的分蘖葱头提取物对实验性高脂血症模型大鼠的血脂调节作用取Wistar大鼠72只，随机分为6组，每组12只。正常对照组喂普通饲料，给生理盐水2ml/kg；高脂对照组喂高脂饲料，给生理盐水2ml/kg；阳性对照组喂高脂饲料并灌服洛伐他汀20mg/kg；分蘖葱头提取物小、中、大剂量组喂高脂饲料，分别灌服分蘖葱头提取物25、50、100mg/kg。高脂饮食组在给药前一天开始，每晚傍晚给予高脂饲料(配方2％胆固醇、0.2％丙基硫氧嘧啶、0.3％胆酸钠、7.5％猪油、90％普通饲料)，每只鼠平均20g，白天补充普通饲料，共15天。
各组动物均于上午灌胃投用上述饲料或药物，连续15天。于给药最后1天晚间禁食，不禁水。次日上午用3％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉动物，自腹主动脉采血3ml，分离血清并按试剂盒(由南京建成生物工程研究所提供)说明书所述方法测定甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、过氧化脂质(LPO)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。另采血4ml，以1％肝素抗凝，其中1ml加入LBY-N6A自清洗旋转式粘度计测定全血低切(10/s)、中切(40/s)、高切(120/s)粘度。其余3ml血以3000转/min离心10min，取上层血浆用放免法(试剂盒由中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所提供)测血浆6-酮-前列腺素F1α(PGI2)及血栓素B2(TXA2)。取1/2肝脏置10％甲醛液中固定以行脂肪染色，观察脂肪沉积情况。另1/2肝脏待测LPO及SOD。结果分别如下列表4-8所示。
表4分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血脂代谢的影响(X±S，n＝10)组别 TG(mmol/L)TC(mmol/L) LDL-c(mmol/L)正常对照组 0.62±0.27* 1.78±0.86***4.54±1.84*高脂对照组 1.07±0.457.70±2.38 7.21±2.34分蘖葱头提出物25mg/kg 0.93±0.186.85±2.02 6.34±2.0350mg/kg 0.67±0.31* 4.97±1.87** 5.81±1.23*100mg/kg 0.56±0.15** 4.08±1.01***4.69±1.12**洛伐他汀20mg/k 0.66±0.28* 4.98±1.20** 4.57±1.03**与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001表5分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血脂代谢的影响(X±S，n＝10)组别 HDL-c(mmol/L) TC/HDL-c(mmol/L) LDL-c/HDL-c(mmol/L)正常对照组 1.04±0.37* 1.71±0.56***4.37±1.41***高脂对照组 0.72±0.2410.69±3.68 10.01±3.82分蘖葱头提出物25mg/kg 0.83±0.278.25±1.28 7.64±2.0150mg/kg 0.99±0.16* 7.42±1.16** 5.87±1.86**100mg/kg 1.01±0.17** 7.28±1.29** 4.64±1.95***洛伐他汀20mg/kg 0.84±0.127.55±1.62* 5.44±2.08**与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由表4和5所示的数据可以看出，高脂对照组动物的血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c及LDL-c/HDL-c均显著高于正常对照组动物(P＜0.05或P＜0.001)，而HDL-c则显著降于正常对照组(P＜0.05)，表明高脂模型复制成功。与高脂对照组动物比较，动物口服大、中剂量蘖葱头提取物(50、100mg/kg)后血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c及LDL-c/HDL-c水平均明显降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，而血清HDL-c水平则明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。
表6分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血清及肝脏LPO及SOD的影响(X±S，n＝10)组别 血 清 肝 脏LPO(nmol/L) SOD(U/L) LPO(nmol/ml) SOD(nu/mg)正常对照组 7.06±1.14** 463.2±42.9* 5.60±1.05*9.26±0.91**高脂对照组 8.80±1.01404.4±55.8 6.98±1.30 7.61±1.39分蘖葱头提出物25mg/kg 8.53±0.47427.7±44.0 6.63±1.61 8.05±1.7850mg/kg 7.87±0.76* 452.8±35.8* 5.70±1.22*9.15±1.13*100mg/kg7.12±1.05** 457.8±51.4* 5.42±1.02** 9.18±1.25*洛伐他汀20mg/kg 7.10±1.07** 412.3±40.7 5.72±1.12*8.32±1.20与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表6所示的数据可以看出，与正常对照组比较，高脂对照组动物血清及肝脏LPO含量明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，而SOD活性明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，表明高脂血症大鼠伴有自由基脂质过氧化损伤。与高脂对照组比较，动物口服大、中剂量分蘖葱头提取物(50、100mg/kg)可使高脂血症大鼠血清及肝脏LPO含量明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，而SOD活性则明显升高(P＜0.05)。
表7分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠全血粘度的影响(X±S，n＝10)组别全血粘度10/s 40/s 120/s正常对照组 11.35±1.21* 4.56±0.39*3.83±0.31*高脂对照组 13.32±2.305.06±0.26 4.34±0.53分蘖葱头提出物25mg/kg12.16±1.494.83±0.36 3.90±0.27*50mg/kg11.42±1.38* 4.98±0.73 3.79±0.58*100mg/kg 11.25±1.21* 4.69±0.47*3.73±0.32**洛伐他汀20mg/kg12.55±1.165.11±0.55 4.14±0.29与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表7所示的数据可以看出，正常对照组比较，高脂对照组动物的全血低切、中切及高切粘度均明显增加(P＜0.05)，表明高脂血症大鼠伴有血液流变学的改变。与高脂对照组比较，大剂量分蘖葱头提取物(100mg/kg)能明显降低全血低切、中切及高切粘度(P＜0.05或P＜0.01)，中剂量分蘖葱头提取物(50mg/kg)能明显降低全血低切及高切粘度(P＜0.05)，而小剂量分蘖葱头提取物(25mg/kg)仅能降低全血高切粘度(P＜0.05)。
表8分蘖葱头提出物对高脂血症大鼠血浆PGI2及TXA2水平的影响(X±S，n＝10)组别PGI2(pg/mL) TXA2(pg/mL) PGI2/TXA2正常对照组 407.3±117.6* 264.9±79.4*1.75±1.13*高脂对照组 280.9±88.5433.7±176.70.73±0.32分蘖葱头提出物25mg/kg 311.3±78.4364.5±91.3 0.85±0.4150mg/kg 364.6±88.1* 276.3±95.6*1.43±0.48**100mg/kg383.8±76.6* 265.2±53.0** 1.52±0.78**洛伐他汀20mg/kg 315.2±58.2271.5±63.9*1.16±0.45*与高脂对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01由表8所示的数据可以看出，与正常对照组比较，高脂对照组动物的血浆TXA2水平明显增加(P＜0.05)，并且PGI2水平及PGI2/TXA2比值均明显降低(P＜0.05)，表明高脂模型可产生TXA2与PGI2之间的平衡失调。与高脂对照组比较，口服大、中剂量分蘖葱头提取物(50、100mg/kg)后动物的血浆PGI2水平明显增加，并且PGI2/TXA2比值亦明显提高(P＜0.05或P＜0.01)，而血浆TXA2水平则降低。
最后，本发明人使用组织学方法观察了分蘖葱头提取物对高脂血症大鼠肝组织脂肪沉积的影响。
各组织肝脏标本固定切片后行脂肪染色，观察肝组织脂肪沉积情况。结果可见，正常对照组10只动物的肝细胞均未见脂肪变性(0/10)；高脂对照组10只动物的肝细胞均可见脂肪变性(10/10)，而服用大、中和小分蘖葱头提取物的各组动物及服用洛伐他汀组动物的肝细胞脂肪变性分别为6/10、4/10、3/10、4/10，且脂肪空泡明显减少。经X2检验，分蘖葱头提取物三个剂量组及洛伐他汀组与高脂对照组比较差异显著(p＜0.05或p＜0.01)，表明分蘖葱头提取物可明显抑制高脂血症大鼠肝脏脂肪的沉积。
权利要求
1.基本上包括黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物的分蘖葱头的非挥发性成分提出物。
2.根据权利要求1的提取物，其中所说的分蘖葱头是分蘖葱头植物或其鳞茎。
3.根据权利要求1的提取物，其中所说的黄酮类化合物选自槲皮素、山柰酚、槲皮素-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3，4′-二氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3′-甲氧基-4′-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。
4.根据权利要求1的提取物，其中所说的甾体化合物选自(25R)-Ruscogenin1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside、(25R)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、(25S)-Ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside、胡萝卜苷、β-谷甾醇。
5.根据权利要求1的提取物，其中所说的含氮化合物选自N-〔2-(4-羟基苯基)乙基〕-3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酰胺、1，6-己内酰胺。
6.制备分蘖葱头的非挥发性成分提出物的方法，该方法包括首先用乙醇浸渍或回流提取预处理的分蘖葱头全株植物和/或其鳞茎，或者直接用蒸馏水将预先清洗并简单切成小块的分蘖葱头植物和/或其鳞茎浸泡12-24小时后榨汁并以常规方法过滤收集浸泡液，回收乙醇后将残留物过吸附树脂层析柱，然后用乙醇洗脱得到基本上由黄酮类化合物、甾体化合物和含氮化合物组成的分蘖葱头的非挥发性提出物。
7.根据权利要求6的方法，其中所说的吸附树脂层析柱选自大孔吸附树脂、聚酰胺或聚丙烯酰胺树脂、硅胶、氧化铝或葡聚糖凝胶层析柱。
8.根据本发明方法的一个优选实施方案，其中用于洗脱的乙醇是20-95％的乙醇水溶液。
9.根据权利要求1的提出物在生产用于减轻体重、调解血脂、抗血小板聚集和抗动脉硬化的药物中的应用。
10.分蘖葱头的粗提物作为添加剂在生产功能性食品或其他健康相关产品中的应用。
全文摘要
本发明涉及百合科葱属植物分蘖葱头，特别是涉及分蘖葱头的非挥发性提取物、其制备方法及所说的提取物在生产用于减轻体重、调节血脂、抗血小板凝集和抗动脉硬化的药物中的应用。
文档编号A61P3/04GK1548051SQ0312703
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月19日 优先权日2003年5月19日
发明者杨晓虹, 睢大员, 刘银燕, 周小平, 张沐新, 陈滴, 刘丽娟, 于小风, 曲绍春 申请人:杨晓虹
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