一种抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制备方法
专利名称：一种抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属遗传工程领域，具体涉及一种抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制备方法。
口蹄疫的致病原为口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，其结构较简单，完整的病毒粒子由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3及VP4各60个拷贝构成的衣壳包裹一条单股正链RNA组成，其中VP1是主要的抗原蛋白。根据免疫原性不同，FMDV有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asial共7个血清型及65个以上的亚型，各型之间彼此几乎没有交叉免疫力，感染了一型FMDV的动物仍可感染另一型FMDV而发病。这给有多种血清型口蹄疫爆发流行的地区口蹄疫防治工作带来了很大的困难。
目前尚无治疗FMD的有效办法，捕杀、消毒以及预防接种是控制FMD的常用途径。由于捕杀会带来巨大的经济损失，且难以在大范围内进行，因此，进行广泛的免疫接种是现阶段最主要的防治措施。预防FMDV的疫苗有减毒疫苗、灭活疫苗、重组多肽疫苗以及仍处在研究阶段的DNA疫苗。减毒疫苗对动物有较好的免疫效果，保护时间也较长，并且很经济，但减毒病毒经过传代以后其毒力可能恢复，有的在通常情况下没有毒力，但在特殊的生理状况下例如孕娠、哺乳期以及幼年动物往往可以致病。因此，尽管减毒疫苗的研究工作仍在继续，但很少在实际中应用。灭活疫苗是目前在大多数国家和地区广泛应用的疫苗，但也存在着安全问题，主要是灭活不彻底或在加工过程中防护不当使病毒从加工厂逃逸出去从而引起FMD的爆发和流行。随着基因工程技术的发展，安全高效的基因工程疫苗的成功开发使安全性很差的传统疫苗(如减毒疫苗、灭活疫苗等)逐步被取代。
由于FMDV各型之间彼此几乎没有交叉免疫力，预防不同血清型口蹄疫病毒的感染，应该用不同的型特异疫苗，才能取得理想的保护效果。
本发明提出的抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗，由Asial型口蹄疫病毒B，T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白，或与载体大分子相连编码表位融合蛋白制备获得。其中B细胞表位包括Asial型口蹄疫病毒结构蛋白VP1 80～101、133～160和200～213位氨基酸。当然，这些B细胞表位也可以同时包含T细胞表位。T细胞表位包括Asial型VP4 20～34位氨基酸或VP1 20～34和35～48位氨基酸。
本发明中，为了选择最佳肽段，保持高的抗病毒免疫原性，上述B，T细胞表位氨基酸可改动及前后移动1～5个氨基酸。上述串联结构的肽段与肽段之间引入有若干氨基酸作为接头。
本发明中，所述多肽疫苗的B，T细胞表位DNA序列串联方式为B细胞表位---T细胞表位---B细胞表位，或T细胞表位---B细胞表位---B细胞表位，或B细胞表位---B细胞表位---T细胞表位。B，T细胞表位DNA序列可单独编码免疫原性蛋白制备疫苗，或与载体蛋白相连编码融合蛋白制备疫苗。载体蛋白可以是β-半乳糖苷酶，家畜自体IgG重链恒定区中的某区段，或乙肝病毒核心抗原等。
制备该多肽疫苗，采用化学方法合成编码Asial型VP1和VP4上B细胞表位和T细胞表位的肽段基因，将其串联，串联片段单独或与载体大分子C端相连再插入质粒载体，再转入细菌表达，经过发酵制备得所需的抗口蹄疫病毒疫苗。具体步骤是将重组质粒转入大肠杆菌菌株，将菌株置于细菌培养基中，培养温度在30℃到37℃之间，培养时间8到25小时，然后收集菌体；若所用质粒为原核表达质粒，则收集菌体破碎，离心收集含有融合或非融合蛋白的包涵体，将包涵体配成油乳剂，即可获得抗口蹄疫病毒多肽疫苗。
本发明制备的疫苗安全性好，具有较强的免疫原性，对豚鼠保护力强。
串联基因结构特征为串联抗原基因的两端各有一个拷贝的编码B细胞表位的VP1133～158位氨基酸的DNA序列，中间是一个拷贝的编码T细胞表位的VP4 20～34位氨基酸的DNA序列；连接这些序列的两个接头分别是“Pro-Gly”(接头1)2个氨基酸和“Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg”(接头2)11个氨基酸。
本实施例串联基因的DNA序列为SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.1对应的氨基酸序列为SEQ.ID.No.2。
采用原核偏爱密码子，分10个片段合成串联基因。串联基因与EcoRI及BamHI酶切消化的质粒载体pWR590在T4 ligase等作用下发生连接反应，获得的重组DNA，转化大肠杆菌C600感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板中，37℃倒置过夜。随意挑取转化子，分别以酶切，DNA测序分析鉴定转化子，序列分析证明插入的串联基因序列与设计相符，即获得阳性克隆，将此克隆命名为pAS1。
将pAS1以含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度6000rpm通气培养8小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5～8分钟。超声后10000rpm离心20分钟收集包涵体。并配成油乳剂，即可获得一种新型的抗Asial型口蹄疫病毒多肽疫苗。
用该疫苗免疫豚鼠，可诱导豚鼠产生高滴度的中和抗体，中和价PD50达1∶331，中和抗体的结果见表1。经该疫苗免疫的豚鼠可抵抗Asial型强毒攻击，保护率达86％，抗病毒能力检测结果见表2。
表1中和抗体测定的结果
表1中和抗体效价以半数保护量PD50表示，按Karber方法计算。Karber法公式为lgPD50＝L+d(S-0.5).L为血清最低稀释度的对数，d为稀释系数，S为保护比值的和。
表2 对豚鼠的免疫保护效果疫苗 疫苗免疫剂量 病毒攻击剂量实验豚鼠数 被保护豚鼠数 保护率pAS1 400μg 100ID50/0.2ml 7686％pWR590 400μg 100ID50/0.2ml 500多肽苗的DNA序列SEQ.ID.No.15’-AATT℃ATGAAAACCACCTACGGTGAAGAATCCACCCGTCGTGGTGACTTCGCTGCTCTGGCTCAGCGTCTGTCCCGTCGTCTGCCGCCGGGTTCCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGCAGTTCGAACTGGAGTTCATGGTTCCGTCCCGTAAAACCACCTACGGTGAAGAATCCACCCGTCGTGGTGACTTCGCTGCTCTGGCTCAGCGTCTGTCCCGTCGTCTGCCGTGAGCTGCAGCCG-3’对应的氨基酸序列SEQ.ID.No.2.N端-FMKTTYGEESTRRGDFAALAQRLSRRLPPGSIINNYYMQQYQNSMQFELEFMVPSRKTTYGEESTRRGDFAALAQRLSRRLP*AAA-C端
权利要求
1.一种抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗，其特征在于由Asial型口蹄疫病毒VP1和VP4上B，T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白，或与载体大分子相连编码表位融合蛋白而获得，其中B细胞表位采用Asial型口蹄疫病毒结构蛋白VP1 80～101、133～160和200～213位氨基酸，T细胞表位包括Asial型VP4 20～34位氨基酸或VP1 20～34和35～48位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T细胞表位DNA序列串联方式为B细胞表位---T细胞表位---B细胞表位，或T细胞表位---B细胞表位---B细胞表位，或B细胞表位---B细胞表位---T细胞表位。
3.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T细胞表位DNA序列可单独编码免疫原性蛋白制备疫苗，或与载体蛋白相连编码融合蛋白制备疫苗。
4.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T细胞表位氨基酸可改动或前后移动1～5个氨基酸。
5.根据权利要求2所述的多肽疫苗，其特征在于该疫苗的的DNA序列为SEQ.ID.No.1，对应的氨基酸序列为SEQ.ID.No.2。
6.根据权利要求3所述的多肽疫苗，其特征在于所说的载体蛋白是β-半乳糖苷酶，家畜自体IgG重链恒定区中的某区段，或乙肝病毒核心抗原。
7.一种如权利要要求1-6所述的抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于用化学方法合成编码Asial型VP1和VP4上B细胞表位和T细胞表位的肽段基因，将其串联，串联基因单独或与载体大分子C端相连再插入质粒载体，转入细菌表达，经过发酵制备得抗口蹄疫病毒疫苗。
全文摘要
本发明是一种抗亚洲一型(Asial型)口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制备方法。该疫苗由Asial型口蹄疫病毒VP1和VP4上B，T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白，或与载体大分子相连编码表位融合蛋白制备获得。用化学方法合成编码Asial型VP1和VP4上B细胞表位和T细胞表位的肽段基因，将其串联，串联基因单独或与载体大分子相连再插入质粒载体，转入细菌表达，经过发酵制备得抗口蹄疫病毒疫苗。该疫苗安全性好，具有较强的免疫原性，对豚鼠保护力强。
文档编号A61P31/00GK1470285SQ03129229
公开日2004年1月28日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者郑兆鑫, 严维耀, 张青, 张震宇 申请人:复旦大学
技术领域：
本发明属遗传工程领域，具体涉及一种抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制备方法。
口蹄疫的致病原为口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，其结构较简单，完整的病毒粒子由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3及VP4各60个拷贝构成的衣壳包裹一条单股正链RNA组成，其中VP1是主要的抗原蛋白。根据免疫原性不同，FMDV有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asial共7个血清型及65个以上的亚型，各型之间彼此几乎没有交叉免疫力，感染了一型FMDV的动物仍可感染另一型FMDV而发病。这给有多种血清型口蹄疫爆发流行的地区口蹄疫防治工作带来了很大的困难。
目前尚无治疗FMD的有效办法，捕杀、消毒以及预防接种是控制FMD的常用途径。由于捕杀会带来巨大的经济损失，且难以在大范围内进行，因此，进行广泛的免疫接种是现阶段最主要的防治措施。预防FMDV的疫苗有减毒疫苗、灭活疫苗、重组多肽疫苗以及仍处在研究阶段的DNA疫苗。减毒疫苗对动物有较好的免疫效果，保护时间也较长，并且很经济，但减毒病毒经过传代以后其毒力可能恢复，有的在通常情况下没有毒力，但在特殊的生理状况下例如孕娠、哺乳期以及幼年动物往往可以致病。因此，尽管减毒疫苗的研究工作仍在继续，但很少在实际中应用。灭活疫苗是目前在大多数国家和地区广泛应用的疫苗，但也存在着安全问题，主要是灭活不彻底或在加工过程中防护不当使病毒从加工厂逃逸出去从而引起FMD的爆发和流行。随着基因工程技术的发展，安全高效的基因工程疫苗的成功开发使安全性很差的传统疫苗(如减毒疫苗、灭活疫苗等)逐步被取代。
由于FMDV各型之间彼此几乎没有交叉免疫力，预防不同血清型口蹄疫病毒的感染，应该用不同的型特异疫苗，才能取得理想的保护效果。
本发明提出的抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗，由Asial型口蹄疫病毒B，T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白，或与载体大分子相连编码表位融合蛋白制备获得。其中B细胞表位包括Asial型口蹄疫病毒结构蛋白VP1 80～101、133～160和200～213位氨基酸。当然，这些B细胞表位也可以同时包含T细胞表位。T细胞表位包括Asial型VP4 20～34位氨基酸或VP1 20～34和35～48位氨基酸。
本发明中，为了选择最佳肽段，保持高的抗病毒免疫原性，上述B，T细胞表位氨基酸可改动及前后移动1～5个氨基酸。上述串联结构的肽段与肽段之间引入有若干氨基酸作为接头。
本发明中，所述多肽疫苗的B，T细胞表位DNA序列串联方式为B细胞表位---T细胞表位---B细胞表位，或T细胞表位---B细胞表位---B细胞表位，或B细胞表位---B细胞表位---T细胞表位。B，T细胞表位DNA序列可单独编码免疫原性蛋白制备疫苗，或与载体蛋白相连编码融合蛋白制备疫苗。载体蛋白可以是β-半乳糖苷酶，家畜自体IgG重链恒定区中的某区段，或乙肝病毒核心抗原等。
制备该多肽疫苗，采用化学方法合成编码Asial型VP1和VP4上B细胞表位和T细胞表位的肽段基因，将其串联，串联片段单独或与载体大分子C端相连再插入质粒载体，再转入细菌表达，经过发酵制备得所需的抗口蹄疫病毒疫苗。具体步骤是将重组质粒转入大肠杆菌菌株，将菌株置于细菌培养基中，培养温度在30℃到37℃之间，培养时间8到25小时，然后收集菌体；若所用质粒为原核表达质粒，则收集菌体破碎，离心收集含有融合或非融合蛋白的包涵体，将包涵体配成油乳剂，即可获得抗口蹄疫病毒多肽疫苗。
本发明制备的疫苗安全性好，具有较强的免疫原性，对豚鼠保护力强。
串联基因结构特征为串联抗原基因的两端各有一个拷贝的编码B细胞表位的VP1133～158位氨基酸的DNA序列，中间是一个拷贝的编码T细胞表位的VP4 20～34位氨基酸的DNA序列；连接这些序列的两个接头分别是“Pro-Gly”(接头1)2个氨基酸和“Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg”(接头2)11个氨基酸。
本实施例串联基因的DNA序列为SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.1对应的氨基酸序列为SEQ.ID.No.2。
采用原核偏爱密码子，分10个片段合成串联基因。串联基因与EcoRI及BamHI酶切消化的质粒载体pWR590在T4 ligase等作用下发生连接反应，获得的重组DNA，转化大肠杆菌C600感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板中，37℃倒置过夜。随意挑取转化子，分别以酶切，DNA测序分析鉴定转化子，序列分析证明插入的串联基因序列与设计相符，即获得阳性克隆，将此克隆命名为pAS1。
将pAS1以含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度6000rpm通气培养8小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5～8分钟。超声后10000rpm离心20分钟收集包涵体。并配成油乳剂，即可获得一种新型的抗Asial型口蹄疫病毒多肽疫苗。
用该疫苗免疫豚鼠，可诱导豚鼠产生高滴度的中和抗体，中和价PD50达1∶331，中和抗体的结果见表1。经该疫苗免疫的豚鼠可抵抗Asial型强毒攻击，保护率达86％，抗病毒能力检测结果见表2。
表1中和抗体测定的结果
表1中和抗体效价以半数保护量PD50表示，按Karber方法计算。Karber法公式为lgPD50＝L+d(S-0.5).L为血清最低稀释度的对数，d为稀释系数，S为保护比值的和。
表2 对豚鼠的免疫保护效果疫苗 疫苗免疫剂量 病毒攻击剂量实验豚鼠数 被保护豚鼠数 保护率pAS1 400μg 100ID50/0.2ml 7686％pWR590 400μg 100ID50/0.2ml 500多肽苗的DNA序列SEQ.ID.No.15’-AATT℃ATGAAAACCACCTACGGTGAAGAATCCACCCGTCGTGGTGACTTCGCTGCTCTGGCTCAGCGTCTGTCCCGTCGTCTGCCGCCGGGTTCCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGCAGTTCGAACTGGAGTTCATGGTTCCGTCCCGTAAAACCACCTACGGTGAAGAATCCACCCGTCGTGGTGACTTCGCTGCTCTGGCTCAGCGTCTGTCCCGTCGTCTGCCGTGAGCTGCAGCCG-3’对应的氨基酸序列SEQ.ID.No.2.N端-FMKTTYGEESTRRGDFAALAQRLSRRLPPGSIINNYYMQQYQNSMQFELEFMVPSRKTTYGEESTRRGDFAALAQRLSRRLP*AAA-C端
权利要求
1.一种抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗，其特征在于由Asial型口蹄疫病毒VP1和VP4上B，T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白，或与载体大分子相连编码表位融合蛋白而获得，其中B细胞表位采用Asial型口蹄疫病毒结构蛋白VP1 80～101、133～160和200～213位氨基酸，T细胞表位包括Asial型VP4 20～34位氨基酸或VP1 20～34和35～48位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T细胞表位DNA序列串联方式为B细胞表位---T细胞表位---B细胞表位，或T细胞表位---B细胞表位---B细胞表位，或B细胞表位---B细胞表位---T细胞表位。
3.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T细胞表位DNA序列可单独编码免疫原性蛋白制备疫苗，或与载体蛋白相连编码融合蛋白制备疫苗。
4.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T细胞表位氨基酸可改动或前后移动1～5个氨基酸。
5.根据权利要求2所述的多肽疫苗，其特征在于该疫苗的的DNA序列为SEQ.ID.No.1，对应的氨基酸序列为SEQ.ID.No.2。
6.根据权利要求3所述的多肽疫苗，其特征在于所说的载体蛋白是β-半乳糖苷酶，家畜自体IgG重链恒定区中的某区段，或乙肝病毒核心抗原。
7.一种如权利要要求1-6所述的抗亚洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于用化学方法合成编码Asial型VP1和VP4上B细胞表位和T细胞表位的肽段基因，将其串联，串联基因单独或与载体大分子C端相连再插入质粒载体，转入细菌表达，经过发酵制备得抗口蹄疫病毒疫苗。
全文摘要
本发明是一种抗亚洲一型(Asial型)口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制备方法。该疫苗由Asial型口蹄疫病毒VP1和VP4上B，T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白，或与载体大分子相连编码表位融合蛋白制备获得。用化学方法合成编码Asial型VP1和VP4上B细胞表位和T细胞表位的肽段基因，将其串联，串联基因单独或与载体大分子相连再插入质粒载体，转入细菌表达，经过发酵制备得抗口蹄疫病毒疫苗。该疫苗安全性好，具有较强的免疫原性，对豚鼠保护力强。
文档编号A61P31/00GK1470285SQ03129229
公开日2004年1月28日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者郑兆鑫, 严维耀, 张青, 张震宇 申请人:复旦大学
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