一种新型冠状病毒株及其医药用途的制作方法
专利名称：一种新型冠状病毒株及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明属微生物病毒领域，涉及新型冠状病毒的新毒株及其医药用途。
本发明的另一目的是采用新型冠状病毒毒株制备SARS诊断试剂、抗SARS疫苗、药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物。
上海市于2003年3月上旬开始SARS的监控，由于当时对SARS的病原不明，本发明对SARS可疑病例进行了检验。本发明检测了流感病毒、禽类流感病毒、呼吸道合胞病毒与衣原体为主的病原学细胞培养、鉴定，对可疑SARS病例进行了诊断排除。本发明在最初的上海23例发热病例中，检测出了A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原体。通过对上海市第一例确诊SARS病例，患者李某，女，40岁，2003年3月27日发病，2003年3月31日诊断为SARS疑似病例，2003年3月31日采样，标本为咽试，2003年4月3日临床确诊SARS病例。
咽拭标本于2003年4月3日按本领域公知技术进行Vero E6细胞培养，2003年4月8日结果显示了细胞病变，分离出直径60-100nm的冠状病毒样颗粒，感染的Vero E6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒等病原体后，证实所分离的冠状病毒为新冠状病毒的变异毒株，於2003年6月6日保藏，命名SARS冠状病毒复旦I株(冠状病毒SARS-CoV-Fudan-I株)CGMCC NO.0942。
本发明采用的细胞系为本领域公知的Veroe E6细胞、HEP-2细胞。
本发明采用的单克隆抗体、第1抗体为确诊的SARS病人三周后的恢复期血清，所用荧光标记第2抗体购自CHEMICON公司产品。
本发明通过下述方法进行分离、培养、鉴定。
1)病原体分离培养咽拭标本经用青、链霉素、两性霉素处理后，接种Veroe E6细胞、HEP-2细胞，在CO233℃条件下培养，每天对细胞病变效应(CPE)进行观察，经培养5-7d后，病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离病毒颗粒进行电镜负染观察。
2)间接免疫荧光以分离感染病毒发生病变的Vero E6细胞制细胞片，细胞发生病变时，取出感染细胞滴片，放入CO233℃条件下培养，使细胞贴壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未贴壁的细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃ 30min，凉干，冷藏备用。
结果显示，(1)、标本感染Vero E6细胞，细胞有病变现象，将发生病变的细胞从培养瓶中取出，经Giemsa细胞染色，显微镜下见细胞发生融合，细胞核试验破碎，高尔基体形成的现象；标本感染HEP-2细胞，从相差显微镜下观察到细胞生长过程，细胞经培养见细胞从单个生长良好的状态形成网状，絮状相联。
(2)电镜负染病毒形态观察，感染细胞经培养5-7天后，蔗糖梯度超速离心，电镜负染观察，显示具有放射状表面的冠状病毒样颗粒(coronavirus-like particles)，直径在60-100nm。冠状病毒在细胞膜边缘的细胞质和粗糙的内质网网状组织的囊腔中。细胞外的颗粒堆积成簇，常沿着质膜表面分布。荧光染色呈阳性反应，病毒形态符合SARS-CoV。
(3)荧光抗体染色，标本感染的Vero E6细胞，经间接免疫荧光染色，见感染细胞边缘呈半月状着色，荧光明显。正常Vero E6细胞则无荧光着色细胞。
图2为72小时正常Vero E6细胞。
图3Giemsa细胞染色，其中可见融合的细胞。
图4电镜负染色可见冠状病毒样颗粒。
图5感染Vero E6细胞间接荧光染色呈阳性反应。
本发明从上海市首例确诊SARS患者分离、培养成功新型冠状病毒“SARS-CoV-Fudan-I株”，并且可被传代培养。所述确诊SARS患者病原学培养检测，排除了呼吸道常见的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒感染。
本发明提供的新型冠状病毒毒株冠状病毒复旦I株，为地区SARS病毒标准株，能确定病原，诊断SARS疾病，可以对可疑SARS病原变异进行比较，作为SARS病原学诊断与SARS抗体诊断方法的金标准。为SARS诊断试剂制备、抗SARS疫苗的研究与生产、抗SARS药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物提供基础和依据。
实施例2将分离感染病毒发生病变的Vero E6细胞制细胞片，细胞发生病变时，取出感染细胞滴片，放入CO235℃条件下培养，使细胞贴壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未贴壁的细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃ 30min，凉干。滴入1∶10稀释的来自确诊的SARS病人三周后的恢复期血清，放入温盒内37℃作用30min，用0.0lmol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液体。滴加荧光标记羊抗人IgG抗体，购自CHEMICON公司，放入温盒内37℃作用30min，用0.01mol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液体。经间接免疫荧光染色，可见到感染细胞边缘呈半月状着色，荧光明显。正常Vero E6细胞则无荧光着色细胞。表明病变的Vero E6细胞被感染病毒。上述方法能确定病原，诊断疾病，可作为SARS病原学诊断与SARS抗体诊断方法的金标准。
权利要求
1.一种新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株CGMCC NO.0942，其具有下述特征，①感染细胞有病变，包括细胞发生融合，细胞核试验破碎，高尔基体形成形成网状，絮状相联；②病毒在细胞质和内质网组织囊腔中，细胞外颗粒成簇，沿质膜表面分布；③荧光染色呈阳性反应，电镜负染显示具有放射状表面的冠状病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株，其特征是所述病毒株直径在60-100nm。
3.权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备SARS诊断试剂中的用途。
4.权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备抗SARS疫苗中的用途。
5.权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备抗SARS病毒的消毒药物中的用途。
全文摘要
本发明属微生物病毒领域，涉及冠状病毒的新毒株及其用途。本发明通过对确诊SARS病人的咽拭细胞培养，分离出新型冠状病毒，命名SARS冠状病毒复旦I株，经感染Vero E6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原体后，证实所分离的冠状病毒为新冠状病毒的变异毒株，本毒株，可以对可疑SARS病原变异进行比较，为SARS诊断试剂制备、抗SARS疫苗的研究与生产、抗SARS药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物提供基础和依据。
文档编号A61K39/215GK1450164SQ03129248
公开日2003年10月22日 申请日期2003年6月11日 优先权日2003年6月11日
发明者姜庆五, 居丽雯, 李子华, 林玉尊, 俞顺章 申请人:复旦大学
技术领域：
本发明属微生物病毒领域，涉及新型冠状病毒的新毒株及其医药用途。
本发明的另一目的是采用新型冠状病毒毒株制备SARS诊断试剂、抗SARS疫苗、药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物。
上海市于2003年3月上旬开始SARS的监控，由于当时对SARS的病原不明，本发明对SARS可疑病例进行了检验。本发明检测了流感病毒、禽类流感病毒、呼吸道合胞病毒与衣原体为主的病原学细胞培养、鉴定，对可疑SARS病例进行了诊断排除。本发明在最初的上海23例发热病例中，检测出了A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原体。通过对上海市第一例确诊SARS病例，患者李某，女，40岁，2003年3月27日发病，2003年3月31日诊断为SARS疑似病例，2003年3月31日采样，标本为咽试，2003年4月3日临床确诊SARS病例。
咽拭标本于2003年4月3日按本领域公知技术进行Vero E6细胞培养，2003年4月8日结果显示了细胞病变，分离出直径60-100nm的冠状病毒样颗粒，感染的Vero E6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒等病原体后，证实所分离的冠状病毒为新冠状病毒的变异毒株，於2003年6月6日保藏，命名SARS冠状病毒复旦I株(冠状病毒SARS-CoV-Fudan-I株)CGMCC NO.0942。
本发明采用的细胞系为本领域公知的Veroe E6细胞、HEP-2细胞。
本发明采用的单克隆抗体、第1抗体为确诊的SARS病人三周后的恢复期血清，所用荧光标记第2抗体购自CHEMICON公司产品。
本发明通过下述方法进行分离、培养、鉴定。
1)病原体分离培养咽拭标本经用青、链霉素、两性霉素处理后，接种Veroe E6细胞、HEP-2细胞，在CO233℃条件下培养，每天对细胞病变效应(CPE)进行观察，经培养5-7d后，病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离病毒颗粒进行电镜负染观察。
2)间接免疫荧光以分离感染病毒发生病变的Vero E6细胞制细胞片，细胞发生病变时，取出感染细胞滴片，放入CO233℃条件下培养，使细胞贴壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未贴壁的细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃ 30min，凉干，冷藏备用。
结果显示，(1)、标本感染Vero E6细胞，细胞有病变现象，将发生病变的细胞从培养瓶中取出，经Giemsa细胞染色，显微镜下见细胞发生融合，细胞核试验破碎，高尔基体形成的现象；标本感染HEP-2细胞，从相差显微镜下观察到细胞生长过程，细胞经培养见细胞从单个生长良好的状态形成网状，絮状相联。
(2)电镜负染病毒形态观察，感染细胞经培养5-7天后，蔗糖梯度超速离心，电镜负染观察，显示具有放射状表面的冠状病毒样颗粒(coronavirus-like particles)，直径在60-100nm。冠状病毒在细胞膜边缘的细胞质和粗糙的内质网网状组织的囊腔中。细胞外的颗粒堆积成簇，常沿着质膜表面分布。荧光染色呈阳性反应，病毒形态符合SARS-CoV。
(3)荧光抗体染色，标本感染的Vero E6细胞，经间接免疫荧光染色，见感染细胞边缘呈半月状着色，荧光明显。正常Vero E6细胞则无荧光着色细胞。
图2为72小时正常Vero E6细胞。
图3Giemsa细胞染色，其中可见融合的细胞。
图4电镜负染色可见冠状病毒样颗粒。
图5感染Vero E6细胞间接荧光染色呈阳性反应。
本发明从上海市首例确诊SARS患者分离、培养成功新型冠状病毒“SARS-CoV-Fudan-I株”，并且可被传代培养。所述确诊SARS患者病原学培养检测，排除了呼吸道常见的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒感染。
本发明提供的新型冠状病毒毒株冠状病毒复旦I株，为地区SARS病毒标准株，能确定病原，诊断SARS疾病，可以对可疑SARS病原变异进行比较，作为SARS病原学诊断与SARS抗体诊断方法的金标准。为SARS诊断试剂制备、抗SARS疫苗的研究与生产、抗SARS药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物提供基础和依据。
实施例2将分离感染病毒发生病变的Vero E6细胞制细胞片，细胞发生病变时，取出感染细胞滴片，放入CO235℃条件下培养，使细胞贴壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未贴壁的细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃ 30min，凉干。滴入1∶10稀释的来自确诊的SARS病人三周后的恢复期血清，放入温盒内37℃作用30min，用0.0lmol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液体。滴加荧光标记羊抗人IgG抗体，购自CHEMICON公司，放入温盒内37℃作用30min，用0.01mol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液体。经间接免疫荧光染色，可见到感染细胞边缘呈半月状着色，荧光明显。正常Vero E6细胞则无荧光着色细胞。表明病变的Vero E6细胞被感染病毒。上述方法能确定病原，诊断疾病，可作为SARS病原学诊断与SARS抗体诊断方法的金标准。
权利要求
1.一种新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株CGMCC NO.0942，其具有下述特征，①感染细胞有病变，包括细胞发生融合，细胞核试验破碎，高尔基体形成形成网状，絮状相联；②病毒在细胞质和内质网组织囊腔中，细胞外颗粒成簇，沿质膜表面分布；③荧光染色呈阳性反应，电镜负染显示具有放射状表面的冠状病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株，其特征是所述病毒株直径在60-100nm。
3.权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备SARS诊断试剂中的用途。
4.权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备抗SARS疫苗中的用途。
5.权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备抗SARS病毒的消毒药物中的用途。
全文摘要
本发明属微生物病毒领域，涉及冠状病毒的新毒株及其用途。本发明通过对确诊SARS病人的咽拭细胞培养，分离出新型冠状病毒，命名SARS冠状病毒复旦I株，经感染Vero E6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原体后，证实所分离的冠状病毒为新冠状病毒的变异毒株，本毒株，可以对可疑SARS病原变异进行比较，为SARS诊断试剂制备、抗SARS疫苗的研究与生产、抗SARS药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物提供基础和依据。
文档编号A61K39/215GK1450164SQ03129248
公开日2003年10月22日 申请日期2003年6月11日 优先权日2003年6月11日
发明者姜庆五, 居丽雯, 李子华, 林玉尊, 俞顺章 申请人:复旦大学
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