芳杂环羧酸衍生物，制备方法及在药学上的应用的制作方法
专利名称：芳杂环羧酸衍生物，制备方法及在药学上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属药物合成领域，具体涉及芳杂环羧酸衍生物，制备方法和在药学上的应用。
自1981年发现第一例艾滋病至今，全世界范围艾滋病毒感染呈直线上升趋势，全球艾滋病患者和病毒携带者总人数达到了3430万。据预测世界上将有1亿以上HIV感染者，而且第三世界感染的发病率将明显上升，亚洲将占42％，非洲占3l％。据联合国艾滋病规划署统计，亚洲的艾滋病患者5年后将从目前的600万人增加到800万人。我国艾滋病的流行经过散发期、局部流行期，已转入广泛流行期。近几年发现的艾滋病患者几乎达到前10年的总和，流行范围也迅速扩大，疫情涉及全国31个省、自治区、直辖市。目前全国已有31个省、自治区、直辖市报告艾滋病病毒感染者18000例，而实际感染人数估计超过60万人，艾滋病加速流行形势十分严峻。
在一些地区和一些人群中，感染病毒的比例很高，而且感染的人数每年增加30％。当前我国艾滋病感染者主要分布在农村地区，其中，经吸毒途径感染艾滋病病毒者约占70％，18-39岁的感染者占60％。近年来，在各类高危人群的哨点监测中，发现艾滋病病毒感染者的人数明显增多，阳性率明显增高。这种严峻的国内外形势充分说明研制低毒有效的抗HIV药物的迫切性。
根据研究结果，在感染HIV-1病毒粒子吸附到宿主T淋巴细胞上以后，目前有四种阻断HIV-1生命周期的抑制剂(1)逆转录酶抑制剂(2)整合酶抑制剂(3)蛋白酶抑制剂(4)锌指蛋白抑制剂。但是，至今只有逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂已被批准用于HIV感染的治疗，二者配伍使用效果更好，但由于HIV复制缺乏保真性，突变发生而致使抗病毒药物产生耐药性，近期有报道，即使采用上述二者抑制剂的联合治疗方案，艾滋病复发的趋势仍不能有效阻止。
为此，进一步研制开发有效的抗HIV药物不仅对于临床治疗艾滋病患者带来新的希望，而且为深入阐明其抗HIV的作用机理以及寻找更有效抑制剂提供新的有益启示。
本发明芳杂环羧酸衍生物具有下述式I或II结构 其中X＝NH，S，OC-R1与N可成双键；C-R3与C-R4可成双键。
R1，R3为COOH，CONHR，CH2OH，CH2OCOR，CH2OR。
R4、R5、R6、R7和R8可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羧基，羧酸酯，酮基，羟基，酰胺基或胺基。
Y＝N，CHR1为取代的含一个或两个杂原子的五元芳杂环，R2为H，H2，羰基，R4，R5为H，OCH3，卤素，烷基，
R6为H，OH，OCOR，OCOAr。
本发明芳杂环羧酸衍生物通过体外药效学研究，包括不同浓度的药物进行体外HIV-1病毒抑制试验、毒理学研究(LD50试验)和微生物的回复突变试验(Ames试验)，显示良好的抗HIV活性和较小的毒副作用，在体外对艾滋病病毒HIV株DP13、IIIB均具较好抑制作用，其作用强度相当于或略强于已知抗艾滋病药物AZT。
本发明的优选化合物具有下述化合物1、2、3的结构 上述化合物通过体外药效学试验，在体外对艾滋病病毒HIV株DP13、IIIB均具较好抑制作用，其作用强度相当于或略强于已知抗艾滋病药物AZT。
本发明所要解决的另一技术问题，是公开上述芳杂环羧酸衍生物的制备方法。
本发明公开的式I芳杂环羧酸衍生物通过以下技术路线获得以色胺或取代色胺为原料，与醛、酮反应，经仿生Pictet-Spengler环合反应后生成四氢-β-咔啉中间体，经脱氢反应后生成β-咔啉衍生物，再经官能团转化反应制得产物。
本发明以杂环二羧酸为原料，经脱水后和胺类反应生成吡嗪并杂环中间体，再经不同的官能团转化反应制得化合物芳杂环羧酸衍生物吡嗪并杂环醇酯。
本发明实施例1详细描述了化合物1的制备方法，化合物1的制备过程如下式 化合物1的制备工艺包括色氨酸、固体氢氧化钠及蒸馏水搅拌至全溶。加入36％甲醛室温搅拌2小时后，回流3小时。用5N盐酸调至pH5，冷却、过滤、洗涤，真空干燥得化合物4。化合物4加入无水乙醇，冰水浴冷却下通入干燥氯化氢气体，固体析出，升温回流，6小时后停止反应，蒸去溶剂量，得白色固体。用25％氨水调节pH至10，氯仿提取，水洗干燥，过滤，蒸干得到黄色产品5。无水苯、化合物5及乙二胺分水回流36小时后蒸去溶剂，得黄色固体，用PTLC分离得黄色固体化合物1。
本发明实施例2，详细描述了化合物2的制备方法，化合物2的制备过程如下式
化合物2的制备工艺包括色胺、36％盐酸和水，搅拌溶解后加入单水乙醛酸溶液，然后加20％氢氧化钾水溶液，调节pH至4，过滤，洗涤，干燥，得化合物6。6和氯化氢甲醇饱和溶液室温搅拌30分钟后升温回流9小时，冷至室温，放入冰箱过夜。次日减压蒸去溶剂，得褐色固体。加入14％氨水调节pH至14，氯仿提取，洗涤，干燥，过滤，蒸干，得7。酯化产物7、硫磺和二甲苯回流1天。减压蒸去溶剂，用PTLC进行分得β-咔啉8。8、乙二胺和无水苯分水回流4.5小时后，减压蒸去溶剂，用PTLC分离得化合物2。
本发明实施例3，详细描述了化合物3的制备方法，化合物3的制备过程如下式 化合物3的制备工艺包括1.化合物9在DioX/H2O中冷却下，分次加入KBH4，得深黄色悬浊反应液。快速搅拌下慢慢将上述反应液倾入放有蒸馏水和冰醋酸杯中，滤取析出的黄色固体，用蒸馏水洗，抽干得粗品。粗品加CHCl3搅拌0.5h，砂芯漏斗抽滤，洗涤，烘干得化合物10。烧瓶内加入氯甲酸对甲苄酯和苯，用旋转蒸发仪共沸脱水干燥后，加入CH2Cl2，加热回流，从冷凝管底部慢慢加入Et3N后，再加热回流10分钟，向瓶内加入10和CH2Cl2，加热搅拌回流20-30h。减压蒸去溶剂，抽干，向瓶内残留物加入蒸馏水，室温下搅拌，滤取固体，干燥后得化合物3。
本发明所要解决的另一技术问题是公开化合物芳杂环羧酸衍生物在制备和作为抗HIV药物中的应用。
本发明化合物芳杂环羧酸衍生物经人淋巴细胞体外抗HIV试验，结果表明具有与阳性对照药AZT相当的抗HIV活性，尤其在药物先和细胞作用，再加入HIV病毒的试验中化合物3和化合物2均具明显抑制作用，略强于目前临床应用的AZT。毒理学研究，LD50试验结果显示毒性小，LD50＞2500mg/kg。微生物的回复突变试验，Ames试验显示其无致突变作用。本发明化合物芳杂环羧酸衍生物显示了很好的抗HIV活性和较小的毒副作用，可研制为治疗HIV的新药。
2.在50ml茄形瓶中加入无水乙醇10ml，化合物40.5g(2.3mmol)，冰水浴冷却下通入干燥氯化氢气体，反应液逐渐澄清，随后有固体析出，移去冰水浴，升温回流，反应用TLC(正丁醇/醋酸/水，5∶1∶1)跟踪，6小时后停止反应，蒸去溶剂量，得白色固体。向内加入少许冰水，然后用25％氨水调节pH至10，得黄色混浊液，用氯仿(5×10ml)提取，合并淡黄色氯仿提取液，用水洗至中性，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸去氯仿，得到黄色产品3-甲氧羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉50.4g，收率75.6％。
3.在50ml圆底烧瓶内加入无水苯50ml、3-甲氧羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉5102mg(0.44mmol)及1ml乙二胺(14.96mmol)，装上分水装置和干燥管，油浴100～105℃回流36小时，TLC检测原料斑点消失(甲醇/氨水，100∶1.5)，停止反应，蒸去溶剂，得黄色固体，用PTLC进行分离，展开剂同上，用甲醇洗脱，过滤，蒸去溶剂，得黄色固体3-氨乙胺基羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉125mg，mp187～190℃，收率为21.9％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ7.22(d，1H，C5-H)，7.09(q，1H，C8-H)，6.87(t，1H，C7-H)，6.80(t，1H，C7-H)，3.87(dd，2H，C1-2H)，3.40(dd，2H，C3-2H)，3.22(m，2H，C3’-2H)，2.86(dd，1H，C4-H)，2.59-2.66(m，3H，C4’-2H，C4-H)；EIMSm/z 258(M++1，39.8％)，171(100％)；IR(cm-1)(KBr)3390，3280，3050，1651，1648；UV(cm-1)227，272，287(ep.)。
实施例2合成化合物21-(氨乙胺基-羰基)-β-咔啉1.在100ml圆底烧瓶中加入色胺4.68g(29.25mmol)、3ml 36％盐酸(29.6mmol)和75ml水，油浴55℃磁力搅拌，色胺大部溶解得棕色反应液，冷至室温，加入单水乙醛酸2.78g(29.3mmol)溶于3ml水所得的溶液，缓慢加入20％氢氧化钾水溶液，调节pH至4，有米色沉淀析出，室温搅拌1小时，过滤，充分洗涤滤饼，抽干，红外灯下干燥，得产品1，2，3，4-四氢-β-咔啉-1-甲酸65.84g，收率92.4％。所述粗品可不经重结晶直接用于下步反应。
2.在100ml茄形瓶中加入化合物62.0g(9.26mmol)和氯化氢甲醇饱和溶液50ml，体系充氮，室温搅拌得褐色溶液，搅拌30分钟后升温回流9小时，冷至室温，放入冰箱过夜。次日用水泵抽去瓶中的氯化氢气体，减压蒸去溶剂，得褐色固体。向内加入14％氨水调节pH至14，室温搅拌，有固体不溶，加入氯仿50ml，充分搅拌30分钟，分取红棕色有机层，水层用氯仿提取(2×30ml)，合并氯仿液，用饱和氯化钠溶液洗涤(2×20ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸去氯仿，得红棕色固体1-甲氧羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉7，产品重2.03g，收率为95.1％，TLC检测为一个斑点(正丁醇/冰醋酸/水，5∶1∶1)。
3.在100ml茄形瓶中加入酯化产物70.5g(2.12mmol)、硫磺1.0g(31.25mmol)和二甲苯40ml，油浴回流1天。减压蒸去溶剂，用PTLC进行分离，展开剂为氯仿∶甲醇＝19∶1，用甲醇洗脱，蒸去溶剂，得红棕色固体1-甲氧羰基-β-咔啉8264mg，mp158～160℃(文献mp168～169℃)，收率55.1％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ9.87(br，1H，C9-H)，8.57(d，1H，C3-H)，8.16-7.55(d，5H，C4，5，6，7，8-H)，4.09(s，3H，-COOCH3)；EIMSm/z 226(M+，36.8％)，168(100％)。
4.将1-甲氧羰基-β-咔啉834.9mg(0.15mmol)、1ml乙二胺(14.96mmol)和30ml无水苯加入100ml圆底烧瓶，装上分水装置和干燥管，油浴100℃回流4.5小时后TLC检测发现原料斑点消失(甲醇/氨水，100∶1.5)，停止反应，减压蒸去溶剂，用PTLC分离，展开剂同上，洗脱剂为甲醇，得到产物1-(氨乙胺基-羰基)-β-咔啉222.8mg，mp＞310℃，收率77.6％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ8.38(d，1H，J＝5.4Hz，C3-H)，8.19(d，1H，J＝5.4Hz，C4-H)，8.14-7.31(m，4H，C5，6，7，8-4H)，3.58(m，2H，C3’-H)，2.92(m，2H，C4’-2H)；EIMSm/z 254(M+，13.2％)，168(100％)；IR(cm-1)(KBr)3390，1610；UV(cm-1)223，253，299，360。
实施例3合成化合物36(5-氯吡啶-2-基)-7-(对甲基苯基羰氧基)-5，6-二氢吡咯[3，4-b]吡嗪-5-酮1.在烧杯内加入化合物919g和DioX/H2O(19/1)190ml，快速搅拌并冷水(10-12℃)冷却，分次小量加入KBH4(加前用刮刀碾碎)3.99g，维持反应液内温12-14℃，10-15分钟加完KBH4，悬浊液在反应中变厚，变深黄色。再在12-13℃搅拌10-15分钟，得深黄色悬浊反应液。
在另一冰水冷却的2000ml烧杯内放蒸馏水950ml和冰醋酸13ml，在快速搅拌下慢慢将上述反应液倾入到此杯中，15-25分钟加完。搅拌，气泡消失后复测反应液PH，加入冰HoAC，使PH为5-6，继续搅拌并用冰冷却(0-6℃)2-3h。滤取析出的黄色固体，用50ml蒸馏水洗滤饼，抽干，粗品于40℃左右红外干燥或置于真空干燥器内(KOH或K2CO3)，干重18.8g。将上述粗品加到250ml三角烧瓶内，加80mlCHCl3充，室温搅拌0.5h，用砂芯漏斗小心抽滤，再用30mlCHCl3充分洗涤滤饼，压干，烘干(40℃空气干燥)，称得11.4g产品10，，收率59.5％。重量收率60％。
2.在250ml茄形烧瓶内加入氯甲酸对甲苄酯8.3g和50ml苯，用旋转蒸发仪加惹共沸脱水干燥后，加入CH2Cl2 50ml，加热回流，从冷凝管底部慢慢加入(在搅拌下)Et3N 22.5ml，加完后再加热回流10分钟左右，将反应瓶移出热源，稍冷后，移去冷凝管，向瓶内一次加入碾碎的106.8g和CH2Cl2 50ml，再加热搅拌回流(冷凝管顶部装CaCl2管)20-30h[2-3]。减压蒸去所有溶剂，抽干，滤液不超过80℃。冷至RT，向瓶内残留物加入蒸馏水，室温下搅拌，滤取黄色松散状固体，干燥(600-700MHg)4-8h后，得3粗品10-11g。粗品中加入50ml醋酸乙酯，回流溶解后再加入异丙醚(10-15ml)，冷至室温，析出粒状黄色结晶，滤取结晶，洗涤，得产品6.8g。真空加热干燥(60-80℃/＜10mmHg)至恒量。3为近白色结晶，收率67％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ8.96(d，1H)，8.83(d，1H)，8.23(s，1H)，7.79(s，1H)，7.75-7.72(d，1H)，7.49-7.47(d，1H)，7.35(m，2H)，7.16-7.11(m，2H)，2.24(s，3H)；EIMSm/z 396(M+)。
实施例4化合物的体外抗HIV活性测试1.测试方法对所测化合物进行实验室HIV-1病毒株和原发感染株药物体外抗HIV试验。抑制试验所用靶细胞为经植物血凝素刺激后的正常人外周血淋巴细胞；2-4病毒株(JRCSF，DPB，JRFL，IIIB)试验，病毒量为100TCID50，使用不同浓度的药物进行两种体外HIV-1病毒抑制试验方法一为药物加病毒培养后再加细胞，二为病毒与细胞培养后加药物。病毒培养应用HIV-1P24抗原检测其病毒培养液HIV-1P24抗原的表达情况，并根据P24抗原检测结果，计算该药物抑制病毒率和EC50，并与阳性对照药AZT的结果进行比较。
2.试验结果对被测化合物进行人淋巴细胞体外抗HIV试验，结果表明本发明化合物有与阳性对照药AZT相当的抗HIV活性，尤其在药物先和细胞作用，再加入HIV病毒的试验中，本发明化合物3和化合物2均具明显抑制作用，略强于目前临床应用的AZT。表1是人淋巴细胞体外抗HIV试验结果(EC50)。表1
实施例5化合物的毒理学研究
LD50试验受试动物昆明种小鼠，腹腔注射受试药物的CMC溶液。然后观察动物反应及死亡情况(一周)，经统计，结果表明化合物毒性小，LD50＞2500mg/kg。表2是毒理学LD50试验结果(七天内小鼠死亡情况)。
表2
实施例6化合物的微生物回复突变试验(Ames试验)1.阴性对照用DMSO；阳性对照选用公认的有致突变作用的物质非活化(不加S9)者TA102用MMS，TA100用SA，TA98用2，7-2AF，TA97用9A，；活化(加S9)者TA102，TA100，TA98和TA97均用2-AF。
2.菌株采用鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA102，TA100，TA98，TA97，TA102和TA100用于检测置换型基因突变，TA98和TA97用于检测移码型基因突变，菌株由美国加州大学Ames试验室提供，保存于-80℃冰箱，均经四步法鉴定合格。
3.用二甲基亚砜按浓度递减原则将受试物配成100ug/ml，1mg/ml，5mg/ml，10mg/ml和50mg/ml五个浓度，实验时每皿加入0.1ml。
4.大鼠肝匀浆微粒体酶系(S9)由多氯联苯(Aroclor 1254)诱导，-80℃低温冰箱保存。使用时用BaP或2-AF测定其活力。
5.实验采用标准平皿渗入法，每个受试浓度作三个平行平皿，每一平皿加受试液0.1ml，37℃温箱培养48小时后以自动菌落计数仪计数菌落，每个试验重复一次。
6.结果所有浓度的所试化合物均无致突变作用。
表3、4是本发明化合物的Ames试验结果。
表3----------------------------------------------------------------------------□SAM/CON TA100+S9TA100-S9 TA98+S9 TA98-S9------------------------------------------------------------------------------DMSO0.00136.0±7.0 116.0±6.2 37.3±2.5 26.7±1.5化合物35000104.7±7.5 86.3±3.5 29.7±3.5 20.3±3.11000120.7±4.9 103.7±6.0 34.3±3.8 30.0±2.6500 131.0±2.6 120.0±6.2 37.7±6.1 37.3±1.5100 137.3±5.5 115.0±6.6 43.0±3.6 39.0±3.610 131.3±3.5 110.7±3.1 51.3±3.2 51.0±2.0SA1.00--- 769.3±22.2** --- ---2-AF10.0912.3±26.9** ---723.0±57.7** ---2，7-AF100 --- ------ 817.7±30.0**-----------------------------------------------------------------------------*＞＝2*C**＞＝3*C (X±S)表4------------------------------------------------------------------------------SAM/CONTA102+S9 TA102-S9TA97+S9 TA97-S9------------------------------------------------------------------------------DMSO0.00 264.3±20.1207.7±11.0 133.3±5.5 122.7±9.7化合物35000 264.7±7.4 216.0±13.7 120.3±8.3 106.3±7.61000 270.7±15.3201.0±12.5 110.7±2.9 105.3±11.2500275.7±15.8187.7±6.1 115.0±6.0 109.7±7.6100266.7±12.1192.3±10.3 117.7±8.5 111.7±3.810 273.0±11.5186.0±7.0 103.0±5.6 104.7±11.9MMS4.00 ---799.7±44.5** --- ---2-AF10.00 979.3±35.5** --- 885.0±84.7** ---PA50.00 ------ --- 873.7±50.6**------------------------------------------------------------------------------*＞＝2*C**＞＝3*C (X±S)
权利要求
1.芳杂环羧酸衍生物，具有下述式I或II结构 其中X＝NH，S，OC-R1与N可成双键；C-R3与C-R4可成双键。R1，R3为COOH，CONHR，CH2OH，CH2OCOR，CH2OR。R4、R5、R6、R7和R8可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羧基，羧酸酯，酮基，羟基，酰胺基或胺基。其中Y＝N，CHR1为取代的含一个或两个杂原子的五元芳杂环，R2为H，H2，羰基，R4，R5为H，OCH3，卤素，烷基，R6为H，OH，OCOR，OCOAr。
2.根据权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物，其特征是所述衍生物是具有下述式结构的化合物，
3.根据权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物，其特征是所述衍生物是具有下述式结构的化合物
4.根据权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物，其特征是所述衍生物是具有下述式结构的化合物
5.权利要求2所述的芳杂环羧酸衍生物的制备方法，其制备过程如下式
6.权利要求3所述的芳杂环羧酸衍生物的制备方法，其制备过程如下式
7.权利要求4所述的芳杂环羧酸衍生物的制备方法，其制备过程如下式
8.芳杂环羧酸衍生物在制备治疗艾滋病毒感染药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及芳杂环羧酸衍生物，制备方法和在药学上的应用。本发明化合物通过在人淋巴细胞上体外抗HIV试验，结果表明具有与阳性对照药AZT相当甚至略强的抗HIV活性。毒理学研究(LD
文档编号A61P31/18GK1472208SQ0312936
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者闻韧, 黄磊, 蒋为群, 董肖椿, 王浩, 周佩, 闻 韧 申请人:复旦大学
技术领域：
本发明属药物合成领域，具体涉及芳杂环羧酸衍生物，制备方法和在药学上的应用。
自1981年发现第一例艾滋病至今，全世界范围艾滋病毒感染呈直线上升趋势，全球艾滋病患者和病毒携带者总人数达到了3430万。据预测世界上将有1亿以上HIV感染者，而且第三世界感染的发病率将明显上升，亚洲将占42％，非洲占3l％。据联合国艾滋病规划署统计，亚洲的艾滋病患者5年后将从目前的600万人增加到800万人。我国艾滋病的流行经过散发期、局部流行期，已转入广泛流行期。近几年发现的艾滋病患者几乎达到前10年的总和，流行范围也迅速扩大，疫情涉及全国31个省、自治区、直辖市。目前全国已有31个省、自治区、直辖市报告艾滋病病毒感染者18000例，而实际感染人数估计超过60万人，艾滋病加速流行形势十分严峻。
在一些地区和一些人群中，感染病毒的比例很高，而且感染的人数每年增加30％。当前我国艾滋病感染者主要分布在农村地区，其中，经吸毒途径感染艾滋病病毒者约占70％，18-39岁的感染者占60％。近年来，在各类高危人群的哨点监测中，发现艾滋病病毒感染者的人数明显增多，阳性率明显增高。这种严峻的国内外形势充分说明研制低毒有效的抗HIV药物的迫切性。
根据研究结果，在感染HIV-1病毒粒子吸附到宿主T淋巴细胞上以后，目前有四种阻断HIV-1生命周期的抑制剂(1)逆转录酶抑制剂(2)整合酶抑制剂(3)蛋白酶抑制剂(4)锌指蛋白抑制剂。但是，至今只有逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂已被批准用于HIV感染的治疗，二者配伍使用效果更好，但由于HIV复制缺乏保真性，突变发生而致使抗病毒药物产生耐药性，近期有报道，即使采用上述二者抑制剂的联合治疗方案，艾滋病复发的趋势仍不能有效阻止。
为此，进一步研制开发有效的抗HIV药物不仅对于临床治疗艾滋病患者带来新的希望，而且为深入阐明其抗HIV的作用机理以及寻找更有效抑制剂提供新的有益启示。
本发明芳杂环羧酸衍生物具有下述式I或II结构 其中X＝NH，S，OC-R1与N可成双键；C-R3与C-R4可成双键。
R1，R3为COOH，CONHR，CH2OH，CH2OCOR，CH2OR。
R4、R5、R6、R7和R8可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羧基，羧酸酯，酮基，羟基，酰胺基或胺基。
Y＝N，CHR1为取代的含一个或两个杂原子的五元芳杂环，R2为H，H2，羰基，R4，R5为H，OCH3，卤素，烷基，
R6为H，OH，OCOR，OCOAr。
本发明芳杂环羧酸衍生物通过体外药效学研究，包括不同浓度的药物进行体外HIV-1病毒抑制试验、毒理学研究(LD50试验)和微生物的回复突变试验(Ames试验)，显示良好的抗HIV活性和较小的毒副作用，在体外对艾滋病病毒HIV株DP13、IIIB均具较好抑制作用，其作用强度相当于或略强于已知抗艾滋病药物AZT。
本发明的优选化合物具有下述化合物1、2、3的结构 上述化合物通过体外药效学试验，在体外对艾滋病病毒HIV株DP13、IIIB均具较好抑制作用，其作用强度相当于或略强于已知抗艾滋病药物AZT。
本发明所要解决的另一技术问题，是公开上述芳杂环羧酸衍生物的制备方法。
本发明公开的式I芳杂环羧酸衍生物通过以下技术路线获得以色胺或取代色胺为原料，与醛、酮反应，经仿生Pictet-Spengler环合反应后生成四氢-β-咔啉中间体，经脱氢反应后生成β-咔啉衍生物，再经官能团转化反应制得产物。
本发明以杂环二羧酸为原料，经脱水后和胺类反应生成吡嗪并杂环中间体，再经不同的官能团转化反应制得化合物芳杂环羧酸衍生物吡嗪并杂环醇酯。
本发明实施例1详细描述了化合物1的制备方法，化合物1的制备过程如下式 化合物1的制备工艺包括色氨酸、固体氢氧化钠及蒸馏水搅拌至全溶。加入36％甲醛室温搅拌2小时后，回流3小时。用5N盐酸调至pH5，冷却、过滤、洗涤，真空干燥得化合物4。化合物4加入无水乙醇，冰水浴冷却下通入干燥氯化氢气体，固体析出，升温回流，6小时后停止反应，蒸去溶剂量，得白色固体。用25％氨水调节pH至10，氯仿提取，水洗干燥，过滤，蒸干得到黄色产品5。无水苯、化合物5及乙二胺分水回流36小时后蒸去溶剂，得黄色固体，用PTLC分离得黄色固体化合物1。
本发明实施例2，详细描述了化合物2的制备方法，化合物2的制备过程如下式
化合物2的制备工艺包括色胺、36％盐酸和水，搅拌溶解后加入单水乙醛酸溶液，然后加20％氢氧化钾水溶液，调节pH至4，过滤，洗涤，干燥，得化合物6。6和氯化氢甲醇饱和溶液室温搅拌30分钟后升温回流9小时，冷至室温，放入冰箱过夜。次日减压蒸去溶剂，得褐色固体。加入14％氨水调节pH至14，氯仿提取，洗涤，干燥，过滤，蒸干，得7。酯化产物7、硫磺和二甲苯回流1天。减压蒸去溶剂，用PTLC进行分得β-咔啉8。8、乙二胺和无水苯分水回流4.5小时后，减压蒸去溶剂，用PTLC分离得化合物2。
本发明实施例3，详细描述了化合物3的制备方法，化合物3的制备过程如下式 化合物3的制备工艺包括1.化合物9在DioX/H2O中冷却下，分次加入KBH4，得深黄色悬浊反应液。快速搅拌下慢慢将上述反应液倾入放有蒸馏水和冰醋酸杯中，滤取析出的黄色固体，用蒸馏水洗，抽干得粗品。粗品加CHCl3搅拌0.5h，砂芯漏斗抽滤，洗涤，烘干得化合物10。烧瓶内加入氯甲酸对甲苄酯和苯，用旋转蒸发仪共沸脱水干燥后，加入CH2Cl2，加热回流，从冷凝管底部慢慢加入Et3N后，再加热回流10分钟，向瓶内加入10和CH2Cl2，加热搅拌回流20-30h。减压蒸去溶剂，抽干，向瓶内残留物加入蒸馏水，室温下搅拌，滤取固体，干燥后得化合物3。
本发明所要解决的另一技术问题是公开化合物芳杂环羧酸衍生物在制备和作为抗HIV药物中的应用。
本发明化合物芳杂环羧酸衍生物经人淋巴细胞体外抗HIV试验，结果表明具有与阳性对照药AZT相当的抗HIV活性，尤其在药物先和细胞作用，再加入HIV病毒的试验中化合物3和化合物2均具明显抑制作用，略强于目前临床应用的AZT。毒理学研究，LD50试验结果显示毒性小，LD50＞2500mg/kg。微生物的回复突变试验，Ames试验显示其无致突变作用。本发明化合物芳杂环羧酸衍生物显示了很好的抗HIV活性和较小的毒副作用，可研制为治疗HIV的新药。
2.在50ml茄形瓶中加入无水乙醇10ml，化合物40.5g(2.3mmol)，冰水浴冷却下通入干燥氯化氢气体，反应液逐渐澄清，随后有固体析出，移去冰水浴，升温回流，反应用TLC(正丁醇/醋酸/水，5∶1∶1)跟踪，6小时后停止反应，蒸去溶剂量，得白色固体。向内加入少许冰水，然后用25％氨水调节pH至10，得黄色混浊液，用氯仿(5×10ml)提取，合并淡黄色氯仿提取液，用水洗至中性，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸去氯仿，得到黄色产品3-甲氧羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉50.4g，收率75.6％。
3.在50ml圆底烧瓶内加入无水苯50ml、3-甲氧羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉5102mg(0.44mmol)及1ml乙二胺(14.96mmol)，装上分水装置和干燥管，油浴100～105℃回流36小时，TLC检测原料斑点消失(甲醇/氨水，100∶1.5)，停止反应，蒸去溶剂，得黄色固体，用PTLC进行分离，展开剂同上，用甲醇洗脱，过滤，蒸去溶剂，得黄色固体3-氨乙胺基羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉125mg，mp187～190℃，收率为21.9％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ7.22(d，1H，C5-H)，7.09(q，1H，C8-H)，6.87(t，1H，C7-H)，6.80(t，1H，C7-H)，3.87(dd，2H，C1-2H)，3.40(dd，2H，C3-2H)，3.22(m，2H，C3’-2H)，2.86(dd，1H，C4-H)，2.59-2.66(m，3H，C4’-2H，C4-H)；EIMSm/z 258(M++1，39.8％)，171(100％)；IR(cm-1)(KBr)3390，3280，3050，1651，1648；UV(cm-1)227，272，287(ep.)。
实施例2合成化合物21-(氨乙胺基-羰基)-β-咔啉1.在100ml圆底烧瓶中加入色胺4.68g(29.25mmol)、3ml 36％盐酸(29.6mmol)和75ml水，油浴55℃磁力搅拌，色胺大部溶解得棕色反应液，冷至室温，加入单水乙醛酸2.78g(29.3mmol)溶于3ml水所得的溶液，缓慢加入20％氢氧化钾水溶液，调节pH至4，有米色沉淀析出，室温搅拌1小时，过滤，充分洗涤滤饼，抽干，红外灯下干燥，得产品1，2，3，4-四氢-β-咔啉-1-甲酸65.84g，收率92.4％。所述粗品可不经重结晶直接用于下步反应。
2.在100ml茄形瓶中加入化合物62.0g(9.26mmol)和氯化氢甲醇饱和溶液50ml，体系充氮，室温搅拌得褐色溶液，搅拌30分钟后升温回流9小时，冷至室温，放入冰箱过夜。次日用水泵抽去瓶中的氯化氢气体，减压蒸去溶剂，得褐色固体。向内加入14％氨水调节pH至14，室温搅拌，有固体不溶，加入氯仿50ml，充分搅拌30分钟，分取红棕色有机层，水层用氯仿提取(2×30ml)，合并氯仿液，用饱和氯化钠溶液洗涤(2×20ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸去氯仿，得红棕色固体1-甲氧羰基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉7，产品重2.03g，收率为95.1％，TLC检测为一个斑点(正丁醇/冰醋酸/水，5∶1∶1)。
3.在100ml茄形瓶中加入酯化产物70.5g(2.12mmol)、硫磺1.0g(31.25mmol)和二甲苯40ml，油浴回流1天。减压蒸去溶剂，用PTLC进行分离，展开剂为氯仿∶甲醇＝19∶1，用甲醇洗脱，蒸去溶剂，得红棕色固体1-甲氧羰基-β-咔啉8264mg，mp158～160℃(文献mp168～169℃)，收率55.1％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ9.87(br，1H，C9-H)，8.57(d，1H，C3-H)，8.16-7.55(d，5H，C4，5，6，7，8-H)，4.09(s，3H，-COOCH3)；EIMSm/z 226(M+，36.8％)，168(100％)。
4.将1-甲氧羰基-β-咔啉834.9mg(0.15mmol)、1ml乙二胺(14.96mmol)和30ml无水苯加入100ml圆底烧瓶，装上分水装置和干燥管，油浴100℃回流4.5小时后TLC检测发现原料斑点消失(甲醇/氨水，100∶1.5)，停止反应，减压蒸去溶剂，用PTLC分离，展开剂同上，洗脱剂为甲醇，得到产物1-(氨乙胺基-羰基)-β-咔啉222.8mg，mp＞310℃，收率77.6％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ8.38(d，1H，J＝5.4Hz，C3-H)，8.19(d，1H，J＝5.4Hz，C4-H)，8.14-7.31(m，4H，C5，6，7，8-4H)，3.58(m，2H，C3’-H)，2.92(m，2H，C4’-2H)；EIMSm/z 254(M+，13.2％)，168(100％)；IR(cm-1)(KBr)3390，1610；UV(cm-1)223，253，299，360。
实施例3合成化合物36(5-氯吡啶-2-基)-7-(对甲基苯基羰氧基)-5，6-二氢吡咯[3，4-b]吡嗪-5-酮1.在烧杯内加入化合物919g和DioX/H2O(19/1)190ml，快速搅拌并冷水(10-12℃)冷却，分次小量加入KBH4(加前用刮刀碾碎)3.99g，维持反应液内温12-14℃，10-15分钟加完KBH4，悬浊液在反应中变厚，变深黄色。再在12-13℃搅拌10-15分钟，得深黄色悬浊反应液。
在另一冰水冷却的2000ml烧杯内放蒸馏水950ml和冰醋酸13ml，在快速搅拌下慢慢将上述反应液倾入到此杯中，15-25分钟加完。搅拌，气泡消失后复测反应液PH，加入冰HoAC，使PH为5-6，继续搅拌并用冰冷却(0-6℃)2-3h。滤取析出的黄色固体，用50ml蒸馏水洗滤饼，抽干，粗品于40℃左右红外干燥或置于真空干燥器内(KOH或K2CO3)，干重18.8g。将上述粗品加到250ml三角烧瓶内，加80mlCHCl3充，室温搅拌0.5h，用砂芯漏斗小心抽滤，再用30mlCHCl3充分洗涤滤饼，压干，烘干(40℃空气干燥)，称得11.4g产品10，，收率59.5％。重量收率60％。
2.在250ml茄形烧瓶内加入氯甲酸对甲苄酯8.3g和50ml苯，用旋转蒸发仪加惹共沸脱水干燥后，加入CH2Cl2 50ml，加热回流，从冷凝管底部慢慢加入(在搅拌下)Et3N 22.5ml，加完后再加热回流10分钟左右，将反应瓶移出热源，稍冷后，移去冷凝管，向瓶内一次加入碾碎的106.8g和CH2Cl2 50ml，再加热搅拌回流(冷凝管顶部装CaCl2管)20-30h[2-3]。减压蒸去所有溶剂，抽干，滤液不超过80℃。冷至RT，向瓶内残留物加入蒸馏水，室温下搅拌，滤取黄色松散状固体，干燥(600-700MHg)4-8h后，得3粗品10-11g。粗品中加入50ml醋酸乙酯，回流溶解后再加入异丙醚(10-15ml)，冷至室温，析出粒状黄色结晶，滤取结晶，洗涤，得产品6.8g。真空加热干燥(60-80℃/＜10mmHg)至恒量。3为近白色结晶，收率67％。1H NMR(CDCl3，ppm)δ8.96(d，1H)，8.83(d，1H)，8.23(s，1H)，7.79(s，1H)，7.75-7.72(d，1H)，7.49-7.47(d，1H)，7.35(m，2H)，7.16-7.11(m，2H)，2.24(s，3H)；EIMSm/z 396(M+)。
实施例4化合物的体外抗HIV活性测试1.测试方法对所测化合物进行实验室HIV-1病毒株和原发感染株药物体外抗HIV试验。抑制试验所用靶细胞为经植物血凝素刺激后的正常人外周血淋巴细胞；2-4病毒株(JRCSF，DPB，JRFL，IIIB)试验，病毒量为100TCID50，使用不同浓度的药物进行两种体外HIV-1病毒抑制试验方法一为药物加病毒培养后再加细胞，二为病毒与细胞培养后加药物。病毒培养应用HIV-1P24抗原检测其病毒培养液HIV-1P24抗原的表达情况，并根据P24抗原检测结果，计算该药物抑制病毒率和EC50，并与阳性对照药AZT的结果进行比较。
2.试验结果对被测化合物进行人淋巴细胞体外抗HIV试验，结果表明本发明化合物有与阳性对照药AZT相当的抗HIV活性，尤其在药物先和细胞作用，再加入HIV病毒的试验中，本发明化合物3和化合物2均具明显抑制作用，略强于目前临床应用的AZT。表1是人淋巴细胞体外抗HIV试验结果(EC50)。表1
实施例5化合物的毒理学研究
LD50试验受试动物昆明种小鼠，腹腔注射受试药物的CMC溶液。然后观察动物反应及死亡情况(一周)，经统计，结果表明化合物毒性小，LD50＞2500mg/kg。表2是毒理学LD50试验结果(七天内小鼠死亡情况)。
表2
实施例6化合物的微生物回复突变试验(Ames试验)1.阴性对照用DMSO；阳性对照选用公认的有致突变作用的物质非活化(不加S9)者TA102用MMS，TA100用SA，TA98用2，7-2AF，TA97用9A，；活化(加S9)者TA102，TA100，TA98和TA97均用2-AF。
2.菌株采用鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA102，TA100，TA98，TA97，TA102和TA100用于检测置换型基因突变，TA98和TA97用于检测移码型基因突变，菌株由美国加州大学Ames试验室提供，保存于-80℃冰箱，均经四步法鉴定合格。
3.用二甲基亚砜按浓度递减原则将受试物配成100ug/ml，1mg/ml，5mg/ml，10mg/ml和50mg/ml五个浓度，实验时每皿加入0.1ml。
4.大鼠肝匀浆微粒体酶系(S9)由多氯联苯(Aroclor 1254)诱导，-80℃低温冰箱保存。使用时用BaP或2-AF测定其活力。
5.实验采用标准平皿渗入法，每个受试浓度作三个平行平皿，每一平皿加受试液0.1ml，37℃温箱培养48小时后以自动菌落计数仪计数菌落，每个试验重复一次。
6.结果所有浓度的所试化合物均无致突变作用。
表3、4是本发明化合物的Ames试验结果。
表3----------------------------------------------------------------------------□SAM/CON TA100+S9TA100-S9 TA98+S9 TA98-S9------------------------------------------------------------------------------DMSO0.00136.0±7.0 116.0±6.2 37.3±2.5 26.7±1.5化合物35000104.7±7.5 86.3±3.5 29.7±3.5 20.3±3.11000120.7±4.9 103.7±6.0 34.3±3.8 30.0±2.6500 131.0±2.6 120.0±6.2 37.7±6.1 37.3±1.5100 137.3±5.5 115.0±6.6 43.0±3.6 39.0±3.610 131.3±3.5 110.7±3.1 51.3±3.2 51.0±2.0SA1.00--- 769.3±22.2** --- ---2-AF10.0912.3±26.9** ---723.0±57.7** ---2，7-AF100 --- ------ 817.7±30.0**-----------------------------------------------------------------------------*＞＝2*C**＞＝3*C (X±S)表4------------------------------------------------------------------------------SAM/CONTA102+S9 TA102-S9TA97+S9 TA97-S9------------------------------------------------------------------------------DMSO0.00 264.3±20.1207.7±11.0 133.3±5.5 122.7±9.7化合物35000 264.7±7.4 216.0±13.7 120.3±8.3 106.3±7.61000 270.7±15.3201.0±12.5 110.7±2.9 105.3±11.2500275.7±15.8187.7±6.1 115.0±6.0 109.7±7.6100266.7±12.1192.3±10.3 117.7±8.5 111.7±3.810 273.0±11.5186.0±7.0 103.0±5.6 104.7±11.9MMS4.00 ---799.7±44.5** --- ---2-AF10.00 979.3±35.5** --- 885.0±84.7** ---PA50.00 ------ --- 873.7±50.6**------------------------------------------------------------------------------*＞＝2*C**＞＝3*C (X±S)
权利要求
1.芳杂环羧酸衍生物，具有下述式I或II结构 其中X＝NH，S，OC-R1与N可成双键；C-R3与C-R4可成双键。R1，R3为COOH，CONHR，CH2OH，CH2OCOR，CH2OR。R4、R5、R6、R7和R8可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羧基，羧酸酯，酮基，羟基，酰胺基或胺基。其中Y＝N，CHR1为取代的含一个或两个杂原子的五元芳杂环，R2为H，H2，羰基，R4，R5为H，OCH3，卤素，烷基，R6为H，OH，OCOR，OCOAr。
2.根据权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物，其特征是所述衍生物是具有下述式结构的化合物，
3.根据权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物，其特征是所述衍生物是具有下述式结构的化合物
4.根据权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物，其特征是所述衍生物是具有下述式结构的化合物
5.权利要求2所述的芳杂环羧酸衍生物的制备方法，其制备过程如下式
6.权利要求3所述的芳杂环羧酸衍生物的制备方法，其制备过程如下式
7.权利要求4所述的芳杂环羧酸衍生物的制备方法，其制备过程如下式
8.芳杂环羧酸衍生物在制备治疗艾滋病毒感染药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及芳杂环羧酸衍生物，制备方法和在药学上的应用。本发明化合物通过在人淋巴细胞上体外抗HIV试验，结果表明具有与阳性对照药AZT相当甚至略强的抗HIV活性。毒理学研究(LD
文档编号A61P31/18GK1472208SQ0312936
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者闻韧, 黄磊, 蒋为群, 董肖椿, 王浩, 周佩, 闻 韧 申请人:复旦大学
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