牛膝的三萜类提取物及在抗骨质疏松药物的用途的制作方法
专利名称：牛膝的三萜类提取物及在抗骨质疏松药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从常用中药牛膝(Achyranthes bidentata Bl.的根)中得到的三萜类(包括三萜苷类)提取物，作为抗骨质疏松药物的应用。
骨组织是一个不断地进行新陈代谢的组织，是由成骨细胞，破骨细胞的偶联所控制。一旦他们之间的平衡遭到破坏，导致成骨细胞的活性降低或破骨细胞的活性增加就会造成骨质疏松症。此病患者的80％为女性，主要是由于女性绝经后，雌激素分泌的急剧下降，造成破骨细胞的活性增加，导致骨组织减少。目前的世界上常用药物主要是抑制破骨细胞的活性。尤其女性骨质疏松症的治疗大部分是使用雌激素补充疗法。但由于其严重的副作用使得许多妇女希望使用副作用小，天然的代替药物。中药，天然药物的宝库几千年来为我国人民的健康繁荣作出了巨大的贡献。从中药中寻找抗骨质疏松药物是新药研发的一条捷径。
牛膝为常用中药，对其化学成分的研究以进行了几十年，大量的化合物被报道，其中主要为三萜类化合物。现有专利申请涉及总甾提取物用于免疫用途，但是对其抗骨质疏松症未见报道。
提供从牛膝根中利用适当的溶媒，高效率的提取具有骨质疏松治疗作用而且副作用很小或没有副作用的提取物的方法。
提供牛膝提取物和其中提取的三萜类化合物及其该类化合物在骨质疏松治疗中的应用，如在剂型上的应用，如提供汤剂(口服液)、片剂、胶囊、丸剂等。本发明中使用的牛膝为牛膝(Achyranthes bidentata Bl.，也称怀牛膝)的根。牛膝为中医常用药，具有补肝肾，强筋骨的作用，自古以来用于腰膝酸痛，筋骨无力。其主要用法为汤剂，粉末，丸剂等。在本发明中，和这些用法不同，利用乙醇等溶媒提取，减压浓缩除去提取液中的溶媒，再将浸膏用别的溶媒提取。用这样的提取方法成功地得到了到目前为止没有发现的对骨质疏松具有治疗作用的牛膝提取物，完成了本发明。
本发明的技术方案如下牛膝的三萜类提取物在抗骨质疏松药物的用途，牛膝(Achyranthes bidentataBl.)的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取得乙醇浸膏，一般而言，乙醇浸膏提取物经过正己烷、石油醚、酯类溶剂、正丁醇等醇类溶剂、水的递次提取。其顺序是从“轻”溶剂到水，亦可以是从上述顺序中直接选定一种溶剂提取，所得提取物基本相近。例如乙醇浸膏直接经石油醚类溶剂1-4次萃取提取得到石油醚提取液；或者直接用同样的将浸膏蒸馏水混悬液分别用乙酸乙酯等酯类1-4次，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类、醇类提取液，最后用水提取，所得的三萜类提取物用于抗骨质疏松。
本发明的进一步改进是上述所得的三萜类提取物制成口服液、片剂、胶囊剂等剂型，摄入量为每天20-200mg。
牛膝三萜类提取物的提取方法牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根，粉碎，用70％~100％乙醇加热回流，提取1-4次。合并提取液，减压浓缩除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏。将该浸膏混悬于蒸馏水中，用溶剂提取，以石油醚为例加入石油醚类溶剂1-4次萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。提取物用乙酸乙酯等酯类1-4次，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类，醇类提取液。减压浓缩除去这些提取液中的溶媒，得石油醚类提取物，酯类提取物，醇类提取物，同样得到水提取物。
本发明对抗骨质疏松有良好的效果，尤其女性骨质疏松症无须使用雌激素补充疗法。是一种副作用小的天然代替药物。
下面，使用具体的实施例来说明提取方法，以及这些提取物的骨质疏松治疗作用。当然这些提取方法并非只限于下列实施例。
也可在正己烷提取后接着加入石油醚(500ml×3次)萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。此项提取也可以直接取代正己烷提取，而当使用正己烷提取时，此项提取亦可以忽略。
接着将剩下浸膏蒸馏水混悬液分别用乙酸乙酯(500ml×3次)，正丁醇(500ml×3次)和水提取，得到乙酸乙酯，正丁醇提取液。用异丙醇提取可以取代正丁醇的提取。
减压浓缩除去这些提取液中的溶媒，得正己烷提取物(0.99g，0.03％)，乙酸乙酯提取物(1.40g，0.47％)，正丁醇提取物(8.35g，2.79％)和水提取物(50.50g，16.83％)。
正丁醇提取物溶解于适量的水中，上大孔树脂，先以水冲洗，然后以40-90％的乙醇冲洗，收集乙醇冲洗液，浓缩得到三萜类化合物总提取物。
酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯等，醇类溶剂包括异丙醇等，工艺条件分别对应上述。
异丙醇提取可以取代正丁醇的提取。酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯等，提取物的成分无明显差别。
对这些提取物进行了进一步的化学成分研究，鉴定了其中的主要含有化合物，这些化合物的构造将在后面叙述。
下面，说明由实施例1得到的各提取物的体外生物活性试验和体内动物生物试验结果。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的乙酸乙酯提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进具有强力的抑制作用。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进具有强力的抑制作用。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的水提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进显示了弱的抑制作用。
下面说明实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物的大鼠卵巢摘除动物模型的生物活性。
以下为实施例6的结果。
结果清楚的表明大鼠实施两侧卵巢摘除手术体重明显增加，而实施例1中得到的牛膝的水提取物对由此引起的体重增加有显著的抑制作用。
结果清楚的表明大鼠实施两侧卵巢摘除手术后骨密度显著降低，而实施例1中得到的牛膝的水提取物对由此引起的骨密度降低有明显的抑制作用。
结果清楚的表明实施两侧卵巢摘除手术给乙炔基雌二醇的大鼠的子宫重量明显增大，而实施例1中得到的牛膝的水提取物没有引起子宫重量增加，无趋子宫作用的。
结果清楚的表明实施两侧卵巢摘除手术给乙炔基雌二醇大鼠的血液雌二醇含量，而实施例1中得到的牛膝的水提取物没有引起大鼠的血液雌二醇含量增高。
以上实施例6的结果表明从实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物对骨质疏松症具有预防和治疗作用，而无雌激素样副作用。
新化合物的性状11(牛膝皂苷Y)Positive FAB-MASm/z993(M+Na)+，Negative ion HR-FAB-MSm/z969.5060(M-H)-(C49H77O19，cal 969.5059)，807.4531(M-Glc-H)-，(C43H67O14，cal 807.4531).
1H-NMR3.28(1H，dd，J＝12.4，4.5Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝12.4，4.0Hz，H-18)，3.73(3H，s，OMe of GluA methyl ester)，4.96(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluAmethyl ester)，5.35(1H，d，J＝7.9Hz，anomeric H of Glc)，5.42(1H，brs，H-12)，6.34(1H，d，J＝7.9Hz，anomeric H of Glc).
12(牛膝皂苷C二甲酯正丁酯)Negative ion HR-FAB-MS m/z1039.5487(M-H)-(C53H83O20，cal 1039.5478).
1H-NMR3.34(1H，dd，J＝12.0，4.0Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝12.9，3.9Hz，H-18)，3.52(3H，s，OMe of 1”-OMe)，3.71(3H，s，OMe of 5”-OMe)，4.71，5.31(2H，ABq，J＝16.3Hz，H-4”)，4.91(1H，d，J＝7.1Hz，anomeric H of GlcA)，5.21(1H，d，J＝2.1Hz，H-2”)，6.04(1H，d，J＝2.5Hz，H-3”)，5.41(1H，brs，H-12)，6.32(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc).
13(牛膝皂苷C二甲酯)Negative ion HR-FAB-MS m/z983.4845(M-H)(C49H75O20，cal 983.4852).
1H-NMR3.34(1H，dd，J＝11.6，3.9Hz，H-3)，3.19(1H，dd，J＝13.1，3.6Hz，H-18)，3.52(3H，s，OMe of 1”-OMe)，3.71(3H，s，OMe of 5”-OMe)，4.74，5.30(2H，ABq，J＝16.3Hz，H-4”)，4.92(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc A methyl ester)，5.19(1H，d，J＝2.4Hz，H-2”)，6.04(1H，d，J＝2.4Hz，H-3”)，5.41(1H，brs，H-12)，6.31(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc).
14(牛膝皂苷E二甲酯)Positive ion FAB-MS m/z977(M+Na)+，Negative ionFAB-MS m/z953(M-H)-.Negative ion HR-FAB-MS m/z953.4760(M-H)-(C48H73O19，cal 953.4746).
1H-NMR3.32(1H，dd，J＝11.8，4.3Hz，H-3)，3.18(1H，dd，J＝14.7，4.1Hz，H-18)，3.57(3H，s，OMe of 5”-OMe)，3.58(3H，s，OMe of 2”-OMe)，4.98，5.18(2H，ABq，J＝16.4Hz，H-4”)，4.90(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.41(1H，brs，H-12)，6.32(1H，d，J＝8.1Hz，anomeric H ofGlc).
15(牛膝皂苷E甲酯正丁酯)Positive ion FAB-MS m/z1019(M+Na)+，Negative ion FAB-MS m/z995(M-H)-.Negative ion HR-FAB-MS m/z995.5244(M-H)-(C51H79O19，cal 995.5244).
1H-NMR3.32(1H，dd，J＝11.6，4.6Hz，H-3)，3.19(1H，dd，J＝14.2，4.1Hz，H-18)，3.57(3H，s，OMe of 5”-OMe)，3.58(3H，s，OMe of 2”-OMe)，4.99，5.23(2H，ABq，J＝16.8Hz，H-4”)，4.93(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.46(1H，brs，H-12)，6.34(1H，d，J＝8.0Hz，anomeric H of Glc).
20Positive ion HR-FAB-MS m/z993.4656(M+Na)+，(C48H74O20Na，cal993.4671)；Negative ion HR-FAB-MS m/z969.4680(M-H)-，(C48H73O20，cal 969.4695).
1H-NMR0.79，0.89，1.11，1.12，1.21，1.25，1.41，(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.45(1H，s)，3.33(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.91(1H，s).
20(11-酮-竹节参皂苷V)Positive ion HR-FAB-MS m/z993.4656(M+Na)+，(C48H74O20Na，cal 993.4671)；Negative ion HR-FAB-MS m/z969.4680(M-H)-，(C48H73O20，cal 969.4695).
1H-NMR0.79，0.89，1.11，1.12，1.21，1.25，1.41(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.45(1H，s)，3.33(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.91(1H，s).
21(2’-去糖-11-酮-竹节参皂苷V)Positive ion HR-FAB-MS m/z809.4323(M+H)+，(C42H65O15，cal 809.4323)；Negative ion HR-FAB-MS m/z807.4172(M-H)-，(C42H63O15，cal 807.4167).
1H-NMR0.80，0.90，0.96，1.21，1.25，1.32，1.44(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.49(1H，s)，3.42(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.21(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.92(1H，s).
22(11-酮-牛膝皂苷E)Positive ion HR-FAB-MS m/z979.3958(M+K)+，(C46H68O20K，cal 979.3941)；Negative ion HR-FAB-MS m/z939.4227(M-H)-，(C46H67O20，cal 939.4226).
1H-NMR0.84，0.98，0.98，1.10，1.14，1.29，1.39(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.44(1H，s)，3.48(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.18(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.90(1H，s).
23(双键10-11-竹节参皂苷V)Positive ion HR-FAB-MS m/z977.4712(M+Na)+，(C48H74O19Na，cal 977.4722)；Negative ion HR-FAB-MS m/z953.4746(M-H)-，(C48H73O19，cal 953.4746).
1H-NMR0.85，0.87，1.12，1.12，1.18，1.29，1.38(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.44(1H，s)，3.36(2H，overlapped H-3，H-18)，5.62(1H，d，J＝5.6Hz)，5.69(1H，d，J＝5.7Hz).
24(11-酮-牛膝皂苷C)Negative ion FAB-MS m/z1131(M-H)-Negative ionHR-FAB-MSn/z1131.4857(M-H)-(C53H79O21，cal 1131.4860).Negative ionFAB-MS/MS(selected m/z1131)m/z969(M-Glc-H)-or(M-functional group).
25(牛膝皂苷D二甲酯)Negative ion FAB-MS m/z1145(M-H)-Negative ionHR-FAB-MS m/z1145.5380(M-H)-，(C55H85O25，cal1145.5380).
1H-NMR3.43(2H，overlapped H-3，H-18)，4.76，5.03(2H，ABq，J＝16.6Hz，H-1”)，4.79(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.37(1H，brs，H-2’)，5.41(1H，brs，H-12)，5.65(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA2-Glc)，6.30(1H，brs，H-1’)，6.33(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of 28-Glc).
26(28-去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯)Negative ion FAB-MSm/z791(M-H)-Negative ion HR-FAB-MS m/z791.4245(M-H)-，(C42H63O14，cal 791.4218).
1H-NMR3.32(2H，overlapped H-3，H-18)，3.58(3H，s，OMe-2”)，3.59(3H，s，OMe-2’)，4.91(1H，d，J＝7.4Hz，anomeric H of GluA)，4.98，5.19(2H，ABq，J＝16.6Hz，H-1”)，5.37(1H，brs，H-2’)，5.46(1H，brs，H-12)，5.65(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H ofGluA2-Glc)，6.30(1H，brs，H-1’)。
实施例8用成骨细胞和破骨细胞的共存培养法离体检测了实施例7得到的化合物1-23，27的对破骨细胞形成的抑制作用。
骨髓细胞的调制将6-9周的小鼠用70％的乙醇消毒后，摘出胫骨，切除两端，用25G的注射器和1mlα-MEM吹出骨髓液。将骨髓液离心，收集细胞，将细胞悬浮于含有10％FBS的α-MEM液中并调整至每0.1ml105个细胞的浓度。
成骨细胞样细胞的调制将生后2天的乳小鼠用70％的乙醇消毒后摘出头盖骨，用含有10％FBS的α-MEM液洗净后，头盖骨用酶溶液()37℃消化10分钟，丢舍浮游部分，加入新酶溶液37℃消化10分钟并重复4次，合并细胞浮游液，用含有10％FBS的α-MEM液中并调整至每孔5×106个细胞的浓度，培养3天，回收细胞，在零下70度冻结保存。
将冻结保存的成骨细胞样细胞(104/0.5ml)和骨髓细胞(105/0.1ml)进行共存培养法，培养液中加入PTH(100ng/ml)或1α，25(OH)2VD3(10-8M)和被检化合物(20μM)，每2天交换培养液，共培养6天。
培养终了后，除去培养液，用10％福尔马林固定细胞(10分钟)，再用乙醇-丙酮脱水后，自然干燥。加入0.5ml二甲基酰胺-重氮盐染色液，放置12分钟后，用2ml蒸留水细净，自然干燥。显维镜下对具有3个核以上的TRAP阳性破骨细胞计数。
以由α，25(OH)2VD3(10-8M)诱发的TRAP阳性破骨细胞为100％，计算被检化合物对破骨细胞形成的抑制作用。
以下为实施例8的结果。
结果清楚的表明实施例8中得到的牛膝的三萜类化合物(20μM)2-15，17-18对用成骨细胞和破骨细胞的共存培养法中对破骨细胞形成的具有明显的抑制作用。其中以化合物3，12，14，15，17尤为强烈。
权利要求
1.牛膝的三萜类提取物在抗骨质疏松药物的用途，其特征是牛膝(Achyranthesbidentata Bl.)的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取得乙醇浸膏，并经乙酸乙酯等酯类1-4次萃取提取得到酯类提取液；或者经乙酸乙酯等酯类提取过的浸膏蒸馏水混悬液用正丁醇等醇类1-4次提取，得到醇类提取液，最后得水提取液，所得的三萜类提取物用于抗骨质疏松。
2.由权利要求1所述的牛膝的三萜类提取物在抗骨质疏松药物的用途，其特征是在剂型上有口服液、片剂、胶囊剂。
3.牛膝三萜类提取物其特征是其提取方法为牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根，粉碎，用70％~100％乙醇加热回流，提取1-4次，合并提取液，减压浓缩除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏；将该浸膏混悬于蒸馏水中，加入正己烷或石油醚1-4次萃取，合并萃取液，得到正己烷或石油醚提取液。
4.由权利要求3所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为再用乙酸乙酯等酯类1-4次提取，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类，醇类提取液；同样得到水提取物。
5.由权利要求3所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为经正己烷提取后再加入石油醚类溶剂1-4次萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。
6.由权利要求5所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为再用乙酸乙酯等酯类1-4次提取，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类，醇类提取液，同样得到水提取物。
7.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为用异丙醇提取可以取代正丁醇的提取，酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯。
8.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为正丁醇提取物溶解于适量的水中，上大孔树脂，先以水冲洗，然后以40-90％的乙醇冲洗，收集乙醇冲洗液，浓缩得到三萜类化合物总提取物。
9.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是正丁醇提取物的成分进行了分离精制，包括下述15个化合物(化合物1-15)allantoin，尿囊素(1)，chikusetusaponin IVa，竹节参皂苷IVa(2)，chikusetusaponin IVa butyl ester竹节参皂苷IVa正丁酯(3)，chikusetusaponin IV a methyl ester竹节参皂苷IVa甲酯(4)，chikusetusaponin Va butyl ester，竹节参皂苷V正丁酯(5)，momordin IIa，木鳖子皂苷IIa(6)，achyranthoside A trimethylester，牛膝皂苷A三甲酯(7)，achyranthoside E trimethylester，牛膝皂苷E三甲酯(8)，achyranthoside D trimethylester，牛膝皂苷D三甲酯(9)，momordin Iib，木鳖子皂苷IIb(10)，Oleanolic acid(齐墩果酸，27)，其中11(牛膝皂苷Y)，12(牛膝皂苷C二甲酯正丁酯)，13(牛膝皂苷C二甲酯)，14(牛膝皂苷E二甲酯)，15(牛膝皂苷E甲酯正丁酯)，25(牛膝皂苷D二甲酯)，26(28-去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯)是这次发明中得到的新化合物，用于抗骨质疏松药物的用途。
10.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是牛膝水提取物的成分分离精制，得到并鉴定了12个化合物(化合物2，4，5，16-24)chikusetusaponinV，竹节参皂苷V(16)，momordin Ib，木鳖子皂苷IIb(17)，achyranthoside E，牛膝皂苷E(18)，achyranthoside A，牛膝皂苷A(19)，其中20(11-酮-竹节参皂苷V)，21(2’-去糖-11-酮-竹节参皂苷V)，22(11-酮-牛膝皂苷E)，23(双键10-11-竹节参皂苷V)，24(11-酮-牛膝皂苷C)是这次发明中得到的新化合物，用于抗骨质疏松药物的用途。
全文摘要
牛膝的三萜类提取方法及在抗骨质疏松药物的用途，牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取得乙醇浸膏，并经乙酸乙酯等酯类1－4次萃取提取得到酯类提取液；或者经乙酸乙酯等酯类提取过的浸膏蒸馏水混悬液用正丁醇等醇类1－4次提取，得到醇类提取液，最后得水提取液，所得的三萜类提取物用于抗骨质疏松。其中包括发现的28－去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯等新化合物，本发明对抗骨质疏松有良好的效果，尤其女性骨质疏松症无须使用雌激素补充疗法。是一种副作用小的天然代替药物。
文档编号A61P19/00GK1472220SQ0313210
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者李建新, 门田重利, 利 申请人:南京大学
技术领域：
本发明涉及从常用中药牛膝(Achyranthes bidentata Bl.的根)中得到的三萜类(包括三萜苷类)提取物，作为抗骨质疏松药物的应用。
骨组织是一个不断地进行新陈代谢的组织，是由成骨细胞，破骨细胞的偶联所控制。一旦他们之间的平衡遭到破坏，导致成骨细胞的活性降低或破骨细胞的活性增加就会造成骨质疏松症。此病患者的80％为女性，主要是由于女性绝经后，雌激素分泌的急剧下降，造成破骨细胞的活性增加，导致骨组织减少。目前的世界上常用药物主要是抑制破骨细胞的活性。尤其女性骨质疏松症的治疗大部分是使用雌激素补充疗法。但由于其严重的副作用使得许多妇女希望使用副作用小，天然的代替药物。中药，天然药物的宝库几千年来为我国人民的健康繁荣作出了巨大的贡献。从中药中寻找抗骨质疏松药物是新药研发的一条捷径。
牛膝为常用中药，对其化学成分的研究以进行了几十年，大量的化合物被报道，其中主要为三萜类化合物。现有专利申请涉及总甾提取物用于免疫用途，但是对其抗骨质疏松症未见报道。
提供从牛膝根中利用适当的溶媒，高效率的提取具有骨质疏松治疗作用而且副作用很小或没有副作用的提取物的方法。
提供牛膝提取物和其中提取的三萜类化合物及其该类化合物在骨质疏松治疗中的应用，如在剂型上的应用，如提供汤剂(口服液)、片剂、胶囊、丸剂等。本发明中使用的牛膝为牛膝(Achyranthes bidentata Bl.，也称怀牛膝)的根。牛膝为中医常用药，具有补肝肾，强筋骨的作用，自古以来用于腰膝酸痛，筋骨无力。其主要用法为汤剂，粉末，丸剂等。在本发明中，和这些用法不同，利用乙醇等溶媒提取，减压浓缩除去提取液中的溶媒，再将浸膏用别的溶媒提取。用这样的提取方法成功地得到了到目前为止没有发现的对骨质疏松具有治疗作用的牛膝提取物，完成了本发明。
本发明的技术方案如下牛膝的三萜类提取物在抗骨质疏松药物的用途，牛膝(Achyranthes bidentataBl.)的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取得乙醇浸膏，一般而言，乙醇浸膏提取物经过正己烷、石油醚、酯类溶剂、正丁醇等醇类溶剂、水的递次提取。其顺序是从“轻”溶剂到水，亦可以是从上述顺序中直接选定一种溶剂提取，所得提取物基本相近。例如乙醇浸膏直接经石油醚类溶剂1-4次萃取提取得到石油醚提取液；或者直接用同样的将浸膏蒸馏水混悬液分别用乙酸乙酯等酯类1-4次，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类、醇类提取液，最后用水提取，所得的三萜类提取物用于抗骨质疏松。
本发明的进一步改进是上述所得的三萜类提取物制成口服液、片剂、胶囊剂等剂型，摄入量为每天20-200mg。
牛膝三萜类提取物的提取方法牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根，粉碎，用70％~100％乙醇加热回流，提取1-4次。合并提取液，减压浓缩除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏。将该浸膏混悬于蒸馏水中，用溶剂提取，以石油醚为例加入石油醚类溶剂1-4次萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。提取物用乙酸乙酯等酯类1-4次，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类，醇类提取液。减压浓缩除去这些提取液中的溶媒，得石油醚类提取物，酯类提取物，醇类提取物，同样得到水提取物。
本发明对抗骨质疏松有良好的效果，尤其女性骨质疏松症无须使用雌激素补充疗法。是一种副作用小的天然代替药物。
下面，使用具体的实施例来说明提取方法，以及这些提取物的骨质疏松治疗作用。当然这些提取方法并非只限于下列实施例。
也可在正己烷提取后接着加入石油醚(500ml×3次)萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。此项提取也可以直接取代正己烷提取，而当使用正己烷提取时，此项提取亦可以忽略。
接着将剩下浸膏蒸馏水混悬液分别用乙酸乙酯(500ml×3次)，正丁醇(500ml×3次)和水提取，得到乙酸乙酯，正丁醇提取液。用异丙醇提取可以取代正丁醇的提取。
减压浓缩除去这些提取液中的溶媒，得正己烷提取物(0.99g，0.03％)，乙酸乙酯提取物(1.40g，0.47％)，正丁醇提取物(8.35g，2.79％)和水提取物(50.50g，16.83％)。
正丁醇提取物溶解于适量的水中，上大孔树脂，先以水冲洗，然后以40-90％的乙醇冲洗，收集乙醇冲洗液，浓缩得到三萜类化合物总提取物。
酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯等，醇类溶剂包括异丙醇等，工艺条件分别对应上述。
异丙醇提取可以取代正丁醇的提取。酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯等，提取物的成分无明显差别。
对这些提取物进行了进一步的化学成分研究，鉴定了其中的主要含有化合物，这些化合物的构造将在后面叙述。
下面，说明由实施例1得到的各提取物的体外生物活性试验和体内动物生物试验结果。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的乙酸乙酯提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进具有强力的抑制作用。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进具有强力的抑制作用。
该提取物与实施例2同样检测其抗骨吸收活性，得到以下结果。
结果清楚的表明实施例1中得到的牛膝的水提取物对由甲状旁腺激素引起的骨吸收亢进显示了弱的抑制作用。
下面说明实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物的大鼠卵巢摘除动物模型的生物活性。
以下为实施例6的结果。
结果清楚的表明大鼠实施两侧卵巢摘除手术体重明显增加，而实施例1中得到的牛膝的水提取物对由此引起的体重增加有显著的抑制作用。
结果清楚的表明大鼠实施两侧卵巢摘除手术后骨密度显著降低，而实施例1中得到的牛膝的水提取物对由此引起的骨密度降低有明显的抑制作用。
结果清楚的表明实施两侧卵巢摘除手术给乙炔基雌二醇的大鼠的子宫重量明显增大，而实施例1中得到的牛膝的水提取物没有引起子宫重量增加，无趋子宫作用的。
结果清楚的表明实施两侧卵巢摘除手术给乙炔基雌二醇大鼠的血液雌二醇含量，而实施例1中得到的牛膝的水提取物没有引起大鼠的血液雌二醇含量增高。
以上实施例6的结果表明从实施例1中得到的牛膝的正丁醇提取物对骨质疏松症具有预防和治疗作用，而无雌激素样副作用。
新化合物的性状11(牛膝皂苷Y)Positive FAB-MASm/z993(M+Na)+，Negative ion HR-FAB-MSm/z969.5060(M-H)-(C49H77O19，cal 969.5059)，807.4531(M-Glc-H)-，(C43H67O14，cal 807.4531).
1H-NMR3.28(1H，dd，J＝12.4，4.5Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝12.4，4.0Hz，H-18)，3.73(3H，s，OMe of GluA methyl ester)，4.96(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluAmethyl ester)，5.35(1H，d，J＝7.9Hz，anomeric H of Glc)，5.42(1H，brs，H-12)，6.34(1H，d，J＝7.9Hz，anomeric H of Glc).
12(牛膝皂苷C二甲酯正丁酯)Negative ion HR-FAB-MS m/z1039.5487(M-H)-(C53H83O20，cal 1039.5478).
1H-NMR3.34(1H，dd，J＝12.0，4.0Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝12.9，3.9Hz，H-18)，3.52(3H，s，OMe of 1”-OMe)，3.71(3H，s，OMe of 5”-OMe)，4.71，5.31(2H，ABq，J＝16.3Hz，H-4”)，4.91(1H，d，J＝7.1Hz，anomeric H of GlcA)，5.21(1H，d，J＝2.1Hz，H-2”)，6.04(1H，d，J＝2.5Hz，H-3”)，5.41(1H，brs，H-12)，6.32(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc).
13(牛膝皂苷C二甲酯)Negative ion HR-FAB-MS m/z983.4845(M-H)(C49H75O20，cal 983.4852).
1H-NMR3.34(1H，dd，J＝11.6，3.9Hz，H-3)，3.19(1H，dd，J＝13.1，3.6Hz，H-18)，3.52(3H，s，OMe of 1”-OMe)，3.71(3H，s，OMe of 5”-OMe)，4.74，5.30(2H，ABq，J＝16.3Hz，H-4”)，4.92(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc A methyl ester)，5.19(1H，d，J＝2.4Hz，H-2”)，6.04(1H，d，J＝2.4Hz，H-3”)，5.41(1H，brs，H-12)，6.31(1H，d，J＝7.8Hz，anomeric H of Glc).
14(牛膝皂苷E二甲酯)Positive ion FAB-MS m/z977(M+Na)+，Negative ionFAB-MS m/z953(M-H)-.Negative ion HR-FAB-MS m/z953.4760(M-H)-(C48H73O19，cal 953.4746).
1H-NMR3.32(1H，dd，J＝11.8，4.3Hz，H-3)，3.18(1H，dd，J＝14.7，4.1Hz，H-18)，3.57(3H，s，OMe of 5”-OMe)，3.58(3H，s，OMe of 2”-OMe)，4.98，5.18(2H，ABq，J＝16.4Hz，H-4”)，4.90(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.41(1H，brs，H-12)，6.32(1H，d，J＝8.1Hz，anomeric H ofGlc).
15(牛膝皂苷E甲酯正丁酯)Positive ion FAB-MS m/z1019(M+Na)+，Negative ion FAB-MS m/z995(M-H)-.Negative ion HR-FAB-MS m/z995.5244(M-H)-(C51H79O19，cal 995.5244).
1H-NMR3.32(1H，dd，J＝11.6，4.6Hz，H-3)，3.19(1H，dd，J＝14.2，4.1Hz，H-18)，3.57(3H，s，OMe of 5”-OMe)，3.58(3H，s，OMe of 2”-OMe)，4.99，5.23(2H，ABq，J＝16.8Hz，H-4”)，4.93(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.46(1H，brs，H-12)，6.34(1H，d，J＝8.0Hz，anomeric H of Glc).
20Positive ion HR-FAB-MS m/z993.4656(M+Na)+，(C48H74O20Na，cal993.4671)；Negative ion HR-FAB-MS m/z969.4680(M-H)-，(C48H73O20，cal 969.4695).
1H-NMR0.79，0.89，1.11，1.12，1.21，1.25，1.41，(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.45(1H，s)，3.33(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.91(1H，s).
20(11-酮-竹节参皂苷V)Positive ion HR-FAB-MS m/z993.4656(M+Na)+，(C48H74O20Na，cal 993.4671)；Negative ion HR-FAB-MS m/z969.4680(M-H)-，(C48H73O20，cal 969.4695).
1H-NMR0.79，0.89，1.11，1.12，1.21，1.25，1.41(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.45(1H，s)，3.33(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.20(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.91(1H，s).
21(2’-去糖-11-酮-竹节参皂苷V)Positive ion HR-FAB-MS m/z809.4323(M+H)+，(C42H65O15，cal 809.4323)；Negative ion HR-FAB-MS m/z807.4172(M-H)-，(C42H63O15，cal 807.4167).
1H-NMR0.80，0.90，0.96，1.21，1.25，1.32，1.44(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.49(1H，s)，3.42(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.21(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.92(1H，s).
22(11-酮-牛膝皂苷E)Positive ion HR-FAB-MS m/z979.3958(M+K)+，(C46H68O20K，cal 979.3941)；Negative ion HR-FAB-MS m/z939.4227(M-H)-，(C46H67O20，cal 939.4226).
1H-NMR0.84，0.98，0.98，1.10，1.14，1.29，1.39(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.44(1H，s)，3.48(1H，dd，J＝11.7，3.4Hz，H-3)，3.18(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz，H-18)，5.90(1H，s).
23(双键10-11-竹节参皂苷V)Positive ion HR-FAB-MS m/z977.4712(M+Na)+，(C48H74O19Na，cal 977.4722)；Negative ion HR-FAB-MS m/z953.4746(M-H)-，(C48H73O19，cal 953.4746).
1H-NMR0.85，0.87，1.12，1.12，1.18，1.29，1.38(3H each，all s，30，29，24，25，26，23，27-CH3)，2.44(1H，s)，3.36(2H，overlapped H-3，H-18)，5.62(1H，d，J＝5.6Hz)，5.69(1H，d，J＝5.7Hz).
24(11-酮-牛膝皂苷C)Negative ion FAB-MS m/z1131(M-H)-Negative ionHR-FAB-MSn/z1131.4857(M-H)-(C53H79O21，cal 1131.4860).Negative ionFAB-MS/MS(selected m/z1131)m/z969(M-Glc-H)-or(M-functional group).
25(牛膝皂苷D二甲酯)Negative ion FAB-MS m/z1145(M-H)-Negative ionHR-FAB-MS m/z1145.5380(M-H)-，(C55H85O25，cal1145.5380).
1H-NMR3.43(2H，overlapped H-3，H-18)，4.76，5.03(2H，ABq，J＝16.6Hz，H-1”)，4.79(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA)，5.37(1H，brs，H-2’)，5.41(1H，brs，H-12)，5.65(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of GluA2-Glc)，6.30(1H，brs，H-1’)，6.33(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H of 28-Glc).
26(28-去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯)Negative ion FAB-MSm/z791(M-H)-Negative ion HR-FAB-MS m/z791.4245(M-H)-，(C42H63O14，cal 791.4218).
1H-NMR3.32(2H，overlapped H-3，H-18)，3.58(3H，s，OMe-2”)，3.59(3H，s，OMe-2’)，4.91(1H，d，J＝7.4Hz，anomeric H of GluA)，4.98，5.19(2H，ABq，J＝16.6Hz，H-1”)，5.37(1H，brs，H-2’)，5.46(1H，brs，H-12)，5.65(1H，d，J＝7.7Hz，anomeric H ofGluA2-Glc)，6.30(1H，brs，H-1’)。
实施例8用成骨细胞和破骨细胞的共存培养法离体检测了实施例7得到的化合物1-23，27的对破骨细胞形成的抑制作用。
骨髓细胞的调制将6-9周的小鼠用70％的乙醇消毒后，摘出胫骨，切除两端，用25G的注射器和1mlα-MEM吹出骨髓液。将骨髓液离心，收集细胞，将细胞悬浮于含有10％FBS的α-MEM液中并调整至每0.1ml105个细胞的浓度。
成骨细胞样细胞的调制将生后2天的乳小鼠用70％的乙醇消毒后摘出头盖骨，用含有10％FBS的α-MEM液洗净后，头盖骨用酶溶液()37℃消化10分钟，丢舍浮游部分，加入新酶溶液37℃消化10分钟并重复4次，合并细胞浮游液，用含有10％FBS的α-MEM液中并调整至每孔5×106个细胞的浓度，培养3天，回收细胞，在零下70度冻结保存。
将冻结保存的成骨细胞样细胞(104/0.5ml)和骨髓细胞(105/0.1ml)进行共存培养法，培养液中加入PTH(100ng/ml)或1α，25(OH)2VD3(10-8M)和被检化合物(20μM)，每2天交换培养液，共培养6天。
培养终了后，除去培养液，用10％福尔马林固定细胞(10分钟)，再用乙醇-丙酮脱水后，自然干燥。加入0.5ml二甲基酰胺-重氮盐染色液，放置12分钟后，用2ml蒸留水细净，自然干燥。显维镜下对具有3个核以上的TRAP阳性破骨细胞计数。
以由α，25(OH)2VD3(10-8M)诱发的TRAP阳性破骨细胞为100％，计算被检化合物对破骨细胞形成的抑制作用。
以下为实施例8的结果。
结果清楚的表明实施例8中得到的牛膝的三萜类化合物(20μM)2-15，17-18对用成骨细胞和破骨细胞的共存培养法中对破骨细胞形成的具有明显的抑制作用。其中以化合物3，12，14，15，17尤为强烈。
权利要求
1.牛膝的三萜类提取物在抗骨质疏松药物的用途，其特征是牛膝(Achyranthesbidentata Bl.)的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取得乙醇浸膏，并经乙酸乙酯等酯类1-4次萃取提取得到酯类提取液；或者经乙酸乙酯等酯类提取过的浸膏蒸馏水混悬液用正丁醇等醇类1-4次提取，得到醇类提取液，最后得水提取液，所得的三萜类提取物用于抗骨质疏松。
2.由权利要求1所述的牛膝的三萜类提取物在抗骨质疏松药物的用途，其特征是在剂型上有口服液、片剂、胶囊剂。
3.牛膝三萜类提取物其特征是其提取方法为牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根，粉碎，用70％~100％乙醇加热回流，提取1-4次，合并提取液，减压浓缩除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏；将该浸膏混悬于蒸馏水中，加入正己烷或石油醚1-4次萃取，合并萃取液，得到正己烷或石油醚提取液。
4.由权利要求3所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为再用乙酸乙酯等酯类1-4次提取，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类，醇类提取液；同样得到水提取物。
5.由权利要求3所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为经正己烷提取后再加入石油醚类溶剂1-4次萃取，合并萃取液，得到石油醚提取液。
6.由权利要求5所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为再用乙酸乙酯等酯类1-4次提取，再用正丁醇等醇类1-4次提取，得到酯类，醇类提取液，同样得到水提取物。
7.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为用异丙醇提取可以取代正丁醇的提取，酯类溶剂还包括乙酸丁酯、乙酸甲酯。
8.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是其提取方法为正丁醇提取物溶解于适量的水中，上大孔树脂，先以水冲洗，然后以40-90％的乙醇冲洗，收集乙醇冲洗液，浓缩得到三萜类化合物总提取物。
9.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是正丁醇提取物的成分进行了分离精制，包括下述15个化合物(化合物1-15)allantoin，尿囊素(1)，chikusetusaponin IVa，竹节参皂苷IVa(2)，chikusetusaponin IVa butyl ester竹节参皂苷IVa正丁酯(3)，chikusetusaponin IV a methyl ester竹节参皂苷IVa甲酯(4)，chikusetusaponin Va butyl ester，竹节参皂苷V正丁酯(5)，momordin IIa，木鳖子皂苷IIa(6)，achyranthoside A trimethylester，牛膝皂苷A三甲酯(7)，achyranthoside E trimethylester，牛膝皂苷E三甲酯(8)，achyranthoside D trimethylester，牛膝皂苷D三甲酯(9)，momordin Iib，木鳖子皂苷IIb(10)，Oleanolic acid(齐墩果酸，27)，其中11(牛膝皂苷Y)，12(牛膝皂苷C二甲酯正丁酯)，13(牛膝皂苷C二甲酯)，14(牛膝皂苷E二甲酯)，15(牛膝皂苷E甲酯正丁酯)，25(牛膝皂苷D二甲酯)，26(28-去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯)是这次发明中得到的新化合物，用于抗骨质疏松药物的用途。
10.由权利要求4、6所述的牛膝三萜类提取物，其特征是牛膝水提取物的成分分离精制，得到并鉴定了12个化合物(化合物2，4，5，16-24)chikusetusaponinV，竹节参皂苷V(16)，momordin Ib，木鳖子皂苷IIb(17)，achyranthoside E，牛膝皂苷E(18)，achyranthoside A，牛膝皂苷A(19)，其中20(11-酮-竹节参皂苷V)，21(2’-去糖-11-酮-竹节参皂苷V)，22(11-酮-牛膝皂苷E)，23(双键10-11-竹节参皂苷V)，24(11-酮-牛膝皂苷C)是这次发明中得到的新化合物，用于抗骨质疏松药物的用途。
全文摘要
牛膝的三萜类提取方法及在抗骨质疏松药物的用途，牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取得乙醇浸膏，并经乙酸乙酯等酯类1－4次萃取提取得到酯类提取液；或者经乙酸乙酯等酯类提取过的浸膏蒸馏水混悬液用正丁醇等醇类1－4次提取，得到醇类提取液，最后得水提取液，所得的三萜类提取物用于抗骨质疏松。其中包括发现的28－去葡萄糖牛膝皂苷E二甲酯等新化合物，本发明对抗骨质疏松有良好的效果，尤其女性骨质疏松症无须使用雌激素补充疗法。是一种副作用小的天然代替药物。
文档编号A61P19/00GK1472220SQ0313210
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者李建新, 门田重利, 利 申请人:南京大学
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