一种治疗乙型肝炎的药物及其制备方法
专利名称：一种治疗乙型肝炎的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以中草药为原料治疗乙型肝炎的药物及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供该制剂的制备方法。
本发明是在中医理论指导下，针对慢性病毒性肝炎多肝郁气滞、肝胃不和、肝郁脾虚、邪毒蕴肝的病机特点，在民间验方基础上，结合20多年的临床经验加减化裁组方而成。
本发明药物是由下列组分制成的(用量为重量份)灵芝308-420 白花蛇舌草392-840栀子182-280郁金182-336 白芍112-336 茯苓112-420丹参84-420黄芩84-280 甘草28-252本发明药物的最佳重量(份)配比是灵芝400 白花蛇舌草400栀子200郁金200 白芍166 茯苓166
丹参100 黄芩100甘草50将上述各组分制成本发明药物的生产方法是1取灵芝、白花蛇舌草、丹参，粉碎成粗粉，加70％乙醇回流提取三次，每次提取2小时，第一次加8倍量的乙醇，第二次、第三次加6倍量的乙醇，提取液滤过，滤液合并，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.02～1.05的清膏，备用；2将上述1所得药渣与黄芩、栀子、白芍、郁金、甘草、茯苓六味药材混合，第一次加12倍量水浸泡1.5小时、煎煮2小时，第二、三次各加入10倍量水，分别煎煮2小时，煎液合并，滤过，浓缩至相对密度1.05～1.10的清膏，加入乙醇使含醇量达到50％，搅匀，静置24小时以上，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.02～1.05的清膏；3将上述1、2所得清膏混合均匀，喷雾干燥，加蔗糖与糊精细粉适量，混合均匀，用75％的乙醇制粒，干燥，整粒，即得散剂。
其中喷雾干燥时要求进风温度为160℃～180℃，喷塔温度为75～80℃，出风温度为70～75℃，转速为2.5万转/分钟；所加蔗糖与糊精的重量比为5∶1。本发明有以下三个方面特点一是能在短期内改善慢性乙肝临床症状，如一般经过1～2月的用药，患者的胁肋疼痛、腔闷腹胀、食欲不振、倦怠乏力、口干恶心等症状85％患者多消失。
二是原肝功能不正常者，经2～3月用药多恢复正常，尤其ALT和AST恢复明显。
三是该方服用半年以上e抗原约有20％可阴转。
药效学试验为了进一步说明本发明的治病机理，我们进行了与本发明药物功能主治有关的主要药效学试验，包括体内体外抗病毒作用、对化学因素诱发的小鼠急性肝损伤的影响、对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响、对小鼠免疫功能的影响等，结果如下
一、抗鸭乙型肝炎病毒的药效学试验资料及文献资料受试药品本发明药物(批号020406)，用2号胶囊包装。试验采用三种剂量的本发明药物1.6g(原生药)·kg-1·D-1、3.2g(原生药)·kg-1·D-1和6.4g(原生药)·kg-1·D-1。
阳性对照药物拉米夫定(批号B038238，葛兰素威康英国行动有限公司生产)购于重医附二院，压碎后自制成5mg/粒的胶囊。动物采用健康成年的重庆麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔接种0.1mlDHBV DNA阳性病毒血清。接种1周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记的DHBV DNA探针经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养至3周龄作为实验动物。给药途径口腔灌喂方法和结果1.方法将感染阳性鸭64只随机分为5组(1)病毒对照组(12只)用淀粉胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为500mg/只。(2)阳性药物对照组(13只)用拉米夫定胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为50mg.Kg-1.D-1。(3)本发明药物小剂量组(13只)每日口腔灌喂1次，剂量为1.6g(原生药).Kg-1.D-1。(4)本发明药物中剂量组(13只)每日口腔灌喂1次，剂量为3.2g(原生药).Kg-1.D-1。(5)本发明药物大剂量组(13只)每日口腔灌喂1次，剂量为6.4g(原生药).Kg-1.D-1。
实验用药时间为28天，停药观察7天。2.实验结果(1)用药前、中、后血清DHBV DNA滴度改变情况病毒对照组(淀粉胶囊)用药前后血清DHBV DNA滴度无明显降低。拉米夫定组用药7天后开始出现有血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.05)，停药后有DHBV DNA回升现象。本发明药物大、中剂量组分别于28天开始出现有血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.01或P＜0.05)，大剂量组于停药7天后病毒DNA出现反跳现象。本发明药物小剂量组在治疗期间内鸭血清中的DHBV DNA滴度有降低趋势，但用药前后比较无统计学意义。见表1。
表1用药前后血清DHBV DNA滴度改变情况(x±S)DHBV DNA(volume)组别用药前用药7天 用药14天 用药21天 用药28天 停药7天淀粉胶囊组 1523.33± 1571.15± 1617.52± 1536.734± 1542.45± 1494.04±113.47109.26 133.44 115.0774.0268.15拉米夫定组 1378.80± 1300.24± 1342.99± 1284.22± 1292.98± 1358.97±130.03119.71*137.56 86.34*60.81*81.46本发明药物大剂 1468.75± 1438.70± 1435.60± 1421.10± 1351.81± 1378.63±量组 251.96 289.26 286.82 244.17178.29**196.82本发明药物中剂 1467.72± 1491.76± 1558.29± 1437.37± 1334.07± 1324.98±量组 202.50 305.83 245.73 323.28164.29*144.28*本发明药物小剂 1529.57± 1547.78± 1479.37± 1466.81± 1510.87± 1472.45±量组 171.12 188.76 190.88 164.24225.93 165.31注上表所列为各组DNA斑点volume值的平均数及标准差，统计学采用配对t检验(＂*＂P＜0.05；＂**＂P＜0.01)，为各组不同时间DNA斑点值与同组用药前DNA斑点值的比较。(2)各组用药前、中、后血清DHBsAgO.D值改变情况病毒对照组(淀粉胶囊)及本发明药物各剂量组用药前后血清DHBsAgO.D值无明显改变，拉米夫定组用药7天开始出现血清DHBsAgO.D值降低(P＜0.01)，至停药7天血清DHBsAgO.D值有回升现象，但与用药前比较仍有持续降低(P＜0.05)。见表2。
表2各组用药前后血清DHBsAgO.D值改变情况(x±S)组别用药前用药7天 用药14天 用药21天 用药28天 停药7天淀粉胶囊组0.74±0.390.65±0.27 0.60±0.340.56±0.26 0.61±0.30 0.63±0.27拉米夫定组0.64±0.480.34±0.25**0.35±0.26*0.26±0.17**0.29±0.25**0.41±0.27*本发明药物大剂量组 0.79±0.590.88±0.62 0.81±0.610.77±0.52 0.66±0.47 0.68±0.36本发明药物中剂量组 0.73±0.530.71±0.49 0.70±0.500.64±0.42 0.61±0.49 0.58±0.42本发明药物小剂量组 0.68±0.410.73±0.48 0.68±0.440.55±0.35 0.56±0.32 0.47±0.34注上表所列为各组DHBsAgO.D值平均数及标准差，统计学采用配对t检验。(＂*＂P＜0.05，＂*″P＜0.01)，为各组不同时间DHBsAgO.D值与同组用药前DHBsAgO.D值的比较。
(3)肝脏HE染色病理检查结果各组均有较轻程度肝细胞浊肿、嗜酸变性，部分组织汇管区、小叶间隔有轻～中度炎症细胞浸润及肝细胞点状坏死现象，这些病理表现用药组与对照组无明显差异。3.结论用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效的治疗药物，已为国内外学者所公认。1-3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象，因此，我们应用1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行本发明药物抗病毒疗效的考核，期望筛选出有抗乙型肝炎病毒作用的药物。并用对乙型肝炎病毒有明显抑制作用的核苷酸类似物拉米夫定作为阳性药物对照。
本次动物试验结果表明本发明药物中、大剂量组鸭血清中的DHBV DNA滴度降低有显著或极显著意义，本发明药物小剂量组在治疗期间内鸭血清中的DHBV DNA滴度虽有降低趋势，但用药前后比较无统计学意义，说明本发明药物对DHBV DNA的抑制效果与试验选择的药物剂量有一定的量效关系。本发明药物大剂量组于停药7天后病毒DNA出现反跳现象，说明本发明药物抑制病毒的效果是一过性的、不彻底的。除拉米夫定组外，其余各组血清中DHBsAg均无明显的降低，说明本发明药物对鸭乙型肝炎病毒表面抗原抑制作用不明显，尽管拉米夫定和本发明对鸭乙型肝炎病毒DNA有一定的抑制作用，这些抑制作用尚达不到“阴转”效果，所以，延长用药时间、选择合适的用药剂量是值得进一步探讨的课题。
由于鸭乙型肝炎动物模型自身的特点，1-3日龄雏鸭免疫系统发育不完善，在感染DHBV后，仅出现单纯的病毒携带状态，但肝脏组织病变轻微，肝功能无明显异常。我们的实验结果发现本发明药物各剂量组肝组织病理检测与对照组无明显差异，虽不能证实该药有改善肝功能的效果(这需要其它动物验证)，但可说明连续用药1个月本发明药物对肝组织无明显毒性损害。
二、对化学因素致小鼠急性肝损伤的保护作用目的观察受试药物对D-半乳糖胺(D-GlaN)、硫代乙酰胺(TAA)和四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤的影响。
方法用D-GlaN、TAA及CCl4等化学品造成小鼠急性肝损伤，以血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST/GOT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)和肝组织病理学检查等为指标，观察受试药对化学因素致小鼠急性肝损伤的保护作用。
结果本发明药物能降低血清AST和ALT，减轻肝组织病理性损害，对D-GlaN、TAA及CCl4等化学因素所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用。
(一)、对D-氨基半乳糖所致的小鼠急性肝损伤的影响1、试验目的用D-GlaN造成小鼠急性肝损伤，以血清AST、ALT和肝组织病理学检查为指标，观察本发明药物对化学因素所致急性肝损伤的影响。
2、试验材料(1)试验动物健康ICR种系小鼠，雄性，体重20±2克，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号医动字第08-004号。饲养条件陕西中医学院中药药理学实验室(国家中医管理局中医药科研实验室分级二级)。
(2)药品和试剂受试药物本发明药物细粉，1g含生药8.33g，由西安绿谷制药有限公司提供，批号020406。用蒸馏水配成45％、22.5％、11.25％(生药)的本发明药物混悬液，给药时摇匀。成人每天口服60g生药，即临床人用剂量为0.86g/kg(人体重以70kg计)。
阳性对照药乙肝宁颗粒，由广西半宙制药股份有限公司生产，批准文号ZZ-5010-桂卫药准字(1990)第079023号，生产批号020120。用蒸馏水配成37％(生药)的混悬液，本试验小鼠给药剂量为7.4g/kg。联苯双酯滴丸，1.5mg/丸，山东省德州制药厂生产，批准文号国药准字H37020113，生产批号020816。研磨后用蒸馏水配成20mg/ml的混悬液，给药剂量为200mg/kg。
试剂D-半乳糖胺(D-Glactosamine D-GlaN)，Sigma出品，批号83H0925。临用时用无菌生理盐水配制成10％D-DlaN溶液。腹腔注射1000mg/kg体重。D-GlaN是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂，引起的肝损伤在生物化学和组织学改变上与人类病毒性肝炎颇为相似[1、3]。AST试剂盒(批号020031)和ALT试剂盒(批号020301)由北京中生生物工程高技术公司生产。
3.实验方法和结果取ICR种雄性小鼠，随机分为7组。本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予45％、22.5％和11.25％的本发明药物混悬液，给药剂量依次为9g生药/kg、4.5g生药/kg和2.25g生药/kg；联苯双酯组灌胃联苯双酯200mg/kg；乙肝宁组给予乙肝宁7.4g/kg；空白对照组和模型组灌常水。每天给药1次，连续5天，给药容积0.2ml/10g。末次给药后1小时，腹腔注射10％的D-GlaN溶液0.1ml/10g体重，24小时后眼眶取空腹血，分离血清，用XD-811C型生化分析仪(上海讯达医疗仪器公司生产)测定血清AST(连续检测法)和ALT(连续检测法)，同时取肝左叶10％福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察病理变化。试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(1)、对血清AST和ALT的影响(表2-1)表2-1对血清AST和ALT的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数 ALT(U/L)AST(U/L)正常对照组- 11 77.4±18.1**119.3±15.6**模型组- 10 132.2±28.0 248.0±88.0联苯双酯组0.210 93.1±31.1**164.2±44.1*乙肝宁组 7.49118.2±26.7 200.2±59.0大剂量组 9 11 102.6±20.5*166.5±62.7中剂量组 4.511 120.8±31.9 180.7±61.0小剂量组 2.25 10 138.3±71.2 223.3±126.3与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01如表2-1所示，模型组动物血清AST和ALT明显升高，与正常对照组比较，差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.01)；本发明药物大、中、小剂量能降低血清AST和ALT，大剂量组动物血清ALT与模型组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)；阳性对照药联苯双酯降酶作用显著(P＜0.01、＜0.05)。
(2)、对肝组织病理学检查的影响(表2-2)表2-2对肝组织病理学检查的影响病变程度组别P- + +++++正常组 8 21 0 ＜0.05模型组 0 36 1联苯双酯组 2 53 0 ＜0.05乙肝宁组 1 35 0大剂量组 4 70 0 ＜0.05中剂量组 2 72 0 ＜0.05小剂量组 1 45 0注变性等级标准-正常，无肝细胞气球样变性+肝小叶不到1/3区域肝细胞轻度肿胀，胞浆内见无定形空泡，肝索基本清楚，肝窦尚可见++介于“+”和“+++”之间+++肝细胞极度肿胀，呈气球样变，肝索紊乱，肝窦不清4、小结用10％D-GlaN以1000mg/kg腹腔注射造成小鼠急性肝损伤，观察本发明药物对其损伤的保护作用。结果表明，本发明药物9g/kg能明显降低血清AST和ALT，减轻肝细胞变性，对D-GlaN所致的小鼠急性肝损伤有保护作用。
(二)、对硫代乙酰胺致小鼠急性肝损伤的影响1、试验目的观察本发明药物对硫代乙酰胺TAA致小鼠急性肝损伤的影响。
2、试验材料试验动物、受试药物和阳性对照药同试验2-1。硫代乙酰胺(Thioacetamide TAA)，分析纯，由中国医药集团上海化学试剂公司提供，批号20011211。用无菌蒸馏水配成2％溶液，以50mg/kg腹腔注射造成急性肝损伤。TAA能干扰PNA从核到细胞质的转运过程，影响蛋白质合成，损害肝细胞膜，导致肝细胞坏死。生化检验试剂同试验2-1。
3、试验方法和结果分组和给药方法同试验2-1。末次给药后1小时，除空白对照组外，其余各组动物腹腔注射2％的TAA溶液0.025ml/10g，16小时后眼眶取空腹血，分离血清，测定血清AST和ALT，肝脏进行病理学检查。试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(1)、对血清AST和ALT的影响(表2-3)表2-3对血清AST和ALT的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数 ALT(U/L)AST(U/L)正常组 - 11 77.4±18.1**119.3±15.6**模型组 - 15 148.8±83.5 325.2±118.1联苯双酯组 0.2 12 99.1±27.0*195.5±81.8**乙肝宁组 7.4 17 114.6±27.0 261.4±84.1大剂量组9 15 98.5±20.6*253.4±94.1中剂量组 4.5 15 105.0±27.3 300.9±71.2小剂量组 2.25 15 122.3±59.3 344.3±62.9
与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，小鼠注射TAA后，肝功能损害严重，血清AST和ALT明显升高，与正常组比较，差异有显著性意义(P＜0.01、P＜0.01)；大剂量组动物血清ALT与模型组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)；联苯双酯能显著降低ALT(P＜0.05)和AST(P＜0.01)。
2、对肝组织病理学检查的影响表2-4对肝组织病理学检查的影响病变程度组别P- ++++++正常组101 0 0 ＜0.05模型组0 6 6 3联苯双酯组2 5 5 0 ＜0.05乙肝宁组 2 8 6 1 ＜0.05大剂量组 6 7 2 0 ＜0.05中剂量组 2 6 6 1小剂量组 0 6 7 2注变性等级标准-正常，无肝细胞气球样变性+肝小叶不到1/3区域肝细胞轻度肿胀，胞浆内见无定形空泡，肝索基本清楚，肝窦尚可见++介于“+”和“+++”之间+++肝细胞极度肿胀，呈气球样变，肝索紊乱，肝窦不清4、小结用TAA50mg/kg腹腔注射造成小鼠急性肝损伤模型，观察本发明药物对损伤的保护作用。结果，大剂量明显降低血清ALT(P＜0.05)，并明显减轻浊肿、坏死等肝细胞病变(P＜0.05)。提示，本发明药物对TAA所致的小鼠急性肝损伤有保护作用。
(三)、对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响1、试验目的观察本发明药物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响。
2、试验材料试验动物、受试药物和阳性对照药同试验2-1。四氯化碳(CCl4)，分析纯，莱阳化工实验厂生产(GB688-92)，批号20011030。临用前用橄榄油配成0.1％的油溶液。生化试剂同试验2-1。
3、试验方法和结果分组和给药同试验2-1。末次给药后1小时，除空白对照组外，其余各组动物腹腔注射0.1％CCl4橄榄油溶液10ml/kg。禁食18小时，眼眶取血，分离血清，测定血清AST和ALT，肝脏进行病理学检查。试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(1)、对血清AST和ALT的影响(表2-5)表2-5对血清AST和ALT的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数ALT(U/L)AST(U/L)正常组-17 77.7±17.2**120.3±18.5**模型组-17 125.4±33.4 213.2±50.7联苯双酯组 0.2 16 81.5±15.7**139.7±38.6**乙肝宁组 7.4 15 96.1±25.6*181.4±67.1大剂量组 9 17 89.1±25.2**168.4±51.5*中剂量组 4.5 16 97.5±26.7*173.1±71.3小剂量组 2.25 11 113.2±27.0 179.0±78.6与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，模型组血清AST和ALT明显增高，与正常对照组比较，差异均有显著性(P＜0.01、＜0.01)；本发明药物各剂量组能不同程度地降低血清AST和ALT，大剂量组与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.05)。中剂量组血清ALT与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.05)。
(2)、对肝组织病理学检查的影响(表2-6)
表2-6对肝组织病理学检查的影响病变程度组别p- + ++ +++正常组16 1 0 0 ＜0.05模型组1 3 7 6联苯双酯组4 6 4 2 ＜0.05乙肝宁组 2 7 5 1 ＜0.05大剂量组 4 10 3 0 ＜0.05中剂量组 2 4 8 2小剂量组 1 4 4 2注气球样变性等级标准-正常，无肝细胞气球样变性+肝小叶不到1/3区域肝细胞轻度肿胀，胞浆内见无定形空泡，肝索基本清楚，肝窦尚可见++介于“+”和“+++”之间+++肝细胞极度肿胀，呈气球样变，肝索紊乱，肝窦不清正常组动物肝脏组织所见同试验2-1；模型组肝脏的肝小叶汇管区和/或中央静脉周围大量肝细胞空泡变及萎缩、坏死并伴有炎症细胞浸润，与正常对照组比较差异显著(P＜0.05)，部分区域细胞呈不同程度的胞浆疏松和水样变，肝细胞排列紊乱，但肝窦尚可见；本发明药物大、中剂量组细胞轻度肿长，水样变、坏死和炎症细胞浸润减轻，大剂量组与模型组比较差异有显著性意义(P＜0.05)。
4、小结本发明药物大剂量组能降低CCl4致小鼠急性肝损伤模型血清AST和ALT，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.05)，能减轻细胞轻度肿长，水样变、坏死和炎症细胞浸润，大剂量组与模型组比较差异有显著性意义(P＜0.05)。提示，本发明药物对CCl4致小鼠急性肝损伤有保护作用。
(四)、结论本发明药物9g/kg、4.5g/kg能不同程度地对抗D-GlaN、TAA及CCl4等所致的小鼠急性肝损伤，降低血清AST和ALT，减轻肝组织的病理性损害，对化学因素所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用。
三、对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响目的 观察本发明药物对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响，探讨其治疗慢性肝炎的中药药理学基础。
方法连续24次给大鼠皮下注射25％的CCl4油溶液，诱导大鼠肝损伤和肝纤维化，同时灌胃本发明药物，以血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST/GPT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT/GOT)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、III型前胶原蛋白(PC-3)和肝脏脏器系数以及肝脏病理学检查为指标，观察受试药物对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响。
结果本发明药物能降低血清AST、ALT；降低血清LN、HA及PC-3，明显减轻肝小叶内肝细胞肿胀、胞浆疏松、脂肪变、气球样变等各种病理变化和肝纤维增生。提示，本发明药物对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤和肝纤维化具有保护作用。
(一)、试验目的用CCl4反复注射造成大鼠慢性肝损伤及肝纤维化，同时灌胃本发明药物，以血清生化及肝脏组织病理学检查为指标，观察本发明药物对该模型的影响，探讨其治疗急、慢性肝炎的中药药理学基础。
(二)、试验材料(1)试验动物SD种大鼠120只，雄性，体重150g±10g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号医动字第08-005号。饲养条件陕西中医学院中药药理学实验室(国家中医管理局中医药科研实验室分级二级)。
(2)药品和试剂受试药物本发明药物细粉，1g含生药8.33g，由西安绿谷制药有限公司提供，批号020316。用蒸馏水配成64％、32％、16％的本发明药物混悬液，给药时摇匀。成人每天口服60g生药，即临床人用剂量为0.86g/kg(体重以70kg计)。
阳性对照药乙肝宁颗粒，由广西半宙制药股份有限公司生产，批准文号ZZ-5010-桂卫药准字(1990)第079023号，生产批号020120。本试验大鼠给药剂量为5.3g生药/kg(人用剂量的5倍)，用蒸馏水配成53g生药/100ml的混悬液。
试剂四氯化碳(CCI4)，分析纯，莱阳化工实验厂生产(GB688-92)，批号20011030，临用前用橄榄油稀释成25％的油溶液。AST试剂盒(批号020031)、ALT试剂盒(批号010071)、总蛋白试剂盒(生产批号020301)和白蛋白试剂盒(生产批号020302)，均由北京中生生物工程高技术公司生产。透明质酸(HA)放射免疫分析试剂盒，河南省焦作市解放免疫诊断试剂研究所出品，批号02022；层粘连蛋白(LN)放射免疫分析试剂盒，河南省焦作市解放免疫诊断研究所出品，批号020225；III型前胶原(PC-3)放射免疫分析试剂盒(平衡法)，批号020201，由上海海军医学研究所生物技术中心提供。
(三)、试验方法取SD种大鼠，随即分为6组。除正常对照组外，其余各组按照文献方法，皮下注射25％CCl4橄榄油溶液0.2ml/100g，每周2次，连续12周，共24次。在注射CCl4的同时，本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予64％、32％、16％(生药)的本发明药物混悬液，给药剂量依次为6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg；乙肝宁组给予乙肝宁5.3g/kg；模型组灌服常水。各组每天给药1次，连续12周，给药容积1ml/100g。末次给药24小时后，用戊巴比妥钠麻醉动物，解剖观察肝脏外观及其它可见病变，经腹主动脉取血，分离血清，进行血液生化学检查。摘取肝脏精密称定，取肝左叶进行病理学检查。
(四)、检测指标和方法1、血液生化学检查用XD-811C型生化分析仪测定血清AST(连续检测法)、ALT(连续检测法)、总蛋白(TP，双缩脲法)和白蛋白(Alb，溴甲酚绿法)。
2、血清层粘连蛋白、透明质酸、III型前胶原用放射免疫法测定。
3、肝脏病理肝脏称重，计算肝脏系数(g/100g体重)，取肝左叶中1/3用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜观察肝组织的病理变化。
(五)、统计方法试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(六)结果1、一般状况模型组动物较空白对照组皮毛明显变黄、蓬乱，精神萎靡，体重增长缓慢，其它各组动物的一般状况较模型组有不同程度的改善，但未见显著差异。试验后期各组动物随机抽样剖检表明，造模后鼠肝有不同程度的肿大，本发明药物对CCl4致大鼠慢性肝损伤有一定的疗效。
2、对血清AST、ALT、Alb和TP的影响(表3-1)表3-1对血清AST、ALT、Alb和TP的影响组别 动物数ALT(U/L) AST(U/L) TP(g/L) Alb(g/L)正常对照组14 49.6±7.5**148.9±28.8**62.5±6.5 31.6±5.0模型组20 180.7±108.5291.2±109.7 66.3±6.5 30.6±8.5乙肝宁组 15 52.7±9.4**149.5±27.6**71.9±7.7*31.8±10.3小剂量组 17 50.9±17.0**149.6±33.1**66.8±5.5 30.3±9.2中剂量组 20 53.2±10.4**146.1±19.7**66.8±9.1 29.8±12.6大剂量组 20 52.9±8.9**156.4±26.5**73.3±9.4*27.5±10.8注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01如表所示，模型组动物血清AST和ALT明显升高，与正常组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)，说明CCl4致大鼠慢性肝损伤动物模型成功；本发明药物6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg灌胃能明显降低动物血清AST和ALT，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)，乙肝宁颗粒剂亦有显著的降酶作用(P＜0.01)。
模型组血清总蛋白和白蛋白与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05)，说明尚未导致低蛋白血症；本发明药物大剂量组与模型组比较，血清总蛋白高于模型组，差异有显著性意义(P＜0.05)。
3、对血清LN、HA及PC-3的影响(表3-2)血清PC-3、LN、HA水平与肝纤维化严重程度呈高度正相关，是肝纤维化肝硬变的早期诊断及药物疗效、愈后评价有意义的指标。结果表明，模型组动物血清中HA及PC-3明显升高，与正常组比较有显著差异(P＜0.01、＜0.01)；本发明药物3.2g生药/kg能明显降低LN、HA及PC-3，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.05，＜0.01，＜0.01)；本发明药物6.4g生药/kg能明显降低LN(P＜0.05)。提示，给大鼠连续注射CCl4能导致肝纤维化，本发明药物能抑制肝纤维化过程。
表3-2对血清LN、HA及PC-3的影响(X±S)动物组别 LN(ng/ml) HA(ng/ml)PC-3 (ug/L)数正常对照组 1484.72±10.16 61.92±42.80**35.92±9.44**模型组 2086.33±7.78 173.38±132.1849.98±4.86乙肝宁组1581.35±9.69 78.94±35.28**44.59±5.74**小剂量组1780.58±10.52 108.87±36.55 47.41±5.33中剂量组2081.10±7.45*84.88±35.76**44.56±5.98**大剂量组2079.32±5.58*121.40±51.76 47.41±3.27注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.015、肝脏组织病理检查结果(1)肉眼观察剖检时在各组动物腹腔内未见腹水。正常大鼠肝脏表面光滑，颜色暗红且质软；模型组动物肝脏粗大，表面不光滑，有不同程度的结节，颜色红褐，边缘印圆，质地硬，肝脏肿大明显。本发明药物各剂量组肝脏颜色、边缘、质地有不同程度的改善。各组动物肝脏系数(g/100g体重)结果见表3-3。
表3-3对肝脏系数(g/100g体重)的影响组别 动物数 剂量(g/kg)肝脏系数(g/100g体重)正常对照组 14-2.73±0.30**模型组 20-4.08±0.43乙肝宁组 15 5.3 2.94±0.31**小剂量组 17 1.6 3.34±0.36**中剂量组 20 3.2 3.08±0.18**大剂量组 20 6.4 3.18±0.23**注与模型组比较**P＜0.01
结果表明，模型组动物肝脏系数(g/100g体重)显著高于正常对照组(P＜0.01)，说明CCl4致大鼠慢性肝损伤时，有肝脏肿大现象。本发明药物6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg均能明显降低动物肝脏系数，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.01、＜0.01)。
(2)病理学检查结果见表3-4(对肝脏变性的影响)和表3-5(对肝脏纤维增生的影响)。
表3-4对肝脏变性的影响动物病变变性分级组别P数 - ± ++++++正常对照组14 121 1 0 0 ＜0.05模型组20 0 1 2 4 13乙肝宁组 15 0 3 8 3 1 ＜0.05大剂量组 17 1 3 5 6 2 ＜0.05中剂量组 20 1 4 5 6 4 ＜0.05小剂量组 20 0 2 6 8 4 ＜0.05注变性病变分级标准-肝细胞及肝小叶结构正常，无病变±偶见单个细胞变性病变+小滴脂防变及肝细胞浊肿占肝小叶的1/3以下++大小滴脂肪变细胞杂存，同时伴有肝细胞包浆疏松占肝小叶的1/3～2/3+++大滴脂肪变细胞遍及肝小叶，完全破坏肝小叶正常结构表3-4所示，模型组几乎全部动物肝脏出现程度不同的浊肿、胞浆疏松及气球样变(包括脂肪变)。本发明药物各剂量组病变明显减轻，与模型组比较差异均有显著性意义(均P＜0.05)。
表3-5对肝脏纤维增生的影响纤维增生分级组别 动物数P0 IIIIIIIVV正常对照组 14140 0 0 0 0＜0.01模型组 20105 3 1 1 0乙肝宁组 159 2 3 1 0 0大剂量组 17133 1 0 0 0＜0.05中剂量组 20114 2 3 0 0小剂量组 20103 3 3 1 0分级标准0级肝细胞正常，纤维增生I级胶原纤维从汇管区或中央静脉周围轻度向外延伸II级胶原纤维延伸明显，但未包绕肝小叶III级胶原纤维延伸明显，互相连接，包绕肝小叶但不太完整IV级胶原纤维延伸明显，互相连接，形成假小叶，以大的假小叶为主。V级肝小叶结构完全破坏，形成大小不同的假小叶，胶原纤维粗大。
表3-5表明，模型组动物肝脏有不同程度的纤维增生，与正常组动物比较差异有显著性意义(P＜0.01)，但纤维增生形成率和程度还不够充分。本发明药物大剂量组动物肝脏纤维增生与模型组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。
(七)、结论用CCl4反复注射造成大鼠慢性肝损伤及肝纤维化，同时灌胃本发明药物，以血清生化及肝脏组织病理学检查为指标，观察本发明药物对该模型的影响。结果表示，本发明药物6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg能明显降低动物血清AST和ALT，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)；本发明药物3.2g生药/kg能明显降低LN、HA及PC-3，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.05，＜0.01，＜0.01)；本发明药物6.4g生药/kg能明显降低LN(P＜0.05)。病理学研究表明，本发明药物能明显降低动物慢性肝损伤的肝脏系数，减轻肝小叶内浊肿、胞浆疏松、气球化等炎症病变，减轻肝纤维增生。本发明药物对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤和肝纤维化具有保护作用。
四、对小鼠免疫功能的影响(一)、对小鼠碳粒廓清的影响目的采用碳粒廓清法，观察本发明药物对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响。
方法将动物分为7组，灌胃给药7天，尾静脉注射10％印度墨汁，注射后2、10分钟分别取血，于波长600nm处测定光密度OD值。
结果本发明药物(9g/kg)加快小鼠碳粒廓清速度，提示本品能增强网状内皮系统的吞噬功能。
1、试验目的以碳粒廓清法观察本发明药物对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响。
2、试验材料(1)试验动物健康ICR种系小鼠，雌雄各性，体重20±2克，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号医动字第08-004号。饲养条件陕西中医学院中药药理学实验室(国家中医管理局中医药科研实验室分级二级)。
(2)药品和试剂受试药物本发明药物细粉，1g含生药8.33g，由西安绿谷制药有限公司提供，批号020406。用蒸馏水配成11.25％、22.5％、45％(生药)的本发明药物混悬液，给药时摇匀。
阳性对照药乙肝宁颗粒，由广西半宙制药股份有限公司生产，批准文号ZZ-5010-桂卫药准字(1990)第079023号，生产批号020120。本试验小鼠给药剂量为7.4g/kg，用蒸馏水配成37％(生药)的混悬液。盐酸左旋咪唑片，25mg/片，南京第二制药厂生产，批准文号苏卫药准字(1998)第254011号，生产批号20020401，用蒸馏水配成混悬液，小鼠灌胃剂量为30mg/kg。
3.实验方法和结果取ICR种雄性小鼠，随机分为6组。本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予45％、22.5％和11.25％的本发明药物混悬液，给药剂量依次为9g生药/kg、4.5g生药/kg和2.25g生药/kg；左旋咪唑灌胃左旋咪唑200mg/kg；乙肝宁组给予乙肝宁7.4g/kg；空白对照组灌常水。每天给药1次，连续10天，给药容积0.2ml/10g。末次给药后2小时，给小鼠尾静脉注射10％印度墨汁0.2ml/只。注射后2和10分钟分别自眼球后静脉丛取血20ul，加入到装有4ml蒸馏水的试管中溶解红细胞，然后用721型分光光度计于波长600nm处测定光密度OD值，按下式计算单位时间内血清中碳粒廓清的速度K。结果见表4-1。K=l0gOD2-l0gOD10t10-t2]]>OD2和OD10分别为注射印度墨汁后2和10分钟所取血样的OD值，t2和t10为取血时间。结果经t检验比较各组与空白对照组间的差异性。
表4-1对小鼠碳粒廓清的影响(X±S)组别 动物数 剂量(g/kg)碳粒廓清指数(K)空白对照组11- 0.00829±0.00695左旋咪唑组10 0.20.01853±0.00548**乙肝宁组 11 7.40.1032±0.00550小剂量组 13 2.25 0.00888±0.00446中剂量组 12 4.50.00953±0.00585大剂量组 13 9 0.01396±0.00565*注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，左旋咪唑组碳粒廓清指数较空白对照组显著增加(P＜0.01)，本发明药物大剂量组(9g生药/kg)碳粒廓清指数较空白对照组显著增加(P＜0.05)，其它两个剂量组虽碳粒廓清速度较空白对照组快，但差异无显著性意义(P＞0.05)。提示本发明药物对小鼠网状内皮系统吞噬功能有增强作用。
4、小结本发明药物能促进小鼠碳粒廓清速度，对小鼠网状内皮系统吞噬功能有增强作用。
(二)、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的影响目的 观察本发明药物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞作用，检测药物对机体非特异性免疫功能的影响。
方法 连续给小鼠灌药10天，腹腔注射5％羊红细胞(SRBC)0.2ml/10g，10小时后，处死动物，冲洗腹腔液，涂片，油镜下计200个巨噬细胞数中吞噬羊红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的羊红细胞总数，计算吞噬指数和吞噬百分率。
结果 本发明药物(9g生药/kg)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞功能具有促进作用。
1、试验目的观察本发明药物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞功能的影响。
2、试验材料试验动物、受试药物、乙肝宁颗粒和左旋咪唑同试验4-1。
3、实验方法和结果取ICR种雄性小鼠，随机分为6组。本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予45％、22.5％和11.25％的本发明药物混悬液，给药剂量依次为9g生药/kg、4.5g生药/kg和2.25g生药/kg；左旋咪唑组灌胃左旋咪唑30mg/kg；乙肝宁组给予乙肝宁7.4g/kg；空白对照组灌常水。每天给药1次，连续10天，给药容积0.2ml/10g。末次给药后1小时，每鼠腹腔注射5％羊红细胞(SRBC)0.2ml/10g，10小时后脱颈椎处死，仰位固定，消毒腹部，剪开皮肤，经腹腔注入生理盐水或阿氏液2～2.5ml。转动1分钟，抽取腹腔洗液1ml，滴涂于干净载玻片上，每片0.2ml，置于37C孵箱中温育30分钟，取出玻片，投入生理盐水中漂洗，以除去未贴片的细胞。晾干，以丙酮-甲醇(1∶1)固定5分钟，用4％姬姆萨-瑞特氏液染色3～5分钟，蒸馏水漂洗，晾干。在油镜下计200个巨噬细胞数中吞噬羊红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的羊红细胞总数，按下式计算吞噬指数和吞噬百分率。
表4-2对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(X±S)组别 动物数吞噬百分率(％)吞噬指数空白对照组12 29.5±10.4 0.433±0.168左旋咪唑组13 39.4±8.6*0.687±0.141**乙肝宁组 10 47.5±6.2**1.015±0.175**小剂量组 15 36.4±12.4 0.648±0.220*中剂量组 11 30.7±10.7 0.534±0.221大剂量组 10 40.9±12.9*0.689±0.283*与空白对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，本发明药物(9g生药/kg)能提高对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的吞噬百分率(％)和吞噬指数，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。本发明药物(2.25g生药/kg)能提高吞噬指数。提示，本发明药物能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的功能。
(三)、对2、4-二硝基氟苯致小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响目的观察本发明药物对2、4-二硝基氟苯(DNFB)致小鼠迟发型变态反应的影响。
方法各组动物共给药第9天，在给药第3天，用1％DNFB丙酮溶液50ul涂抹于腹部脱毛处1次致敏，致敏第5天，于右耳两面涂抹DNFB20ul攻击，24小时后，颈椎脱臼处死，剪下左右耳壳，用打孔器冲下直径8mm耳片，称重，计算左右耳片重量差即肿胀度，进行比较。
结果本发明药物大、中两个剂量组均明显降低由迟发型变态反应所引起的耳肿度(P＜0.01、＜0.05)。
1、试验目的以2、4-二硝基氟苯为抗原给小鼠致敏，观察本发明药物对再次接受此抗原攻击引起的迟发型变态反应(DTH)的影响。
2、试验材料(1)实验动物同实验4-1。
(2)药物及剂量同实验4-1。
3、试验方法将动物随机分为攻击组、致敏攻击组、左旋咪唑组、乙肝宁组和本发明药物大、中、小剂量组。各组按实验4-1的剂量和方法灌胃给药，每天1次，连续8天。给药第3天，除攻击组外，其余各组用1％DNFB丙酮溶液50ul涂抹于腹部脱毛处1次致敏。致敏第5天，给全部小鼠右耳两面涂抹1％DNFB丙酮溶液20ul，进行攻击。24小时后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器冲下直径8mm的耳片，称重。左右耳片重量之差即为肿胀度，用以反映迟发型变态反应(DTH)的程度。结果采用T检验进行比较各给药组与致敏攻击组组间差异的显著性。结果见表4-3。
如表所示，致敏攻击组耳片的肿胀度较攻击组显著提高(P＜0.01)，说明2、4-二硝基氟苯(DNFB)致小鼠迟发型变态反应模型成功。本发明药物小、中、大剂量组均能显著抑制DNFB致小鼠迟发型变态反应的鼠耳肿胀(P＜0.01、＜0.01、＜0.01)。
表4-3对2、4-二硝基氟苯(DNFB)致小鼠DTH的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数 肿胀度(mg)攻击组 - 11 0.63±0.64**致敏攻击组 - 10 2.25±0.61乙肝宁组 5.3 13 0.60±0.39**小剂量组 2.25 12 0.61±0.70**中剂量组 4.5 12 0.44±0.29**大剂量组 911 0.34±0.34**注与致敏攻击组比较*P＜0.05 **P＜0.014、小结本发明药物对DNFB引起的小鼠迟发型变态反应有抑制作用。
毒理研究1、急性毒性研究按照“中药(新药)研究指南”的要求，观察本发明药物小鼠灌胃的急性毒性，测定LD50或最大给药量。方法在预试验中，小鼠在以0.4ml/10g单次给予本发明药物最大浓度562.8％(g生药/100ml)时，5只动物无一死亡，遂进行最大给药量测定。试验时，取ICR小鼠20只，雌雄各半，灌胃给予562.8％的本发明药物混悬液，每隔4小时一次，连续2次，给药后观察一周。结果观察期内未见动物有急性毒性反应。本品小鼠灌胃的最大给药量是450g生药/kg，此剂量是临床人用量的523.3倍(人以70kg计，每天的剂量为0.86g生药/kg)。2、长期毒性研究按照“中药(新药)研究指南”的要求，观察大鼠灌胃本发明药物6个月对机体的毒性反应。
方法将SD种大鼠120只，随机分四组，每组30只。大剂量组灌胃本发明药物51.6g生药/kg(相当于人用剂量的60倍)，中剂量组灌胃本发明药物25.8g生药/kg(相当于人用剂量的30倍)，小剂量组给予本发明药物12.9g生药/kg(相当于人用剂量的15倍)，对照组给予等容积常水。给药周期为6个月，每日观察一般状况，每周称体重1次，摄食量和饮水量每周测定5天。给药3个月后，每组取10只动物进行心电图、血液学、血液生化学和病理学检查。其余各组动物继续给药，给药周期结束后，按前方法进行检查上述指标，剩余动物停止给药，观察2周，再进行心电图、血液学、血液生化学和病理学检查。
结果各组大鼠在给药期间和恢复期内，均未出现任何与药物有因果关系的毒性反应和死亡等现象；各给药组动物的一般观察、心电图、血液学、血液生化学和病理学检查与对照组比较，差异均无显著性意义。
结论51.6g生药/kg、25.8g生药/kg和12.9g生药/kg连续灌胃6个月对SD种大鼠无长期毒性反应，对动物的体重、摄食水量、血液学、血液生化学及心电图等无明显影响，对肝、肾、骨髓、胃肠等主要脏器或组织无明显的病理性损害。
综上所述，主要药效学研究表明，本发明药物有抗鸭乙型肝炎病毒作用；能不同程度地对抗D-GlaN、TAA及CCl4等所致的小鼠急性肝损伤，降低血清AST和ALT，减轻肝组织的病理性损害；对化学因素所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用、能减轻由CCI4诱导的大鼠肝脏内各种病变，并能抑制肝纤维化以及肝硬变形成；对DNFB引起的小鼠迟发型变态反应有抑制作用。
毒理研究表明本品小鼠灌胃的最大给药量是450g生药/kg，此剂量是临床人用量的523.3倍(人以70kg计，每天的剂量为0.86g生药/kg)。用本品51.6g生药/kg、25.8g生药/kg和12.9g生药/kg连续灌胃6个月对SD种大鼠无长期毒性反应，对动物的体重、摄食水量、血液学、血液生化学及心电图等无明显影响，对肝、肾、骨髓、胃肠等主要脏器或组织无明显的病理性损害。
喷雾干燥时进风温度为168℃，喷塔温度为78℃，出风温度为72℃，转速为2.5万转/分钟。
权利要求
1一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其特征在于它是由下列重量配比的原料制成的药剂灵芝308-420 白花蛇舌草392-840 栀子182-280郁金182-336 白芍112-336茯苓112-420丹参84-420 黄芩84-280 甘草28-252
2根据权利要求1所述的药物组合物，其中各原料的重量配比是灵芝400 白花蛇舌草400 栀子200郁金200 白芍166 茯苓166丹参100 黄芩100 甘草50
3根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
4根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的药剂是散剂。
5权利要求1所述药物组合物的制备方法，其特征在于(1)取灵芝、白花蛇舌草、丹参，粉碎成粗粉，加70％乙醇回流提取三次，每次提取2小时，第一次加8倍量的乙醇，第二次、第三次加6倍量的乙醇，提取液滤过，滤液合并，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.02～1.05的清膏，备用；(2)将上述(1)所得药渣与黄芩、栀子、白芍、郁金、甘草、茯苓六味药材混合，第一次加12倍量水浸泡1.5小时、煎煮2小时，第二、三次各加入10倍量水，分别煎煮2小时，煎液合并，滤过，浓缩至相对密度1.05～1.10的清膏，加入乙醇使含醇量达到50％，搅匀，静置24小时以上，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.02～1.05的清膏；(3)将上述(1)、(2)所得清膏混合均匀，喷雾干燥，加蔗糖与糊精细粉适量，混合均匀，用75％的乙醇制粒，干燥，整粒，即得散剂。
6根据权利要求5所述药物组合物的制备方法，其特征在于喷雾干燥时要求进风温度为160℃～180℃，喷塔温度为75～80℃，出风温度为70～75℃，转速为2.5万转/分钟。
7根据权利要求6所述药物组合物的制备方法，其特征在于所加蔗糖与糊精的重量比为5∶1。
全文摘要
本发明是以灵芝、白花蛇舌草、栀子、丹参、甘草、茯苓、黄芩、白芍、郁金九味中草药按一定重量配比，经过提纯、水煎、过滤、浓缩、干燥制成的复方颗粒，具有益气解毒，健脾理气，化瘀止痛之功能，用于乙型肝炎(慢性活动性及慢性迁延性肝炎)的治疗。
文档编号A61P1/16GK1454661SQ03134209
公开日2003年11月12日 申请日期2003年5月30日 优先权日2003年5月30日
发明者刘梅英, 刘林洲 申请人:刘梅英, 刘林洲
技术领域：
本发明涉及一种以中草药为原料治疗乙型肝炎的药物及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供该制剂的制备方法。
本发明是在中医理论指导下，针对慢性病毒性肝炎多肝郁气滞、肝胃不和、肝郁脾虚、邪毒蕴肝的病机特点，在民间验方基础上，结合20多年的临床经验加减化裁组方而成。
本发明药物是由下列组分制成的(用量为重量份)灵芝308-420 白花蛇舌草392-840栀子182-280郁金182-336 白芍112-336 茯苓112-420丹参84-420黄芩84-280 甘草28-252本发明药物的最佳重量(份)配比是灵芝400 白花蛇舌草400栀子200郁金200 白芍166 茯苓166
丹参100 黄芩100甘草50将上述各组分制成本发明药物的生产方法是1取灵芝、白花蛇舌草、丹参，粉碎成粗粉，加70％乙醇回流提取三次，每次提取2小时，第一次加8倍量的乙醇，第二次、第三次加6倍量的乙醇，提取液滤过，滤液合并，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.02～1.05的清膏，备用；2将上述1所得药渣与黄芩、栀子、白芍、郁金、甘草、茯苓六味药材混合，第一次加12倍量水浸泡1.5小时、煎煮2小时，第二、三次各加入10倍量水，分别煎煮2小时，煎液合并，滤过，浓缩至相对密度1.05～1.10的清膏，加入乙醇使含醇量达到50％，搅匀，静置24小时以上，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.02～1.05的清膏；3将上述1、2所得清膏混合均匀，喷雾干燥，加蔗糖与糊精细粉适量，混合均匀，用75％的乙醇制粒，干燥，整粒，即得散剂。
其中喷雾干燥时要求进风温度为160℃～180℃，喷塔温度为75～80℃，出风温度为70～75℃，转速为2.5万转/分钟；所加蔗糖与糊精的重量比为5∶1。本发明有以下三个方面特点一是能在短期内改善慢性乙肝临床症状，如一般经过1～2月的用药，患者的胁肋疼痛、腔闷腹胀、食欲不振、倦怠乏力、口干恶心等症状85％患者多消失。
二是原肝功能不正常者，经2～3月用药多恢复正常，尤其ALT和AST恢复明显。
三是该方服用半年以上e抗原约有20％可阴转。
药效学试验为了进一步说明本发明的治病机理，我们进行了与本发明药物功能主治有关的主要药效学试验，包括体内体外抗病毒作用、对化学因素诱发的小鼠急性肝损伤的影响、对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响、对小鼠免疫功能的影响等，结果如下
一、抗鸭乙型肝炎病毒的药效学试验资料及文献资料受试药品本发明药物(批号020406)，用2号胶囊包装。试验采用三种剂量的本发明药物1.6g(原生药)·kg-1·D-1、3.2g(原生药)·kg-1·D-1和6.4g(原生药)·kg-1·D-1。
阳性对照药物拉米夫定(批号B038238，葛兰素威康英国行动有限公司生产)购于重医附二院，压碎后自制成5mg/粒的胶囊。动物采用健康成年的重庆麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔接种0.1mlDHBV DNA阳性病毒血清。接种1周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记的DHBV DNA探针经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养至3周龄作为实验动物。给药途径口腔灌喂方法和结果1.方法将感染阳性鸭64只随机分为5组(1)病毒对照组(12只)用淀粉胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为500mg/只。(2)阳性药物对照组(13只)用拉米夫定胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为50mg.Kg-1.D-1。(3)本发明药物小剂量组(13只)每日口腔灌喂1次，剂量为1.6g(原生药).Kg-1.D-1。(4)本发明药物中剂量组(13只)每日口腔灌喂1次，剂量为3.2g(原生药).Kg-1.D-1。(5)本发明药物大剂量组(13只)每日口腔灌喂1次，剂量为6.4g(原生药).Kg-1.D-1。
实验用药时间为28天，停药观察7天。2.实验结果(1)用药前、中、后血清DHBV DNA滴度改变情况病毒对照组(淀粉胶囊)用药前后血清DHBV DNA滴度无明显降低。拉米夫定组用药7天后开始出现有血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.05)，停药后有DHBV DNA回升现象。本发明药物大、中剂量组分别于28天开始出现有血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.01或P＜0.05)，大剂量组于停药7天后病毒DNA出现反跳现象。本发明药物小剂量组在治疗期间内鸭血清中的DHBV DNA滴度有降低趋势，但用药前后比较无统计学意义。见表1。
表1用药前后血清DHBV DNA滴度改变情况(x±S)DHBV DNA(volume)组别用药前用药7天 用药14天 用药21天 用药28天 停药7天淀粉胶囊组 1523.33± 1571.15± 1617.52± 1536.734± 1542.45± 1494.04±113.47109.26 133.44 115.0774.0268.15拉米夫定组 1378.80± 1300.24± 1342.99± 1284.22± 1292.98± 1358.97±130.03119.71*137.56 86.34*60.81*81.46本发明药物大剂 1468.75± 1438.70± 1435.60± 1421.10± 1351.81± 1378.63±量组 251.96 289.26 286.82 244.17178.29**196.82本发明药物中剂 1467.72± 1491.76± 1558.29± 1437.37± 1334.07± 1324.98±量组 202.50 305.83 245.73 323.28164.29*144.28*本发明药物小剂 1529.57± 1547.78± 1479.37± 1466.81± 1510.87± 1472.45±量组 171.12 188.76 190.88 164.24225.93 165.31注上表所列为各组DNA斑点volume值的平均数及标准差，统计学采用配对t检验(＂*＂P＜0.05；＂**＂P＜0.01)，为各组不同时间DNA斑点值与同组用药前DNA斑点值的比较。(2)各组用药前、中、后血清DHBsAgO.D值改变情况病毒对照组(淀粉胶囊)及本发明药物各剂量组用药前后血清DHBsAgO.D值无明显改变，拉米夫定组用药7天开始出现血清DHBsAgO.D值降低(P＜0.01)，至停药7天血清DHBsAgO.D值有回升现象，但与用药前比较仍有持续降低(P＜0.05)。见表2。
表2各组用药前后血清DHBsAgO.D值改变情况(x±S)组别用药前用药7天 用药14天 用药21天 用药28天 停药7天淀粉胶囊组0.74±0.390.65±0.27 0.60±0.340.56±0.26 0.61±0.30 0.63±0.27拉米夫定组0.64±0.480.34±0.25**0.35±0.26*0.26±0.17**0.29±0.25**0.41±0.27*本发明药物大剂量组 0.79±0.590.88±0.62 0.81±0.610.77±0.52 0.66±0.47 0.68±0.36本发明药物中剂量组 0.73±0.530.71±0.49 0.70±0.500.64±0.42 0.61±0.49 0.58±0.42本发明药物小剂量组 0.68±0.410.73±0.48 0.68±0.440.55±0.35 0.56±0.32 0.47±0.34注上表所列为各组DHBsAgO.D值平均数及标准差，统计学采用配对t检验。(＂*＂P＜0.05，＂*″P＜0.01)，为各组不同时间DHBsAgO.D值与同组用药前DHBsAgO.D值的比较。
(3)肝脏HE染色病理检查结果各组均有较轻程度肝细胞浊肿、嗜酸变性，部分组织汇管区、小叶间隔有轻～中度炎症细胞浸润及肝细胞点状坏死现象，这些病理表现用药组与对照组无明显差异。3.结论用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效的治疗药物，已为国内外学者所公认。1-3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象，因此，我们应用1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行本发明药物抗病毒疗效的考核，期望筛选出有抗乙型肝炎病毒作用的药物。并用对乙型肝炎病毒有明显抑制作用的核苷酸类似物拉米夫定作为阳性药物对照。
本次动物试验结果表明本发明药物中、大剂量组鸭血清中的DHBV DNA滴度降低有显著或极显著意义，本发明药物小剂量组在治疗期间内鸭血清中的DHBV DNA滴度虽有降低趋势，但用药前后比较无统计学意义，说明本发明药物对DHBV DNA的抑制效果与试验选择的药物剂量有一定的量效关系。本发明药物大剂量组于停药7天后病毒DNA出现反跳现象，说明本发明药物抑制病毒的效果是一过性的、不彻底的。除拉米夫定组外，其余各组血清中DHBsAg均无明显的降低，说明本发明药物对鸭乙型肝炎病毒表面抗原抑制作用不明显，尽管拉米夫定和本发明对鸭乙型肝炎病毒DNA有一定的抑制作用，这些抑制作用尚达不到“阴转”效果，所以，延长用药时间、选择合适的用药剂量是值得进一步探讨的课题。
由于鸭乙型肝炎动物模型自身的特点，1-3日龄雏鸭免疫系统发育不完善，在感染DHBV后，仅出现单纯的病毒携带状态，但肝脏组织病变轻微，肝功能无明显异常。我们的实验结果发现本发明药物各剂量组肝组织病理检测与对照组无明显差异，虽不能证实该药有改善肝功能的效果(这需要其它动物验证)，但可说明连续用药1个月本发明药物对肝组织无明显毒性损害。
二、对化学因素致小鼠急性肝损伤的保护作用目的观察受试药物对D-半乳糖胺(D-GlaN)、硫代乙酰胺(TAA)和四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤的影响。
方法用D-GlaN、TAA及CCl4等化学品造成小鼠急性肝损伤，以血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST/GOT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)和肝组织病理学检查等为指标，观察受试药对化学因素致小鼠急性肝损伤的保护作用。
结果本发明药物能降低血清AST和ALT，减轻肝组织病理性损害，对D-GlaN、TAA及CCl4等化学因素所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用。
(一)、对D-氨基半乳糖所致的小鼠急性肝损伤的影响1、试验目的用D-GlaN造成小鼠急性肝损伤，以血清AST、ALT和肝组织病理学检查为指标，观察本发明药物对化学因素所致急性肝损伤的影响。
2、试验材料(1)试验动物健康ICR种系小鼠，雄性，体重20±2克，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号医动字第08-004号。饲养条件陕西中医学院中药药理学实验室(国家中医管理局中医药科研实验室分级二级)。
(2)药品和试剂受试药物本发明药物细粉，1g含生药8.33g，由西安绿谷制药有限公司提供，批号020406。用蒸馏水配成45％、22.5％、11.25％(生药)的本发明药物混悬液，给药时摇匀。成人每天口服60g生药，即临床人用剂量为0.86g/kg(人体重以70kg计)。
阳性对照药乙肝宁颗粒，由广西半宙制药股份有限公司生产，批准文号ZZ-5010-桂卫药准字(1990)第079023号，生产批号020120。用蒸馏水配成37％(生药)的混悬液，本试验小鼠给药剂量为7.4g/kg。联苯双酯滴丸，1.5mg/丸，山东省德州制药厂生产，批准文号国药准字H37020113，生产批号020816。研磨后用蒸馏水配成20mg/ml的混悬液，给药剂量为200mg/kg。
试剂D-半乳糖胺(D-Glactosamine D-GlaN)，Sigma出品，批号83H0925。临用时用无菌生理盐水配制成10％D-DlaN溶液。腹腔注射1000mg/kg体重。D-GlaN是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂，引起的肝损伤在生物化学和组织学改变上与人类病毒性肝炎颇为相似[1、3]。AST试剂盒(批号020031)和ALT试剂盒(批号020301)由北京中生生物工程高技术公司生产。
3.实验方法和结果取ICR种雄性小鼠，随机分为7组。本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予45％、22.5％和11.25％的本发明药物混悬液，给药剂量依次为9g生药/kg、4.5g生药/kg和2.25g生药/kg；联苯双酯组灌胃联苯双酯200mg/kg；乙肝宁组给予乙肝宁7.4g/kg；空白对照组和模型组灌常水。每天给药1次，连续5天，给药容积0.2ml/10g。末次给药后1小时，腹腔注射10％的D-GlaN溶液0.1ml/10g体重，24小时后眼眶取空腹血，分离血清，用XD-811C型生化分析仪(上海讯达医疗仪器公司生产)测定血清AST(连续检测法)和ALT(连续检测法)，同时取肝左叶10％福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察病理变化。试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(1)、对血清AST和ALT的影响(表2-1)表2-1对血清AST和ALT的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数 ALT(U/L)AST(U/L)正常对照组- 11 77.4±18.1**119.3±15.6**模型组- 10 132.2±28.0 248.0±88.0联苯双酯组0.210 93.1±31.1**164.2±44.1*乙肝宁组 7.49118.2±26.7 200.2±59.0大剂量组 9 11 102.6±20.5*166.5±62.7中剂量组 4.511 120.8±31.9 180.7±61.0小剂量组 2.25 10 138.3±71.2 223.3±126.3与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01如表2-1所示，模型组动物血清AST和ALT明显升高，与正常对照组比较，差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.01)；本发明药物大、中、小剂量能降低血清AST和ALT，大剂量组动物血清ALT与模型组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)；阳性对照药联苯双酯降酶作用显著(P＜0.01、＜0.05)。
(2)、对肝组织病理学检查的影响(表2-2)表2-2对肝组织病理学检查的影响病变程度组别P- + +++++正常组 8 21 0 ＜0.05模型组 0 36 1联苯双酯组 2 53 0 ＜0.05乙肝宁组 1 35 0大剂量组 4 70 0 ＜0.05中剂量组 2 72 0 ＜0.05小剂量组 1 45 0注变性等级标准-正常，无肝细胞气球样变性+肝小叶不到1/3区域肝细胞轻度肿胀，胞浆内见无定形空泡，肝索基本清楚，肝窦尚可见++介于“+”和“+++”之间+++肝细胞极度肿胀，呈气球样变，肝索紊乱，肝窦不清4、小结用10％D-GlaN以1000mg/kg腹腔注射造成小鼠急性肝损伤，观察本发明药物对其损伤的保护作用。结果表明，本发明药物9g/kg能明显降低血清AST和ALT，减轻肝细胞变性，对D-GlaN所致的小鼠急性肝损伤有保护作用。
(二)、对硫代乙酰胺致小鼠急性肝损伤的影响1、试验目的观察本发明药物对硫代乙酰胺TAA致小鼠急性肝损伤的影响。
2、试验材料试验动物、受试药物和阳性对照药同试验2-1。硫代乙酰胺(Thioacetamide TAA)，分析纯，由中国医药集团上海化学试剂公司提供，批号20011211。用无菌蒸馏水配成2％溶液，以50mg/kg腹腔注射造成急性肝损伤。TAA能干扰PNA从核到细胞质的转运过程，影响蛋白质合成，损害肝细胞膜，导致肝细胞坏死。生化检验试剂同试验2-1。
3、试验方法和结果分组和给药方法同试验2-1。末次给药后1小时，除空白对照组外，其余各组动物腹腔注射2％的TAA溶液0.025ml/10g，16小时后眼眶取空腹血，分离血清，测定血清AST和ALT，肝脏进行病理学检查。试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(1)、对血清AST和ALT的影响(表2-3)表2-3对血清AST和ALT的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数 ALT(U/L)AST(U/L)正常组 - 11 77.4±18.1**119.3±15.6**模型组 - 15 148.8±83.5 325.2±118.1联苯双酯组 0.2 12 99.1±27.0*195.5±81.8**乙肝宁组 7.4 17 114.6±27.0 261.4±84.1大剂量组9 15 98.5±20.6*253.4±94.1中剂量组 4.5 15 105.0±27.3 300.9±71.2小剂量组 2.25 15 122.3±59.3 344.3±62.9
与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，小鼠注射TAA后，肝功能损害严重，血清AST和ALT明显升高，与正常组比较，差异有显著性意义(P＜0.01、P＜0.01)；大剂量组动物血清ALT与模型组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)；联苯双酯能显著降低ALT(P＜0.05)和AST(P＜0.01)。
2、对肝组织病理学检查的影响表2-4对肝组织病理学检查的影响病变程度组别P- ++++++正常组101 0 0 ＜0.05模型组0 6 6 3联苯双酯组2 5 5 0 ＜0.05乙肝宁组 2 8 6 1 ＜0.05大剂量组 6 7 2 0 ＜0.05中剂量组 2 6 6 1小剂量组 0 6 7 2注变性等级标准-正常，无肝细胞气球样变性+肝小叶不到1/3区域肝细胞轻度肿胀，胞浆内见无定形空泡，肝索基本清楚，肝窦尚可见++介于“+”和“+++”之间+++肝细胞极度肿胀，呈气球样变，肝索紊乱，肝窦不清4、小结用TAA50mg/kg腹腔注射造成小鼠急性肝损伤模型，观察本发明药物对损伤的保护作用。结果，大剂量明显降低血清ALT(P＜0.05)，并明显减轻浊肿、坏死等肝细胞病变(P＜0.05)。提示，本发明药物对TAA所致的小鼠急性肝损伤有保护作用。
(三)、对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响1、试验目的观察本发明药物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响。
2、试验材料试验动物、受试药物和阳性对照药同试验2-1。四氯化碳(CCl4)，分析纯，莱阳化工实验厂生产(GB688-92)，批号20011030。临用前用橄榄油配成0.1％的油溶液。生化试剂同试验2-1。
3、试验方法和结果分组和给药同试验2-1。末次给药后1小时，除空白对照组外，其余各组动物腹腔注射0.1％CCl4橄榄油溶液10ml/kg。禁食18小时，眼眶取血，分离血清，测定血清AST和ALT，肝脏进行病理学检查。试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(1)、对血清AST和ALT的影响(表2-5)表2-5对血清AST和ALT的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数ALT(U/L)AST(U/L)正常组-17 77.7±17.2**120.3±18.5**模型组-17 125.4±33.4 213.2±50.7联苯双酯组 0.2 16 81.5±15.7**139.7±38.6**乙肝宁组 7.4 15 96.1±25.6*181.4±67.1大剂量组 9 17 89.1±25.2**168.4±51.5*中剂量组 4.5 16 97.5±26.7*173.1±71.3小剂量组 2.25 11 113.2±27.0 179.0±78.6与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，模型组血清AST和ALT明显增高，与正常对照组比较，差异均有显著性(P＜0.01、＜0.01)；本发明药物各剂量组能不同程度地降低血清AST和ALT，大剂量组与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.05)。中剂量组血清ALT与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.05)。
(2)、对肝组织病理学检查的影响(表2-6)
表2-6对肝组织病理学检查的影响病变程度组别p- + ++ +++正常组16 1 0 0 ＜0.05模型组1 3 7 6联苯双酯组4 6 4 2 ＜0.05乙肝宁组 2 7 5 1 ＜0.05大剂量组 4 10 3 0 ＜0.05中剂量组 2 4 8 2小剂量组 1 4 4 2注气球样变性等级标准-正常，无肝细胞气球样变性+肝小叶不到1/3区域肝细胞轻度肿胀，胞浆内见无定形空泡，肝索基本清楚，肝窦尚可见++介于“+”和“+++”之间+++肝细胞极度肿胀，呈气球样变，肝索紊乱，肝窦不清正常组动物肝脏组织所见同试验2-1；模型组肝脏的肝小叶汇管区和/或中央静脉周围大量肝细胞空泡变及萎缩、坏死并伴有炎症细胞浸润，与正常对照组比较差异显著(P＜0.05)，部分区域细胞呈不同程度的胞浆疏松和水样变，肝细胞排列紊乱，但肝窦尚可见；本发明药物大、中剂量组细胞轻度肿长，水样变、坏死和炎症细胞浸润减轻，大剂量组与模型组比较差异有显著性意义(P＜0.05)。
4、小结本发明药物大剂量组能降低CCl4致小鼠急性肝损伤模型血清AST和ALT，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.05)，能减轻细胞轻度肿长，水样变、坏死和炎症细胞浸润，大剂量组与模型组比较差异有显著性意义(P＜0.05)。提示，本发明药物对CCl4致小鼠急性肝损伤有保护作用。
(四)、结论本发明药物9g/kg、4.5g/kg能不同程度地对抗D-GlaN、TAA及CCl4等所致的小鼠急性肝损伤，降低血清AST和ALT，减轻肝组织的病理性损害，对化学因素所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用。
三、对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响目的 观察本发明药物对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响，探讨其治疗慢性肝炎的中药药理学基础。
方法连续24次给大鼠皮下注射25％的CCl4油溶液，诱导大鼠肝损伤和肝纤维化，同时灌胃本发明药物，以血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST/GPT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT/GOT)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、III型前胶原蛋白(PC-3)和肝脏脏器系数以及肝脏病理学检查为指标，观察受试药物对CCl4致大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的影响。
结果本发明药物能降低血清AST、ALT；降低血清LN、HA及PC-3，明显减轻肝小叶内肝细胞肿胀、胞浆疏松、脂肪变、气球样变等各种病理变化和肝纤维增生。提示，本发明药物对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤和肝纤维化具有保护作用。
(一)、试验目的用CCl4反复注射造成大鼠慢性肝损伤及肝纤维化，同时灌胃本发明药物，以血清生化及肝脏组织病理学检查为指标，观察本发明药物对该模型的影响，探讨其治疗急、慢性肝炎的中药药理学基础。
(二)、试验材料(1)试验动物SD种大鼠120只，雄性，体重150g±10g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号医动字第08-005号。饲养条件陕西中医学院中药药理学实验室(国家中医管理局中医药科研实验室分级二级)。
(2)药品和试剂受试药物本发明药物细粉，1g含生药8.33g，由西安绿谷制药有限公司提供，批号020316。用蒸馏水配成64％、32％、16％的本发明药物混悬液，给药时摇匀。成人每天口服60g生药，即临床人用剂量为0.86g/kg(体重以70kg计)。
阳性对照药乙肝宁颗粒，由广西半宙制药股份有限公司生产，批准文号ZZ-5010-桂卫药准字(1990)第079023号，生产批号020120。本试验大鼠给药剂量为5.3g生药/kg(人用剂量的5倍)，用蒸馏水配成53g生药/100ml的混悬液。
试剂四氯化碳(CCI4)，分析纯，莱阳化工实验厂生产(GB688-92)，批号20011030，临用前用橄榄油稀释成25％的油溶液。AST试剂盒(批号020031)、ALT试剂盒(批号010071)、总蛋白试剂盒(生产批号020301)和白蛋白试剂盒(生产批号020302)，均由北京中生生物工程高技术公司生产。透明质酸(HA)放射免疫分析试剂盒，河南省焦作市解放免疫诊断试剂研究所出品，批号02022；层粘连蛋白(LN)放射免疫分析试剂盒，河南省焦作市解放免疫诊断研究所出品，批号020225；III型前胶原(PC-3)放射免疫分析试剂盒(平衡法)，批号020201，由上海海军医学研究所生物技术中心提供。
(三)、试验方法取SD种大鼠，随即分为6组。除正常对照组外，其余各组按照文献方法，皮下注射25％CCl4橄榄油溶液0.2ml/100g，每周2次，连续12周，共24次。在注射CCl4的同时，本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予64％、32％、16％(生药)的本发明药物混悬液，给药剂量依次为6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg；乙肝宁组给予乙肝宁5.3g/kg；模型组灌服常水。各组每天给药1次，连续12周，给药容积1ml/100g。末次给药24小时后，用戊巴比妥钠麻醉动物，解剖观察肝脏外观及其它可见病变，经腹主动脉取血，分离血清，进行血液生化学检查。摘取肝脏精密称定，取肝左叶进行病理学检查。
(四)、检测指标和方法1、血液生化学检查用XD-811C型生化分析仪测定血清AST(连续检测法)、ALT(连续检测法)、总蛋白(TP，双缩脲法)和白蛋白(Alb，溴甲酚绿法)。
2、血清层粘连蛋白、透明质酸、III型前胶原用放射免疫法测定。
3、肝脏病理肝脏称重，计算肝脏系数(g/100g体重)，取肝左叶中1/3用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜观察肝组织的病理变化。
(五)、统计方法试验所得的计量资料经t值法分析检验，等级资料用Ridit法进行统计分析，比较组间差异的显著性。
(六)结果1、一般状况模型组动物较空白对照组皮毛明显变黄、蓬乱，精神萎靡，体重增长缓慢，其它各组动物的一般状况较模型组有不同程度的改善，但未见显著差异。试验后期各组动物随机抽样剖检表明，造模后鼠肝有不同程度的肿大，本发明药物对CCl4致大鼠慢性肝损伤有一定的疗效。
2、对血清AST、ALT、Alb和TP的影响(表3-1)表3-1对血清AST、ALT、Alb和TP的影响组别 动物数ALT(U/L) AST(U/L) TP(g/L) Alb(g/L)正常对照组14 49.6±7.5**148.9±28.8**62.5±6.5 31.6±5.0模型组20 180.7±108.5291.2±109.7 66.3±6.5 30.6±8.5乙肝宁组 15 52.7±9.4**149.5±27.6**71.9±7.7*31.8±10.3小剂量组 17 50.9±17.0**149.6±33.1**66.8±5.5 30.3±9.2中剂量组 20 53.2±10.4**146.1±19.7**66.8±9.1 29.8±12.6大剂量组 20 52.9±8.9**156.4±26.5**73.3±9.4*27.5±10.8注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01如表所示，模型组动物血清AST和ALT明显升高，与正常组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)，说明CCl4致大鼠慢性肝损伤动物模型成功；本发明药物6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg灌胃能明显降低动物血清AST和ALT，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)，乙肝宁颗粒剂亦有显著的降酶作用(P＜0.01)。
模型组血清总蛋白和白蛋白与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05)，说明尚未导致低蛋白血症；本发明药物大剂量组与模型组比较，血清总蛋白高于模型组，差异有显著性意义(P＜0.05)。
3、对血清LN、HA及PC-3的影响(表3-2)血清PC-3、LN、HA水平与肝纤维化严重程度呈高度正相关，是肝纤维化肝硬变的早期诊断及药物疗效、愈后评价有意义的指标。结果表明，模型组动物血清中HA及PC-3明显升高，与正常组比较有显著差异(P＜0.01、＜0.01)；本发明药物3.2g生药/kg能明显降低LN、HA及PC-3，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.05，＜0.01，＜0.01)；本发明药物6.4g生药/kg能明显降低LN(P＜0.05)。提示，给大鼠连续注射CCl4能导致肝纤维化，本发明药物能抑制肝纤维化过程。
表3-2对血清LN、HA及PC-3的影响(X±S)动物组别 LN(ng/ml) HA(ng/ml)PC-3 (ug/L)数正常对照组 1484.72±10.16 61.92±42.80**35.92±9.44**模型组 2086.33±7.78 173.38±132.1849.98±4.86乙肝宁组1581.35±9.69 78.94±35.28**44.59±5.74**小剂量组1780.58±10.52 108.87±36.55 47.41±5.33中剂量组2081.10±7.45*84.88±35.76**44.56±5.98**大剂量组2079.32±5.58*121.40±51.76 47.41±3.27注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.015、肝脏组织病理检查结果(1)肉眼观察剖检时在各组动物腹腔内未见腹水。正常大鼠肝脏表面光滑，颜色暗红且质软；模型组动物肝脏粗大，表面不光滑，有不同程度的结节，颜色红褐，边缘印圆，质地硬，肝脏肿大明显。本发明药物各剂量组肝脏颜色、边缘、质地有不同程度的改善。各组动物肝脏系数(g/100g体重)结果见表3-3。
表3-3对肝脏系数(g/100g体重)的影响组别 动物数 剂量(g/kg)肝脏系数(g/100g体重)正常对照组 14-2.73±0.30**模型组 20-4.08±0.43乙肝宁组 15 5.3 2.94±0.31**小剂量组 17 1.6 3.34±0.36**中剂量组 20 3.2 3.08±0.18**大剂量组 20 6.4 3.18±0.23**注与模型组比较**P＜0.01
结果表明，模型组动物肝脏系数(g/100g体重)显著高于正常对照组(P＜0.01)，说明CCl4致大鼠慢性肝损伤时，有肝脏肿大现象。本发明药物6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg均能明显降低动物肝脏系数，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01、＜0.01、＜0.01)。
(2)病理学检查结果见表3-4(对肝脏变性的影响)和表3-5(对肝脏纤维增生的影响)。
表3-4对肝脏变性的影响动物病变变性分级组别P数 - ± ++++++正常对照组14 121 1 0 0 ＜0.05模型组20 0 1 2 4 13乙肝宁组 15 0 3 8 3 1 ＜0.05大剂量组 17 1 3 5 6 2 ＜0.05中剂量组 20 1 4 5 6 4 ＜0.05小剂量组 20 0 2 6 8 4 ＜0.05注变性病变分级标准-肝细胞及肝小叶结构正常，无病变±偶见单个细胞变性病变+小滴脂防变及肝细胞浊肿占肝小叶的1/3以下++大小滴脂肪变细胞杂存，同时伴有肝细胞包浆疏松占肝小叶的1/3～2/3+++大滴脂肪变细胞遍及肝小叶，完全破坏肝小叶正常结构表3-4所示，模型组几乎全部动物肝脏出现程度不同的浊肿、胞浆疏松及气球样变(包括脂肪变)。本发明药物各剂量组病变明显减轻，与模型组比较差异均有显著性意义(均P＜0.05)。
表3-5对肝脏纤维增生的影响纤维增生分级组别 动物数P0 IIIIIIIVV正常对照组 14140 0 0 0 0＜0.01模型组 20105 3 1 1 0乙肝宁组 159 2 3 1 0 0大剂量组 17133 1 0 0 0＜0.05中剂量组 20114 2 3 0 0小剂量组 20103 3 3 1 0分级标准0级肝细胞正常，纤维增生I级胶原纤维从汇管区或中央静脉周围轻度向外延伸II级胶原纤维延伸明显，但未包绕肝小叶III级胶原纤维延伸明显，互相连接，包绕肝小叶但不太完整IV级胶原纤维延伸明显，互相连接，形成假小叶，以大的假小叶为主。V级肝小叶结构完全破坏，形成大小不同的假小叶，胶原纤维粗大。
表3-5表明，模型组动物肝脏有不同程度的纤维增生，与正常组动物比较差异有显著性意义(P＜0.01)，但纤维增生形成率和程度还不够充分。本发明药物大剂量组动物肝脏纤维增生与模型组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。
(七)、结论用CCl4反复注射造成大鼠慢性肝损伤及肝纤维化，同时灌胃本发明药物，以血清生化及肝脏组织病理学检查为指标，观察本发明药物对该模型的影响。结果表示，本发明药物6.4g生药/kg、3.2g生药/kg和1.6g生药/kg能明显降低动物血清AST和ALT，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)；本发明药物3.2g生药/kg能明显降低LN、HA及PC-3，与模型组比较差异均有显著性意义(P＜0.05，＜0.01，＜0.01)；本发明药物6.4g生药/kg能明显降低LN(P＜0.05)。病理学研究表明，本发明药物能明显降低动物慢性肝损伤的肝脏系数，减轻肝小叶内浊肿、胞浆疏松、气球化等炎症病变，减轻肝纤维增生。本发明药物对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤和肝纤维化具有保护作用。
四、对小鼠免疫功能的影响(一)、对小鼠碳粒廓清的影响目的采用碳粒廓清法，观察本发明药物对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响。
方法将动物分为7组，灌胃给药7天，尾静脉注射10％印度墨汁，注射后2、10分钟分别取血，于波长600nm处测定光密度OD值。
结果本发明药物(9g/kg)加快小鼠碳粒廓清速度，提示本品能增强网状内皮系统的吞噬功能。
1、试验目的以碳粒廓清法观察本发明药物对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响。
2、试验材料(1)试验动物健康ICR种系小鼠，雌雄各性，体重20±2克，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号医动字第08-004号。饲养条件陕西中医学院中药药理学实验室(国家中医管理局中医药科研实验室分级二级)。
(2)药品和试剂受试药物本发明药物细粉，1g含生药8.33g，由西安绿谷制药有限公司提供，批号020406。用蒸馏水配成11.25％、22.5％、45％(生药)的本发明药物混悬液，给药时摇匀。
阳性对照药乙肝宁颗粒，由广西半宙制药股份有限公司生产，批准文号ZZ-5010-桂卫药准字(1990)第079023号，生产批号020120。本试验小鼠给药剂量为7.4g/kg，用蒸馏水配成37％(生药)的混悬液。盐酸左旋咪唑片，25mg/片，南京第二制药厂生产，批准文号苏卫药准字(1998)第254011号，生产批号20020401，用蒸馏水配成混悬液，小鼠灌胃剂量为30mg/kg。
3.实验方法和结果取ICR种雄性小鼠，随机分为6组。本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予45％、22.5％和11.25％的本发明药物混悬液，给药剂量依次为9g生药/kg、4.5g生药/kg和2.25g生药/kg；左旋咪唑灌胃左旋咪唑200mg/kg；乙肝宁组给予乙肝宁7.4g/kg；空白对照组灌常水。每天给药1次，连续10天，给药容积0.2ml/10g。末次给药后2小时，给小鼠尾静脉注射10％印度墨汁0.2ml/只。注射后2和10分钟分别自眼球后静脉丛取血20ul，加入到装有4ml蒸馏水的试管中溶解红细胞，然后用721型分光光度计于波长600nm处测定光密度OD值，按下式计算单位时间内血清中碳粒廓清的速度K。结果见表4-1。K=l0gOD2-l0gOD10t10-t2]]>OD2和OD10分别为注射印度墨汁后2和10分钟所取血样的OD值，t2和t10为取血时间。结果经t检验比较各组与空白对照组间的差异性。
表4-1对小鼠碳粒廓清的影响(X±S)组别 动物数 剂量(g/kg)碳粒廓清指数(K)空白对照组11- 0.00829±0.00695左旋咪唑组10 0.20.01853±0.00548**乙肝宁组 11 7.40.1032±0.00550小剂量组 13 2.25 0.00888±0.00446中剂量组 12 4.50.00953±0.00585大剂量组 13 9 0.01396±0.00565*注与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，左旋咪唑组碳粒廓清指数较空白对照组显著增加(P＜0.01)，本发明药物大剂量组(9g生药/kg)碳粒廓清指数较空白对照组显著增加(P＜0.05)，其它两个剂量组虽碳粒廓清速度较空白对照组快，但差异无显著性意义(P＞0.05)。提示本发明药物对小鼠网状内皮系统吞噬功能有增强作用。
4、小结本发明药物能促进小鼠碳粒廓清速度，对小鼠网状内皮系统吞噬功能有增强作用。
(二)、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的影响目的 观察本发明药物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞作用，检测药物对机体非特异性免疫功能的影响。
方法 连续给小鼠灌药10天，腹腔注射5％羊红细胞(SRBC)0.2ml/10g，10小时后，处死动物，冲洗腹腔液，涂片，油镜下计200个巨噬细胞数中吞噬羊红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的羊红细胞总数，计算吞噬指数和吞噬百分率。
结果 本发明药物(9g生药/kg)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞功能具有促进作用。
1、试验目的观察本发明药物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞功能的影响。
2、试验材料试验动物、受试药物、乙肝宁颗粒和左旋咪唑同试验4-1。
3、实验方法和结果取ICR种雄性小鼠，随机分为6组。本发明药物大、中、小剂量组分别灌胃给予45％、22.5％和11.25％的本发明药物混悬液，给药剂量依次为9g生药/kg、4.5g生药/kg和2.25g生药/kg；左旋咪唑组灌胃左旋咪唑30mg/kg；乙肝宁组给予乙肝宁7.4g/kg；空白对照组灌常水。每天给药1次，连续10天，给药容积0.2ml/10g。末次给药后1小时，每鼠腹腔注射5％羊红细胞(SRBC)0.2ml/10g，10小时后脱颈椎处死，仰位固定，消毒腹部，剪开皮肤，经腹腔注入生理盐水或阿氏液2～2.5ml。转动1分钟，抽取腹腔洗液1ml，滴涂于干净载玻片上，每片0.2ml，置于37C孵箱中温育30分钟，取出玻片，投入生理盐水中漂洗，以除去未贴片的细胞。晾干，以丙酮-甲醇(1∶1)固定5分钟，用4％姬姆萨-瑞特氏液染色3～5分钟，蒸馏水漂洗，晾干。在油镜下计200个巨噬细胞数中吞噬羊红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的羊红细胞总数，按下式计算吞噬指数和吞噬百分率。
表4-2对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(X±S)组别 动物数吞噬百分率(％)吞噬指数空白对照组12 29.5±10.4 0.433±0.168左旋咪唑组13 39.4±8.6*0.687±0.141**乙肝宁组 10 47.5±6.2**1.015±0.175**小剂量组 15 36.4±12.4 0.648±0.220*中剂量组 11 30.7±10.7 0.534±0.221大剂量组 10 40.9±12.9*0.689±0.283*与空白对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明，本发明药物(9g生药/kg)能提高对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的吞噬百分率(％)和吞噬指数，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。本发明药物(2.25g生药/kg)能提高吞噬指数。提示，本发明药物能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的功能。
(三)、对2、4-二硝基氟苯致小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响目的观察本发明药物对2、4-二硝基氟苯(DNFB)致小鼠迟发型变态反应的影响。
方法各组动物共给药第9天，在给药第3天，用1％DNFB丙酮溶液50ul涂抹于腹部脱毛处1次致敏，致敏第5天，于右耳两面涂抹DNFB20ul攻击，24小时后，颈椎脱臼处死，剪下左右耳壳，用打孔器冲下直径8mm耳片，称重，计算左右耳片重量差即肿胀度，进行比较。
结果本发明药物大、中两个剂量组均明显降低由迟发型变态反应所引起的耳肿度(P＜0.01、＜0.05)。
1、试验目的以2、4-二硝基氟苯为抗原给小鼠致敏，观察本发明药物对再次接受此抗原攻击引起的迟发型变态反应(DTH)的影响。
2、试验材料(1)实验动物同实验4-1。
(2)药物及剂量同实验4-1。
3、试验方法将动物随机分为攻击组、致敏攻击组、左旋咪唑组、乙肝宁组和本发明药物大、中、小剂量组。各组按实验4-1的剂量和方法灌胃给药，每天1次，连续8天。给药第3天，除攻击组外，其余各组用1％DNFB丙酮溶液50ul涂抹于腹部脱毛处1次致敏。致敏第5天，给全部小鼠右耳两面涂抹1％DNFB丙酮溶液20ul，进行攻击。24小时后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器冲下直径8mm的耳片，称重。左右耳片重量之差即为肿胀度，用以反映迟发型变态反应(DTH)的程度。结果采用T检验进行比较各给药组与致敏攻击组组间差异的显著性。结果见表4-3。
如表所示，致敏攻击组耳片的肿胀度较攻击组显著提高(P＜0.01)，说明2、4-二硝基氟苯(DNFB)致小鼠迟发型变态反应模型成功。本发明药物小、中、大剂量组均能显著抑制DNFB致小鼠迟发型变态反应的鼠耳肿胀(P＜0.01、＜0.01、＜0.01)。
表4-3对2、4-二硝基氟苯(DNFB)致小鼠DTH的影响(X±S)组别 剂量(g/kg) 动物数 肿胀度(mg)攻击组 - 11 0.63±0.64**致敏攻击组 - 10 2.25±0.61乙肝宁组 5.3 13 0.60±0.39**小剂量组 2.25 12 0.61±0.70**中剂量组 4.5 12 0.44±0.29**大剂量组 911 0.34±0.34**注与致敏攻击组比较*P＜0.05 **P＜0.014、小结本发明药物对DNFB引起的小鼠迟发型变态反应有抑制作用。
毒理研究1、急性毒性研究按照“中药(新药)研究指南”的要求，观察本发明药物小鼠灌胃的急性毒性，测定LD50或最大给药量。方法在预试验中，小鼠在以0.4ml/10g单次给予本发明药物最大浓度562.8％(g生药/100ml)时，5只动物无一死亡，遂进行最大给药量测定。试验时，取ICR小鼠20只，雌雄各半，灌胃给予562.8％的本发明药物混悬液，每隔4小时一次，连续2次，给药后观察一周。结果观察期内未见动物有急性毒性反应。本品小鼠灌胃的最大给药量是450g生药/kg，此剂量是临床人用量的523.3倍(人以70kg计，每天的剂量为0.86g生药/kg)。2、长期毒性研究按照“中药(新药)研究指南”的要求，观察大鼠灌胃本发明药物6个月对机体的毒性反应。
方法将SD种大鼠120只，随机分四组，每组30只。大剂量组灌胃本发明药物51.6g生药/kg(相当于人用剂量的60倍)，中剂量组灌胃本发明药物25.8g生药/kg(相当于人用剂量的30倍)，小剂量组给予本发明药物12.9g生药/kg(相当于人用剂量的15倍)，对照组给予等容积常水。给药周期为6个月，每日观察一般状况，每周称体重1次，摄食量和饮水量每周测定5天。给药3个月后，每组取10只动物进行心电图、血液学、血液生化学和病理学检查。其余各组动物继续给药，给药周期结束后，按前方法进行检查上述指标，剩余动物停止给药，观察2周，再进行心电图、血液学、血液生化学和病理学检查。
结果各组大鼠在给药期间和恢复期内，均未出现任何与药物有因果关系的毒性反应和死亡等现象；各给药组动物的一般观察、心电图、血液学、血液生化学和病理学检查与对照组比较，差异均无显著性意义。
结论51.6g生药/kg、25.8g生药/kg和12.9g生药/kg连续灌胃6个月对SD种大鼠无长期毒性反应，对动物的体重、摄食水量、血液学、血液生化学及心电图等无明显影响，对肝、肾、骨髓、胃肠等主要脏器或组织无明显的病理性损害。
综上所述，主要药效学研究表明，本发明药物有抗鸭乙型肝炎病毒作用；能不同程度地对抗D-GlaN、TAA及CCl4等所致的小鼠急性肝损伤，降低血清AST和ALT，减轻肝组织的病理性损害；对化学因素所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用、能减轻由CCI4诱导的大鼠肝脏内各种病变，并能抑制肝纤维化以及肝硬变形成；对DNFB引起的小鼠迟发型变态反应有抑制作用。
毒理研究表明本品小鼠灌胃的最大给药量是450g生药/kg，此剂量是临床人用量的523.3倍(人以70kg计，每天的剂量为0.86g生药/kg)。用本品51.6g生药/kg、25.8g生药/kg和12.9g生药/kg连续灌胃6个月对SD种大鼠无长期毒性反应，对动物的体重、摄食水量、血液学、血液生化学及心电图等无明显影响，对肝、肾、骨髓、胃肠等主要脏器或组织无明显的病理性损害。
喷雾干燥时进风温度为168℃，喷塔温度为78℃，出风温度为72℃，转速为2.5万转/分钟。
权利要求
1一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其特征在于它是由下列重量配比的原料制成的药剂灵芝308-420 白花蛇舌草392-840 栀子182-280郁金182-336 白芍112-336茯苓112-420丹参84-420 黄芩84-280 甘草28-252
2根据权利要求1所述的药物组合物，其中各原料的重量配比是灵芝400 白花蛇舌草400 栀子200郁金200 白芍166 茯苓166丹参100 黄芩100 甘草50
3根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
4根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的药剂是散剂。
5权利要求1所述药物组合物的制备方法，其特征在于(1)取灵芝、白花蛇舌草、丹参，粉碎成粗粉，加70％乙醇回流提取三次，每次提取2小时，第一次加8倍量的乙醇，第二次、第三次加6倍量的乙醇，提取液滤过，滤液合并，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.02～1.05的清膏，备用；(2)将上述(1)所得药渣与黄芩、栀子、白芍、郁金、甘草、茯苓六味药材混合，第一次加12倍量水浸泡1.5小时、煎煮2小时，第二、三次各加入10倍量水，分别煎煮2小时，煎液合并，滤过，浓缩至相对密度1.05～1.10的清膏，加入乙醇使含醇量达到50％，搅匀，静置24小时以上，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.02～1.05的清膏；(3)将上述(1)、(2)所得清膏混合均匀，喷雾干燥，加蔗糖与糊精细粉适量，混合均匀，用75％的乙醇制粒，干燥，整粒，即得散剂。
6根据权利要求5所述药物组合物的制备方法，其特征在于喷雾干燥时要求进风温度为160℃～180℃，喷塔温度为75～80℃，出风温度为70～75℃，转速为2.5万转/分钟。
7根据权利要求6所述药物组合物的制备方法，其特征在于所加蔗糖与糊精的重量比为5∶1。
全文摘要
本发明是以灵芝、白花蛇舌草、栀子、丹参、甘草、茯苓、黄芩、白芍、郁金九味中草药按一定重量配比，经过提纯、水煎、过滤、浓缩、干燥制成的复方颗粒，具有益气解毒，健脾理气，化瘀止痛之功能，用于乙型肝炎(慢性活动性及慢性迁延性肝炎)的治疗。
文档编号A61P1/16GK1454661SQ03134209
公开日2003年11月12日 申请日期2003年5月30日 优先权日2003年5月30日
发明者刘梅英, 刘林洲 申请人:刘梅英, 刘林洲
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