外胚间充质干细胞的分离和培养方法
专利名称：外胚间充质干细胞的分离和培养方法
技术领域：
本发明属于生物细胞技术领域，涉及外胚间充质干细胞分离培养方法。
背景技术：
在颌面部各突起的发育过程中，来源于神经管和表面外胚层结合处的神经嵴细胞(neural crest stem cell，以下简称NCSC)经过定向迁移、增殖，到达面突中胚层，称为外胚间充质。在胚胎的发育过程中，外胚间充质干细胞又可以进一步向成牙本质细胞、牙髓细胞、成骨细胞、成肌细胞、胶质细胞、神经元等多个谱系进行分化。与其它应用于组织工程的干细胞(如胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、神经嵴细胞及神经干细胞)相比，它具有以下优点①来源丰富，容易取材；②增殖速度快，人颌突间充质干细胞可持续传数十代；③可用于异体移植，临床应用范围广；④在细胞因子的作用下可保持未分化状态，自然情况下可向其它谱系进行分化；⑤在外源因子诱导下，可分化为多种终末分化的细胞，其中包括成牙本质细胞、雪旺细胞等，在组织工程牙齿和外周神经修复中具有重要的理论研究和使用价值。外胚间充质干细胞取自生物体早期胚胎，保持了干细胞的特性，具有较强的增殖能力，研究表明，在外源性生长因子的作用下，外胚间充质干细胞可以分化为成牙本质细胞，还可被诱导分化为多种功能细胞，如成骨细胞、骨骼肌细胞、雪旺细胞、成牙本质细胞等，适合作为组织工程的种子细胞，与各种生物材料结合，利用该细胞的多向分化潜能，用于构建组织工程骨、肌肉、神经、牙齿，并用于缺损修复。
目前，国内外对NCSC的研究主要局限于非卵生系统中，尚未见分离、培养出NCSC的任何文献报导及相关专利。
发明内容
鉴于NCSC具有上述如此多的优点而并未得到研究、开发和利用的现状，本发明的目的在于提供外胚间充质干细胞的分离培养方法。并提出本发明方法制备的NCSC的新用途。
本发明分离培养方法的特征在于其包括外胚间充质干细胞培养基的配制、外胚间充质干细胞的分离和培养、外胚间充质干细胞的纯化，具体步骤有(1)外胚间充质干细胞培养基的配制a.取商用最低必需培养液DMEM和商用培养液F12按1∶1混合制成的基础培养液；b.向基础培养液中加入碳酸氢钠、胎牛血清、L-谷氨酰铵、碳酸氢钠、青霉素/链霉素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、牛垂体提取物(BPE)和白血病抑制因子(LIF)，充分搅拌混匀；调pH为7.4-7.5；c.超净台抽滤消毒，4℃保存备用；(2)外胚间充质干细胞的分离和培养a.在无菌条件下，切取自愿终止妊娠的40-50天胎儿或妊娠11-12天鼠胚的上下颌突，剪切成1mm3大小，2.5g/l胰酶37℃消化；b.加入等量的含血清的培养液终止消化，吹打使组织分散成细胞悬液，离心，弃上清，加入培养液使细胞再悬浮后分装入培养瓶中，置37℃、5％CO2的孵箱中；(3)外胚间充质干细胞的纯化a.在原代培养时，单细胞悬液接种于培养瓶中培养至大部分细胞贴壁后，弃上清，加入新的培养液继续培养；b.细胞铺满瓶底时，消化传代，再通过交联有特异性抗体HNK-1(CD57)的磁珠分离纯化获得外胚间充质干细胞。
上述的外胚间充质细胞的培养方法中，在基础培养液中所加入各组分的量为成份1000ml体积胎牛血清(5-15％)50-150ml碳酸氢钠4-6gL-谷氨酰铵 0.1-0.3g碱性成纤维细胞生长因子 5-15μg牛垂体提取物0.1-20ml白血病抑制因子 106U青霉素/链霉素 50-150i.u外胚间充质干细胞的用途在于1.外胚间充质干细胞用于骨组织工程颌面部骨骼则主要来自颅神经嵴来源的外胚间充质干细胞。小鼠、大鼠、人胚胎面突外胚间充质干细胞具有成骨能力已被证实。体外实验显示，在含β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的矿化诱导液中，外胚间充质细胞出现了一系列的变化。细胞形态由梭形的成纤维样变为多角形、立方形，同时体积增大，细胞增殖速度变慢，表达I型胶原。碱性磷酸酶活性增高及骨钙素的表达进一步表明该细胞已分化为成骨细胞。随培养时间的延长，矿化结节的形成证实诱导细胞已分泌矿化基质。这一系列改变表明外胚间充质细胞已被成功诱导分化为成骨细胞。将体外诱导后的细胞直接植入动物体内，或者与胶原、煅烧骨、珊瑚复合，修复骨缺损，均可见缺损区有成熟的新骨形成，并开始重建骨缺损区。表明外胚间充质干细胞经诱导后用于构建组织工程骨并用于缺损修复是可行的。
2.胚间充质干细胞用于肌肉组织工程肌肉组织工程的研究大都着眼于细胞移植的角度出发。成肌细胞具有较强的分化增殖能力，目前肌肉组织工程方面的研究多采用成肌细胞为种子细胞。种子细胞来源的另一途径是通过干细胞工程获得相应的种子细胞。胚胎干细胞和间充质干细胞具有分化为肌肉细胞的能力。而外胚间充质干细胞的研究表明，它是干细胞肌肉组织工程种子细胞来源的又一有益补充。外胚间充质干细胞具有分化为肌肉细胞的能力。研究表明，外胚间充质干细胞在无分化抑制剂存在时，向平滑肌细胞分化的趋势非常明显，而在TGF-β作用下，分化的比例可达到95％。在DEMSO的作用下，外胚间充质干细胞可分化为骨骼肌细胞。如果将外胚间充质干细胞在体外诱导分化为平滑肌细胞、骨骼肌细胞，再与胶原或其他生物材料相复合，移植到体内，可以修复肌肉缺损。
3.外胚间充质干细胞用于外周神经修复研究表明，外胚间充质干细胞在佛丝扣林(forskolin)、牛垂体提取物的作用下，可以分化为雪旺细胞。通过定向诱导颌突间充质干细胞定向分化为雪旺细胞，将有可能寻找到组织工程神经新的种子细胞来源。通过与研制的壳聚糖/胶原神经导管复合，桥接坐骨神经断端，观察神经轴突的再生，将为探索神经再生、损伤修复的治疗提供新的思路和更加有效的途径。
4.外胚间充质干细胞用于牙组织工程除牙釉质外，包括牙本质、牙骨质、牙髓、牙周组织均来自外胚间充质干细胞。口腔上皮与间充质相互作用，共同调控牙齿的发育。在牙胚发育的早期，局部增厚的口腔上皮形成牙板并向深层结缔组织内伸延，在固定区域提供成牙信息，指导其下方及周围的外胚间充质干细胞向牙源性间充质细胞分化。此时的牙板上皮又称牙源性上皮，将来发育为成釉器，并形成釉质。在牙源性上皮的诱导下，牙源性间充质紧邻内釉上皮层的部分将分化为成牙本质细胞，并分泌牙本质基质，矿化形成牙本质，下方的牙乳头细胞进一步分化为牙髓组织细胞，而周围的部分牙囊细胞分化形成牙骨质，从而造成牙齿的形态学发生。外胚间充质干细胞是牙齿组织工程最为适宜的种子细胞。作为牙齿多种结构的来源细胞，其多向分化潜能是向牙齿多种结构分化的保障。研究表明，在外源性生长因子的作用下，外胚间充质干细胞可以分化为成牙本质细胞。
具体实施例方式
本实施例为SD大鼠颌突外胚间充质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤1.SD大鼠颌突外胚间充质细胞的分离和原代培养断颈处死妊娠11-12天的SD大鼠，无菌条件下剖腹取出胎鼠，Hank’s液中切取胎鼠上下面突，切碎后用2.5g/l胰酶37℃消化8分钟，加入等量的含血清的培养液终止消化，轻轻吹打使组织分散成细胞悬液，800转/分钟离心6分钟，弃上清，加入培养液使细胞再悬浮后分装入培养瓶中，加入适量的培养液，置37℃、5％CO2的孵箱中40分钟，倒置显微镜下观察大部分细胞已经贴壁，弃上清，加入新鲜培养液继续培养，隔日观察细胞生长状况，2-3日更换培养液。
2.传代培养和初步纯化细胞长满培养瓶底时，用2.5g/l胰酶37℃消化6分钟，在倒置显微镜见大部分细胞已经回缩并漂浮于培养液中，用等量含血清的培养液终止消化，离心再悬沉淀，1∶2传代。37℃40分钟后弃上清加入新鲜培养液常规培养。
3.免疫磁珠分离纯化将制备的单细胞悬液通过磁珠筛选，所采用的特异抗体为CD57。将预处理过的磁珠放入与CD57充分结合的细胞悬液中，均匀混合后置于室温下孵育30分钟。将结合了磁珠的细胞悬液放入高强磁场中静置5-10分钟，轻轻吸去试管中的液体；将试管脱离磁场并以D-Hank液冲洗试管壁使粘附在管壁上的细胞(即CD57阳性细胞)冲洗下来制成纯化细胞悬液。
4.在第5代之前，采用扩增培养基，为10％的DMEM/F12，其中添加1000U/ml的重组人LIF(Sigma公司生产)，和10ng/ml的重组人bFGF(Sigma公司生产)，5％的牛垂体提取物(Sigma公司生产)。
5.在第5代之前，将细胞应用于备种研究和生产中。
本发明方法简单，可重复性强，操作简便易行，为外胚间充质干细胞及其应用的科研、教学、临床应用等能起到不可估量和的作用，同时也孕育着巨大的社会效益和经济效益。
权利要求
1.外胚间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于包括外胚间充质干细胞培养基的配制、外胚间充质干细胞的分离和培养、外胚间充质干细胞的纯化，具体步骤有(1)外胚间充质干细胞培养基的配制a.取最低必需培养液DMEM和培养液F12按1∶1混合而成的基础培养液；b.向基础培养液中加入胎牛血清、L-谷氨酰铵、碳酸氢钠、青霉素/链霉素、碱性成纤维细胞生长因子、牛垂体提取物和白血病抑制因子，搅拌混匀；c.调pH为7.4-7.5，超净台抽滤消毒，保存备用；(2)外胚间充质干细胞的分离和培养a.在无菌条件下，切取自愿终止妊娠的40-50天胎儿或妊娠11-12天鼠胚的上下颌突，胰酶消化；b.加入等量的含血清的培养液终止消化，吹打使组织分散成细胞悬液，离心，弃上清，加入培养液使细胞再悬浮后分装入培养瓶中，置孵箱中孵育；(3)外胚间充质干细胞的纯化a.在原代培养时，单细胞悬液接种于培养瓶中培养至大部分细胞贴壁后，弃上清，加入新的培养液继续培养；b.细胞铺满瓶底时，消化传代，再通过交联有特异性抗体HNK-1(CD57)的磁珠分离纯化获得外胚间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的外胚间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于外胚间充质干细胞的培养方法中所用的培养基各组分的配比为(以总体积1L计)胎牛血清50-150ml、碳酸氢钠4-6g、L-谷氨酰铵0.1-0.3g、碱性成纤维细胞生长因子5-15ug、牛垂体提取物0.1-20ml、白血病抑制因子106u、青霉素或链霉素50-150i.u。
3.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于外胚间充质干细胞经诱导后用于构建组织工程骨并用于缺损修复。
4.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于将外胚间充质干细胞在体外诱导分化为平滑肌细胞、骨骼肌细胞，再与胶原或其他生物材料相复合，移植到体内，可以修复肌肉缺损。
5.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于外胚间充质干细胞通过定向诱导为雪旺细胞，可作为组织工程神经新的种子细胞来源，用于外周神经修复；通过与壳聚糖/胶原神经导管复合，可桥接坐骨神经断端。
6.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于外胚间充质干细胞是牙齿组织工程最为适宜的种子细胞而用于牙组织工程；在外源性生长因子的作用下，外胚间充质干细胞可以分化为成牙本质细胞。
全文摘要
本发明涉及生物细胞技术领域中的外胚间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于所述方法包括外胚间充质干细胞培养基的配制、外胚间充质干细胞的分离和培养、外胚间充质干细胞的纯化步骤。用本发明方法制备的外胚间充质干细胞可用于骨组织工程、肌肉组织工程、外周神经修复和牙组织工程。本发明方法简单，重复性强，操作简便，为有关外胚间充质干细胞的科研、教学、临床应用等能起到不可估量的作用，同时孕育着巨大的社会效益和经济效益。
文档编号A61L31/00GK1590537SQ0313453
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者金岩, 邓蔓菁, 张建平, 张光东 申请人:中国人民解放军第四军医大学口腔医学院
技术领域：
本发明属于生物细胞技术领域，涉及外胚间充质干细胞分离培养方法。
背景技术：
在颌面部各突起的发育过程中，来源于神经管和表面外胚层结合处的神经嵴细胞(neural crest stem cell，以下简称NCSC)经过定向迁移、增殖，到达面突中胚层，称为外胚间充质。在胚胎的发育过程中，外胚间充质干细胞又可以进一步向成牙本质细胞、牙髓细胞、成骨细胞、成肌细胞、胶质细胞、神经元等多个谱系进行分化。与其它应用于组织工程的干细胞(如胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、神经嵴细胞及神经干细胞)相比，它具有以下优点①来源丰富，容易取材；②增殖速度快，人颌突间充质干细胞可持续传数十代；③可用于异体移植，临床应用范围广；④在细胞因子的作用下可保持未分化状态，自然情况下可向其它谱系进行分化；⑤在外源因子诱导下，可分化为多种终末分化的细胞，其中包括成牙本质细胞、雪旺细胞等，在组织工程牙齿和外周神经修复中具有重要的理论研究和使用价值。外胚间充质干细胞取自生物体早期胚胎，保持了干细胞的特性，具有较强的增殖能力，研究表明，在外源性生长因子的作用下，外胚间充质干细胞可以分化为成牙本质细胞，还可被诱导分化为多种功能细胞，如成骨细胞、骨骼肌细胞、雪旺细胞、成牙本质细胞等，适合作为组织工程的种子细胞，与各种生物材料结合，利用该细胞的多向分化潜能，用于构建组织工程骨、肌肉、神经、牙齿，并用于缺损修复。
目前，国内外对NCSC的研究主要局限于非卵生系统中，尚未见分离、培养出NCSC的任何文献报导及相关专利。
发明内容
鉴于NCSC具有上述如此多的优点而并未得到研究、开发和利用的现状，本发明的目的在于提供外胚间充质干细胞的分离培养方法。并提出本发明方法制备的NCSC的新用途。
本发明分离培养方法的特征在于其包括外胚间充质干细胞培养基的配制、外胚间充质干细胞的分离和培养、外胚间充质干细胞的纯化，具体步骤有(1)外胚间充质干细胞培养基的配制a.取商用最低必需培养液DMEM和商用培养液F12按1∶1混合制成的基础培养液；b.向基础培养液中加入碳酸氢钠、胎牛血清、L-谷氨酰铵、碳酸氢钠、青霉素/链霉素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、牛垂体提取物(BPE)和白血病抑制因子(LIF)，充分搅拌混匀；调pH为7.4-7.5；c.超净台抽滤消毒，4℃保存备用；(2)外胚间充质干细胞的分离和培养a.在无菌条件下，切取自愿终止妊娠的40-50天胎儿或妊娠11-12天鼠胚的上下颌突，剪切成1mm3大小，2.5g/l胰酶37℃消化；b.加入等量的含血清的培养液终止消化，吹打使组织分散成细胞悬液，离心，弃上清，加入培养液使细胞再悬浮后分装入培养瓶中，置37℃、5％CO2的孵箱中；(3)外胚间充质干细胞的纯化a.在原代培养时，单细胞悬液接种于培养瓶中培养至大部分细胞贴壁后，弃上清，加入新的培养液继续培养；b.细胞铺满瓶底时，消化传代，再通过交联有特异性抗体HNK-1(CD57)的磁珠分离纯化获得外胚间充质干细胞。
上述的外胚间充质细胞的培养方法中，在基础培养液中所加入各组分的量为成份1000ml体积胎牛血清(5-15％)50-150ml碳酸氢钠4-6gL-谷氨酰铵 0.1-0.3g碱性成纤维细胞生长因子 5-15μg牛垂体提取物0.1-20ml白血病抑制因子 106U青霉素/链霉素 50-150i.u外胚间充质干细胞的用途在于1.外胚间充质干细胞用于骨组织工程颌面部骨骼则主要来自颅神经嵴来源的外胚间充质干细胞。小鼠、大鼠、人胚胎面突外胚间充质干细胞具有成骨能力已被证实。体外实验显示，在含β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的矿化诱导液中，外胚间充质细胞出现了一系列的变化。细胞形态由梭形的成纤维样变为多角形、立方形，同时体积增大，细胞增殖速度变慢，表达I型胶原。碱性磷酸酶活性增高及骨钙素的表达进一步表明该细胞已分化为成骨细胞。随培养时间的延长，矿化结节的形成证实诱导细胞已分泌矿化基质。这一系列改变表明外胚间充质细胞已被成功诱导分化为成骨细胞。将体外诱导后的细胞直接植入动物体内，或者与胶原、煅烧骨、珊瑚复合，修复骨缺损，均可见缺损区有成熟的新骨形成，并开始重建骨缺损区。表明外胚间充质干细胞经诱导后用于构建组织工程骨并用于缺损修复是可行的。
2.胚间充质干细胞用于肌肉组织工程肌肉组织工程的研究大都着眼于细胞移植的角度出发。成肌细胞具有较强的分化增殖能力，目前肌肉组织工程方面的研究多采用成肌细胞为种子细胞。种子细胞来源的另一途径是通过干细胞工程获得相应的种子细胞。胚胎干细胞和间充质干细胞具有分化为肌肉细胞的能力。而外胚间充质干细胞的研究表明，它是干细胞肌肉组织工程种子细胞来源的又一有益补充。外胚间充质干细胞具有分化为肌肉细胞的能力。研究表明，外胚间充质干细胞在无分化抑制剂存在时，向平滑肌细胞分化的趋势非常明显，而在TGF-β作用下，分化的比例可达到95％。在DEMSO的作用下，外胚间充质干细胞可分化为骨骼肌细胞。如果将外胚间充质干细胞在体外诱导分化为平滑肌细胞、骨骼肌细胞，再与胶原或其他生物材料相复合，移植到体内，可以修复肌肉缺损。
3.外胚间充质干细胞用于外周神经修复研究表明，外胚间充质干细胞在佛丝扣林(forskolin)、牛垂体提取物的作用下，可以分化为雪旺细胞。通过定向诱导颌突间充质干细胞定向分化为雪旺细胞，将有可能寻找到组织工程神经新的种子细胞来源。通过与研制的壳聚糖/胶原神经导管复合，桥接坐骨神经断端，观察神经轴突的再生，将为探索神经再生、损伤修复的治疗提供新的思路和更加有效的途径。
4.外胚间充质干细胞用于牙组织工程除牙釉质外，包括牙本质、牙骨质、牙髓、牙周组织均来自外胚间充质干细胞。口腔上皮与间充质相互作用，共同调控牙齿的发育。在牙胚发育的早期，局部增厚的口腔上皮形成牙板并向深层结缔组织内伸延，在固定区域提供成牙信息，指导其下方及周围的外胚间充质干细胞向牙源性间充质细胞分化。此时的牙板上皮又称牙源性上皮，将来发育为成釉器，并形成釉质。在牙源性上皮的诱导下，牙源性间充质紧邻内釉上皮层的部分将分化为成牙本质细胞，并分泌牙本质基质，矿化形成牙本质，下方的牙乳头细胞进一步分化为牙髓组织细胞，而周围的部分牙囊细胞分化形成牙骨质，从而造成牙齿的形态学发生。外胚间充质干细胞是牙齿组织工程最为适宜的种子细胞。作为牙齿多种结构的来源细胞，其多向分化潜能是向牙齿多种结构分化的保障。研究表明，在外源性生长因子的作用下，外胚间充质干细胞可以分化为成牙本质细胞。
具体实施例方式
本实施例为SD大鼠颌突外胚间充质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤1.SD大鼠颌突外胚间充质细胞的分离和原代培养断颈处死妊娠11-12天的SD大鼠，无菌条件下剖腹取出胎鼠，Hank’s液中切取胎鼠上下面突，切碎后用2.5g/l胰酶37℃消化8分钟，加入等量的含血清的培养液终止消化，轻轻吹打使组织分散成细胞悬液，800转/分钟离心6分钟，弃上清，加入培养液使细胞再悬浮后分装入培养瓶中，加入适量的培养液，置37℃、5％CO2的孵箱中40分钟，倒置显微镜下观察大部分细胞已经贴壁，弃上清，加入新鲜培养液继续培养，隔日观察细胞生长状况，2-3日更换培养液。
2.传代培养和初步纯化细胞长满培养瓶底时，用2.5g/l胰酶37℃消化6分钟，在倒置显微镜见大部分细胞已经回缩并漂浮于培养液中，用等量含血清的培养液终止消化，离心再悬沉淀，1∶2传代。37℃40分钟后弃上清加入新鲜培养液常规培养。
3.免疫磁珠分离纯化将制备的单细胞悬液通过磁珠筛选，所采用的特异抗体为CD57。将预处理过的磁珠放入与CD57充分结合的细胞悬液中，均匀混合后置于室温下孵育30分钟。将结合了磁珠的细胞悬液放入高强磁场中静置5-10分钟，轻轻吸去试管中的液体；将试管脱离磁场并以D-Hank液冲洗试管壁使粘附在管壁上的细胞(即CD57阳性细胞)冲洗下来制成纯化细胞悬液。
4.在第5代之前，采用扩增培养基，为10％的DMEM/F12，其中添加1000U/ml的重组人LIF(Sigma公司生产)，和10ng/ml的重组人bFGF(Sigma公司生产)，5％的牛垂体提取物(Sigma公司生产)。
5.在第5代之前，将细胞应用于备种研究和生产中。
本发明方法简单，可重复性强，操作简便易行，为外胚间充质干细胞及其应用的科研、教学、临床应用等能起到不可估量和的作用，同时也孕育着巨大的社会效益和经济效益。
权利要求
1.外胚间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于包括外胚间充质干细胞培养基的配制、外胚间充质干细胞的分离和培养、外胚间充质干细胞的纯化，具体步骤有(1)外胚间充质干细胞培养基的配制a.取最低必需培养液DMEM和培养液F12按1∶1混合而成的基础培养液；b.向基础培养液中加入胎牛血清、L-谷氨酰铵、碳酸氢钠、青霉素/链霉素、碱性成纤维细胞生长因子、牛垂体提取物和白血病抑制因子，搅拌混匀；c.调pH为7.4-7.5，超净台抽滤消毒，保存备用；(2)外胚间充质干细胞的分离和培养a.在无菌条件下，切取自愿终止妊娠的40-50天胎儿或妊娠11-12天鼠胚的上下颌突，胰酶消化；b.加入等量的含血清的培养液终止消化，吹打使组织分散成细胞悬液，离心，弃上清，加入培养液使细胞再悬浮后分装入培养瓶中，置孵箱中孵育；(3)外胚间充质干细胞的纯化a.在原代培养时，单细胞悬液接种于培养瓶中培养至大部分细胞贴壁后，弃上清，加入新的培养液继续培养；b.细胞铺满瓶底时，消化传代，再通过交联有特异性抗体HNK-1(CD57)的磁珠分离纯化获得外胚间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的外胚间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于外胚间充质干细胞的培养方法中所用的培养基各组分的配比为(以总体积1L计)胎牛血清50-150ml、碳酸氢钠4-6g、L-谷氨酰铵0.1-0.3g、碱性成纤维细胞生长因子5-15ug、牛垂体提取物0.1-20ml、白血病抑制因子106u、青霉素或链霉素50-150i.u。
3.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于外胚间充质干细胞经诱导后用于构建组织工程骨并用于缺损修复。
4.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于将外胚间充质干细胞在体外诱导分化为平滑肌细胞、骨骼肌细胞，再与胶原或其他生物材料相复合，移植到体内，可以修复肌肉缺损。
5.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于外胚间充质干细胞通过定向诱导为雪旺细胞，可作为组织工程神经新的种子细胞来源，用于外周神经修复；通过与壳聚糖/胶原神经导管复合，可桥接坐骨神经断端。
6.根据权利要求1所制备的外胚间充质干细胞的新用途，其特征在于外胚间充质干细胞是牙齿组织工程最为适宜的种子细胞而用于牙组织工程；在外源性生长因子的作用下，外胚间充质干细胞可以分化为成牙本质细胞。
全文摘要
本发明涉及生物细胞技术领域中的外胚间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于所述方法包括外胚间充质干细胞培养基的配制、外胚间充质干细胞的分离和培养、外胚间充质干细胞的纯化步骤。用本发明方法制备的外胚间充质干细胞可用于骨组织工程、肌肉组织工程、外周神经修复和牙组织工程。本发明方法简单，重复性强，操作简便，为有关外胚间充质干细胞的科研、教学、临床应用等能起到不可估量的作用，同时孕育着巨大的社会效益和经济效益。
文档编号A61L31/00GK1590537SQ0313453
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者金岩, 邓蔓菁, 张建平, 张光东 申请人:中国人民解放军第四军医大学口腔医学院
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