基因修饰的组织工程血管的制作方法
专利名称：基因修饰的组织工程血管的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种构建基因修饰的组织工程血管。
背景技术：
目前各种血管移植物，以人体自身血管为佳。但人体自身非必需血管的长度和直径极为有限，有些患者有全身血管病变甚至无合适的自体血管移植物。对于大血管，虽然PTFE(聚四氟乙烯)等人工血管可在一定程度上满足临床需要，但不能降解，一直作为异物存在人体内，且抑制血管细胞的再生功能。PTFE等人工血管的抗凝血机理是让血液在人工血管内壁形成一层血栓膜，因此这种人工血管的内径通常不能小于6mm，否则会引起血管阻塞，直径小于6mm的小血管病变，仍无满意的人工血管替代物。目前临床血管移植物仍尽量取用自身动、静脉。虽然自体动脉移植物有着无可比拟的优良效果，自体静脉移植物仍然是冠状动脉搭桥术选用最多的血管移植物，但是由于来源少，其顺应性不匹配及移植前后各种因素对内皮细胞损伤，大多数搭桥血管发生内膜增生，最终导致血管狭窄闭塞，静脉桥的远期通畅率低，又是困扰心脏外科医生的一个难题。
另外人工血管用于急性血管损伤治疗或用于一些不能提供合适种子细胞的病人，构建的人工血管不能用自体细胞种植需要耐受同种移植。冠脉搭桥需要小直径血管，但直径小于6mm的人工血管移植6个月后血栓率高达40％，仍无满意的人工血管替代物。用人工材料构建小直径血管不易成型，同时很难做到顺应性相匹配。因而如何改善移植血管的力学特性及生物相容性，防止血管闭塞，是构建小直径血管面临的主要问题。
组织工程血管研究的关键问题是种子细胞和支架材料。种子细胞包括成体血管细胞和干细胞等。在支架材料方面，血管组织工程最终研制的产品是具有三维形状和空间结构的血管，因此在培育细胞时，必须提供具有特定三维结构的立体血管支架材料，使接种细胞能定位、贴附、局域化生长增殖，同时材料可使细胞在支架空间分布排列有序，分化具有特定功能并合成适当的细胞外基质，细胞与细胞外基质形成的组织或器官与三维支架形状一致，组织工程血管移植体内时支架材料还兼有力学支持功能，抗血流压力等。目前组织工程血管使用的支架材料包括天然材料和人工合成材料，人工合成材料主要有两种，一种为不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等，另一种为可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物。由于这类物质具有低毒、无免疫反应、安全性较好且有很好的生物相容性的特性得到广泛应用。人工材料尽管有许多优点，但也存在一些问题，人工合成材料的生物相容性、生物活性、生物降解性及与宿主血管力学匹配等方面还存在一些缺点，且在孔隙率及孔径大小等方面的仿生制作还有一定难度，同时某些人工材料(如聚乳酸等)大量使用时在体内降解过程中产生的酸性物质堆积，不利于细胞的附着、分裂、增殖；同时亲水性差，细胞吸附力较弱，机械强度不足。另外作为合成类高分子材料缺乏细胞识别信号，其昂贵的价格也限制了其广泛应用。因此，支架材料已成为妨碍组织工程血管研究进程的主要问题。
因血管替代治疗并不能改变机体的内部致病环境，Ratliff等观察了115例，用作冠状动脉搭桥的大隐静脉，发现移植物动脉粥样硬化(GAS)病变者占99％。说明尽管进行了替代治疗，但由于移植过程中的损伤、及机体的内部致病环境仍然存在，极有可能再度导致移植血管发生再狭窄，从而导致移植失败。尽管目前有构建小直径血管的报道，但都局限在血管表面进行修饰加强细胞种植，对血管移植后发生的内膜增生血管再狭窄闭塞尚没有好的办法解决。
A20基因属于锌指蛋白家族，在抗炎症方面有相关报道，但目前国内外未见任何将A20基因应用于血管组织工程研究报道。
发明内容
本发明的目的就在于改进现有技术中的不足，提供一种同时具有良好力学性能及抗血栓形成、血管再狭窄的基因修饰的组织工程血管，用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。
为实现本发明的上述目的而采用的技术方案是这样的，即一种基因修饰的组织工程血管，其特征是采用如下的方法制备1、血管支架材料获取由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分，保留血管的天然网状结构制成，或直接采用人工合成材料制成；2、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生长因子蛋白为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，余量为去离子水。充分混合成水溶液，灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；3、平滑肌细胞种植完成血管腔表面修饰后，再在血管中膜上接种平滑肌细胞；4、内皮细胞种植平滑肌细胞长好后，在血管腔的表面再种植A20基因修饰的血管内皮细胞。
在上述制备方法中，步骤1中所述的人工合成材料可采用不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯，或可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物；在步骤2中的可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料为N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯；粘附短肽为Gly-Arg-Gly-Asp、或Arg-Gly-Asp、生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子；本发明解决的主要问题是血管的力学特性和生物相容性，与现有技术相比具有如下优点1.在基因修饰组织工程血管方面，A20基因具有抗血栓形成、血管再狭窄功能，本发明通过基因工程方法和组织工程相结合在种子细胞转入或超表达A20基因，则既能对抗血管搭桥病人血液中的损伤因子对移植血管内皮的损伤，抑制平滑肌细胞的病理性增殖，同时能有效抑制急性血管替代治疗所面临的同种移植损伤。
2.制备的血管支架，其抗原性较弱，有良好的组织亲和性和结合力，其天然的孔隙结构、大小和形态端正，为种子细胞的粘附、增殖、分化提供天然的三维生长空间结构。这种材料来源丰富，制作简便，易于塑形，并在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。
3.抗凝血及控制生长因子释放的N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯表面修饰剂由光交联的壳聚糖(Az-CH-LA)磺化和硫酸酯化合成，因而具有很强的亲水性和抗凝性，经紫外光照射可迅速变成不易溶解柔韧的水凝胶，能控制药物的释放。而目前常见合成的类肝素体N-磺酸-壳聚糖硫酸酯具有抗凝性但不具有控制药物释放的功能。目前国内外尚未见同时具有控制药物释放及抗凝的壳聚糖合成报道。因此本发明将光交联壳聚糖(Az-CH-LA)材料化学改性成类肝素体结构以形成全新的能用于与血液相接触的生物材料类肝素体N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯，则一方面可控制生长因子或药物的释放，另一方面具有抗凝血性能，同时具有可降解性。可用于本发明构建的血管、人工血管、其他组织工程血管及血管内支架的表面修饰。
4.血管支架本身具有良好细胞诱异性，进一步复合表面修饰物质后，为种子细胞粘附、增殖及发挥抗凝血功能提供好的微环境。本发明中表面修饰有以下优点，合成的抗凝血高分子材料N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯一方面可控制生长因子的释放，另一方面交联在血管表面在内皮种子细胞不足或细胞脱落时不会引起血栓形成，交联的粘附短肽可促进离体和在体的细胞粘附，内皮生长因子蛋白可离体诱导种子细胞生长及在体诱导血液中内皮祖细胞在血管表面粘附分化(或质粒DNA)A20基因可有效对抗各种因素对血管损伤。本发明通过表面修饰在急性血管替代或取病人内皮细胞数量不足时，可以直接将血管移植到病人体内，N-CM-光交联壳聚糖抗凝表面不会导致血液凝固，交联的内皮生长因子和粘附肽可诱导血液中的内皮祖细胞和临近内皮细胞补充在移植血管内皮丢失或尚未种植部位。交联的A20基因DNA便于粘附分化的内皮祖细胞吸取，迅速形成具有抗动脉粥样硬化功能的小直径血管。这种方法也可在体诱导血液中的内皮祖细胞粘附分化生长成内皮细胞，而不必离体分离培养，这样可大大提高组织工程效率。尚未见任何报道有这些设想或实验结果。
5.利用上述的良好支架材料，种植平滑肌细胞，再离体种植内皮种子细胞或在体诱导内皮祖细胞种植，成为有生命的基因修饰组织工程血管，可广泛用于临床上修复血管损伤。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。
1.血管支架材料获取无菌条件下取新鲜异种(如猪血管)或同种血管，去除其上所附软组织，无菌PBS冲洗血管，去除血栓凝块，无菌包装放入-80℃保存。复温于37℃用0.1mol/L PMSF溶液处理1--3小时，抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3--5小时，每1小时换液一次；无菌蒸馏水浸洗干净，在保持37℃、5％CO2用0.03％--0.05％胰蛋白酶处理16--24小时，每8小时换液一次，无菌蒸馏水浸洗干净；用0.005％---0.01％RNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.006％--0.01％DNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.005％--0.01％脂质酶消化2--4小时，无菌抗生素蒸馏水浸洗干净。15--20GY γ射线辐射处理10--15分钟消毒并清除剩余血管基质胶原蛋白、弹性蛋白的抗原性，最后获得血管支架。
将上述方法获得的血管支架运用形态学方法检测可见处理血管细胞已去除，血管基质纤维较前疏松，但分布完整，未见纤维断裂，弹力纤维及胶原纤维含量未见明显变化，处理前与处理后血管长度及内径相差不显著。压力容积实验对其顺应性进行检测与处理前对照，处理前后血管的压力容积曲线与抛物线的上升支非常接近，动脉P-V数据用二次抛物线关系式V＝aP2+bP+c进行拟合，其相关系数均大于0.95，说明拟合效果良好，所对应动脉顺应性的计算方法C＝dv/dp＝2ap+b。得处理后血管顺应性下降，但相差不显著(P＞0.05)，其中在压力为100mmHg时，处理前后的顺应性分别为6.25±0.42，5.80±0.67(×10-4ml/mmHg)，相差不显著(P＞0.05)。用Western blot检测表明未处理前猪血管MHC抗原、异种移植超急性排斥反应α-Gal抗原都有较强表达，处理后未见表达。
2.血管表面修饰2.1.表面修饰物之一的可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料实质上是将光交联壳聚糖进行磺化和硫酸酯化后得到的N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯。实施例为①、用6-O-磺化光交联壳聚糖(6-O-SM-Az-CH-LA)的合成将纯化的光交联壳聚糖(Az-CH-LA)溶解在2％甲酸溶液中，然后在室温下逐滴加入适量的1mol/L的CuSO4.5H2O溶液，搅拌15--20小时后，过滤后依次用水、丙酮和乙醚洗涤。将所得产物完全分散在干燥的DMF溶液中，然后将溶解在DMF中的SO3.Pyridine溶液按1∶4的比例(1∶4＝壳聚糖分子重复单元与SO3.Pyridine之间的摩尔比)在低温下滴加到溶液中，搅拌1--3小时后，在氮气保护和50℃下加热搅拌15--小时。将冷却后的溶液用NaHCO3调到pH值为8.2，加入适量的水透析3--5天。将所得溶液用色谱的方法除掉铜离子后，冷冻干燥(这步的产率为80％)等到产品。②、将上一步得到的6-O-磺酸光交联壳聚糖溶解在一定量的水中，然后加入适量的Na2CO3和SO3.NMe3复合物，用氮气保护，在70℃下搅拌15--20小时。等反应完成后，在去离子水中透析25--35小时，在稀NaoH溶液中透析4--6小时，最后在去离子水中透析3--5天，冷冻干燥得最终产品。15--20Gy Y射线辐射处理15--20分钟消毒备用。
2.2.A20基因质粒DNA的制备用肿瘤坏死因子TNF刺激培养的内皮细胞3--5小时，可刺激A20基因表达。抽提细胞中RNA，设计引物上游5’-AGTTGTCCCATTCGTCATTCC-3’，下游5’-TTTGAGCAATATGCGGAAAGC-3’，用RT-PCR方法克隆A20基因cDNA，带A末端DNA克隆载体pUCm-T Vector(编号BS434从上海生物工程有限公司购买)，将A20基因cDNA与pUCm-T Vector进行连接，运用x-gal染色，蓝白斑筛选出成功连接的菌落，扩增后抽提质粒DNA，用EcoR I和BamH I进行酶切，得到大量包含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段。绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1(catalog#6085-1从美国基因有限公司购买)包括4.7kb，此载体包括多个酶切位点可以插入外源片段，其中本实验主要应用载体多克隆位点中的631处的EcoR I位点和661bp处的BamH I位点，用EcoR I和BamH I双酶切线性化pEGFP-N1载体，再用连接酶将含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1，筛选出阳性菌落，扩增抽提得到包含A20基因的真核表达载体pEGFPA20-N1。
2.3.将无菌条件下合成表面修饰混合物。其配比关系为N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯70-90％(w/v)，Gly-Arg-Gly-Asp(GRGD)0.3-1％，内皮生长因子为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，其余用水补足。混合成水溶液，充分混合处理后灌注到处理好的血管腔，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用。此种修饰方法也可应用生物降解材料合成的血管支架内及人工血管腔表面及血管内支架表面进行修饰。
经上述步骤进行表面修饰后的血管，经扫描电镜检测可见血管内腔全部由表面修饰物覆盖，并附着均匀。
3.平滑肌细胞种植，在自行构建血管培养系统中，原代培养的平滑肌细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔内一直有一定压力进行培养。另一种平滑肌细胞种植方法是用同样数量细胞采用间隔相同的点微注射到血管中膜，在血管细胞化生物反应器中进行培养。
上述步骤种植的平滑肌细胞的形态学检测将种植了平滑肌细胞的血管中膜用0.1％硝酸银液灌注30秒，日光下显色30min，再用显微器械分离铺片，常规脱水透明封片，数码显微相机照相。同时HE方法对种植平滑肌的血管进行染色，结果银染可见血管腔平滑肌细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了平滑肌细胞化。HE染色显示血管中膜的平滑肌细胞形态正常，呈梭型，密集排列，沿血管长轴分布。说明在血管基质材料上成功进行了平滑肌细胞化
4.内皮细胞种植，转基因内皮细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90--120min后，在2--4天的内皮细胞种植培养过程中，腔内流速逐渐从0.033到0.1ml/s增高，在血管壁相应的剪切应力约为1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之间，构建基因修饰的组织工程血管。
上述步骤种植的内皮细胞经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了内皮化，银染也表明内皮细胞成功种植在血管基质上。荧光显微镜显示种植在血管基质材料上的的内皮细胞能分泌细胞外基质。表明内皮细胞可在血管基质上正常生长。
对上述步骤后获得的血管进行周向张力检测，实验中对构建好的转基因组织工程血管逐步加增加力刺激，当静水压达到2000mmHg时仍未见血管破裂，说明构建的血管抗胀裂强度/静水压大于2000mmHg。
备择方案，在不能获取足够数量的人内皮细胞时，可按前述方法制备血管支架并表面修饰后，也可仅在中膜种植平滑肌细胞，血管内腔主要诱导在体血液中内皮祖细胞和临近内皮细胞种植。
下面举例进行说明，但本发明的应用不仅在于此。
实施例1。一种基因修饰的组织工程血管制备，按步骤上述(1)方法制备猪血管或异体血管基质材料，按步骤(2)进行表面修饰后，按(3)种植猴平滑肌细胞，按步骤(4)种植内皮细胞。
获得的血管可见种植的平滑肌细胞形态良好，血管内皮细胞分布完整，顺血管长轴分布。移植到猴颈总动脉，12个月后进行检测。见血管内皮细胞分布完好，形态正常，血管平滑肌细胞形态正常，顺血管长轴分布，血管保持通畅，没有血管内膜增生及血栓形成。
与异种移植血管(直接从猪到猴)与同种移植血管进行比较。可见异种移植血管可见管腔全部闭塞，血管内有血栓形成，血管壁内膜破坏，未见增生，血管壁有大量的炎性细胞浸润。而同种移植血管6个月后血管闭塞，血管内膜呈典型移植物动脉粥样硬化病理改变，可见均匀弥漫性内膜增厚，病灶规则，呈向心性轮环状，病灶内富含泡沫细胞，炎症反应十分明显，纤维形成不充分，钙化不明显，在增厚的内膜中间有一小的圆形空隙，内被血栓充填，说明在血管狭窄到一定程度后，导致血栓形成，血管闭塞。而同种移植1个月的血管HE染色可见血管未闭塞，内膜层增厚，内皮下出现淡染的空泡细胞，中膜明显增生，平滑肌细胞排列紊乱并向内膜突起，呈斑块状结构，有些部位中膜有明显的钙化形成，钙化区周围出现泡沫样细胞。有炎性细胞浸润，经免疫组化检测可见血管外膜层有不同程度的CD4阳性细胞。Tunnel检测表明同种移植血管血管内膜层基本未见凋亡细胞，而中膜层、外膜层可见大量的凋亡细胞。血管HE染色血管内膜层增厚部分经Brdu为单抗检测都为Brdu阳性细胞，免疫荧光经α-actin为单抗检测确定增生的内膜层细胞为α-actin阳性细胞。说明增生的内膜层主要是增殖的平滑肌细胞。
而本方法构建的基因修饰的组织工程血管移植12个月后HE染色基本未见血管内膜层增厚及明显的平滑肌细胞增生，血管形态正常，各层结构完整，排列整齐，未见钙化区及炎性细胞浸润，免疫组化检测未见血管有CD4表达。血管基本未见凋亡细胞。血管移植后HE染色未见血管内膜增厚，免疫荧光用Brdu、α-actin为单抗检测内膜层未见红色荧光。说明内膜层未见增殖的平滑肌细胞，与HE染色结果相吻合。以上结果说明本发明通过基因工程方法和组织工程相结合在种子细胞转入或超表达A20基因，则既能对抗血管搭桥病人血液中的损伤因子对移植血管内皮的损伤，抗血栓形成，抑制平滑肌细胞的病理性增殖，抗血管再狭窄。同时能有效抑制急性血管替代治疗所面临的同种移植损伤。
实施例2、能在体诱导内皮化的基因修饰组织工程血管制备，按上述步骤(1)方法制备相应管径的猪血管或异体血管基质材料，按步骤(2)进行表面修饰后，按(3)种植大鼠平滑肌细胞，不种植内皮细胞。移植到大鼠颈总动脉，6个月后进行检测，见血管保持通畅，扫描电镜检测，血管已完全内皮化，没有血管内膜增生及血栓形成。而对照组未经表面修饰及基因修饰的血管未见内皮层形成，血管腔狭窄，血管内膜增生，一部分血管全部闭塞。
实施例3。一种基因修饰的组织工程血管制备，按实施(1)方法制备猪血管或同种血管基质材料，按(2)进行表面修饰后，按(3)、(4)种植人平滑肌细胞，同种内皮细胞。用于透析病人未见血栓形成，而对照组有血栓形成。
权利要求
1.一种基因修饰的组织工程血管，其特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架材料获取由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分，保留血管的天然网状结构制成，或直接采用人工合成材料制成；(2)、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生长因子蛋白为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，余量为去离子水。充分混合成水溶液，灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；(3)、平滑肌细胞种植完成血管腔表面修饰后，再在血管中膜上接种平滑肌细胞；(4)、内皮细胞种植平滑肌细胞长好后，在血管腔的表面再种植A20基因修饰的血管内皮细胞。
2.一种基因修饰的组织工程血管，其特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架材料获取由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分，保留血管的天然网状结构制成，或直接采用人工合成材料制成；(2)、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生长因子蛋白为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，余量为去离子水。充分混合成水溶液，灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；(3)、平滑肌细胞种植完成血管腔表面修饰后，再在血管中膜上接种平滑肌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是在其制备方法的步骤1中所述的人工合成材料可采用不可降解材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯，或可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物；在步骤2中的可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料为N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯；粘附短肽为Gly-Arg-Gly-Asp、或Arg-Gly-Asp、生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子；
4.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(1)中血管支架材料获取的采用以下方式在无菌条件下取新鲜异种(如猪血管)或同种血管，去除其上所附软组织，无菌PBS冲洗血管，去除血栓凝块，无菌包装放入-80℃保存。复温于37℃用0.1mol/L PMSF溶液处理1--3小时，抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3--5小时，每1小时换液一次；无菌蒸馏水浸洗干净，在保持37℃、5％CO2用0.03％--0.05％胰蛋白酶处理16--24小时，每8小时换液一次，无菌蒸馏水浸洗干净；用0.005％---0.01％RNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.006％--0.01％DNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.005％--0.01％脂质酶消化2--4小时，无菌抗生素蒸馏水浸洗干净。15--20GY γ射线辐射处理10--15分钟消毒并清除剩余血管基质胶原蛋白、弹性蛋白的抗原性，最后获得血管支架。
5.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(2)中可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料制备是将光交联壳聚糖进行磺化和硫酸酯化后得到的N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯，具体方法为①、6-O-磺化光交联壳聚糖(6-O-SM-Az-CH-LA)的合成将纯化的光交联壳聚糖(Az-CH-LA)溶解在2％甲酸溶液中，然后在室温下逐滴加入适量的1mol/L的CuSO4.5H2O溶液，搅拌15--20小时后，过滤后依次用水、丙酮和乙醚洗涤。将所得产物完全分散在干燥的DMF溶液中，然后将溶解在DMF中的SO3.Pyridine溶液按1∶4的比例(1∶4＝壳聚糖分子重复单元与SO3.Pyridine之间的摩尔比)在低温下滴加到溶液中，搅拌1--3小时后，在氮气保护和50℃下加热搅拌15--小时。将冷却后的溶液用NaHCO3调到pH值为8.2，加入适量的水透析3--5天。将所得溶液用色谱的方法除掉铜离子后，冷冻干燥(这步的产率为80％)等到产品；②、将上一步得到的6-O-磺酸光交联壳聚糖溶解在一定量的水中，然后加入适量的Na2CO3和SO3.NMe3复合物，用氮气保护，在70℃下搅拌15--20小时。等反应完成后，在去离子水中透析25--35小时，在稀NaoH溶液中透析4--6小时，最后在去离子水中透析3--5天，冷冻干燥得最终产品。15--20Gy Y射线辐射处理15--20分钟消毒备用。
6.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(2)中A20基因质粒DNA的制备如下用肿瘤坏死因子TNF刺激培养的内皮细胞3--5小时，可刺激A20基因表达。抽提细胞中RNA，设计引物上游5’-AGTTGTCCCATTCGTCATTCC-3’，下游5’-TTTGAGCAATATGCGGAAAGC-3’，用RT-PCR方法克隆A20基因cDNA，带A末端DNA克隆载体pUCm-T Vector(编号BS434)，将A20基因cDNA与pUCm-T Vector进行连接，筛选出成功连接的菌落，扩增后抽提质粒DNA，用EcoR I和BamH I进行酶切，得到大量包含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段；绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1(catalog #6085-1)包括4.7kb，此载体包括多个酶切位点可以插入外源片段，其中本实验主要应用载体多克隆位点中的631处的EcoR I位点和661bp处的BamH I位点，用EcoRI和BamH I双酶切线性化pEGFP-N1载体，再用连接酶将含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1，筛选出阳性菌落，扩增抽提得到包含A20基因的真核表达载体质粒pEGFPA20-N1。
7.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(3)中平滑肌细胞种植方式如下在自行构建血管培养系统中，原代培养的平滑肌细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔内一直有一定搏动压力进行培养；另一种平滑肌细胞种植方法是用同样数量细胞采用间隔相同的点微注射到血管中膜，在血管细胞化生物反应器中进行培养。
8.根据权利要求1所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(4)中内皮细胞种植方法如下转基因内皮细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90--120min后，在2--4天的内皮细胞种植培养过程中，腔内流速逐渐从0.033到0.1ml/s增高，在血管壁相应的剪切应力约为1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之间，构建出基因修饰的组织工程血管。
全文摘要
本发明涉及的基因修饰的组织工程血管的特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架材料获取；(2)、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；(3)、平滑肌细胞种植；(4)、内皮细胞种植。所述组织工程血管具有良好力学性能及抗血栓形成、抗血管再狭窄等性能，用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。
文档编号A61L27/00GK1491728SQ0313572
公开日2004年4月28日 申请日期2003年8月29日 优先权日2003年8月29日
发明者朱楚洪, 应大君, 糜建红 申请人:中国人民解放军第三军医大学
技术领域：
本发明涉及一种构建基因修饰的组织工程血管。
背景技术：
目前各种血管移植物，以人体自身血管为佳。但人体自身非必需血管的长度和直径极为有限，有些患者有全身血管病变甚至无合适的自体血管移植物。对于大血管，虽然PTFE(聚四氟乙烯)等人工血管可在一定程度上满足临床需要，但不能降解，一直作为异物存在人体内，且抑制血管细胞的再生功能。PTFE等人工血管的抗凝血机理是让血液在人工血管内壁形成一层血栓膜，因此这种人工血管的内径通常不能小于6mm，否则会引起血管阻塞，直径小于6mm的小血管病变，仍无满意的人工血管替代物。目前临床血管移植物仍尽量取用自身动、静脉。虽然自体动脉移植物有着无可比拟的优良效果，自体静脉移植物仍然是冠状动脉搭桥术选用最多的血管移植物，但是由于来源少，其顺应性不匹配及移植前后各种因素对内皮细胞损伤，大多数搭桥血管发生内膜增生，最终导致血管狭窄闭塞，静脉桥的远期通畅率低，又是困扰心脏外科医生的一个难题。
另外人工血管用于急性血管损伤治疗或用于一些不能提供合适种子细胞的病人，构建的人工血管不能用自体细胞种植需要耐受同种移植。冠脉搭桥需要小直径血管，但直径小于6mm的人工血管移植6个月后血栓率高达40％，仍无满意的人工血管替代物。用人工材料构建小直径血管不易成型，同时很难做到顺应性相匹配。因而如何改善移植血管的力学特性及生物相容性，防止血管闭塞，是构建小直径血管面临的主要问题。
组织工程血管研究的关键问题是种子细胞和支架材料。种子细胞包括成体血管细胞和干细胞等。在支架材料方面，血管组织工程最终研制的产品是具有三维形状和空间结构的血管，因此在培育细胞时，必须提供具有特定三维结构的立体血管支架材料，使接种细胞能定位、贴附、局域化生长增殖，同时材料可使细胞在支架空间分布排列有序，分化具有特定功能并合成适当的细胞外基质，细胞与细胞外基质形成的组织或器官与三维支架形状一致，组织工程血管移植体内时支架材料还兼有力学支持功能，抗血流压力等。目前组织工程血管使用的支架材料包括天然材料和人工合成材料，人工合成材料主要有两种，一种为不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等，另一种为可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物。由于这类物质具有低毒、无免疫反应、安全性较好且有很好的生物相容性的特性得到广泛应用。人工材料尽管有许多优点，但也存在一些问题，人工合成材料的生物相容性、生物活性、生物降解性及与宿主血管力学匹配等方面还存在一些缺点，且在孔隙率及孔径大小等方面的仿生制作还有一定难度，同时某些人工材料(如聚乳酸等)大量使用时在体内降解过程中产生的酸性物质堆积，不利于细胞的附着、分裂、增殖；同时亲水性差，细胞吸附力较弱，机械强度不足。另外作为合成类高分子材料缺乏细胞识别信号，其昂贵的价格也限制了其广泛应用。因此，支架材料已成为妨碍组织工程血管研究进程的主要问题。
因血管替代治疗并不能改变机体的内部致病环境，Ratliff等观察了115例，用作冠状动脉搭桥的大隐静脉，发现移植物动脉粥样硬化(GAS)病变者占99％。说明尽管进行了替代治疗，但由于移植过程中的损伤、及机体的内部致病环境仍然存在，极有可能再度导致移植血管发生再狭窄，从而导致移植失败。尽管目前有构建小直径血管的报道，但都局限在血管表面进行修饰加强细胞种植，对血管移植后发生的内膜增生血管再狭窄闭塞尚没有好的办法解决。
A20基因属于锌指蛋白家族，在抗炎症方面有相关报道，但目前国内外未见任何将A20基因应用于血管组织工程研究报道。
发明内容
本发明的目的就在于改进现有技术中的不足，提供一种同时具有良好力学性能及抗血栓形成、血管再狭窄的基因修饰的组织工程血管，用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。
为实现本发明的上述目的而采用的技术方案是这样的，即一种基因修饰的组织工程血管，其特征是采用如下的方法制备1、血管支架材料获取由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分，保留血管的天然网状结构制成，或直接采用人工合成材料制成；2、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生长因子蛋白为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，余量为去离子水。充分混合成水溶液，灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；3、平滑肌细胞种植完成血管腔表面修饰后，再在血管中膜上接种平滑肌细胞；4、内皮细胞种植平滑肌细胞长好后，在血管腔的表面再种植A20基因修饰的血管内皮细胞。
在上述制备方法中，步骤1中所述的人工合成材料可采用不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯，或可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物；在步骤2中的可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料为N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯；粘附短肽为Gly-Arg-Gly-Asp、或Arg-Gly-Asp、生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子；本发明解决的主要问题是血管的力学特性和生物相容性，与现有技术相比具有如下优点1.在基因修饰组织工程血管方面，A20基因具有抗血栓形成、血管再狭窄功能，本发明通过基因工程方法和组织工程相结合在种子细胞转入或超表达A20基因，则既能对抗血管搭桥病人血液中的损伤因子对移植血管内皮的损伤，抑制平滑肌细胞的病理性增殖，同时能有效抑制急性血管替代治疗所面临的同种移植损伤。
2.制备的血管支架，其抗原性较弱，有良好的组织亲和性和结合力，其天然的孔隙结构、大小和形态端正，为种子细胞的粘附、增殖、分化提供天然的三维生长空间结构。这种材料来源丰富，制作简便，易于塑形，并在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。
3.抗凝血及控制生长因子释放的N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯表面修饰剂由光交联的壳聚糖(Az-CH-LA)磺化和硫酸酯化合成，因而具有很强的亲水性和抗凝性，经紫外光照射可迅速变成不易溶解柔韧的水凝胶，能控制药物的释放。而目前常见合成的类肝素体N-磺酸-壳聚糖硫酸酯具有抗凝性但不具有控制药物释放的功能。目前国内外尚未见同时具有控制药物释放及抗凝的壳聚糖合成报道。因此本发明将光交联壳聚糖(Az-CH-LA)材料化学改性成类肝素体结构以形成全新的能用于与血液相接触的生物材料类肝素体N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯，则一方面可控制生长因子或药物的释放，另一方面具有抗凝血性能，同时具有可降解性。可用于本发明构建的血管、人工血管、其他组织工程血管及血管内支架的表面修饰。
4.血管支架本身具有良好细胞诱异性，进一步复合表面修饰物质后，为种子细胞粘附、增殖及发挥抗凝血功能提供好的微环境。本发明中表面修饰有以下优点，合成的抗凝血高分子材料N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯一方面可控制生长因子的释放，另一方面交联在血管表面在内皮种子细胞不足或细胞脱落时不会引起血栓形成，交联的粘附短肽可促进离体和在体的细胞粘附，内皮生长因子蛋白可离体诱导种子细胞生长及在体诱导血液中内皮祖细胞在血管表面粘附分化(或质粒DNA)A20基因可有效对抗各种因素对血管损伤。本发明通过表面修饰在急性血管替代或取病人内皮细胞数量不足时，可以直接将血管移植到病人体内，N-CM-光交联壳聚糖抗凝表面不会导致血液凝固，交联的内皮生长因子和粘附肽可诱导血液中的内皮祖细胞和临近内皮细胞补充在移植血管内皮丢失或尚未种植部位。交联的A20基因DNA便于粘附分化的内皮祖细胞吸取，迅速形成具有抗动脉粥样硬化功能的小直径血管。这种方法也可在体诱导血液中的内皮祖细胞粘附分化生长成内皮细胞，而不必离体分离培养，这样可大大提高组织工程效率。尚未见任何报道有这些设想或实验结果。
5.利用上述的良好支架材料，种植平滑肌细胞，再离体种植内皮种子细胞或在体诱导内皮祖细胞种植，成为有生命的基因修饰组织工程血管，可广泛用于临床上修复血管损伤。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。
1.血管支架材料获取无菌条件下取新鲜异种(如猪血管)或同种血管，去除其上所附软组织，无菌PBS冲洗血管，去除血栓凝块，无菌包装放入-80℃保存。复温于37℃用0.1mol/L PMSF溶液处理1--3小时，抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3--5小时，每1小时换液一次；无菌蒸馏水浸洗干净，在保持37℃、5％CO2用0.03％--0.05％胰蛋白酶处理16--24小时，每8小时换液一次，无菌蒸馏水浸洗干净；用0.005％---0.01％RNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.006％--0.01％DNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.005％--0.01％脂质酶消化2--4小时，无菌抗生素蒸馏水浸洗干净。15--20GY γ射线辐射处理10--15分钟消毒并清除剩余血管基质胶原蛋白、弹性蛋白的抗原性，最后获得血管支架。
将上述方法获得的血管支架运用形态学方法检测可见处理血管细胞已去除，血管基质纤维较前疏松，但分布完整，未见纤维断裂，弹力纤维及胶原纤维含量未见明显变化，处理前与处理后血管长度及内径相差不显著。压力容积实验对其顺应性进行检测与处理前对照，处理前后血管的压力容积曲线与抛物线的上升支非常接近，动脉P-V数据用二次抛物线关系式V＝aP2+bP+c进行拟合，其相关系数均大于0.95，说明拟合效果良好，所对应动脉顺应性的计算方法C＝dv/dp＝2ap+b。得处理后血管顺应性下降，但相差不显著(P＞0.05)，其中在压力为100mmHg时，处理前后的顺应性分别为6.25±0.42，5.80±0.67(×10-4ml/mmHg)，相差不显著(P＞0.05)。用Western blot检测表明未处理前猪血管MHC抗原、异种移植超急性排斥反应α-Gal抗原都有较强表达，处理后未见表达。
2.血管表面修饰2.1.表面修饰物之一的可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料实质上是将光交联壳聚糖进行磺化和硫酸酯化后得到的N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯。实施例为①、用6-O-磺化光交联壳聚糖(6-O-SM-Az-CH-LA)的合成将纯化的光交联壳聚糖(Az-CH-LA)溶解在2％甲酸溶液中，然后在室温下逐滴加入适量的1mol/L的CuSO4.5H2O溶液，搅拌15--20小时后，过滤后依次用水、丙酮和乙醚洗涤。将所得产物完全分散在干燥的DMF溶液中，然后将溶解在DMF中的SO3.Pyridine溶液按1∶4的比例(1∶4＝壳聚糖分子重复单元与SO3.Pyridine之间的摩尔比)在低温下滴加到溶液中，搅拌1--3小时后，在氮气保护和50℃下加热搅拌15--小时。将冷却后的溶液用NaHCO3调到pH值为8.2，加入适量的水透析3--5天。将所得溶液用色谱的方法除掉铜离子后，冷冻干燥(这步的产率为80％)等到产品。②、将上一步得到的6-O-磺酸光交联壳聚糖溶解在一定量的水中，然后加入适量的Na2CO3和SO3.NMe3复合物，用氮气保护，在70℃下搅拌15--20小时。等反应完成后，在去离子水中透析25--35小时，在稀NaoH溶液中透析4--6小时，最后在去离子水中透析3--5天，冷冻干燥得最终产品。15--20Gy Y射线辐射处理15--20分钟消毒备用。
2.2.A20基因质粒DNA的制备用肿瘤坏死因子TNF刺激培养的内皮细胞3--5小时，可刺激A20基因表达。抽提细胞中RNA，设计引物上游5’-AGTTGTCCCATTCGTCATTCC-3’，下游5’-TTTGAGCAATATGCGGAAAGC-3’，用RT-PCR方法克隆A20基因cDNA，带A末端DNA克隆载体pUCm-T Vector(编号BS434从上海生物工程有限公司购买)，将A20基因cDNA与pUCm-T Vector进行连接，运用x-gal染色，蓝白斑筛选出成功连接的菌落，扩增后抽提质粒DNA，用EcoR I和BamH I进行酶切，得到大量包含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段。绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1(catalog#6085-1从美国基因有限公司购买)包括4.7kb，此载体包括多个酶切位点可以插入外源片段，其中本实验主要应用载体多克隆位点中的631处的EcoR I位点和661bp处的BamH I位点，用EcoR I和BamH I双酶切线性化pEGFP-N1载体，再用连接酶将含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1，筛选出阳性菌落，扩增抽提得到包含A20基因的真核表达载体pEGFPA20-N1。
2.3.将无菌条件下合成表面修饰混合物。其配比关系为N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯70-90％(w/v)，Gly-Arg-Gly-Asp(GRGD)0.3-1％，内皮生长因子为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，其余用水补足。混合成水溶液，充分混合处理后灌注到处理好的血管腔，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用。此种修饰方法也可应用生物降解材料合成的血管支架内及人工血管腔表面及血管内支架表面进行修饰。
经上述步骤进行表面修饰后的血管，经扫描电镜检测可见血管内腔全部由表面修饰物覆盖，并附着均匀。
3.平滑肌细胞种植，在自行构建血管培养系统中，原代培养的平滑肌细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔内一直有一定压力进行培养。另一种平滑肌细胞种植方法是用同样数量细胞采用间隔相同的点微注射到血管中膜，在血管细胞化生物反应器中进行培养。
上述步骤种植的平滑肌细胞的形态学检测将种植了平滑肌细胞的血管中膜用0.1％硝酸银液灌注30秒，日光下显色30min，再用显微器械分离铺片，常规脱水透明封片，数码显微相机照相。同时HE方法对种植平滑肌的血管进行染色，结果银染可见血管腔平滑肌细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了平滑肌细胞化。HE染色显示血管中膜的平滑肌细胞形态正常，呈梭型，密集排列，沿血管长轴分布。说明在血管基质材料上成功进行了平滑肌细胞化
4.内皮细胞种植，转基因内皮细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90--120min后，在2--4天的内皮细胞种植培养过程中，腔内流速逐渐从0.033到0.1ml/s增高，在血管壁相应的剪切应力约为1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之间，构建基因修饰的组织工程血管。
上述步骤种植的内皮细胞经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了内皮化，银染也表明内皮细胞成功种植在血管基质上。荧光显微镜显示种植在血管基质材料上的的内皮细胞能分泌细胞外基质。表明内皮细胞可在血管基质上正常生长。
对上述步骤后获得的血管进行周向张力检测，实验中对构建好的转基因组织工程血管逐步加增加力刺激，当静水压达到2000mmHg时仍未见血管破裂，说明构建的血管抗胀裂强度/静水压大于2000mmHg。
备择方案，在不能获取足够数量的人内皮细胞时，可按前述方法制备血管支架并表面修饰后，也可仅在中膜种植平滑肌细胞，血管内腔主要诱导在体血液中内皮祖细胞和临近内皮细胞种植。
下面举例进行说明，但本发明的应用不仅在于此。
实施例1。一种基因修饰的组织工程血管制备，按步骤上述(1)方法制备猪血管或异体血管基质材料，按步骤(2)进行表面修饰后，按(3)种植猴平滑肌细胞，按步骤(4)种植内皮细胞。
获得的血管可见种植的平滑肌细胞形态良好，血管内皮细胞分布完整，顺血管长轴分布。移植到猴颈总动脉，12个月后进行检测。见血管内皮细胞分布完好，形态正常，血管平滑肌细胞形态正常，顺血管长轴分布，血管保持通畅，没有血管内膜增生及血栓形成。
与异种移植血管(直接从猪到猴)与同种移植血管进行比较。可见异种移植血管可见管腔全部闭塞，血管内有血栓形成，血管壁内膜破坏，未见增生，血管壁有大量的炎性细胞浸润。而同种移植血管6个月后血管闭塞，血管内膜呈典型移植物动脉粥样硬化病理改变，可见均匀弥漫性内膜增厚，病灶规则，呈向心性轮环状，病灶内富含泡沫细胞，炎症反应十分明显，纤维形成不充分，钙化不明显，在增厚的内膜中间有一小的圆形空隙，内被血栓充填，说明在血管狭窄到一定程度后，导致血栓形成，血管闭塞。而同种移植1个月的血管HE染色可见血管未闭塞，内膜层增厚，内皮下出现淡染的空泡细胞，中膜明显增生，平滑肌细胞排列紊乱并向内膜突起，呈斑块状结构，有些部位中膜有明显的钙化形成，钙化区周围出现泡沫样细胞。有炎性细胞浸润，经免疫组化检测可见血管外膜层有不同程度的CD4阳性细胞。Tunnel检测表明同种移植血管血管内膜层基本未见凋亡细胞，而中膜层、外膜层可见大量的凋亡细胞。血管HE染色血管内膜层增厚部分经Brdu为单抗检测都为Brdu阳性细胞，免疫荧光经α-actin为单抗检测确定增生的内膜层细胞为α-actin阳性细胞。说明增生的内膜层主要是增殖的平滑肌细胞。
而本方法构建的基因修饰的组织工程血管移植12个月后HE染色基本未见血管内膜层增厚及明显的平滑肌细胞增生，血管形态正常，各层结构完整，排列整齐，未见钙化区及炎性细胞浸润，免疫组化检测未见血管有CD4表达。血管基本未见凋亡细胞。血管移植后HE染色未见血管内膜增厚，免疫荧光用Brdu、α-actin为单抗检测内膜层未见红色荧光。说明内膜层未见增殖的平滑肌细胞，与HE染色结果相吻合。以上结果说明本发明通过基因工程方法和组织工程相结合在种子细胞转入或超表达A20基因，则既能对抗血管搭桥病人血液中的损伤因子对移植血管内皮的损伤，抗血栓形成，抑制平滑肌细胞的病理性增殖，抗血管再狭窄。同时能有效抑制急性血管替代治疗所面临的同种移植损伤。
实施例2、能在体诱导内皮化的基因修饰组织工程血管制备，按上述步骤(1)方法制备相应管径的猪血管或异体血管基质材料，按步骤(2)进行表面修饰后，按(3)种植大鼠平滑肌细胞，不种植内皮细胞。移植到大鼠颈总动脉，6个月后进行检测，见血管保持通畅，扫描电镜检测，血管已完全内皮化，没有血管内膜增生及血栓形成。而对照组未经表面修饰及基因修饰的血管未见内皮层形成，血管腔狭窄，血管内膜增生，一部分血管全部闭塞。
实施例3。一种基因修饰的组织工程血管制备，按实施(1)方法制备猪血管或同种血管基质材料，按(2)进行表面修饰后，按(3)、(4)种植人平滑肌细胞，同种内皮细胞。用于透析病人未见血栓形成，而对照组有血栓形成。
权利要求
1.一种基因修饰的组织工程血管，其特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架材料获取由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分，保留血管的天然网状结构制成，或直接采用人工合成材料制成；(2)、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生长因子蛋白为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，余量为去离子水。充分混合成水溶液，灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；(3)、平滑肌细胞种植完成血管腔表面修饰后，再在血管中膜上接种平滑肌细胞；(4)、内皮细胞种植平滑肌细胞长好后，在血管腔的表面再种植A20基因修饰的血管内皮细胞。
2.一种基因修饰的组织工程血管，其特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架材料获取由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分，保留血管的天然网状结构制成，或直接采用人工合成材料制成；(2)、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生长因子蛋白为0.003-0.008％，A20基因质粒DNA为0.001-0.003％，余量为去离子水。充分混合成水溶液，灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；(3)、平滑肌细胞种植完成血管腔表面修饰后，再在血管中膜上接种平滑肌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是在其制备方法的步骤1中所述的人工合成材料可采用不可降解材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯，或可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物；在步骤2中的可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料为N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯；粘附短肽为Gly-Arg-Gly-Asp、或Arg-Gly-Asp、生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子；
4.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(1)中血管支架材料获取的采用以下方式在无菌条件下取新鲜异种(如猪血管)或同种血管，去除其上所附软组织，无菌PBS冲洗血管，去除血栓凝块，无菌包装放入-80℃保存。复温于37℃用0.1mol/L PMSF溶液处理1--3小时，抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3--5小时，每1小时换液一次；无菌蒸馏水浸洗干净，在保持37℃、5％CO2用0.03％--0.05％胰蛋白酶处理16--24小时，每8小时换液一次，无菌蒸馏水浸洗干净；用0.005％---0.01％RNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.006％--0.01％DNA酶消化1--3小时，无菌蒸馏水浸洗干净，0.005％--0.01％脂质酶消化2--4小时，无菌抗生素蒸馏水浸洗干净。15--20GY γ射线辐射处理10--15分钟消毒并清除剩余血管基质胶原蛋白、弹性蛋白的抗原性，最后获得血管支架。
5.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(2)中可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料制备是将光交联壳聚糖进行磺化和硫酸酯化后得到的N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯，具体方法为①、6-O-磺化光交联壳聚糖(6-O-SM-Az-CH-LA)的合成将纯化的光交联壳聚糖(Az-CH-LA)溶解在2％甲酸溶液中，然后在室温下逐滴加入适量的1mol/L的CuSO4.5H2O溶液，搅拌15--20小时后，过滤后依次用水、丙酮和乙醚洗涤。将所得产物完全分散在干燥的DMF溶液中，然后将溶解在DMF中的SO3.Pyridine溶液按1∶4的比例(1∶4＝壳聚糖分子重复单元与SO3.Pyridine之间的摩尔比)在低温下滴加到溶液中，搅拌1--3小时后，在氮气保护和50℃下加热搅拌15--小时。将冷却后的溶液用NaHCO3调到pH值为8.2，加入适量的水透析3--5天。将所得溶液用色谱的方法除掉铜离子后，冷冻干燥(这步的产率为80％)等到产品；②、将上一步得到的6-O-磺酸光交联壳聚糖溶解在一定量的水中，然后加入适量的Na2CO3和SO3.NMe3复合物，用氮气保护，在70℃下搅拌15--20小时。等反应完成后，在去离子水中透析25--35小时，在稀NaoH溶液中透析4--6小时，最后在去离子水中透析3--5天，冷冻干燥得最终产品。15--20Gy Y射线辐射处理15--20分钟消毒备用。
6.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(2)中A20基因质粒DNA的制备如下用肿瘤坏死因子TNF刺激培养的内皮细胞3--5小时，可刺激A20基因表达。抽提细胞中RNA，设计引物上游5’-AGTTGTCCCATTCGTCATTCC-3’，下游5’-TTTGAGCAATATGCGGAAAGC-3’，用RT-PCR方法克隆A20基因cDNA，带A末端DNA克隆载体pUCm-T Vector(编号BS434)，将A20基因cDNA与pUCm-T Vector进行连接，筛选出成功连接的菌落，扩增后抽提质粒DNA，用EcoR I和BamH I进行酶切，得到大量包含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段；绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1(catalog #6085-1)包括4.7kb，此载体包括多个酶切位点可以插入外源片段，其中本实验主要应用载体多克隆位点中的631处的EcoR I位点和661bp处的BamH I位点，用EcoRI和BamH I双酶切线性化pEGFP-N1载体，再用连接酶将含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1，筛选出阳性菌落，扩增抽提得到包含A20基因的真核表达载体质粒pEGFPA20-N1。
7.根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(3)中平滑肌细胞种植方式如下在自行构建血管培养系统中，原代培养的平滑肌细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔内一直有一定搏动压力进行培养；另一种平滑肌细胞种植方法是用同样数量细胞采用间隔相同的点微注射到血管中膜，在血管细胞化生物反应器中进行培养。
8.根据权利要求1所述的基因修饰的组织工程血管，其特征是其制备方法步骤(4)中内皮细胞种植方法如下转基因内皮细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90--120min后，在2--4天的内皮细胞种植培养过程中，腔内流速逐渐从0.033到0.1ml/s增高，在血管壁相应的剪切应力约为1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之间，构建出基因修饰的组织工程血管。
全文摘要
本发明涉及的基因修饰的组织工程血管的特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架材料获取；(2)、血管表面修饰在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒DNA组成的表面修饰混合物；(3)、平滑肌细胞种植；(4)、内皮细胞种植。所述组织工程血管具有良好力学性能及抗血栓形成、抗血管再狭窄等性能，用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。
文档编号A61L27/00GK1491728SQ0313572
公开日2004年4月28日 申请日期2003年8月29日 优先权日2003年8月29日
发明者朱楚洪, 应大君, 糜建红 申请人:中国人民解放军第三军医大学
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