带有降钙素基因相关肽衍生物及其制备方法
专利名称：带有降钙素基因相关肽衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明属遗传工程领域带有降钙素基因相关肽即CGRP广泛分布于人体中枢神经系统，周围神经系统，心血管系统，泌尿系统等组织器官中。它在动物体内具有多方面的生理功能，是强有力的血管舒张剂，能扩张血管、降低血压，增强心肌收缩能力，提高血液输出量。具有治疗高血压，调节心律不齐，治疗心衰，心绞痛，冠心病及心肌坏死等心血管疾病的巨大临床应用价值。但是CGRP本身是小肽，在动物体内易被降解，作用时间短、生产成本高、价格贵，因而限制了CGRP在医疗实践中的应用价值。
本发明的目的是研制三种带有降钙素基因相关肽衍生物及其制备方法。
本发明的目的是研制上述带有降钙素基因相关肽衍生物的治疗心血管疾病的药物。
本发明的目的是研制上述带有降钙素基因相关肽衍生物的治疗心血管疾病的用药途径。
本发明是用重组基因，将其转入大肠杆菌细胞，经发酵后，从大肠杆菌细胞中分离到三种CGRP衍生物。这三种CGRP衍生物都是肽或蛋白质。
CGRP衍生物Ⅰ由38个氨基酸组成，其氨基酸序列是AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet也可以是: (β)AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是3.9KuCGRP衍生物Ⅱ由53个氨基酸组成，其氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet也可以是(β)GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet
该衍生物的分子量是4.5-5.8KuCGRP衍生物Ⅲ由137个氨基酸组成，其氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet也可以是(β)GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSetAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是13.9-4.5Ku本发明中制备的CGRP衍生物Ⅰ，衍生物Ⅱ和衍生物Ⅲ都含有CGRP基因。
由该基因编码37个氨基酸的多肽，人的CGRP有α和β两种。其中α-CGRP的第3位、22位、25位分别是ASP、Val、Asn；β-CGRP中第3位、22位、25位分别是Asn、Met、Ser、而其余序列相同。基因克隆时将α-CGRP基因或β-CGRP基因化学合成，然后将CGRP基因插入大肠杆菌质粒载体pUC18，这种重组质粒命名为pUC18-CGRP。经过亚克隆，然后将这种重组质粒转入大肠杆菌受体菌。这种受体菌制成感受态细胞可以是C600、TG1、MC1061、JM101等。用双酶切或PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计序列一致。转化子在LB培养基上即可培养，于28℃～42℃的温度培养8-25小时，然后收集细菌细胞，破碎菌体，从上清液中收集融合蛋白。然后将融合蛋白经加热5℃～90℃和30％～50％的(NH4)2SO4沉淀。再将初步纯化的融合蛋白通过Q-Sepharose柱和Glutathione Sepherose4B层折柱。层折后将融合蛋白用凝血酶切便得到CGRP衍生物Ⅱ。用凝血酶切后再用CNBr切便得到CGRP衍生物Ⅰ。
制备CGRP衍生物Ⅲ是从pUC18-CGRP质粒上切下CGRP基因加入化学合成的接头。将三个CGRP基因串联并与原核质粒载体相连，转入大肠杆菌受体菌。这种受体菌是感受态细胞，他们可以是C600、TG1、MC1061、JM101等菌株。用双酶切与PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计的序列一致。转化子在LB培养基上培养，于28℃～42℃的温度下培养8-15小时，然后收集细菌细胞，破碎菌体，收集融合蛋白。然后将融合蛋白悬浮于尿素，然后过Q-Sepharose柱和Glatathione sepharose 4B层析柱，再经凝血酶切便得到CGRP衍生物Ⅲ。CGRP衍生物Ⅰ共有38个氨基酸，分子量为3.9ku。CGRP衍生物Ⅱ共含有43-53个氨基酸，与天然CGRP相比它的N端增加5-15个氨基酸，C端增加一个甲硫氨酸，其分子量从4.5-5.8ku。衍生物Ⅲ与天然CGRP相比它是由三个CGRP串联而成，它的N端增加了5-15个氨基酸，C端增加一个甲硫氨酸。共含有127-137个氨基酸，其分子量从13.9-14.5ku。
本发明设计的基因结构充分考虑到CGRP扩张血管，降低血压、增强心肌收缩力，提高血液输出量的作用，又改善了CGRP作用时间短的不足。作为治疗心血管疾病的药物，本发明的CGRP衍生物十分有利于高效、方便地治疗高血压，心律不齐，心衰，心绞痛心血管系统疾病。
本发明利用基因工程技术，设计基因结构，通过细菌发酵和不同的分离纯化过程，得到三种CGRP衍生物。这些CGRP衍生物可通过注射、口腔滴喷、鼻腔滴喷、粘膜等途径为病人供药。单独或混合为病人供给CGRP衍生物后，非但在体内产生和天然CGRP一样的功能，而且作用时间更为持久。
上述三种CGRP衍生物具有和天然CGRP同样的生理功能。以人工肾性高血压狗ARHB为动物模型，每条狗用药量为2微克，高血压狗的血压便迅速下降。CGRP衍生物Ⅰ引起血压下降幅度达50％，血压下降维持时间22分钟。CGRP衍生物Ⅱ引起血压下降幅度为25.4％，平均血压下降维持时间为30分钟。CGRP衍生物Ⅲ引起血压下降幅度为17.2％，平均血压下降维持时间为80分钟，尤其是CGRP衍生物Ⅱ和CGRP衍生物Ⅲ的生物活性比天然CGRP更为优越，在动物体内引起的血压下降维持时间，显著延长。
实施例按权利要求1将用化学法合成的CGRP基因共编码38个氨基酸，然后将该基因插入pUC18质粒，克隆得到pUC18-CGRP。然后用BamHI+SalI酶切位点，将上述CGRP插入质粒pGEX-4T中得到重组质粒pGEX-CGRP。再将pGEX-CGRP转化至大肠杆菌受体菌JM101。转化子在40℃的温度下培养8小时，然后收集细胞，破碎菌体，收集上清。然后将上清液加热55℃并加50％(NH4)2SO4沉淀，便得到初步纯化的融合蛋白，再通过Q-Sepharose用缓冲液洗脱收集第2峰，浓缩后再通过Glutathione Sepharose 4B柱，充分洗脱后，用凝血酶切便得到纯化的CGRP衍生物Ⅱ，它含有53个氨基酸，该种CGRP衍生物Ⅱ的纯度用Tris-Tricine小分子量蛋白电泳。HPLCC-14反向柱分析和质谱分析检查纯度，分析表明CGRP衍生物Ⅱ在蛋白电泳中仅有一条带，HPLC检测只有一个峰纯度达到95％，质谱分析结果证明分子量为5.804ku和理论值一致。
纯化的CGRP衍物Ⅱ用CNBr裂解，除去N末端的15个氨基酸，便得到CGRP衍生物Ⅰ。它含有38个氨基酸即N末端和天然CGRP一样，但C末端比天然CGRP多一个Met。该种CGRP衍生物Ⅰ的纯度很高，在Tris-Tricine小分子量电泳中只有一条带，质谱分析确定分子量3.94ku。
制备CGRP衍生物Ⅲ，首先从大肠杆菌细胞中分离质粒pUC18-CGRP基因，加入二个化学合成的接头，连接成带有3个CGRP的串连基因，用EcoRI+SalI切点再与质粒pGEX-4T连接，将得到的转化子转入大肠杆菌JM101菌珠，转化子在30℃培养8小时，收集菌体。然后破碎细胞获得融合蛋白、悬浮融合蛋白在尿素和磷酸缓冲液中过Q-Sepharose层折柱，收集第3个峰中成份，再上GlutathioneSepharose 4B层折柱，收集第2个峰并用凝血酶切，便得到纯化的CGRP衍生物Ⅲ。该种衍生物Ⅲ的纯度用Tris-Tricine小分子量蛋白电泳检测只有一条带。用HPLCC-18柱分析出现单一的主峰。质谱分析结果证明分子量为14.5ku共有137个氨基酸。应用这条分离纯化路线可得到纯度为95％以上的纯制品。
这三种CGRP衍生物都有生物活性，以肾性血压狗(ARHB)为动物模型，通过注射或口腔喷滴都引起血压下降，其降压特征如下表三种CGRP衍生物的降压特征
权利要求
1．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物Ⅰ的结构，其特征是由编码38个氨基酸组成的活性肽，N端与天然CGRP一样，仅在其C端增加一个甲硫氨酸， 该CGRP衍生物的氨基酸序列是AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是3.9Ku。
2．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物Ⅱ的结构，其特征是由A和B两部分肽段组成，A肽共有38个氨基酸即CGRP衍生物Ⅰ，B 肽由5-15个氨基酸组成，B肽的15个氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMet该衍生物Ⅱ的氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是4.5-5.8Ku。
3．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物Ⅲ的结构，其特征是由两个各含四个氨基酸的接头将三个分子的A肽串连而成C肽，C肽共有122个氨基酸，B肽由5-15个氨基酸组成， 该衍生物Ⅲ的氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是13.9-14.5Ku
4．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物的制备方法，主要有CGRP基因的制备、分离、提取等，其特征是(1) 化学合成的人CGRP基因或3-5个CGRP基因串联后与大肠杆菌表达载体相连并转入大肠杆菌菌株；(2) 将菌株置于细菌培养基中，培养温度在28-42℃之间，培养时间8-25小时，然后收集菌体细胞；(3) 破碎细胞，将细胞中的目的蛋白通过阴离子交换柱或凝胶层析柱或亲和层析柱；(4) 过柱后目的蛋白经凝血酶或Xa因子酶解和CNBr裂解，得到CGRP衍生物Ⅰ；过柱后目的蛋白经凝血酶或Xa因子酶解，得到CGRP衍生物Ⅱ；CGRP串联基因过柱后，目的蛋白经凝血酶或Xa因子酶解，得到CGRP衍生物Ⅲ。
5．根据权利要求1或2或3所述的三种CGRP衍生物，其特征是该衍生物用于治疗高血压，心律不齐，心衰，心绞痛等心血管系统疾病。
6．根据权利要求1或2或3所述的CGRP衍生物，其特征是对病人用药途径可以是注射，口腔滴喷，鼻腔滴喷或粘膜的涂抹。
全文摘要
本发明是通过基因工程技术组建降钙素基因(CGRP)相关肽衍生物基因,经大肠杆菌发酵生产三种降钙素基因相关肽衍生物。CGRP具有降血压等重要的生理功能,但是在动物体内易被降解,作用时间短。本发明设计了一段DNA序列和大肠杆菌质粒载体相连接,构成带有降钙素基因相关肽的基因。由大肠杆菌发酵生产的融合蛋白,再经不同的分离提取过程制备降钙素基因相关肽衍生物Ⅰ和Ⅱ。又通过多个CGRP基因串联,发酵分离到降钙素基因相关肽衍生物Ⅲ。
文档编号A61P9/00GK1285358SQ00125048
公开日2001年2月28日 申请日期2000年9月7日 优先权日2000年9月7日
发明者郑兆鑫, 严维耀, 柴常星, 孙立春, 林焱, 汤健 申请人:复旦大学
技术领域：
本发明属遗传工程领域带有降钙素基因相关肽即CGRP广泛分布于人体中枢神经系统，周围神经系统，心血管系统，泌尿系统等组织器官中。它在动物体内具有多方面的生理功能，是强有力的血管舒张剂，能扩张血管、降低血压，增强心肌收缩能力，提高血液输出量。具有治疗高血压，调节心律不齐，治疗心衰，心绞痛，冠心病及心肌坏死等心血管疾病的巨大临床应用价值。但是CGRP本身是小肽，在动物体内易被降解，作用时间短、生产成本高、价格贵，因而限制了CGRP在医疗实践中的应用价值。
本发明的目的是研制三种带有降钙素基因相关肽衍生物及其制备方法。
本发明的目的是研制上述带有降钙素基因相关肽衍生物的治疗心血管疾病的药物。
本发明的目的是研制上述带有降钙素基因相关肽衍生物的治疗心血管疾病的用药途径。
本发明是用重组基因，将其转入大肠杆菌细胞，经发酵后，从大肠杆菌细胞中分离到三种CGRP衍生物。这三种CGRP衍生物都是肽或蛋白质。
CGRP衍生物Ⅰ由38个氨基酸组成，其氨基酸序列是AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet也可以是: (β)AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是3.9KuCGRP衍生物Ⅱ由53个氨基酸组成，其氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet也可以是(β)GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet
该衍生物的分子量是4.5-5.8KuCGRP衍生物Ⅲ由137个氨基酸组成，其氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet也可以是(β)GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSetAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是13.9-4.5Ku本发明中制备的CGRP衍生物Ⅰ，衍生物Ⅱ和衍生物Ⅲ都含有CGRP基因。
由该基因编码37个氨基酸的多肽，人的CGRP有α和β两种。其中α-CGRP的第3位、22位、25位分别是ASP、Val、Asn；β-CGRP中第3位、22位、25位分别是Asn、Met、Ser、而其余序列相同。基因克隆时将α-CGRP基因或β-CGRP基因化学合成，然后将CGRP基因插入大肠杆菌质粒载体pUC18，这种重组质粒命名为pUC18-CGRP。经过亚克隆，然后将这种重组质粒转入大肠杆菌受体菌。这种受体菌制成感受态细胞可以是C600、TG1、MC1061、JM101等。用双酶切或PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计序列一致。转化子在LB培养基上即可培养，于28℃～42℃的温度培养8-25小时，然后收集细菌细胞，破碎菌体，从上清液中收集融合蛋白。然后将融合蛋白经加热5℃～90℃和30％～50％的(NH4)2SO4沉淀。再将初步纯化的融合蛋白通过Q-Sepharose柱和Glutathione Sepherose4B层折柱。层折后将融合蛋白用凝血酶切便得到CGRP衍生物Ⅱ。用凝血酶切后再用CNBr切便得到CGRP衍生物Ⅰ。
制备CGRP衍生物Ⅲ是从pUC18-CGRP质粒上切下CGRP基因加入化学合成的接头。将三个CGRP基因串联并与原核质粒载体相连，转入大肠杆菌受体菌。这种受体菌是感受态细胞，他们可以是C600、TG1、MC1061、JM101等菌株。用双酶切与PCR扩增及核苷酸序列分析，确证转化子的序列与所设计的序列一致。转化子在LB培养基上培养，于28℃～42℃的温度下培养8-15小时，然后收集细菌细胞，破碎菌体，收集融合蛋白。然后将融合蛋白悬浮于尿素，然后过Q-Sepharose柱和Glatathione sepharose 4B层析柱，再经凝血酶切便得到CGRP衍生物Ⅲ。CGRP衍生物Ⅰ共有38个氨基酸，分子量为3.9ku。CGRP衍生物Ⅱ共含有43-53个氨基酸，与天然CGRP相比它的N端增加5-15个氨基酸，C端增加一个甲硫氨酸，其分子量从4.5-5.8ku。衍生物Ⅲ与天然CGRP相比它是由三个CGRP串联而成，它的N端增加了5-15个氨基酸，C端增加一个甲硫氨酸。共含有127-137个氨基酸，其分子量从13.9-14.5ku。
本发明设计的基因结构充分考虑到CGRP扩张血管，降低血压、增强心肌收缩力，提高血液输出量的作用，又改善了CGRP作用时间短的不足。作为治疗心血管疾病的药物，本发明的CGRP衍生物十分有利于高效、方便地治疗高血压，心律不齐，心衰，心绞痛心血管系统疾病。
本发明利用基因工程技术，设计基因结构，通过细菌发酵和不同的分离纯化过程，得到三种CGRP衍生物。这些CGRP衍生物可通过注射、口腔滴喷、鼻腔滴喷、粘膜等途径为病人供药。单独或混合为病人供给CGRP衍生物后，非但在体内产生和天然CGRP一样的功能，而且作用时间更为持久。
上述三种CGRP衍生物具有和天然CGRP同样的生理功能。以人工肾性高血压狗ARHB为动物模型，每条狗用药量为2微克，高血压狗的血压便迅速下降。CGRP衍生物Ⅰ引起血压下降幅度达50％，血压下降维持时间22分钟。CGRP衍生物Ⅱ引起血压下降幅度为25.4％，平均血压下降维持时间为30分钟。CGRP衍生物Ⅲ引起血压下降幅度为17.2％，平均血压下降维持时间为80分钟，尤其是CGRP衍生物Ⅱ和CGRP衍生物Ⅲ的生物活性比天然CGRP更为优越，在动物体内引起的血压下降维持时间，显著延长。
实施例按权利要求1将用化学法合成的CGRP基因共编码38个氨基酸，然后将该基因插入pUC18质粒，克隆得到pUC18-CGRP。然后用BamHI+SalI酶切位点，将上述CGRP插入质粒pGEX-4T中得到重组质粒pGEX-CGRP。再将pGEX-CGRP转化至大肠杆菌受体菌JM101。转化子在40℃的温度下培养8小时，然后收集细胞，破碎菌体，收集上清。然后将上清液加热55℃并加50％(NH4)2SO4沉淀，便得到初步纯化的融合蛋白，再通过Q-Sepharose用缓冲液洗脱收集第2峰，浓缩后再通过Glutathione Sepharose 4B柱，充分洗脱后，用凝血酶切便得到纯化的CGRP衍生物Ⅱ，它含有53个氨基酸，该种CGRP衍生物Ⅱ的纯度用Tris-Tricine小分子量蛋白电泳。HPLCC-14反向柱分析和质谱分析检查纯度，分析表明CGRP衍生物Ⅱ在蛋白电泳中仅有一条带，HPLC检测只有一个峰纯度达到95％，质谱分析结果证明分子量为5.804ku和理论值一致。
纯化的CGRP衍物Ⅱ用CNBr裂解，除去N末端的15个氨基酸，便得到CGRP衍生物Ⅰ。它含有38个氨基酸即N末端和天然CGRP一样，但C末端比天然CGRP多一个Met。该种CGRP衍生物Ⅰ的纯度很高，在Tris-Tricine小分子量电泳中只有一条带，质谱分析确定分子量3.94ku。
制备CGRP衍生物Ⅲ，首先从大肠杆菌细胞中分离质粒pUC18-CGRP基因，加入二个化学合成的接头，连接成带有3个CGRP的串连基因，用EcoRI+SalI切点再与质粒pGEX-4T连接，将得到的转化子转入大肠杆菌JM101菌珠，转化子在30℃培养8小时，收集菌体。然后破碎细胞获得融合蛋白、悬浮融合蛋白在尿素和磷酸缓冲液中过Q-Sepharose层折柱，收集第3个峰中成份，再上GlutathioneSepharose 4B层折柱，收集第2个峰并用凝血酶切，便得到纯化的CGRP衍生物Ⅲ。该种衍生物Ⅲ的纯度用Tris-Tricine小分子量蛋白电泳检测只有一条带。用HPLCC-18柱分析出现单一的主峰。质谱分析结果证明分子量为14.5ku共有137个氨基酸。应用这条分离纯化路线可得到纯度为95％以上的纯制品。
这三种CGRP衍生物都有生物活性，以肾性血压狗(ARHB)为动物模型，通过注射或口腔喷滴都引起血压下降，其降压特征如下表三种CGRP衍生物的降压特征
权利要求
1．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物Ⅰ的结构，其特征是由编码38个氨基酸组成的活性肽，N端与天然CGRP一样，仅在其C端增加一个甲硫氨酸， 该CGRP衍生物的氨基酸序列是AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是3.9Ku。
2．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物Ⅱ的结构，其特征是由A和B两部分肽段组成，A肽共有38个氨基酸即CGRP衍生物Ⅰ，B 肽由5-15个氨基酸组成，B肽的15个氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMet该衍生物Ⅱ的氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是4.5-5.8Ku。
3．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物Ⅲ的结构，其特征是由两个各含四个氨基酸的接头将三个分子的A肽串连而成C肽，C肽共有122个氨基酸，B肽由5-15个氨基酸组成， 该衍生物Ⅲ的氨基酸序列是GlySerProGlyIleArgAlaArgTryProGlyIleArgSerMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMetSerValGlyMetAlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheMet该衍生物的分子量是13.9-14.5Ku
4．一种带有降钙素基因相关肽即CGRP衍生物的制备方法，主要有CGRP基因的制备、分离、提取等，其特征是(1) 化学合成的人CGRP基因或3-5个CGRP基因串联后与大肠杆菌表达载体相连并转入大肠杆菌菌株；(2) 将菌株置于细菌培养基中，培养温度在28-42℃之间，培养时间8-25小时，然后收集菌体细胞；(3) 破碎细胞，将细胞中的目的蛋白通过阴离子交换柱或凝胶层析柱或亲和层析柱；(4) 过柱后目的蛋白经凝血酶或Xa因子酶解和CNBr裂解，得到CGRP衍生物Ⅰ；过柱后目的蛋白经凝血酶或Xa因子酶解，得到CGRP衍生物Ⅱ；CGRP串联基因过柱后，目的蛋白经凝血酶或Xa因子酶解，得到CGRP衍生物Ⅲ。
5．根据权利要求1或2或3所述的三种CGRP衍生物，其特征是该衍生物用于治疗高血压，心律不齐，心衰，心绞痛等心血管系统疾病。
6．根据权利要求1或2或3所述的CGRP衍生物，其特征是对病人用药途径可以是注射，口腔滴喷，鼻腔滴喷或粘膜的涂抹。
全文摘要
本发明是通过基因工程技术组建降钙素基因(CGRP)相关肽衍生物基因,经大肠杆菌发酵生产三种降钙素基因相关肽衍生物。CGRP具有降血压等重要的生理功能,但是在动物体内易被降解,作用时间短。本发明设计了一段DNA序列和大肠杆菌质粒载体相连接,构成带有降钙素基因相关肽的基因。由大肠杆菌发酵生产的融合蛋白,再经不同的分离提取过程制备降钙素基因相关肽衍生物Ⅰ和Ⅱ。又通过多个CGRP基因串联,发酵分离到降钙素基因相关肽衍生物Ⅲ。
文档编号A61P9/00GK1285358SQ00125048
公开日2001年2月28日 申请日期2000年9月7日 优先权日2000年9月7日
发明者郑兆鑫, 严维耀, 柴常星, 孙立春, 林焱, 汤健 申请人:复旦大学
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