含嗜酸乳杆菌的药物制剂及制备方法
专利名称：含嗜酸乳杆菌的药物制剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂，具体涉及一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂及制备方法。
寄生于正常阴道内的微生物群主要有细菌、真菌、原虫和病毒。它们主要栖居于粘膜的皱褶以及穹窿部，其次是宫颈。阴道内主要的常住菌有乳杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、B族链球菌、粪链球菌、支原体、白色念珠菌、消化球菌和类杆菌等。一般用定性和定量的方法测得健康妇女阴道排出物中活菌为102CFU/ml-109CFU/ml，厌氧菌与需氧菌之比为5∶1，其中乳杆菌是阴道正常菌群中最重要、数量最多的常住菌。正常情况下乳杆菌占阴道内所有常住菌的95％以上，是正常菌群，其量约每ml阴道分泌物中含≤104CFU。目前研究表明从健康妇女阴道内可分离出16种乳杆菌，分离率达50-80％，其中数量较多的是嗜酸乳杆菌(77.5％)、唾液乳杆菌和发酵乳杆菌，而糖元分解能力强的菌包括嗜酸乳杆菌、莱氏乳杆菌及唾液乳杆菌。乳杆菌在维持阴道微生态平衡中起重要作用。它可分解阴道粘膜上皮细胞内的糖元，产生一定量的乳酸进而维持阴道内较低的酸碱度，使阴道保持酸性环境，抑制有害菌的过度生长，有利于阴道的自净作用。同时它可提高机体的免疫功能，激活巨噬细胞，维持阴道局部的抗感染能力。
妇科窥器检查时阴道分泌物不会积聚成堆，其中很少有多形核中性白细胞，阴道分泌物涂片经革兰氏染色，上皮细胞边界清晰，涂片中有多量染色较深的革兰氏阳性乳杆菌。阴道壁存在着大量的乳杆菌可形成一种生物膜，起到了占位性保护作用。嗜酸乳杆菌是健康妇女阴道内微生物群中优势菌属的正常菌群菌株之一，数量最多，约占整个菌群的67％。它们对正常菌丛起着平衡作用，使宿主阴道微生态系统处于动态平衡，保持妇女阴道正常功能，免于遭受可能有致病性的内栖菌或者外源性致病菌的侵袭。
阴道炎发病与阴道微生态环境改变有关(1)阴道pH值的升高；(2)月经周期中性激素的变化；(3)阴道灌洗，灌洗不当使阴道局部受伤；(4)抗生素等应用杀灭了病菌的同时也抑制了阴道正常菌群；(5)同时伴有其它感染。全身性疾病、阴道局部损伤、卵巢功能底下或免疫抑制剂、抗肿瘤药物等失度使用均导致阴道菌群中一些常住菌乘虚而入，引起阴道感染。感染的主要来源是阴道微生物群中许多潜在性致病微生物比如大肠杆菌、类杆菌、消化球菌、金黄色葡萄球菌、B族链球菌、白色念珠菌、毛滴虫、支原体等。以上5种情况都可以破坏阴道的微生态平衡，致使致病菌繁殖而致阴道炎。另外，厌氧菌繁殖同时，有些氨类物质产生，也进一步碱化阴道，使阴道上皮脱落，阴道分泌物异常。而有些氨类物质也可进一步促进厌氧菌生长，加重阴道炎的症状，致使阴道微生态环境破坏。阴道炎是妇女常见、多发的疾病之一，与妇女阴道中微生态平衡有关。近十多年，由于阴道微生物基础理论研究的进展，为这类制剂的开发和应用提供了科学依据。
含乳杆菌的制剂，由于在制备的时候产生的物理碰撞而导致的死亡细菌细胞占一定比例，以及当它们在阴道腔中进一步扩散和它们的繁殖开始时，细菌细胞的数量进一步减少，因此，需要处理乳杆菌的适当品种，或辅料，和包含它们的制剂，以保证制剂有好的质量，给病人使用是真正有益的。另外，制剂应能够保持繁殖的嗜酸乳杆菌的数量恒定，并确保嗜酸乳杆菌在阴道腔内扩散时连续不变地作用。
申请人已发现可以得到对治疗阴道感染非常有效的嗜酸乳杆菌为基础的药物制剂，其提供了以下特征，可满足可能的最高水平(1)所选的嗜酸乳杆菌菌株必须有对阴道上皮的高亲和性，即粘附到阴道上皮细胞的高性能，这种性能使细菌能在生理和病理条件下与阴道粘膜相互作用，执行在上皮受体位点与病原有机体的竞争作用，并重建微生物体系和最适pH条件。(2)必须有高的干扰能力，竞争大肠杆菌和白色念珠菌在人体阴道上皮细胞上的粘附。(3)必须有抑制大肠杆菌、白色念珠菌、淋病奈瑟氏菌生长的高性能。
因此，本发明的目的是提供满足以上特征，达到可能的最高水平的嗜酸乳杆菌为基础的制剂，并适于有效地用于治疗阴道感染，如阴道炎、淋病等。
本发明提供了一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂，该制剂是由嗜酸乳杆菌与药用赋形剂组成的。
本发明使用的嗜酸乳杆菌是经体外人工发酵繁殖后制成的活菌。本菌种以西红柿汁作为培养基，经体外人工发酵、冷却、离心、加保护剂后冻干后制剂化，用于阴道感染的治疗，起到阴道微生态治疗作用。本菌种菌粉菌量以108-1010CFU/g为优，优选菌量大约为1011CFU/g。本嗜酸乳杆菌治疗剂量(菌量)应大于104CFU/g，优选菌量为106-107CFU/g。
本发明的另一目的是提供了一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂的制备方法，该方法包括下列步骤
1、制备嗜酸乳杆菌菌粉将阴道中分泌物进行分离、纯化后获得的嗜酸乳杆菌SL9404菌株于MRS琼脂斜面上划线传代，经37±1℃培养48h。选取饱满、色泽均匀、中等偏大的菌落，再次划线接种于茄子瓶内的MRS琼脂斜面上，经37±1℃培养48h。转种接入牛肉疱肉管，37±1℃培养20-50h。取1-4支疱肉管转入300ml牛奶发酵培养基或5-20％西红柿汁发酵培养基或牛奶+西红柿汁发酵培养基，37±1℃培养8-48h发酵培养，逐步放大至大罐发酵，离心，冷冻干燥后制得菌粉；2、制备药剂按处方量称取嗜酸乳杆菌和药用赋形剂，按常规药物制剂方法制成各种制剂。
本菌种的保藏以冷冻干燥的形式为优。
该菌种已于2000年6月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NOM200013。
本发明的含嗜酸乳杆菌制剂的作用机理主要有(1)维持酸性环境。阴道乳杆菌活菌制剂可以补充患者阴道内最重要的乳杆菌，它可分解阴道粘膜上皮中贮存的糖元产生乳酸、乙酸等酸性物质，同时它本身亦能产生乳酸，这对维持阴道的酸性环境，抑杀多种病原微生物起着重要作用。(2)占位保护作用。大量研究证明外源性的乳杆菌能牢固地粘附于阴道粘膜上皮，形成空间性占位保护作用。(3)直接拮抗作用。体内外的研究证实乳杆菌对阴道加德钠氏菌、滴虫、念珠菌、葡萄球菌等有直接的抑制作用。(4)产生多种抑菌物质。乳杆菌能分解阴道粘膜上皮中贮存的糖元，产生乳酸、乙酸等酸性物质，同时它本身亦能产生乳酸，维持阴道的酸性环境，抑杀多种病原微生物。(5)营养竞争。大量定植于阴道中的乳杆菌，营养处于竞争优势状态，不利于其他菌的生长。乳杆菌疗法是将乳杆菌活菌制剂放入到阴道中，使乳杆菌活菌回到机体内发挥其自然的生理功能，调整阴道菌群，维护生态平衡，使阴道菌群重新达到微生态平衡，达到防治疾病的目的。
本发明的制剂形式可以是液体形式、膏体形式或固体形式，如片剂、胶囊剂、散剂、霜剂、乳膏剂、栓剂或喷雾剂。
本发明制剂所述的常用药物赋形剂，包括玉米淀粉、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠、糊精、乳糖、异乳糖、甘露醇、葡萄糖、维生素C、柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、酒石酸、富马酸、硼酸、酸性氨基酸类(如谷氨酸、天冬氨酸)等弱酸、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠(钙)、羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、碳酸钙、碳酸氢钠、硬脂酸镁、羊毛脂、聚乙二醇等。添加剂是指食用脱脂奶粉、维生素C、谷氨酸等有关营养剂。
本发明的含嗜酸乳杆菌制剂可用于妇女阴道感染方面、淋病等疾病的治疗和预防。一、嗜酸乳杆菌对人阴道上皮细胞(VEC)粘附作用观察(中国药品生物制品检定所检测)(一)目的观察嗜酸乳杆菌SL9404对人体阴道上皮细胞的粘附作用。(二)材料与方法1、人体阴道上皮细胞(以下简称VEC)取自健康妇女，年龄40岁以下，医院妇科门诊体检正常。
刮取的VEC标本立即悬浮于20mlRPMI-1640中旋涡混合器震荡洗涤细胞3次，500rpm×3min，滤器反复抽滤，除去内源性细菌。血球计数板计数，调整VEC浓度105/ml。2、菌种(1)分离自健康妇女阴道嗜酸乳杆菌9403、SL9404和9405株菌(2)大肠杆菌CMCC44113株(3)白色念珠菌CMCC 10231株(4)德氏乳杆菌一株，分离自定菌生制品3、菌液制备将乳杆菌接种于MRS培养基、大肠杆菌与白色念珠菌接种于普通营养琼脂，37℃，18小时培养；试验前刮取菌苔，RPMI-1640洗涤细菌3次(3000×10min)，调整细胞浓度为1×108/ml。4、方法(1)粘附试验3株嗜酸乳杆菌粘附作用比较取VEC悬液及菌液各1ml，混合，37℃，2小时培养；涂片，室温干燥，甲醇固定10min，革兰氏染色，镜下观察细菌在VEC上粘附情况并计数。(2)乳杆菌对大肠杆菌、白色念珠菌粘附VEC的影响，分为以下三组进行第一组1ml乳杆菌菌液中加入1ml大肠杆菌菌液或1ml白色念珠菌菌液，再加入1mlVEC悬液混匀，37℃，2小时，按上述试验方法镜下观察并计数。
第二组1ml乳杆菌菌液与1mlVEC悬液混匀，37C先培养30min后，再加入1ml大肠杆菌菌液或1ml白色念珠菌菌液，混匀，继续37℃，2小时，同上述试验方法镜下观察并计数。5、计数镜下随机计数50个VEC上粘附的细菌数，计算平均数及标准差。(三)结果1、不同株嗜酸乳杆菌粘附作用的比较三株嗜酸乳杆菌对人体VEC的粘附作用是不同的，其中SL9404株对VEC有较明显的粘附作用，见表1，即为50个VEC的细菌粘附数(113.8±33.69)，而9403和9405株经与VEC培养37℃，2小时后，大量细胞分布在混合液中，在VBC上未见明显粘附。对照菌即由定菌生分离的德氏乳杆菌粘附作用也不明显。
表一 嗜酸乳杆菌SL9404株对VEC的粘附作用
2、嗜酸乳杆菌SL9404株对大肠杆菌、白色念珠菌粘附VEC的影响(1)大肠杆菌44113株及白色念珠菌10231、白157.14±54.06和31.84±11.65(见表2)。表2、第一组试验结果
(2)第一组试验结果(表2)标明，将嗜酸乳杆菌SL9404株与大肠杆菌44113株或白色念珠菌10231株同时培养于37℃后，SL9404株可以抑制其它两株菌的粘附作用，统计学处理有明显差异，且比对照德氏乳杆菌的抑制作用更为明显。(3)第二组试验结果表明，当时嗜酸乳杆菌9405株先与VEC培养后，再加入大肠杆菌44113或白色念株菌10231时(表3)，则嗜酸乳杆菌SL9404株会明显抑制后两株菌粘附VEC的作用。表3、第2组试验结果
(4)第三组试验结果表明，当大肠杆菌44113、白色念珠菌10231先与VEC培养后，再加入嗜酸乳杆菌SL9404株时，SL9404株对前两株菌粘附VEC也有明显的抑制作用(见表4)表4、嗜酸乳杆菌SL9404株对大肠肝菌44113或白色念珠菌10231在VEC粘附作用影响
(四)结论1、嗜酸乳杆菌SL9404株对人本阴道上皮细胞有明显的粘附作用。2、嗜酸乳杆菌SL9404株可以抑制大肠杆菌44113株和白色念珠菌10231株在人体阴道上皮细胞的粘附作用。3、嗜酸乳杆菌SL9404株对人体阴道上皮细胞粘附作用较分离自定菌生制剂的德氏乳杆菌更为明显。二、嗜酸乳杆菌体外拮抗3种致病菌的研究(中国生物制品检定所测定)(一)目的观察嗜酸乳杆菌SL9404在体外对三种常见阴道致病菌，即致病性大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌和白色念珠菌的拮抗作用。(二)材料与方法(1)菌种①嗜酸乳杆菌SL9404株由上海信谊药业公司提供。②三种致病菌均由中国医学细菌保藏管理中心提供致病性大肠杆菌CMCC44l13淋病奈瑟氏菌(以下简称淋球病)CMCC29403白色念珠菌CMCC10231(2)培养基①含2％小牛血清TPY培养液用于液体培养。②乳杆菌选择性培养基采用MRS琼脂培养基。③大肠杆菌选择性培养基采用MRS琼脂培养基。④白色念珠菌选择性培养基采用虎红琼脂培养基。⑤淋球病选择性培养基采用NG琼脂培养基。(3)菌液制备分别将各菌株新鲜培养物，用标准细菌比浊管比浊，并用2％小牛血清TPY培养液调整细菌浓度，嗜酸乳杆菌为1×107/ml，其他三种致病菌均为1×105/ml。(4)试验分组嗜酸乳杆菌菌液分别与三种致病菌菌液等量混合于三角瓶中(9ml+9ml)混合构成对照组。
试验组与对照组均置于37℃水溶液培养至72小时或96小时。(5)菌量测定上述各试验组、对照组在培养起始(0时)、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时各取样，分别测定试验组三角瓶中的嗜酸乳杆菌和三种致病菌的细菌生产浓度。同时也测定各对照组的菌量。菌量测定方法参照1995年版《中国生物制品规程》规定的活菌计数方法进行，并以菌量浓度的对数值统计入表。(三)结果与分析(1)表5显示嗜酸乳杆菌SL8404对三种常见阴道致病菌的拮抗作用，表明当SL9404株分别与大肠杆菌、淋球菌和白色念珠菌混合培养72-96小时生长良好；每ml活菌浓度均在1×108个菌以上各试验组中SL9404株的活菌数量与对照组近似。(2)表5显示试验组或对照组中三种致病菌培养至12小时，活菌浓度已明显增加，两组菌量相近。(3)表5显示试验组中的淋病菌培养至12小时以后，生长明显抑制，至24小时，每ml菌液活菌浓度已少于10个，而此时对照组的菌量仍与12小时的菌量保持一致。(4)表5显示对照组大肠杆菌培养72小时，细菌浓度仍每ml大于108。试验组中大肠杆菌培养至24小时，活菌浓度也在108/ml以上，与对照组相似，但24小时后生长明显抑制。在48小时每ml菌液中活菌量低于105。(5)表5也显示了试验组中白色念珠菌的生长也有一定抑制，从培养12小时至96小时，其活菌浓度较对照组低。
表五 嗜酸乳杆菌SL9404株拮抗试验结果
(四)结论①嗜酸乳杆菌SL9404株在体外对淋病奈瑟氏菌的生长可较快抑制。②嗜酸乳杆菌SL9404株在体外可抑制致病性大肠杆菌生长。③嗜酸乳杆菌SL9404株在体外对白色念珠菌有一定作用。三、阴道用乳酸杆菌泡腾片对大鼠阴道刺激试验(中科院上海药物所测定)雌性SD大鼠24只，分为3组，给药组、赋形剂组和未处理组，每组8只。连续7天阴道给药，每在观测行为和外阴部情况。末次给药后24小时取大鼠阴道组织肉眼检查并作病理组织学检查。实验结果表明，肉眼观察未见外阴部明显的异常反应，病理组织学检查无明显病变。1、实验目的观察阴道用乳酸杆菌泡腾片连续7天大鼠阴道给药后刺激反应。2、受试药物(1)名称阴道用乳酸杆菌泡腾片，白色橄榄状片剂。(2)规格1.7×107CFU/片(0.25g/片)(3)提供单位上海信谊药业有限公司(4)批号DM-032573、对照物(1)赋形剂0.25g/片，上海信谊药业有限公司提供。(2)批号DM032504、动物(1)来源、种属、品系试验前予处理雌性SD大鼠24只，由中国科学院上海实验动物中心提供。合格证中科动管第005号。单笼饲养，动物自由摄食，饮水。实验前在中科院上海药物研究所动物房饲养一周。(2)体重242±24g(3)性别雌性(4)每组动物物按体重随机分为3组，每组8只，即受试物组、赋形剂和未处理组。(5)动物房温度23±2℃5、剂量(1)剂量设置临床人用阴道用乳酸杆菌泡腾片106CFU/片/人。大鼠给药剂量定为1.7×107CFU/片/只。局部用药量约为人用剂量10倍。(2)每只动物给药容量0.25g/片/只。6、给药途径大鼠阴道给药7、方法试验时将受试物轻轻置入大鼠阴道内，在旁观察确保药物与阴道粘膜接触直至溶解。每天一次，每次一片，连续7天，每天观察大鼠行为和外阴部情况。末次给药后24小时解剖进行肉眼检查并取材作组织学镜检。8、观察指标(1)肉眼观察每天观察大鼠行为反应、阴道口情况。在末次给药后24小时处死大鼠，取出阴道组织，观察有无充血、红肿等刺激现象。(2)组织学检查每只大鼠阴道组织取样作病理组织学检查。(3)结果判断试验结果与未处理组进行比较判断。9、结果(1)肉眼观察连续7天大鼠给药后行为正常，肉眼观察外阴部无明显异常反应。末次给药后24小时，取出阴道组织，未见充血、红肿等刺激现象。
(2)组织学检查病理组织学观察阴道上皮均为复层鳞状上皮，结构正常，均未见异常变化。
10、结论阴道用乳酸杆菌泡腾片1.7×107CFU/片/只连续7天，给药后肉眼观察大鼠阴道无明显异常反应，病理组织学检查亦未见异常变化。阴道用乳酸杆菌泡腾片对大鼠阴道无刺激的反应。
四、大鼠阴道用乳酸杆菌泡腾片最大耐受量试验(由中科院药物所测定)雌性SD大鼠24只，分为4组。测试一次阴道给乳酸杆菌泡腾片的急性毒性。剂量为1.7×107、6.9×109CFU/片/只，另设赋形剂组和未处理组，共4个剂量组。连续14天观察行为反应并记录体重增长情况。给药后大鼠活动正常，无明显异常变化，无动物死亡。第15天解剖所有动物，肉眼检查内脏未见明显病变。大鼠对乳酸杆菌泡腾片最大耐受量>6.9×109DFU/只。按绝对量计算，为人用量106CFU/片/人的1000倍以上。
1、实验目的观察大鼠阴道一次接触受试物后所产生的急性毒性反应、死亡情况及体重的影响。
2、受试药物(1)名称阴道用乳酸杆菌泡腾片，白色橄榄状片剂。
(2)规格1.7×107、6.9×109CFU/片(0.25g/片)(3)提供单位上海信谊药业有限公司(4)批号DM—03257；DM—032553、对照物(1)赋形剂0.25g/片，上海信谊药业有限公司提供。
(2)批号DM032504、动物来源、种属、合格证雌性SD大鼠4只，由中国科学院上海实验动物中心提供。合格证中科动管第005号。试验前一周适应性饲养。饲料购自中英合资上海西普尔一必凯实验动物有限公司。自由取水、摄食，饲养温度为23±2℃。
5、剂量(1)剂量设置临床人用阴道用乳酸杆菌泡腾片106CFU/片/人(1g/片)。动物的有效剂量为106CFU/片/只。为观测毒性反应用尽可能大的剂量和考虑到制片的技术关系。设1.7×107CFU/片/只和6.9×109CFU/片/只。按局部用药量计算分别相当临床用量10和1000倍，并设赋形剂和未处理组。
(2)每只动物接受容量l片/只。
6、给药途径；大鼠阴道给药。
7、方法试验时先用生量盐水冲洗阴道，然后将受试物轻轻置入大鼠阴道内。在旁观察6小时确保药片与阴道粘膜接触。给药后即观察动物反应情况，若死亡动物即进行解剖，检查内脏。
8、观察指标(1)观察期14天(2)毒性反应观察检查大鼠外观、行为、进食、粪便、体重增长等情况，死亡动物进行尸解。第15天实验结束时，存活大鼠解剖，检查心、肺、肝、脾、肾等脏器病变。
9、结果大鼠阴道给于乳酸杆菌泡腾片后，外观行为、进食和粪便等情况，均未见异常变化，无动物死亡，大鼠体重增长给药组和赋形剂组与未处理组相似。体重增长情况列入下表表六、阴道用乳酸杆菌泡腾片对大鼠体重的影响
10、结果评价实验用泡腾片，所含的细菌为临床用量10或1000倍。因大鼠体积比人小得多，故泡腾片的大小也相应缩小，相对来说含菌密度较人用泡腾片要高。从制片技术上来说已经达到极限了。大鼠阴道给于乳酸杆菌泡腾片1.7×107、6.9×109CFU/片/只，连续观察14天，给药后大鼠活动正常，无明显异常变化，无动物死亡。给药组和赋形剂组大鼠体重增长与示处理组相似。大鼠阴道用乳酸杆菌泡腾片的最大耐受量大于6.9×109CFU/只。五、嗜酸乳杆菌SL9404株稳定性试验(由中国药品生物制品检定所测定)1、目的观察嗜酸乳杆菌SL9404株连续传代30代后的稳定性。2、材料与方法(1)菌株嗜酸乳杆菌SL9404株由上海信谊药业公司提供。(2)培养基①MRS液体培养基-传代用②MRS琼脂培养基-特征检查用③糖生化反应培养基-观察生化反应用④PYG液体培养基-测代谢产物用(3)方法菌种通过MRS液体培养基连续传代30代后，将原代株与30代株进行生物学表型特征(包括生长特性、菌落形态、染色镜检、生化反应、药敏试验、毒性试验及代谢产物中乳酸含量测定)和遗传学特征(G+C Mol％测定)的比较。3、结果原代株与30代株特性检查见表7所列。
表7嗜酸乳杆菌9404原代株与30代特征稳定性比较
结论9404菌种连续传代30代，生物学和遗传学特性稳定。
9403，9405菌种生物学、遗传学特征比较
结论(1)两株菌生长特征、菌落形态及染色镜检符合乳杆菌特征。(2)两株菌均能产生乳酸。(3)9403株核糖、松三糖、甘露醇、山梨醇生化反应不符合伯杰氏手册规定的嗜酸乳杆菌特征。
9405株阿拉伯糖、核糖、松三糖、甘露醇生化反应不符合伯杰氏手册规定的嗜酸乳杆菌特征。(4)两株菌的DNA的G+C Mol％测定值高于伯杰氏手册规定的哮酸乳杆菌的G+C Mol％含量。
妇女阴道感染是妇女常见的疾病，是妇女阴道中微生态平衡失调所引起疾病，主要与性激素水平、性生活过度、安宫内节育器、以及抗菌治疗扰乱阴道正常菌群等有关。妇女阴道感染的发病率占妇女疾病中的比率较高，通过给予补充阴道益生菌，使益生菌在阴道中定植，从而阻止阴道中细菌的繁衍，起到治疗阴道炎的效果和作用，减轻和解脱妇女的疾苦。本发明具有极大的经济效益潜力和极高的开发价值。
实例一 嗜酸乳杆菌对人体阴道上皮细胞(VEC)的明显粘附通过这个试验，测试了嗜酸乳杆菌SL9404对人体阴道上皮细胞的粘附能力。
取人体阴道上皮细胞悬液及菌悬液各1ml，混合，37℃，2小时培养；涂片，室温干燥，甲醇固定10min，革兰氏染色，镜下观察细菌在人体阴道上皮细胞上粘附情况并计数。
得到的结果在表一中表示，表明嗜酸乳杆菌SL9404对人体阴道上皮细胞有很强的粘附能力，适于制备本发明的制剂。
表一 嗜酸乳杆菌SL9404株对VEC的粘附作用
实例二 嗜酸乳杆菌的抗大肠杆菌和白色念珠菌效应嗜酸乳杆菌SL9404以竞争方式干扰大肠杆菌和白色念珠菌在人体阴道上皮细胞的粘附的能力得到检验。
先取1ml大肠杆菌菌液或1ml白色念珠菌菌液与1ml VEC悬液混匀，37℃预培养30min后，再加入1ml乳杆菌菌液，混匀，继续37℃，2小时，按上述实例一试验方法镜下观察并计数。
得到的结果在表二中表示，表明嗜酸乳杆菌SL9404减少了大肠杆菌和白色念珠菌在人体阴道上皮细胞的粘附。
表二 嗜酸乳杆菌SL9404株对大肠杆菌44113或白色念珠菌10231在VEC粘附作用影响
实例三 嗜酸乳杆菌在体外对淋病奈瑟氏菌、大肠杆菌、白色念珠菌生长的抑制嗜酸乳杆菌菌液分别与三种致病菌菌液等量混合于三角瓶(9ml+9ml)构成试验组。同时每种菌液与等量2％小牛血清TPY培养液(9ml+9ml)混合构成对照组。试验组与对照组均置于37℃水浴培养至72小时或96小时。各试验组、对照组在培养起始(0小时)、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时各取样，分别测定试验组三角瓶中的嗜酸乳杆菌和三种致病菌的细菌生长浓度。同时也测定各对照组的菌量。
得到的结果在表三中表示，表明嗜酸乳杆菌SL9404在体外对淋病奈瑟氏菌的生长可较快抑制，亦可抑制致病性大肠杆菌的生长，对白色念珠菌也有一定作用。
表三 嗜酸乳杆菌SL9404株拮抗试验结果
实例四 嗜酸乳杆菌冻干菌粉经与赋形剂组合，制剂而成片剂的处方。
压片前上述物料需过40目筛，并充分混合后，在旋转压片机中，用椭圆形冲模压制成片剂，片重为1000mg的阴道用片剂。本片在数分钟之内即能软化。实例五 嗜酸乳杆菌冻干菌粉经与弱酸和碳酸盐配方，制剂成阴道泡腾片的处方。
制备上述片剂时，碳酸氢钠和碳酸钙需预先制成颗粒，在旋转式压片机中，用椭圆形冲模压制成阴道用片剂，片重为1000mg。经发泡量检查，结果在2ml水中20分钟发泡量大于6ml，小于10ml。实例六
将冻干菌粉装于铝箔小袋中，另将无菌生理盐水装于塑料小瓶中。使用时将冻干菌粉倒入上述塑料小瓶中，混匀后使用实例七 阴道软膏(5g管)
将羊毛脂、凡士灵预热到35-42℃，使全部融化，再加入胶态化二氧化硅和冻干菌粉搅拌，使均匀，装入软管内。实例八 乳杆菌喷霉剂(10g)的制备
制备上述喷雾剂时，先将冻干菌粉，PVP和无菌生理盐水配制成混悬液，灌入喷雾剂专用瓶中，将喷雾剂专用喷头密闭后，灌入二氧化碳。
权利要求
1.一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂，其特征在于该制剂是由嗜酸乳杆菌与药用赋形剂组成的。
2.一种如权利要求1所述的一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)制备嗜酸乳杆菌菌粉将阴道中分泌物进行分离、纯化后获得的嗜酸乳杆菌SL9404菌株于MRS琼脂斜面上划线传代，经37±1℃培养48h。选取饱满、色泽均匀、中等偏大的菌落，再次划线接种于茄子瓶内的MRS琼脂斜面上，经37±1℃培养48h。转种接入牛肉疱肉管，37±1℃培养20-50h。取1-4支疱肉管转入300ml牛奶发酵培养基或5-20％西红柿汁发酵培养基或牛奶+西红柿汁发酵培养基，37±1℃培养8-48h发酵培养，逐步放大至大罐发酵，离心，冷冻干燥后制得菌粉；(2)制备药剂按处方量称取嗜酸乳杆菌和药用赋形剂，按常规药物制剂方法制成各种制剂。
3.根据权利要求1所述的一种含嗜酸乳杆菌或其菌群的药物制剂，其特征在于其中所述的药用赋型剂为玉米淀粉、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠、糊精、乳糖、异乳糖、甘露醇、葡萄糖、维生素C、柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、酒石酸、富马酸、硼酸或酸性氨基酸类谷氨酸、天冬氨酸弱酸；微晶纤维素、羧甲基纤维素钠(钙)、羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、碳酸钙、碳酸氢钠、硬脂酸镁、羊毛脂、聚乙二醇；添加剂是指食用脱脂奶粉、维生素C或谷氨酸。
4.根据权利要求1所述的一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂，其特征在于该制剂为液体形式、膏体形式或固体形式，片剂、胶囊剂、散剂、霜剂、乳膏剂、栓剂或喷雾剂。
全文摘要
本发明提供了含嗜酸乳杆菌的药物制剂。该制剂是由嗜酸乳杆菌和药用赋形剂组成的。本发明的制剂为液体、固体、霜剂、乳膏剂、栓剂或喷雾剂。可用于治疗和预防阴道疾病和感染及淋病等。
文档编号A61K35/74GK1345589SQ00125469
公开日2002年4月24日 申请日期2000年9月28日 优先权日2000年9月28日
发明者吴刚, 刘京, 夏凌云, 高原, 杜育华 申请人:上海信谊药业有限公司
技术领域：
本发明涉及生物制剂，具体涉及一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂及制备方法。
寄生于正常阴道内的微生物群主要有细菌、真菌、原虫和病毒。它们主要栖居于粘膜的皱褶以及穹窿部，其次是宫颈。阴道内主要的常住菌有乳杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、B族链球菌、粪链球菌、支原体、白色念珠菌、消化球菌和类杆菌等。一般用定性和定量的方法测得健康妇女阴道排出物中活菌为102CFU/ml-109CFU/ml，厌氧菌与需氧菌之比为5∶1，其中乳杆菌是阴道正常菌群中最重要、数量最多的常住菌。正常情况下乳杆菌占阴道内所有常住菌的95％以上，是正常菌群，其量约每ml阴道分泌物中含≤104CFU。目前研究表明从健康妇女阴道内可分离出16种乳杆菌，分离率达50-80％，其中数量较多的是嗜酸乳杆菌(77.5％)、唾液乳杆菌和发酵乳杆菌，而糖元分解能力强的菌包括嗜酸乳杆菌、莱氏乳杆菌及唾液乳杆菌。乳杆菌在维持阴道微生态平衡中起重要作用。它可分解阴道粘膜上皮细胞内的糖元，产生一定量的乳酸进而维持阴道内较低的酸碱度，使阴道保持酸性环境，抑制有害菌的过度生长，有利于阴道的自净作用。同时它可提高机体的免疫功能，激活巨噬细胞，维持阴道局部的抗感染能力。
妇科窥器检查时阴道分泌物不会积聚成堆，其中很少有多形核中性白细胞，阴道分泌物涂片经革兰氏染色，上皮细胞边界清晰，涂片中有多量染色较深的革兰氏阳性乳杆菌。阴道壁存在着大量的乳杆菌可形成一种生物膜，起到了占位性保护作用。嗜酸乳杆菌是健康妇女阴道内微生物群中优势菌属的正常菌群菌株之一，数量最多，约占整个菌群的67％。它们对正常菌丛起着平衡作用，使宿主阴道微生态系统处于动态平衡，保持妇女阴道正常功能，免于遭受可能有致病性的内栖菌或者外源性致病菌的侵袭。
阴道炎发病与阴道微生态环境改变有关(1)阴道pH值的升高；(2)月经周期中性激素的变化；(3)阴道灌洗，灌洗不当使阴道局部受伤；(4)抗生素等应用杀灭了病菌的同时也抑制了阴道正常菌群；(5)同时伴有其它感染。全身性疾病、阴道局部损伤、卵巢功能底下或免疫抑制剂、抗肿瘤药物等失度使用均导致阴道菌群中一些常住菌乘虚而入，引起阴道感染。感染的主要来源是阴道微生物群中许多潜在性致病微生物比如大肠杆菌、类杆菌、消化球菌、金黄色葡萄球菌、B族链球菌、白色念珠菌、毛滴虫、支原体等。以上5种情况都可以破坏阴道的微生态平衡，致使致病菌繁殖而致阴道炎。另外，厌氧菌繁殖同时，有些氨类物质产生，也进一步碱化阴道，使阴道上皮脱落，阴道分泌物异常。而有些氨类物质也可进一步促进厌氧菌生长，加重阴道炎的症状，致使阴道微生态环境破坏。阴道炎是妇女常见、多发的疾病之一，与妇女阴道中微生态平衡有关。近十多年，由于阴道微生物基础理论研究的进展，为这类制剂的开发和应用提供了科学依据。
含乳杆菌的制剂，由于在制备的时候产生的物理碰撞而导致的死亡细菌细胞占一定比例，以及当它们在阴道腔中进一步扩散和它们的繁殖开始时，细菌细胞的数量进一步减少，因此，需要处理乳杆菌的适当品种，或辅料，和包含它们的制剂，以保证制剂有好的质量，给病人使用是真正有益的。另外，制剂应能够保持繁殖的嗜酸乳杆菌的数量恒定，并确保嗜酸乳杆菌在阴道腔内扩散时连续不变地作用。
申请人已发现可以得到对治疗阴道感染非常有效的嗜酸乳杆菌为基础的药物制剂，其提供了以下特征，可满足可能的最高水平(1)所选的嗜酸乳杆菌菌株必须有对阴道上皮的高亲和性，即粘附到阴道上皮细胞的高性能，这种性能使细菌能在生理和病理条件下与阴道粘膜相互作用，执行在上皮受体位点与病原有机体的竞争作用，并重建微生物体系和最适pH条件。(2)必须有高的干扰能力，竞争大肠杆菌和白色念珠菌在人体阴道上皮细胞上的粘附。(3)必须有抑制大肠杆菌、白色念珠菌、淋病奈瑟氏菌生长的高性能。
因此，本发明的目的是提供满足以上特征，达到可能的最高水平的嗜酸乳杆菌为基础的制剂，并适于有效地用于治疗阴道感染，如阴道炎、淋病等。
本发明提供了一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂，该制剂是由嗜酸乳杆菌与药用赋形剂组成的。
本发明使用的嗜酸乳杆菌是经体外人工发酵繁殖后制成的活菌。本菌种以西红柿汁作为培养基，经体外人工发酵、冷却、离心、加保护剂后冻干后制剂化，用于阴道感染的治疗，起到阴道微生态治疗作用。本菌种菌粉菌量以108-1010CFU/g为优，优选菌量大约为1011CFU/g。本嗜酸乳杆菌治疗剂量(菌量)应大于104CFU/g，优选菌量为106-107CFU/g。
本发明的另一目的是提供了一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂的制备方法，该方法包括下列步骤
1、制备嗜酸乳杆菌菌粉将阴道中分泌物进行分离、纯化后获得的嗜酸乳杆菌SL9404菌株于MRS琼脂斜面上划线传代，经37±1℃培养48h。选取饱满、色泽均匀、中等偏大的菌落，再次划线接种于茄子瓶内的MRS琼脂斜面上，经37±1℃培养48h。转种接入牛肉疱肉管，37±1℃培养20-50h。取1-4支疱肉管转入300ml牛奶发酵培养基或5-20％西红柿汁发酵培养基或牛奶+西红柿汁发酵培养基，37±1℃培养8-48h发酵培养，逐步放大至大罐发酵，离心，冷冻干燥后制得菌粉；2、制备药剂按处方量称取嗜酸乳杆菌和药用赋形剂，按常规药物制剂方法制成各种制剂。
本菌种的保藏以冷冻干燥的形式为优。
该菌种已于2000年6月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NOM200013。
本发明的含嗜酸乳杆菌制剂的作用机理主要有(1)维持酸性环境。阴道乳杆菌活菌制剂可以补充患者阴道内最重要的乳杆菌，它可分解阴道粘膜上皮中贮存的糖元产生乳酸、乙酸等酸性物质，同时它本身亦能产生乳酸，这对维持阴道的酸性环境，抑杀多种病原微生物起着重要作用。(2)占位保护作用。大量研究证明外源性的乳杆菌能牢固地粘附于阴道粘膜上皮，形成空间性占位保护作用。(3)直接拮抗作用。体内外的研究证实乳杆菌对阴道加德钠氏菌、滴虫、念珠菌、葡萄球菌等有直接的抑制作用。(4)产生多种抑菌物质。乳杆菌能分解阴道粘膜上皮中贮存的糖元，产生乳酸、乙酸等酸性物质，同时它本身亦能产生乳酸，维持阴道的酸性环境，抑杀多种病原微生物。(5)营养竞争。大量定植于阴道中的乳杆菌，营养处于竞争优势状态，不利于其他菌的生长。乳杆菌疗法是将乳杆菌活菌制剂放入到阴道中，使乳杆菌活菌回到机体内发挥其自然的生理功能，调整阴道菌群，维护生态平衡，使阴道菌群重新达到微生态平衡，达到防治疾病的目的。
本发明的制剂形式可以是液体形式、膏体形式或固体形式，如片剂、胶囊剂、散剂、霜剂、乳膏剂、栓剂或喷雾剂。
本发明制剂所述的常用药物赋形剂，包括玉米淀粉、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠、糊精、乳糖、异乳糖、甘露醇、葡萄糖、维生素C、柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、酒石酸、富马酸、硼酸、酸性氨基酸类(如谷氨酸、天冬氨酸)等弱酸、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠(钙)、羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、碳酸钙、碳酸氢钠、硬脂酸镁、羊毛脂、聚乙二醇等。添加剂是指食用脱脂奶粉、维生素C、谷氨酸等有关营养剂。
本发明的含嗜酸乳杆菌制剂可用于妇女阴道感染方面、淋病等疾病的治疗和预防。一、嗜酸乳杆菌对人阴道上皮细胞(VEC)粘附作用观察(中国药品生物制品检定所检测)(一)目的观察嗜酸乳杆菌SL9404对人体阴道上皮细胞的粘附作用。(二)材料与方法1、人体阴道上皮细胞(以下简称VEC)取自健康妇女，年龄40岁以下，医院妇科门诊体检正常。
刮取的VEC标本立即悬浮于20mlRPMI-1640中旋涡混合器震荡洗涤细胞3次，500rpm×3min，滤器反复抽滤，除去内源性细菌。血球计数板计数，调整VEC浓度105/ml。2、菌种(1)分离自健康妇女阴道嗜酸乳杆菌9403、SL9404和9405株菌(2)大肠杆菌CMCC44113株(3)白色念珠菌CMCC 10231株(4)德氏乳杆菌一株，分离自定菌生制品3、菌液制备将乳杆菌接种于MRS培养基、大肠杆菌与白色念珠菌接种于普通营养琼脂，37℃，18小时培养；试验前刮取菌苔，RPMI-1640洗涤细菌3次(3000×10min)，调整细胞浓度为1×108/ml。4、方法(1)粘附试验3株嗜酸乳杆菌粘附作用比较取VEC悬液及菌液各1ml，混合，37℃，2小时培养；涂片，室温干燥，甲醇固定10min，革兰氏染色，镜下观察细菌在VEC上粘附情况并计数。(2)乳杆菌对大肠杆菌、白色念珠菌粘附VEC的影响，分为以下三组进行第一组1ml乳杆菌菌液中加入1ml大肠杆菌菌液或1ml白色念珠菌菌液，再加入1mlVEC悬液混匀，37℃，2小时，按上述试验方法镜下观察并计数。
第二组1ml乳杆菌菌液与1mlVEC悬液混匀，37C先培养30min后，再加入1ml大肠杆菌菌液或1ml白色念珠菌菌液，混匀，继续37℃，2小时，同上述试验方法镜下观察并计数。5、计数镜下随机计数50个VEC上粘附的细菌数，计算平均数及标准差。(三)结果1、不同株嗜酸乳杆菌粘附作用的比较三株嗜酸乳杆菌对人体VEC的粘附作用是不同的，其中SL9404株对VEC有较明显的粘附作用，见表1，即为50个VEC的细菌粘附数(113.8±33.69)，而9403和9405株经与VEC培养37℃，2小时后，大量细胞分布在混合液中，在VBC上未见明显粘附。对照菌即由定菌生分离的德氏乳杆菌粘附作用也不明显。
表一 嗜酸乳杆菌SL9404株对VEC的粘附作用
2、嗜酸乳杆菌SL9404株对大肠杆菌、白色念珠菌粘附VEC的影响(1)大肠杆菌44113株及白色念珠菌10231、白157.14±54.06和31.84±11.65(见表2)。表2、第一组试验结果
(2)第一组试验结果(表2)标明，将嗜酸乳杆菌SL9404株与大肠杆菌44113株或白色念珠菌10231株同时培养于37℃后，SL9404株可以抑制其它两株菌的粘附作用，统计学处理有明显差异，且比对照德氏乳杆菌的抑制作用更为明显。(3)第二组试验结果表明，当时嗜酸乳杆菌9405株先与VEC培养后，再加入大肠杆菌44113或白色念株菌10231时(表3)，则嗜酸乳杆菌SL9404株会明显抑制后两株菌粘附VEC的作用。表3、第2组试验结果
(4)第三组试验结果表明，当大肠杆菌44113、白色念珠菌10231先与VEC培养后，再加入嗜酸乳杆菌SL9404株时，SL9404株对前两株菌粘附VEC也有明显的抑制作用(见表4)表4、嗜酸乳杆菌SL9404株对大肠肝菌44113或白色念珠菌10231在VEC粘附作用影响
(四)结论1、嗜酸乳杆菌SL9404株对人本阴道上皮细胞有明显的粘附作用。2、嗜酸乳杆菌SL9404株可以抑制大肠杆菌44113株和白色念珠菌10231株在人体阴道上皮细胞的粘附作用。3、嗜酸乳杆菌SL9404株对人体阴道上皮细胞粘附作用较分离自定菌生制剂的德氏乳杆菌更为明显。二、嗜酸乳杆菌体外拮抗3种致病菌的研究(中国生物制品检定所测定)(一)目的观察嗜酸乳杆菌SL9404在体外对三种常见阴道致病菌，即致病性大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌和白色念珠菌的拮抗作用。(二)材料与方法(1)菌种①嗜酸乳杆菌SL9404株由上海信谊药业公司提供。②三种致病菌均由中国医学细菌保藏管理中心提供致病性大肠杆菌CMCC44l13淋病奈瑟氏菌(以下简称淋球病)CMCC29403白色念珠菌CMCC10231(2)培养基①含2％小牛血清TPY培养液用于液体培养。②乳杆菌选择性培养基采用MRS琼脂培养基。③大肠杆菌选择性培养基采用MRS琼脂培养基。④白色念珠菌选择性培养基采用虎红琼脂培养基。⑤淋球病选择性培养基采用NG琼脂培养基。(3)菌液制备分别将各菌株新鲜培养物，用标准细菌比浊管比浊，并用2％小牛血清TPY培养液调整细菌浓度，嗜酸乳杆菌为1×107/ml，其他三种致病菌均为1×105/ml。(4)试验分组嗜酸乳杆菌菌液分别与三种致病菌菌液等量混合于三角瓶中(9ml+9ml)混合构成对照组。
试验组与对照组均置于37℃水溶液培养至72小时或96小时。(5)菌量测定上述各试验组、对照组在培养起始(0时)、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时各取样，分别测定试验组三角瓶中的嗜酸乳杆菌和三种致病菌的细菌生产浓度。同时也测定各对照组的菌量。菌量测定方法参照1995年版《中国生物制品规程》规定的活菌计数方法进行，并以菌量浓度的对数值统计入表。(三)结果与分析(1)表5显示嗜酸乳杆菌SL8404对三种常见阴道致病菌的拮抗作用，表明当SL9404株分别与大肠杆菌、淋球菌和白色念珠菌混合培养72-96小时生长良好；每ml活菌浓度均在1×108个菌以上各试验组中SL9404株的活菌数量与对照组近似。(2)表5显示试验组或对照组中三种致病菌培养至12小时，活菌浓度已明显增加，两组菌量相近。(3)表5显示试验组中的淋病菌培养至12小时以后，生长明显抑制，至24小时，每ml菌液活菌浓度已少于10个，而此时对照组的菌量仍与12小时的菌量保持一致。(4)表5显示对照组大肠杆菌培养72小时，细菌浓度仍每ml大于108。试验组中大肠杆菌培养至24小时，活菌浓度也在108/ml以上，与对照组相似，但24小时后生长明显抑制。在48小时每ml菌液中活菌量低于105。(5)表5也显示了试验组中白色念珠菌的生长也有一定抑制，从培养12小时至96小时，其活菌浓度较对照组低。
表五 嗜酸乳杆菌SL9404株拮抗试验结果
(四)结论①嗜酸乳杆菌SL9404株在体外对淋病奈瑟氏菌的生长可较快抑制。②嗜酸乳杆菌SL9404株在体外可抑制致病性大肠杆菌生长。③嗜酸乳杆菌SL9404株在体外对白色念珠菌有一定作用。三、阴道用乳酸杆菌泡腾片对大鼠阴道刺激试验(中科院上海药物所测定)雌性SD大鼠24只，分为3组，给药组、赋形剂组和未处理组，每组8只。连续7天阴道给药，每在观测行为和外阴部情况。末次给药后24小时取大鼠阴道组织肉眼检查并作病理组织学检查。实验结果表明，肉眼观察未见外阴部明显的异常反应，病理组织学检查无明显病变。1、实验目的观察阴道用乳酸杆菌泡腾片连续7天大鼠阴道给药后刺激反应。2、受试药物(1)名称阴道用乳酸杆菌泡腾片，白色橄榄状片剂。(2)规格1.7×107CFU/片(0.25g/片)(3)提供单位上海信谊药业有限公司(4)批号DM-032573、对照物(1)赋形剂0.25g/片，上海信谊药业有限公司提供。(2)批号DM032504、动物(1)来源、种属、品系试验前予处理雌性SD大鼠24只，由中国科学院上海实验动物中心提供。合格证中科动管第005号。单笼饲养，动物自由摄食，饮水。实验前在中科院上海药物研究所动物房饲养一周。(2)体重242±24g(3)性别雌性(4)每组动物物按体重随机分为3组，每组8只，即受试物组、赋形剂和未处理组。(5)动物房温度23±2℃5、剂量(1)剂量设置临床人用阴道用乳酸杆菌泡腾片106CFU/片/人。大鼠给药剂量定为1.7×107CFU/片/只。局部用药量约为人用剂量10倍。(2)每只动物给药容量0.25g/片/只。6、给药途径大鼠阴道给药7、方法试验时将受试物轻轻置入大鼠阴道内，在旁观察确保药物与阴道粘膜接触直至溶解。每天一次，每次一片，连续7天，每天观察大鼠行为和外阴部情况。末次给药后24小时解剖进行肉眼检查并取材作组织学镜检。8、观察指标(1)肉眼观察每天观察大鼠行为反应、阴道口情况。在末次给药后24小时处死大鼠，取出阴道组织，观察有无充血、红肿等刺激现象。(2)组织学检查每只大鼠阴道组织取样作病理组织学检查。(3)结果判断试验结果与未处理组进行比较判断。9、结果(1)肉眼观察连续7天大鼠给药后行为正常，肉眼观察外阴部无明显异常反应。末次给药后24小时，取出阴道组织，未见充血、红肿等刺激现象。
(2)组织学检查病理组织学观察阴道上皮均为复层鳞状上皮，结构正常，均未见异常变化。
10、结论阴道用乳酸杆菌泡腾片1.7×107CFU/片/只连续7天，给药后肉眼观察大鼠阴道无明显异常反应，病理组织学检查亦未见异常变化。阴道用乳酸杆菌泡腾片对大鼠阴道无刺激的反应。
四、大鼠阴道用乳酸杆菌泡腾片最大耐受量试验(由中科院药物所测定)雌性SD大鼠24只，分为4组。测试一次阴道给乳酸杆菌泡腾片的急性毒性。剂量为1.7×107、6.9×109CFU/片/只，另设赋形剂组和未处理组，共4个剂量组。连续14天观察行为反应并记录体重增长情况。给药后大鼠活动正常，无明显异常变化，无动物死亡。第15天解剖所有动物，肉眼检查内脏未见明显病变。大鼠对乳酸杆菌泡腾片最大耐受量>6.9×109DFU/只。按绝对量计算，为人用量106CFU/片/人的1000倍以上。
1、实验目的观察大鼠阴道一次接触受试物后所产生的急性毒性反应、死亡情况及体重的影响。
2、受试药物(1)名称阴道用乳酸杆菌泡腾片，白色橄榄状片剂。
(2)规格1.7×107、6.9×109CFU/片(0.25g/片)(3)提供单位上海信谊药业有限公司(4)批号DM—03257；DM—032553、对照物(1)赋形剂0.25g/片，上海信谊药业有限公司提供。
(2)批号DM032504、动物来源、种属、合格证雌性SD大鼠4只，由中国科学院上海实验动物中心提供。合格证中科动管第005号。试验前一周适应性饲养。饲料购自中英合资上海西普尔一必凯实验动物有限公司。自由取水、摄食，饲养温度为23±2℃。
5、剂量(1)剂量设置临床人用阴道用乳酸杆菌泡腾片106CFU/片/人(1g/片)。动物的有效剂量为106CFU/片/只。为观测毒性反应用尽可能大的剂量和考虑到制片的技术关系。设1.7×107CFU/片/只和6.9×109CFU/片/只。按局部用药量计算分别相当临床用量10和1000倍，并设赋形剂和未处理组。
(2)每只动物接受容量l片/只。
6、给药途径；大鼠阴道给药。
7、方法试验时先用生量盐水冲洗阴道，然后将受试物轻轻置入大鼠阴道内。在旁观察6小时确保药片与阴道粘膜接触。给药后即观察动物反应情况，若死亡动物即进行解剖，检查内脏。
8、观察指标(1)观察期14天(2)毒性反应观察检查大鼠外观、行为、进食、粪便、体重增长等情况，死亡动物进行尸解。第15天实验结束时，存活大鼠解剖，检查心、肺、肝、脾、肾等脏器病变。
9、结果大鼠阴道给于乳酸杆菌泡腾片后，外观行为、进食和粪便等情况，均未见异常变化，无动物死亡，大鼠体重增长给药组和赋形剂组与未处理组相似。体重增长情况列入下表表六、阴道用乳酸杆菌泡腾片对大鼠体重的影响
10、结果评价实验用泡腾片，所含的细菌为临床用量10或1000倍。因大鼠体积比人小得多，故泡腾片的大小也相应缩小，相对来说含菌密度较人用泡腾片要高。从制片技术上来说已经达到极限了。大鼠阴道给于乳酸杆菌泡腾片1.7×107、6.9×109CFU/片/只，连续观察14天，给药后大鼠活动正常，无明显异常变化，无动物死亡。给药组和赋形剂组大鼠体重增长与示处理组相似。大鼠阴道用乳酸杆菌泡腾片的最大耐受量大于6.9×109CFU/只。五、嗜酸乳杆菌SL9404株稳定性试验(由中国药品生物制品检定所测定)1、目的观察嗜酸乳杆菌SL9404株连续传代30代后的稳定性。2、材料与方法(1)菌株嗜酸乳杆菌SL9404株由上海信谊药业公司提供。(2)培养基①MRS液体培养基-传代用②MRS琼脂培养基-特征检查用③糖生化反应培养基-观察生化反应用④PYG液体培养基-测代谢产物用(3)方法菌种通过MRS液体培养基连续传代30代后，将原代株与30代株进行生物学表型特征(包括生长特性、菌落形态、染色镜检、生化反应、药敏试验、毒性试验及代谢产物中乳酸含量测定)和遗传学特征(G+C Mol％测定)的比较。3、结果原代株与30代株特性检查见表7所列。
表7嗜酸乳杆菌9404原代株与30代特征稳定性比较
结论9404菌种连续传代30代，生物学和遗传学特性稳定。
9403，9405菌种生物学、遗传学特征比较
结论(1)两株菌生长特征、菌落形态及染色镜检符合乳杆菌特征。(2)两株菌均能产生乳酸。(3)9403株核糖、松三糖、甘露醇、山梨醇生化反应不符合伯杰氏手册规定的嗜酸乳杆菌特征。
9405株阿拉伯糖、核糖、松三糖、甘露醇生化反应不符合伯杰氏手册规定的嗜酸乳杆菌特征。(4)两株菌的DNA的G+C Mol％测定值高于伯杰氏手册规定的哮酸乳杆菌的G+C Mol％含量。
妇女阴道感染是妇女常见的疾病，是妇女阴道中微生态平衡失调所引起疾病，主要与性激素水平、性生活过度、安宫内节育器、以及抗菌治疗扰乱阴道正常菌群等有关。妇女阴道感染的发病率占妇女疾病中的比率较高，通过给予补充阴道益生菌，使益生菌在阴道中定植，从而阻止阴道中细菌的繁衍，起到治疗阴道炎的效果和作用，减轻和解脱妇女的疾苦。本发明具有极大的经济效益潜力和极高的开发价值。
实例一 嗜酸乳杆菌对人体阴道上皮细胞(VEC)的明显粘附通过这个试验，测试了嗜酸乳杆菌SL9404对人体阴道上皮细胞的粘附能力。
取人体阴道上皮细胞悬液及菌悬液各1ml，混合，37℃，2小时培养；涂片，室温干燥，甲醇固定10min，革兰氏染色，镜下观察细菌在人体阴道上皮细胞上粘附情况并计数。
得到的结果在表一中表示，表明嗜酸乳杆菌SL9404对人体阴道上皮细胞有很强的粘附能力，适于制备本发明的制剂。
表一 嗜酸乳杆菌SL9404株对VEC的粘附作用
实例二 嗜酸乳杆菌的抗大肠杆菌和白色念珠菌效应嗜酸乳杆菌SL9404以竞争方式干扰大肠杆菌和白色念珠菌在人体阴道上皮细胞的粘附的能力得到检验。
先取1ml大肠杆菌菌液或1ml白色念珠菌菌液与1ml VEC悬液混匀，37℃预培养30min后，再加入1ml乳杆菌菌液，混匀，继续37℃，2小时，按上述实例一试验方法镜下观察并计数。
得到的结果在表二中表示，表明嗜酸乳杆菌SL9404减少了大肠杆菌和白色念珠菌在人体阴道上皮细胞的粘附。
表二 嗜酸乳杆菌SL9404株对大肠杆菌44113或白色念珠菌10231在VEC粘附作用影响
实例三 嗜酸乳杆菌在体外对淋病奈瑟氏菌、大肠杆菌、白色念珠菌生长的抑制嗜酸乳杆菌菌液分别与三种致病菌菌液等量混合于三角瓶(9ml+9ml)构成试验组。同时每种菌液与等量2％小牛血清TPY培养液(9ml+9ml)混合构成对照组。试验组与对照组均置于37℃水浴培养至72小时或96小时。各试验组、对照组在培养起始(0小时)、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时各取样，分别测定试验组三角瓶中的嗜酸乳杆菌和三种致病菌的细菌生长浓度。同时也测定各对照组的菌量。
得到的结果在表三中表示，表明嗜酸乳杆菌SL9404在体外对淋病奈瑟氏菌的生长可较快抑制，亦可抑制致病性大肠杆菌的生长，对白色念珠菌也有一定作用。
表三 嗜酸乳杆菌SL9404株拮抗试验结果
实例四 嗜酸乳杆菌冻干菌粉经与赋形剂组合，制剂而成片剂的处方。
压片前上述物料需过40目筛，并充分混合后，在旋转压片机中，用椭圆形冲模压制成片剂，片重为1000mg的阴道用片剂。本片在数分钟之内即能软化。实例五 嗜酸乳杆菌冻干菌粉经与弱酸和碳酸盐配方，制剂成阴道泡腾片的处方。
制备上述片剂时，碳酸氢钠和碳酸钙需预先制成颗粒，在旋转式压片机中，用椭圆形冲模压制成阴道用片剂，片重为1000mg。经发泡量检查，结果在2ml水中20分钟发泡量大于6ml，小于10ml。实例六
将冻干菌粉装于铝箔小袋中，另将无菌生理盐水装于塑料小瓶中。使用时将冻干菌粉倒入上述塑料小瓶中，混匀后使用实例七 阴道软膏(5g管)
将羊毛脂、凡士灵预热到35-42℃，使全部融化，再加入胶态化二氧化硅和冻干菌粉搅拌，使均匀，装入软管内。实例八 乳杆菌喷霉剂(10g)的制备
制备上述喷雾剂时，先将冻干菌粉，PVP和无菌生理盐水配制成混悬液，灌入喷雾剂专用瓶中，将喷雾剂专用喷头密闭后，灌入二氧化碳。
权利要求
1.一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂，其特征在于该制剂是由嗜酸乳杆菌与药用赋形剂组成的。
2.一种如权利要求1所述的一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)制备嗜酸乳杆菌菌粉将阴道中分泌物进行分离、纯化后获得的嗜酸乳杆菌SL9404菌株于MRS琼脂斜面上划线传代，经37±1℃培养48h。选取饱满、色泽均匀、中等偏大的菌落，再次划线接种于茄子瓶内的MRS琼脂斜面上，经37±1℃培养48h。转种接入牛肉疱肉管，37±1℃培养20-50h。取1-4支疱肉管转入300ml牛奶发酵培养基或5-20％西红柿汁发酵培养基或牛奶+西红柿汁发酵培养基，37±1℃培养8-48h发酵培养，逐步放大至大罐发酵，离心，冷冻干燥后制得菌粉；(2)制备药剂按处方量称取嗜酸乳杆菌和药用赋形剂，按常规药物制剂方法制成各种制剂。
3.根据权利要求1所述的一种含嗜酸乳杆菌或其菌群的药物制剂，其特征在于其中所述的药用赋型剂为玉米淀粉、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠、糊精、乳糖、异乳糖、甘露醇、葡萄糖、维生素C、柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、酒石酸、富马酸、硼酸或酸性氨基酸类谷氨酸、天冬氨酸弱酸；微晶纤维素、羧甲基纤维素钠(钙)、羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、碳酸钙、碳酸氢钠、硬脂酸镁、羊毛脂、聚乙二醇；添加剂是指食用脱脂奶粉、维生素C或谷氨酸。
4.根据权利要求1所述的一种含嗜酸乳杆菌的药物制剂，其特征在于该制剂为液体形式、膏体形式或固体形式，片剂、胶囊剂、散剂、霜剂、乳膏剂、栓剂或喷雾剂。
全文摘要
本发明提供了含嗜酸乳杆菌的药物制剂。该制剂是由嗜酸乳杆菌和药用赋形剂组成的。本发明的制剂为液体、固体、霜剂、乳膏剂、栓剂或喷雾剂。可用于治疗和预防阴道疾病和感染及淋病等。
文档编号A61K35/74GK1345589SQ00125469
公开日2002年4月24日 申请日期2000年9月28日 优先权日2000年9月28日
发明者吴刚, 刘京, 夏凌云, 高原, 杜育华 申请人:上海信谊药业有限公司
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