氟塞米的适应症的制作方法
专利名称：氟塞米的适应症的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫抑制及调节剂，更具体地说免疫抑制剂及调节剂氟塞米在治疗器官移植后的排异反应的药物中应用。
器官移植逐渐成为在医疗中的一个重要手段，它越来越被人们认识并加以肯定，目前器官移植后的排异反应尚未能得到很好解决，因此，直接影响了该项手段的发展，随着外科技术的完善，离体脏器活力有效保存方法的建立，以及对控制移植后排异反应的措施与药物的研制，一定会使器官移植进入新的阶段。
器官移植在我国开展已有二十多年的历史，主要以肾脏移植为主。我国现有2万多肾移植患者，并以每年超过2000例速度递增。肾脏移植带动了其它大器官的移植，包括肝脏移植、心脏移植、肺移植和心-肺联合移植、胰腺移植和胰-肾联合移植、小肠移植和肝-小肠联合移植以及脾脏移植等。就我国的情况看，近几年来肾脏移植发展较快，但其它大器官移植与国际上相比尚存在较大差距。关键问题，就是我们迄今仍未接受“脑死亡”这一重要的科学概念，致使可供移植的器官未得到充分利用。
影响器官移植的主要因素是排异反应，随着环孢素以及其它免疫抑制剂的问世，采用环孢素、皮质激素和硫唑嘌呤的三联疗法，急性排拆反应得到较好的控制，但毒副作用较多较重，同时慢性排斥反应无法克服，并已成为影响移植的主要因素，70％存活5年以上的肾移植病人失肾原因为慢性排异反应。目前无任何可靠的治疗方法能控制慢性排异反应的进展，控制慢性排异反应成为世界性难题。
本发明目的提供一种新型免疫抑制和调节剂，利用它的免疫抑制和调节作用以控制器官移植后的急性排异反应与慢性排异反应。
本发明为氟塞米在治疗器官移植后的排异反应的药物中应用。
一种新的免疫抑制调节剂——氟塞米它的化学结构如下 化学名称为N-(对三氟甲苯)-2-腈基-三-羟基-2-丁烯酰胺氟塞米是来氟米特(HWA)的代谢产物，它可以通过HPLC分离而得到，根据来氟米特的代谢的特点可以分别在不同脏器中分离获得，从而可以看出氟塞米在体内的吸收，分布排泄，以及与蛋白结合等，了解其动态变化的规律与特点给临床合理用药提供参考。
本发明采用氟塞米进行对人体外周淋巴细胞单向混合反应的抑制作用，结果发现氟塞米在不同浓度下抑制单向混合淋巴细胞反应比较理想而对淋巴细胞无毒副作用。
人体外周白细胞分离取正常人体40ml放入50ml试管中，由底部加入Ficoll-Hypague(Pharmacia，Piscataway，NJ)10ml，1600转/分钟离心20分钟，吸取淋巴细胞层，由PBS洗涤三次后，将分离的淋巴细胞混悬于含有10％灭活小牛血清(FBS，GLBCO)及100u/ml青/链霉素的RPMI1644(GIBCO，Grand Lsand，NY)中备用。
T淋巴细胞分离在进行混合淋巴细胞反应试验前，将白细胞混悬于含有10％灭活的人血清(Diognoctic Inc Meguan，WI)RPMI1644中，以尼龙羊毛柱(nylon wool column)及抗白细胞11b抗体(Anti-Leu Ab，Becton DickinsonMountain View，CA)，加补体(Pel-Free，Brow Derr，WL)。分别去除巨噬细胞，B-细胞，中性杀伤细胞，单核细胞，得到的混悬液95％为CD3为阳性T细胞，其余为B细胞。
混合淋巴细胞反应(MLR)将分离的T细胞每孔2×105与等量的伽玛射线(3000拉德)照射过的同种异体淋巴细胞混合培养，并加入不同剂量氟塞米及环孢霉素。
此实验用U型底96孔板进行，每剂量组试验重复5次(孔)。培养6天后，于每孔中加入1μCi的3H标记胸腺嘧啶，检测放射活性。
计算公式为％抑制＝[(试验标本放射活性-背景放射活性)/(对照标本放射活性-背景放射活性)]×100％药品浓度氟塞米的浓度分别为100μM，75μM，50μM及25μM，环孢霉素浓度为90nM。结果见表1表1氟塞米抑制单向混合淋巴细胞反应
其中，背景为100％抑制，无任何药物抑制率为0％。
当氟塞米浓度为100μM，75μM，50μM及25μM时，单向淋巴细胞反应抑制率分别为90.20±11.66，84.21±8.27，66.50±16.20，11.57±47.29，蓝染色证实淋巴细胞无破坏，故以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。鉴于淋巴细胞在器官移植后的急性排异反应中，对移植物抗原的反应起着重要作用，而氟塞米于安全浓度范围内对淋巴细胞反应有较强的抑制作用。因此氟塞米有希望成为安全有效的免疫抑制剂，可有望成为在治疗器官移植后的排异反应的药物。以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。
氟塞米对大鼠小肠移植的免疫抑制作用11只Lewis大鼠接受来自供体Lewis/Brown-Norway杂交的F1子代(LBN F1)大鼠的原位小肠移植(单一排异模型)；12只(LBN.FI)大鼠接受来自供体Brown-Norway大鼠的原位小肠移植(单一GVHD)模型，每种移植模型的大鼠分别分成第一组未治疗组；第二组氟塞米5mg/kg/d×14天组，监测受体存活时间和死亡原因(包括排异和GVHD)。
从表2显示来氟米特5mg/kg/d灌胃给药7天到28天均明显延长小肠移植大鼠的存活时间(表2)，与对照组相比，给予氟塞米进一步延长存活时间(表2)。在单一急性排异反应和GVHD的半同种模型中氟塞米无限期延长所有受体的存活(表2)，按设计的剂量给药，在这些受体中未观察到明显的毒副作用。
尽管最近在临床和实验受体的免疫抑制方面有明显进步，但急性和慢性排异均阻碍小肠移植的成功，在一系列新出现的免疫抑制剂中，氟塞米显示了在实验和临床移植方面的前景，氟塞米抑制B淋巴细胞和浆细胞的增殖以及T-淋巴细胞的反应，在全同种模型(BN-L)和单一GVHD模型(LBN-Lewis)中，氟塞米延长受体存活，表明其对T-淋巴细胞占优势的急性排异反应的作用效果，在大鼠心脏移植模型中显示氟塞米同样的免疫抑制作用，此外，本研究显示氟塞米在小肠移植中的作用效果与其它重要的免疫抑制剂相同或优于它们，如环孢素A、FK506，雷帕霉素18-deoxyspergualin。
在小肠移植中，氟塞米对GVHD有很好的效果与对过路淋巴细胞有一定的抑制作用有关，氟塞米对大鼠小肠移植的作用与在其它药物中发现的作用相同或超过它们，包括雷帕霉素和RS-61443。环孢素A和FK506抑制和改善大鼠小肠移植的作用尚存在争议，因此，氟塞米似乎是少数能同时明显抑制该模型急性排异和GVHD的药物之一。
总之，氟塞米静脉给药不仅明显延长小肠移植大鼠的存活时间，已有研究表明氟塞米与环孢素有协同免疫抑制作用并且毒性低，因此氟塞米有可能成为用于小肠移植的有效替代药物。
表2氟塞米对大鼠小肠移植模型的抑制作用
与N()R()组比较明显异常，P＜0.05-0.000L，Mantel-Cox方法+处死时体重正常，移植物组织学检查正常￥处死时体重正常，无GVHD的表现本发明优点1、氟塞米在安全浓度范围内对淋巴细胞反应有较强的抑制作用。
2、氟塞米抑制B-淋巴细胞和浆细胞的增殖及T-淋巴细胞的反应，延长受体存活时间。
3、氟塞米的毒性低将成为用于小肠移植的有效替代药物。
4、氟塞米能溶于生理盐水等多种液体，从而可制成针剂及喷雾剂。
下面实施例对本发明作进一步阐述，但不作任何限制。
实施例1 氟塞米对人体外周淋巴细胞单向混合反应的抑制作用。
受试药物氟塞米提供单位欣凯医药化工中间体(上海)有限公司批号CKA、含量＞99％溶剂0.9生理盐水或细胞保存液。
配制方法氟塞米加入细胞保存液中，配成25μM，50μM，100μM的溶液，试验方法人体外周白细胞分离取正常人体40ml放入50ml试管中，由底部加入Ficoll-Hypague(Pharmacia，Piscataway，NJ)10ml，1600转/分钟离心20分钟，吸取淋巴细胞层，由PBS洗涤三次后，将分离的淋巴细胞混悬于含有10％灭活小牛血清(FBS，GLBCO)及100u/ml青/链霉素的RPMI1644(GIBCO，Grand Lsand，NY)中备用。
T淋巴细胞分离在进行混合淋巴细胞反应试验前，将白细胞混悬于含有10％灭活的人血清(Diognoctic Inc Meguan，WI)RPMI1644中，以尼龙羊毛柱(nylon wool column)及抗白细胞11b抗体(Anti-Leu Ab，Becton DickinsonMountain View，CA)，加补体(Pel-Free，Brow Derr，WL)。分别去除巨噬细胞，B-细胞，中性杀伤细胞，单核细胞，得到的混悬液95％为CD3为阳性T细胞，其余为B细胞。
混合淋巴细胞反应(MLR)将分离的T细胞每孔2×105与等量的伽玛射线(3000拉德)照射过的同种异体淋巴细胞混合培养，并加入不同剂量氟塞米及环孢霉素。
此实验用U型底96孔板进行，每剂量组试验重复5次(孔)。培养6天后，于每孔中加入1μCi的3H标记胸腺嘧啶，检测放射活性。
计算公式为％抑制＝[(试验标本放射活性-背景放射活性)/(对照标本放射活性-背景放射活性)]×100％药品浓度氟塞米的浓度分别为100μM，75μM，50μM及25μM，环孢霉素浓度为90nM。
结果见表1表1氟塞米抑制单向混合淋巴细胞反应
其中，背景为100％抑制，无任何药物抑制率为0％。当氟塞米浓度为100μM，75μM，50μM及25μM时，单向淋巴细胞反应抑制率分别为90.20±11.66，84.21±8.27，66.50±16.20，11.57±47.29，蓝染色证实淋巴细胞无破坏，故以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。鉴于淋巴细胞在器官移植后的急性排异反应中，对移植物抗原的反应起着重要作用，而氟塞米于安全浓度范围内对淋巴细胞反应有较强的抑制作用。因此氟塞米有希望成为安全有效的免疫抑制剂，可有望成为在治疗器官移植后的排异反应的药物。以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。
实施例2 氟塞米及来氟米特对同种大鼠全小肠移植受体存活的影响氟塞米对大鼠小肠移植的免疫抑制作用材料与方法34只成年Lewis大鼠接受来自供体BN大鼠的全小肠原位移植，受体随机分组，移植后分别灌胃给来氟米特治疗；第1组(NO RX)不给予免疫抑制治疗；第2组(LEF-5×7)LEF 5mg/kg/d×7天；第3组(LEF-5×14)，LFF 5mg/kg/天×14天；第4组(LEF-5×28)LEF 5mg/d×28天；其它组通过植入的微型泵静脉给予氟塞米，包括氟塞米5×7(氟塞米5mg/kg/d静脉注射×7天)和氟塞米5×14(氟塞米5mg/kg/d静脉注射×14天)。
11只Lcwis大鼠接受来自供体Lewis/Brown-Norway杂交的F1子代(LBN F1)大鼠的原位小肠移植(单一排异模型)；12只(LBN.FI)大鼠接受来自供体Brown-Norway大鼠的原位小肠移植(单一GVHD)模型，每种移植模型的大鼠分别分成第一组未治疗组；第二组氟塞米5mg/kg/d×14天组，监测受体存活时间和死亡原因(包括排异和GVHD)。
从表1显示来氟米特5mg/kg/d灌胃给药7天到28天均明显延长小肠移植大鼠的存活时间(表1)。与对照组相比，给予氟塞米进一步延长存活时间(表1)。在单一急性排异反应和GVHD的半同种模型中氟塞米无限期延长所有受体的存活(表1)，按设计的剂量给药，在这些受体中未观察到明显的毒副作用。
尽管最近在临床和实验受体的免疫抑制方面有明显进步，但急性和慢性排异均阻碍小肠移植的成功，在一系列新出现的免疫抑制剂中，氟塞米显示了在实验和临床移植方面的前景，氟塞米抑制B淋巴细胞和浆细胞的增殖以及T-淋巴细胞的反应，在全同种模型(BN-L)和单一GVHD模型(LBN-Lewis)中，氟塞米延长受体存活，表明其对T-淋巴细胞占优势的急性排异反应的作用效果，在大鼠心脏移植模型中显示氟塞米同样的免疫抑制作用，此外，本研究显示氟塞米在小肠移植中的作用效果与其它重要的免疫抑制剂相同或优于它们，如环孢素A、FK506，雷帕霉素18-deoxyspergualin。
在小肠移植中，氟塞米对GVHD有很好的效果与对过路淋巴细胞有一定的抑制作用有关，氟塞米对大鼠小肠移植的作用与在其它药物中发现的作用相同或超过它们，包括雷帕霉素和RS-61443。环孢素A和FK506抑制和改善大鼠小肠移植的作用尚存在争议，因此，氟塞米似乎是少数能同时明显抑制该模型急性排异和GVHD的药物之一。
总之，氟塞米静脉给药不仅明显延长小肠移植大鼠的存活时间，已有研究表明氟塞米与环孢素有协同免疫抑制作用并且毒性低，因此氟塞米有可能成为用于小肠移植的有效替代药物。
表2氟塞米对大鼠小肠移植模型的抑制作用
与N()R()组比较明显异常，P＜0.05-0.000L，Mantel-Cox方法+处死时体重正常，移植物组织学检查正常￥处死时体重正常，无GVHD的表现
权利要求
1.一种免疫抑制及调节剂氟塞米在治疗器官移植后的排异反应的药物中应用。
全文摘要
本发明提供一种氟塞米的适应性,氟塞米是新型免疫抑制剂来氟米特的有效代谢物,氟塞米对人体外周淋巴细胞单向混合反应具有抑制作用,当其浓度为75－100μM(20.25μg/ml－27μg/ml)对淋巴细胞混合反应抑制率>84%;当浓度为50μM(13.5μg/ml)时,淋巴细胞混合反应抑制率>50%。鉴于淋巴细胞在器官移植后的急性排异反应中,对移植物抗原的反应起着很重要作用,故氟塞米可应用于治疗器官移植后的排异反应。
文档编号A61K31/275GK1350847SQ0012587
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月27日 优先权日2000年10月27日
发明者肖飞 申请人:欣凯医药化工中间体(上海)有限公司
技术领域：
本发明涉及免疫抑制及调节剂，更具体地说免疫抑制剂及调节剂氟塞米在治疗器官移植后的排异反应的药物中应用。
器官移植逐渐成为在医疗中的一个重要手段，它越来越被人们认识并加以肯定，目前器官移植后的排异反应尚未能得到很好解决，因此，直接影响了该项手段的发展，随着外科技术的完善，离体脏器活力有效保存方法的建立，以及对控制移植后排异反应的措施与药物的研制，一定会使器官移植进入新的阶段。
器官移植在我国开展已有二十多年的历史，主要以肾脏移植为主。我国现有2万多肾移植患者，并以每年超过2000例速度递增。肾脏移植带动了其它大器官的移植，包括肝脏移植、心脏移植、肺移植和心-肺联合移植、胰腺移植和胰-肾联合移植、小肠移植和肝-小肠联合移植以及脾脏移植等。就我国的情况看，近几年来肾脏移植发展较快，但其它大器官移植与国际上相比尚存在较大差距。关键问题，就是我们迄今仍未接受“脑死亡”这一重要的科学概念，致使可供移植的器官未得到充分利用。
影响器官移植的主要因素是排异反应，随着环孢素以及其它免疫抑制剂的问世，采用环孢素、皮质激素和硫唑嘌呤的三联疗法，急性排拆反应得到较好的控制，但毒副作用较多较重，同时慢性排斥反应无法克服，并已成为影响移植的主要因素，70％存活5年以上的肾移植病人失肾原因为慢性排异反应。目前无任何可靠的治疗方法能控制慢性排异反应的进展，控制慢性排异反应成为世界性难题。
本发明目的提供一种新型免疫抑制和调节剂，利用它的免疫抑制和调节作用以控制器官移植后的急性排异反应与慢性排异反应。
本发明为氟塞米在治疗器官移植后的排异反应的药物中应用。
一种新的免疫抑制调节剂——氟塞米它的化学结构如下 化学名称为N-(对三氟甲苯)-2-腈基-三-羟基-2-丁烯酰胺氟塞米是来氟米特(HWA)的代谢产物，它可以通过HPLC分离而得到，根据来氟米特的代谢的特点可以分别在不同脏器中分离获得，从而可以看出氟塞米在体内的吸收，分布排泄，以及与蛋白结合等，了解其动态变化的规律与特点给临床合理用药提供参考。
本发明采用氟塞米进行对人体外周淋巴细胞单向混合反应的抑制作用，结果发现氟塞米在不同浓度下抑制单向混合淋巴细胞反应比较理想而对淋巴细胞无毒副作用。
人体外周白细胞分离取正常人体40ml放入50ml试管中，由底部加入Ficoll-Hypague(Pharmacia，Piscataway，NJ)10ml，1600转/分钟离心20分钟，吸取淋巴细胞层，由PBS洗涤三次后，将分离的淋巴细胞混悬于含有10％灭活小牛血清(FBS，GLBCO)及100u/ml青/链霉素的RPMI1644(GIBCO，Grand Lsand，NY)中备用。
T淋巴细胞分离在进行混合淋巴细胞反应试验前，将白细胞混悬于含有10％灭活的人血清(Diognoctic Inc Meguan，WI)RPMI1644中，以尼龙羊毛柱(nylon wool column)及抗白细胞11b抗体(Anti-Leu Ab，Becton DickinsonMountain View，CA)，加补体(Pel-Free，Brow Derr，WL)。分别去除巨噬细胞，B-细胞，中性杀伤细胞，单核细胞，得到的混悬液95％为CD3为阳性T细胞，其余为B细胞。
混合淋巴细胞反应(MLR)将分离的T细胞每孔2×105与等量的伽玛射线(3000拉德)照射过的同种异体淋巴细胞混合培养，并加入不同剂量氟塞米及环孢霉素。
此实验用U型底96孔板进行，每剂量组试验重复5次(孔)。培养6天后，于每孔中加入1μCi的3H标记胸腺嘧啶，检测放射活性。
计算公式为％抑制＝[(试验标本放射活性-背景放射活性)/(对照标本放射活性-背景放射活性)]×100％药品浓度氟塞米的浓度分别为100μM，75μM，50μM及25μM，环孢霉素浓度为90nM。结果见表1表1氟塞米抑制单向混合淋巴细胞反应
其中，背景为100％抑制，无任何药物抑制率为0％。
当氟塞米浓度为100μM，75μM，50μM及25μM时，单向淋巴细胞反应抑制率分别为90.20±11.66，84.21±8.27，66.50±16.20，11.57±47.29，蓝染色证实淋巴细胞无破坏，故以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。鉴于淋巴细胞在器官移植后的急性排异反应中，对移植物抗原的反应起着重要作用，而氟塞米于安全浓度范围内对淋巴细胞反应有较强的抑制作用。因此氟塞米有希望成为安全有效的免疫抑制剂，可有望成为在治疗器官移植后的排异反应的药物。以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。
氟塞米对大鼠小肠移植的免疫抑制作用11只Lewis大鼠接受来自供体Lewis/Brown-Norway杂交的F1子代(LBN F1)大鼠的原位小肠移植(单一排异模型)；12只(LBN.FI)大鼠接受来自供体Brown-Norway大鼠的原位小肠移植(单一GVHD)模型，每种移植模型的大鼠分别分成第一组未治疗组；第二组氟塞米5mg/kg/d×14天组，监测受体存活时间和死亡原因(包括排异和GVHD)。
从表2显示来氟米特5mg/kg/d灌胃给药7天到28天均明显延长小肠移植大鼠的存活时间(表2)，与对照组相比，给予氟塞米进一步延长存活时间(表2)。在单一急性排异反应和GVHD的半同种模型中氟塞米无限期延长所有受体的存活(表2)，按设计的剂量给药，在这些受体中未观察到明显的毒副作用。
尽管最近在临床和实验受体的免疫抑制方面有明显进步，但急性和慢性排异均阻碍小肠移植的成功，在一系列新出现的免疫抑制剂中，氟塞米显示了在实验和临床移植方面的前景，氟塞米抑制B淋巴细胞和浆细胞的增殖以及T-淋巴细胞的反应，在全同种模型(BN-L)和单一GVHD模型(LBN-Lewis)中，氟塞米延长受体存活，表明其对T-淋巴细胞占优势的急性排异反应的作用效果，在大鼠心脏移植模型中显示氟塞米同样的免疫抑制作用，此外，本研究显示氟塞米在小肠移植中的作用效果与其它重要的免疫抑制剂相同或优于它们，如环孢素A、FK506，雷帕霉素18-deoxyspergualin。
在小肠移植中，氟塞米对GVHD有很好的效果与对过路淋巴细胞有一定的抑制作用有关，氟塞米对大鼠小肠移植的作用与在其它药物中发现的作用相同或超过它们，包括雷帕霉素和RS-61443。环孢素A和FK506抑制和改善大鼠小肠移植的作用尚存在争议，因此，氟塞米似乎是少数能同时明显抑制该模型急性排异和GVHD的药物之一。
总之，氟塞米静脉给药不仅明显延长小肠移植大鼠的存活时间，已有研究表明氟塞米与环孢素有协同免疫抑制作用并且毒性低，因此氟塞米有可能成为用于小肠移植的有效替代药物。
表2氟塞米对大鼠小肠移植模型的抑制作用
与N()R()组比较明显异常，P＜0.05-0.000L，Mantel-Cox方法+处死时体重正常，移植物组织学检查正常￥处死时体重正常，无GVHD的表现本发明优点1、氟塞米在安全浓度范围内对淋巴细胞反应有较强的抑制作用。
2、氟塞米抑制B-淋巴细胞和浆细胞的增殖及T-淋巴细胞的反应，延长受体存活时间。
3、氟塞米的毒性低将成为用于小肠移植的有效替代药物。
4、氟塞米能溶于生理盐水等多种液体，从而可制成针剂及喷雾剂。
下面实施例对本发明作进一步阐述，但不作任何限制。
实施例1 氟塞米对人体外周淋巴细胞单向混合反应的抑制作用。
受试药物氟塞米提供单位欣凯医药化工中间体(上海)有限公司批号CKA、含量＞99％溶剂0.9生理盐水或细胞保存液。
配制方法氟塞米加入细胞保存液中，配成25μM，50μM，100μM的溶液，试验方法人体外周白细胞分离取正常人体40ml放入50ml试管中，由底部加入Ficoll-Hypague(Pharmacia，Piscataway，NJ)10ml，1600转/分钟离心20分钟，吸取淋巴细胞层，由PBS洗涤三次后，将分离的淋巴细胞混悬于含有10％灭活小牛血清(FBS，GLBCO)及100u/ml青/链霉素的RPMI1644(GIBCO，Grand Lsand，NY)中备用。
T淋巴细胞分离在进行混合淋巴细胞反应试验前，将白细胞混悬于含有10％灭活的人血清(Diognoctic Inc Meguan，WI)RPMI1644中，以尼龙羊毛柱(nylon wool column)及抗白细胞11b抗体(Anti-Leu Ab，Becton DickinsonMountain View，CA)，加补体(Pel-Free，Brow Derr，WL)。分别去除巨噬细胞，B-细胞，中性杀伤细胞，单核细胞，得到的混悬液95％为CD3为阳性T细胞，其余为B细胞。
混合淋巴细胞反应(MLR)将分离的T细胞每孔2×105与等量的伽玛射线(3000拉德)照射过的同种异体淋巴细胞混合培养，并加入不同剂量氟塞米及环孢霉素。
此实验用U型底96孔板进行，每剂量组试验重复5次(孔)。培养6天后，于每孔中加入1μCi的3H标记胸腺嘧啶，检测放射活性。
计算公式为％抑制＝[(试验标本放射活性-背景放射活性)/(对照标本放射活性-背景放射活性)]×100％药品浓度氟塞米的浓度分别为100μM，75μM，50μM及25μM，环孢霉素浓度为90nM。
结果见表1表1氟塞米抑制单向混合淋巴细胞反应
其中，背景为100％抑制，无任何药物抑制率为0％。当氟塞米浓度为100μM，75μM，50μM及25μM时，单向淋巴细胞反应抑制率分别为90.20±11.66，84.21±8.27，66.50±16.20，11.57±47.29，蓝染色证实淋巴细胞无破坏，故以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。鉴于淋巴细胞在器官移植后的急性排异反应中，对移植物抗原的反应起着重要作用，而氟塞米于安全浓度范围内对淋巴细胞反应有较强的抑制作用。因此氟塞米有希望成为安全有效的免疫抑制剂，可有望成为在治疗器官移植后的排异反应的药物。以上浓度对淋巴细胞无毒性作用。
实施例2 氟塞米及来氟米特对同种大鼠全小肠移植受体存活的影响氟塞米对大鼠小肠移植的免疫抑制作用材料与方法34只成年Lewis大鼠接受来自供体BN大鼠的全小肠原位移植，受体随机分组，移植后分别灌胃给来氟米特治疗；第1组(NO RX)不给予免疫抑制治疗；第2组(LEF-5×7)LEF 5mg/kg/d×7天；第3组(LEF-5×14)，LFF 5mg/kg/天×14天；第4组(LEF-5×28)LEF 5mg/d×28天；其它组通过植入的微型泵静脉给予氟塞米，包括氟塞米5×7(氟塞米5mg/kg/d静脉注射×7天)和氟塞米5×14(氟塞米5mg/kg/d静脉注射×14天)。
11只Lcwis大鼠接受来自供体Lewis/Brown-Norway杂交的F1子代(LBN F1)大鼠的原位小肠移植(单一排异模型)；12只(LBN.FI)大鼠接受来自供体Brown-Norway大鼠的原位小肠移植(单一GVHD)模型，每种移植模型的大鼠分别分成第一组未治疗组；第二组氟塞米5mg/kg/d×14天组，监测受体存活时间和死亡原因(包括排异和GVHD)。
从表1显示来氟米特5mg/kg/d灌胃给药7天到28天均明显延长小肠移植大鼠的存活时间(表1)。与对照组相比，给予氟塞米进一步延长存活时间(表1)。在单一急性排异反应和GVHD的半同种模型中氟塞米无限期延长所有受体的存活(表1)，按设计的剂量给药，在这些受体中未观察到明显的毒副作用。
尽管最近在临床和实验受体的免疫抑制方面有明显进步，但急性和慢性排异均阻碍小肠移植的成功，在一系列新出现的免疫抑制剂中，氟塞米显示了在实验和临床移植方面的前景，氟塞米抑制B淋巴细胞和浆细胞的增殖以及T-淋巴细胞的反应，在全同种模型(BN-L)和单一GVHD模型(LBN-Lewis)中，氟塞米延长受体存活，表明其对T-淋巴细胞占优势的急性排异反应的作用效果，在大鼠心脏移植模型中显示氟塞米同样的免疫抑制作用，此外，本研究显示氟塞米在小肠移植中的作用效果与其它重要的免疫抑制剂相同或优于它们，如环孢素A、FK506，雷帕霉素18-deoxyspergualin。
在小肠移植中，氟塞米对GVHD有很好的效果与对过路淋巴细胞有一定的抑制作用有关，氟塞米对大鼠小肠移植的作用与在其它药物中发现的作用相同或超过它们，包括雷帕霉素和RS-61443。环孢素A和FK506抑制和改善大鼠小肠移植的作用尚存在争议，因此，氟塞米似乎是少数能同时明显抑制该模型急性排异和GVHD的药物之一。
总之，氟塞米静脉给药不仅明显延长小肠移植大鼠的存活时间，已有研究表明氟塞米与环孢素有协同免疫抑制作用并且毒性低，因此氟塞米有可能成为用于小肠移植的有效替代药物。
表2氟塞米对大鼠小肠移植模型的抑制作用
与N()R()组比较明显异常，P＜0.05-0.000L，Mantel-Cox方法+处死时体重正常，移植物组织学检查正常￥处死时体重正常，无GVHD的表现
权利要求
1.一种免疫抑制及调节剂氟塞米在治疗器官移植后的排异反应的药物中应用。
全文摘要
本发明提供一种氟塞米的适应性,氟塞米是新型免疫抑制剂来氟米特的有效代谢物,氟塞米对人体外周淋巴细胞单向混合反应具有抑制作用,当其浓度为75－100μM(20.25μg/ml－27μg/ml)对淋巴细胞混合反应抑制率>84%;当浓度为50μM(13.5μg/ml)时,淋巴细胞混合反应抑制率>50%。鉴于淋巴细胞在器官移植后的急性排异反应中,对移植物抗原的反应起着很重要作用,故氟塞米可应用于治疗器官移植后的排异反应。
文档编号A61K31/275GK1350847SQ0012587
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月27日 优先权日2000年10月27日
发明者肖飞 申请人:欣凯医药化工中间体(上海)有限公司
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