氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用的制作方法
专利名称：氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及氧化苦参碱的用途，尤其涉及氧化苦参碱在制药领域中的用途。
1979年Ibragimov等(Chem Anal 1979；9020431-9)用X-射线衍射法研究了氧化苦参碱的结构，其分子式为C15H24N2O2，其结构式为 该化合物可通过常规的提取方法从豆科槐植物苦参(Sophora FlavescensAit)或苦豆子(Sophora alopecuroides L.)中提取，为一种白色水溶性固体。文献“中药化学成分提取分离手册”，中国中医药出版社，1998年8月第1版详细报道了所述化合物的提取方法。
氧化苦参碱是一种用途十分广泛的氧化生物碱，中国专利96109782.5公开了氧化苦参碱在制备治疗乙型肝炎药物中的应用，而该化合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用尚未见报道。
肝纤维化是一种病理状态，临床医生常将此同肝病慢性化等同起来。1984年著名肝病学家Hans Popper曾提出肝纤维性增生疾病。临床医生如何把这种状态与慢性肝病区别，对诊断、治疗及预后的判断将有很大的启发。肝纤维化是慢性肝损伤的代偿性修复反应，肝脏内结缔组织呈异常增生。生物化学测定表明，每克正常肝组织湿重平均有5.5～6.5毫克的胶原，而肝硬化的肝脏高达20毫克以上。肝纤维化是慢性肝病进一步向肝硬化发展的主要中间环节，故阻止和逆转肝纤维化的发展，促进肝纤维化的逐步分解吸收，不仅能减轻肝脏损害程度，而且能防止肝硬化的发生。各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，其中25％-40％最终发展为肝硬化甚至肝癌。在过去的几十年里，肝纤维化能否发生逆转，一直是医学界有争议的问题，现已知肝纤维化是一个可逆性的病变，而肝硬化是不可逆性病变。
肝纤维化的治疗应包括祛除原发病因、抗肝纤维化及对症治疗三方面。最有效的治疗是病因治疗。然而这在临床上有时不易做到，且不少病例病因治疗后，主动性肝纤维化仍然继续发展。因此抗肝纤维化治疗是控制肝纤维化进展的重要途径。近年来人们对肝纤维化发病机制有不少的新认识和了解，目前认为肝纤维化形成和发展中肝星状细胞是主要效应细胞，起中心环节作用，参与细胞外基质(ECM)及细胞因子的调控，近来某些新干预研究已初步用于临床。如Rockey等报道γ-干扰素是肝星状细胞激活的强烈抑制剂；维甲酸也可能对肝星状细胞激活有抑制作用；α和γ干扰素可抑制肝星状细胞增生和基质蛋白的合成和/或装配；基质金属蛋白酶的活性受生理性抑制物如α2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶抑制剂-1和-2的抑制；多不饱和卵磷脂对狒狒的酒精性肝病发展为肝纤维化有明显的保护作用；近来有人观察到Relaxin可降低胶原合成、刺激胶原酶的表达而显示抗肝纤维化作用；糖蛋白decorin可与TGFβ1结合，可抑制TGFβ1活性，有利于肝纤维化的改善；近年来国内有报道中药复方等有抗肝纤维化作用。尽管治疗的药物很多，但目前尚未发现对肝纤维化有特效的药物。因此寻找确切有效的抗肝纤维化药物是今后努力发展的方向。
本发明的目的在于提供氧化苦参碱的新用途，即在制药中的新用途，根据氧化苦参碱可抑制肝星状细胞和NIH3T3细胞增殖和活化的特性，提供氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，以下将用氧化苦参碱的毒性试验、药理试验和临床试验的结果来说明其在制药领域中的新用途。
氧化苦参碱是从苦参和苦豆子中提取的白色固体，其分子式为C15H24N2O2，采用文献“中药化学成分提取分离手册”，中国中医药出版社，1998年8月第1版报道的方法提取氧化苦参碱，纯度为98％以上，余量是槐定碱。用无热源去离子的纯净蒸馏水将氧化苦参碱溶解，消毒配制成100mg/ml/支或200mg/2ml/支的注射剂备用。
具体实验和临床结果分述如下一.动物实验1.小鼠口服氧化苦参碱急性毒性实验昆明种小鼠一次灌胃，根据预试验，最高剂量定为443mg/kg，以0.75的比例递减，即为443、332、249、186.9、140.2 mg/kg 5个剂量组。连续观察14天，大剂量组(443、332mg/kg)药后5～10分钟活动稍减少，20分钟左右呈现双耳发红。各给药组均出现大便湿软，但成形。死亡发生在24小时内，尸检可见心脏淤血，其他各脏器未见明显异常。存活者第15天全部解剖，肉眼检查主要脏器未见明显病变。死亡率用Bliss法求得LD50为234.55mg/kg；95％可信限为202.15～272.14mg/kg。2.氧化苦参碱小鼠肌肉注射急性毒性试验对昆明种小鼠肌肉注射氧化苦参碱的急性毒性进行检验，用Bliss法计算，其LD50为452.24mg/kg，95％可信限为366.77～551.35mg/kg。死亡动物尸检肉眼未见任何病变。
上述结果说明氧化苦参碱毒性非常低，临床使用安全。二.体外实验一).氧化苦参碱对NIH 3T3细胞增殖的影响(一)方法1.细胞种板采用市售的NIH 3T3细胞株(该细胞的制备方法为现有技术，有公开的文献报道，也可购于中科院上海细胞生物所)，用含10％胎牛血清(上海浦东高桥兽医站)的1640培养液(Giboco公司产品)进行培养。待细胞长满单层后，用0.1％胰酶消化，按1传2进行传代，培养于50ml细胞培养瓶中。约24小时后，细胞处于对数生长期。取2瓶细胞，用0.1％胰酶进行消化，用培养液调细胞浓度为0.5×105个/ml。取4块96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液。留下6个孔不加细胞悬液，为空白对照。将细胞板放入湿盒内保持湿润并置于37℃、5％CO2培养箱中孵育。
2.药物干预用含5％胎牛血清的1640培养液将氧化苦参碱注射液稀释成一系列浓度。氧化苦参碱稀释为8000、6000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6(μg/ml)共11个水平；将孵育24h的96孔板取出，吸尽各孔的培养上清液，每孔加入100μl药液，每个药物水平设6个复孔。取6个孔各加入100μl含5％胎牛血清的1640培养液，为正常对照孔。6个空白对照孔则不加任何液体。将96孔板放湿盒内并置37℃、5％CO2温箱中孵育。
3.加MTT药物作用48小时后加入MTT(Fluka公司产品)。加入MTT之前观察药物的毒性作用并将细胞生长状况在倒置显微镜拍照。MTT用PBS配成5mg/ml的浓度，每孔加入20μl MTT溶液。空白对照孔中不加MTT。继续在37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时。
4.加入二甲基亚枫(DMSO)将作用4小时的96孔板取出，迅速吸尽每孔内液体，弃掉。每孔各加入100μl PBS洗一次，将PBS吸尽弃掉。每孔各加入150μl DMSO溶液，包括6个空白对照孔。于摇床上摇匀作用20min后测吸光度。
5.测吸光度将96孔板置酶标仪(型号为E-Liza Mat-3000，Beckman公司产品)在单波长570nm和双波长570nm-630nm下分别测吸光度值(OD)。各孔的吸光度值减去6个空白对照孔吸光度值的平均值即为实际的吸光度值。
6.统计分析数据以mean±SD表示，用SPSS软件进行方差齐性检验及配对t检验，P＜0.05有统计学意义。
(二)结果1.氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的毒性作用显微镜下观察发现氧化苦参碱浓度在8000、6000和4000μg/ml有毒性作用，表现为细胞坏死和裂解。
2.氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的增殖抑制作用氧化苦参碱浓度在2000、1000、500、250、125和62.25μg/ml有抑制作用，与正常生长的细胞相比，表现为细胞的数量较少，形态基本正常。
3.氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的增殖影响结果见表1，氧化苦参碱浓度在8000、6000和4000μg/ml有毒性作用；2000、1000、500、250、125和62.25μg/ml有抑制作用。
注与正常对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01表1氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的增殖影响二)氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响(一)方法1.实验试剂及仪器Nycodenz为美国Sigma产品，Pronase E为德国Merck产品，DMEM培养基为GIBCO公司产品，胶原酶粗制品为上海医药工业研究院产品，MTT为Fluka公司产品，CO2培养箱为Flow Laboratories公司产品，倒置和荧光显微镜为Olympus公司产品，离心机和酶标仪(E-Liza Mat-3000)为Beckman产品.
2.试验方法1).肝星状细胞(HSC)分离Wistar雄性大鼠，体重400～450g，中国科学院上海实验动物中心提供。大鼠经1.5％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，门静脉插管输入无Ca2+灌注液，同时剪断下腔静脉放血，灌注30min后，小心分离肝脏，待肝组织软化后，剪碎，酶消化振荡30min过200目网后，滤液离心450g 7min，弃上清，沉淀物以1∶2的体积与18％(W/V)的Nycodenz混匀，上覆少许DMEM培养液，行密度梯度离心，1450g，17min，离心后取界面处细胞，用DMEM清洗1次，450g 7min，取沉淀细胞悬浮于含20％小牛血清的DMEM中台盼蓝染色判断存活率并计算产率；2).肝星状细胞培养细胞以每平方厘米1×105接种于培养皿(Coring公司产品)，置5％CO2，95％空气培养箱中37℃，24小时细胞贴壁后换液，以后隔3-4天更换1次培养液；3).肝星状细胞鉴定新分离的的肝星状细胞悬液点涂片，置于荧光显微镜328nm波长紫外光照射下，细胞呈现蓝绿色自发荧光.兔抗人Desmin爬片作SP免疫组化染色示胞浆阳染者为肝星状细胞；4).MTT比色法原代培养的细胞长满单层后用胰酶消化后置20％DMEM培养液中，调整细胞数为1×108个/l，以每孔100ul加入96孔Nunc培养板内。置37℃，5％CO2培养箱内预培养72小时后，分为8组，一组为空白对照组，其余8组加入不同浓度(分别为0.25，0.5，1，2，4，8，16和32ug/ml)的氧化苦参碱，每组设6个复孔。48小时后，每孔加入5mg/ml的MTT液20ul，振荡后37℃，5％CO2继续孵育4小时后，用酶标仪(E-Liza Mat-3000)双波长测定其吸光度OD值，以OD值间接反映肝星状细胞在培养孔中的增殖密度，OD值越低则说明肝星状细胞的增殖越弱。测定波长为570nm，参考波长为630nm，酶标仪所示OD值为OD570减去OD630，以消除非特异性光吸收效应。
3.统计学方法用Student t检验，以P值＜0.05判断有显著性差异。(二)结果1.肝星状细胞的得率和纯度用本法分离的肝星状细胞，其得率每肝为5×106-1×107，以0.4％台盼兰染色，细胞存活率在98％以上。原代培养的肝星状细胞Desmin阳性在90％以上，传代培养后肝星状细胞Desmin阳性在98％以上。
2氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响见表2。组别 氧化苦参碱浓度 培养孔液OD值(ug/ml)X±SI 32 0.0731±0.0337**II16 0.0905±0.0081**III 80.1097±0.0199**IV40.1097±0.0310**V 20.1307±0.0247**VI10.1437±0.0326**VII 0.5 0.1307±0.0214**VIII 0.25 0.1677±0.0465正常对照 00.2033±0.0313注与正常对照组比较**p＜0.01表2不同浓度的氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响氧化苦参碱浓度≥0.5ug/ml之培养孔液OD值均低于0.25ug/ml孔，与正常对照组相比统计学有非常显著意义(P＜0.01)。显微镜下观察发现氧化苦参碱浓度在32ug/ml显示毒性作用，表现为细胞裂解和坏死；氧化苦参碱浓度在16、8、4、2、1和0.5ug/ml有抑制作用，表现为细胞数量减少，细胞形态基本正常。三)氧化苦参碱对体外培养肝星状细胞合成细胞外基质的影响(一).材料与方法1.材料雄性Wistar大鼠，体重400～450g，清洁级，由中科院上海实验动物中心提供；胶原酶粗制品购于上海医药工业研究院，链酶蛋白酶E为德国Merck公司产品，Nycodenz为美国Sigma公司产品；DMEM培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清购于上海浦东高桥兽医站；兔抗人Desmin单克隆抗体为丹麦DAKO公司产品；III型前胶原氨基末端多肽(PIIINP)放免试剂盒为美国Biotech公司产品、透明质酸(HA)和层粘素(LN)放免试剂盒为上海海军医学研究所产品、IV型胶原7S(IV 7S)ELISA检测试剂盒为芬兰Orien公司产品。采用上述的氧化苦参碱注射液，200毫克/2毫升/支。
2.方法1).HSC的分离与培养同前。
2).IV 7S、PIIINP、HA和LN含量的测定原代细胞经胰酶消化后，调细胞数为1×105/ml，按每孔1ml种24孔板。48h后换含1、2、4ug/ml不同药物浓度的培养液作用24h，弃掉上清，换无血清DMEM培养液继续培养24h。收集上清液，-20℃保存待测。PIIINP、HA和LN的放免法检测按试剂盒说明进行，各变量值均以ng/ml表示。
3).统计学处理数据以x±s表示，组间比较采用t检验。(二)结果氧化苦参碱对HSC合成IV 7S、PIIINP、HA和LN能力的影响，结果见表3。组别N IV7s(ng/ml) PIIINP(ng/ml) HA(ng/ml) LN(ng/ml)正常对照组 6 158.4±24.4 129.3±10.6 280.2±25.9208.4±25.81ug/ml 6 125.5±15.9*109.6±8.6*180.4±16.4*110.1±16.6**2ug/ml 6 103.4±21.0*67.4±9.9**105.7±15.2*63.2±10.4**4ug/ml 6 64.7±14.8**48.4±5.6**40.2±8.5**42.8±14.4**注与正常对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01
表3.氧化苦参碱对HSC培养上清中细胞外基质水平的影响氧化苦参碱在1、2、4ug/ml浓度可显著降低HSC培养上清液中IV 7S、PIIINP、HA、LN的水平(P＜0.05或P＜0.01)。三.体内试验一)氧化苦参碱对肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标水平的影响(一)材料与方法1.材料(1)动物清洁级雄性Wistar大鼠140只，体重230～250克，购于中科院上海实验动物中心。
(2)药物氧化苦参碱，规格为200mg/2ml；CCl4，分析纯。
2.方法动物饲养自由进食与饮水，室温24℃，相对湿度70％-80％。
动物分组140只大鼠随机分为2组，正常对照组20只，CCl4肝纤维化模型组120只。CCl4用精制花生油配成40％(V/V)浓度。正常对照组不加任何处理。CCl4模型组每周2次皮下注射CCl4，剂量为0.3ml/100g体重。在CCl4注射12周后，肝纤维化模型成功，按95年全国慢性肝炎病理诊断标准全部处于肝纤维化S3期。停止CCl4攻击，然后将肝纤维化模型组100只分成治疗对照组40只、氧化苦参碱治疗低剂量组20只、中剂量组20只、高剂量组20只，治疗对照组不加任何处理，氧化苦参碱治疗组肌肉注射氧化苦参碱，低、中、高剂量组剂量分别为20、40、80mg/kg体重，每日1次，直至剖杀。于治疗第6、8、10周分批处死动物，剩余动物在第12周时剖杀。剖杀前经腹主动脉采血，分离血清置-70℃保存待测。
(3)血清纤维化指标检测IV型胶原ELISA检测试剂盒为美国Biotech公司产品，PIIINP放免检测试剂盒为芬兰Orien公司产品，HA和LN放免检测试剂盒为上海海军医学研究所产品。
(4)统计分析数据以x±s表示，组间比较采用完全随机设计多样本均数的方差分析，P＜0.05时有统计学意义。
(二)结果治疗6周后，除氧化苦参碱低剂量组血清IV型胶原水平与治疗对照组相比未见显著性差异(P＞0.05)外，氧化苦参碱治疗其余各剂量组的血清纤维化指标血清IV型胶原、PIIINP、HA、LN水平较治疗对照组显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。氧化苦参碱治疗第12周的血清标本检测发现，除氧化苦参碱低剂量组血清IV型胶原、HA和LN水平与治疗对照组相比未见显著性差异(P＞0.05)外，氧化苦参碱治疗其余各剂量组的血清纤维化指标均较治疗对照组显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。本研究通过检测氧化苦参碱治疗各剂量组动物肝纤维化血清学指标的水平，证实氧化苦参碱对S3期肝纤维化有一定的逆转作用，提示它可用于肝纤维化的治疗，见表4和表5。
注与肝纤维化对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，ΔP＜0.01表4.氧化苦参碱治疗6周后肝纤维化血清学指标的改变
注与肝纤维化对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，ΔP＜0.01表5.氧化苦参碱治疗12周后肝纤维化血清学指标的改变二)氧化苦参碱抗肝纤维化的体内实验研究材料与方法1.材料(1)动物清洁级雄性Wister大鼠150只，体重230～250克，购于中科院上海实验动物中心。
(2)药物氧化苦参碱，200mg/2ml/支；CCl4，分析纯。
2.方法
(1)动物饲养自由进食与饮水，室温24℃，相对湿度70％-80％。
(2)动物分组150只大鼠随机分为5组，正常对照组20只，CCl4模型对照组40只，氧化苦参碱预防低剂量组30只、中剂量组30只、高剂量组30只。CCl4用精制花生油配成40％(V/V)浓度。正常对照组不加任何处理。CCl4模型对照组每周2次皮下注射CCl4，剂量为0.3ml/100g体重，氧化苦参碱预防组在皮下注射CCl40.3ml/100g体重同时，肌肉注射氧化苦参碱，低、中、高剂量组剂量分别为20、40、80mg/kg体重，每日1次，直至剖杀。于造模第6、8、10周分批处死5只动物，剩余动物在第12周时剖杀。剖杀前经腹主动脉采血，分离血清置-70℃保存待测。
(3)血清纤维化指标检测IV型胶原ELISA检测试剂盒为Biotech公司产品，PIIINP放免检测试剂盒为芬兰Orien公司产品，HA和LN放免检测试剂盒为上海海军医学研究所产品。
(4)肝组织学检查在肝右上叶的相同位置取肝组织，用10％福尔马林固定，制片后经HE染色观察肝细胞变性坏死和纤维化程度，采用95年全国肝纤维化分期标准进行评判。Masson三重胶原纤维染色和Gomori银网状纤维染色对胶原纤维和网状纤维进行半定量。
(5)统计分析数据以x±s表示，组间比较采用完全随机设计多样本均数的方差分析，分级资料采用秩和检验，P＜0.05时有统计学意义。
(二)结果1.动物一般情况CCl4模型组死亡5只，氧化苦参碱预防低剂量组死亡2只，中剂量组3只，高剂量组死亡2只，正常对照组无动物死亡。各组死亡率未见显著差异(P＜0.05)。
2.血清纤维化指标比较第12周时，CCl4模型对照组血清纤维化指标IV型胶原、PIIINP、HA、LN水平较正常对照组显著升高(P均＜0.01)，氧化苦参碱预防各剂量组较CCl4模型对照组低，以中高剂量组最明显(P＜0.01)。中高剂量组间除HA(P＜0.01)外，均无显著性差异。见表5。
3.肝组织学观察结果(表6)正常对照组肝脏呈红褐色，质软，表面光滑，镜下为正常结构。CCl4对照组肝脏体积缩小，质硬，色黄，肝表面呈细小结节状，镜下见肝组织正常结构大部破坏，肝小叶结构紊乱，汇管区周围纤维化明显，沿肝板延伸形成纤维间隔，部分区域有桥样间隔形成。氧化苦参碱预防低剂量组肝小叶结构尚可见，汇管区周围纤维化组织增生较明显，增生的纤维间隔向小叶内延伸形成纤维间隔，偶见桥样间隔形成，纤维化程度较CCl4造模对照组减轻(P＜0.05)；中剂量组肝小叶结构可见，纤维组织增生较对照组(P＜0.01)和低剂量组(P＜0.05)显著减轻。高剂量组肝小叶结构清晰可见，未见明显纤维间隔形成，纤维组织增生明显轻于对照组(P＜0.01)和低剂量组(P＜0.01)，但与中剂量组间无显著性差异(P＞0.05)。Masson和Gomori染色结果与HE染色结果基本一致。
组别 S0S1S2S3CCl4模型对照组00 1 9低剂量组(n＝10)00 5 4ΔΔ中剂量组(n＝10)05 5 0ΔΔ**高剂量组(n＝10)27 1 0ΔΔ**注与CCl4模型对照组比较，ΔΔp＜0.01；与预防低剂量组比较，**P＜0.01。
表6氧化苦参碱治疗后肝纤维化组织学程度的比较三.临床治疗1.选择216例慢性肝炎患者用氧化苦参碱进行治疗，入选标准为1)年龄18--65岁，性别不限；2)对慢性乙型肝炎患者(1)筛选前血清HBsAg阳性并至少6个月；(2)筛选前血清HBeAg阳性并至少6个月；(3)筛选时血清HBV DNA阳性。3)对慢性丙型肝炎患者(1)筛选前血清HCV RNA阳性并至少6个月；(2)筛选前血清抗HCV阳性并至少6个月。4)筛选前6个月及6个月以上曾有两次或两次以上异常(ALT至少是正常值的1.5倍)，两次试验间隔在8周；筛选时ALT异常(ALT在正常上限1.5倍以上10倍以下)。5)签署知情同意书。6)同意不服用其它观察药、不用全身抗病毒药、细胞毒药、激素、免疫调节剂、降酶退黄药物和中药(除非医疗上确实需要)。2.排除标准1)已知血清HIV阳性；2)失代偿期肝病，有以下表现(1)血清胆红素＞正常上限的2.5倍；(2)凝血酶原时间较正常对照延长3秒以上；(3)血清白蛋白在正常范围之外(＜35g/L)；(4)有腹水、静脉曲张破裂出血和肝性脑病病史者；3)有自身免疫性肝炎征象者(抗核抗体滴度＞1∶160)；4)骨髓抑制，有下列表现(1)血红蛋白＜10g/dl；(2)白细胞＜4×109/L；(3)血小板＜80×109/L；5)血清肌酐＞正常上限1.5倍；6)合并研究者认为影响本疗法的严重疾病者，如不稳定性糖尿病、肾功能不全、不稳定性心绞痛、嗜酒(每天饮酒量＞40g)、癫痫、临床有明显的神经病变、吸毒、精神病、胰腺炎、吸收不良及恶性疾病者；7)首剂前30天接受其它研究药者；8)筛选前6个月内接受全身抗病毒物、免疫调节剂、全身细胞毒药物或全身激素治疗者；9)对氧化苦参碱过敏者；10)妊娠及哺乳期；11)有受孕可能而未采取有效避孕措施者。3.病例数病例数共216例。氧化苦参碱胶囊组36例(比较治疗组)，氧化苦参碱针剂组36例(比较对照组)，氧化苦参碱胶囊组72例(治疗组)，空白对照组72例。4.药品来源1)采用实施例3所制备的氧化苦参碱胶囊；规格100mg/囊；2)氧化苦参碱针剂采用实施例1提供的针剂，规格200mg/2ml/支。5.给药方法1)氧化苦参碱胶囊组36例(比较治疗组)剂量胶囊300mg一日三次口服；针剂400mg/天肌注；疗程分二步前24周氧化苦参碱胶囊，以后改为氧化苦参碱针剂直至52周疗程结束；给药途径前24周口服氧化苦参碱胶囊，以后改为肌注氧化苦参碱针剂直至52周疗程结束。
2)氧化苦参碱针剂36例(比较对照组)剂量针剂400mg/天肌注 胶囊300mg一日三次口服；疗程分二步前24周氧化苦参碱针剂，以后改为氧化苦参碱胶囊直至52周疗程结束；给药途径前24周肌注氧化苦参碱针剂，以后改为口服氧化苦参碱胶囊直至52周疗程结束。
3)氧化苦参碱胶囊组72例(治疗组)剂量胶囊300mg一日三次口服；疗程52周；给药途径口服。
4)空白对照组72例剂量维生素C 2粒一日三次口服复合维生素B 2粒一日三次口服；疗程52周；给药途径口服。6.试验方法在筛选评价完成后，合格的病人将按顺序随机分配到氧化苦参碱胶囊组(比较治疗组)、氧化苦参碱针剂组(比较对照组)、氧化苦参碱胶囊组(治疗组)及空白对照组(维生素C和复合维生素B)。完成52周后，所有病人于停药后门诊随访3个月。7.观察项目和指标1)血液学指标血红蛋白(Hb)、红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)及分类、血小板计数。
2)生化指标肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白、A/G、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(SB)、直接胆红素(SB’)碱性磷酸酶(ALP)、凝血酶原时间(PT)、α2-巨球蛋白、转铁蛋白。
3)尿液检查尿常规。
4)肝纤维化相关指标检测血清标志物检测透明质酸(HA)、层粘素(LN)、III型前胶原肽(PIIIP)、IV型胶原-7S(IV-7S)。
5)病理学检查所有入选病例均行肝穿刺活检。8.结果(1)通过某医院对216例肝病患者进行了临床试验，试验结束后，实际病例199例，脱落17例，其中比较治疗组33例，比较对照组34例，治疗组67例，空白对照组65例。(2)一般情况至52周疗程结束后，比较治疗组、比较对照组和治疗组患者对氧化苦参碱耐受性良好，纳差、乏力肝区不适等症状有所好转，但体格检查肝脏和脾脏回缩不明显，疗程中未见发热，皮疹等副反应，但多数病例述说肌肉注射时局部疼痛较明显，改为深部肌肉注射后有所减轻。空白对照组患者52周内病情未见明显变化。氧化苦参碱比较治疗组、比较对照组和治疗组在治疗前后均检查外周血象、尿常规、肾功能等，均未见异常反应。(3)血清ALT复常率空白对照组65例患者中血清ALT 52周后仅5例患者完全降至正常，ALT复常率为7.69％；氧化苦参碱治疗组67例患者经氧化苦参碱治疗后，血清ALT均下降，52周后有37例患者降至正常，ALT复常率为55.22％，显著高于空白对照组(P＜0.05)；氧化苦参碱比较治疗组33例，52周后有22例患者降至正常，ALT复常率为66.67％，显著高于空白对照组(P＜0.05)；氧化苦参碱比较对照组34例，52周后有21例患者降至正常，ALT复常率为61.76％，亦显著高于空白对照组(P＜0.05)。ALT复常率在氧化苦参碱治疗组、比较治疗组和比较对照组之间未见差异(P＞0.05)，表明氧化苦参碱针剂和胶囊组之间无差异。(4)血清肝纤维化相关指标检测199例患者经治疗后其血清肝纤维化相关指标检测结果见表8和9
注与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01表8 199例患者经治疗后其血清透明质酸和层粘素的变化
注与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01表9 199例患者经治疗后其血清III型前胶原肽和IV型胶原的变化从上表可见，肝纤维化相关标志物经氧化苦参碱(针剂和胶囊)治疗后均明显下降(P＜0.05或P＜0.01)，而在氧化苦参碱针剂和胶囊组之间未见差异。2)氧化苦参碱治疗后肝组织学变化氧化苦参碱治疗组、比较治疗组和比较对照组经氧化苦参碱治疗后其组织学均较空白对照组有明显的改善。而在氧化苦参碱治疗组、比较治疗组和比较对比组之间无差异。
由上述公开的毒性试验、药理试验和临床试验可见(1)氧化苦参碱可明显抑制肝星状细胞和NIH 3T3细胞的增殖及细胞外基质的合成，体内动物实验显示其有抗肝纤维化的作用；(2)临床研究显示，氧化苦参碱有较好的降酶效果，ALT复常率在55.22％～66.67％，肝纤维化血清相关标志物及肝组织学均有明显改善，且氧化苦参碱针剂和胶囊之间无明显差异；(3)将氧化苦参碱用于制造治疗肝纤维化药物，能治疗肝纤维化，改善临床症状，效果明显。
(4)氧化苦参碱毒性非常低，临床使用安全、方便。
以下将通过实施例对本发明进行说明。
实施例1用1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将100g氧化苦参碱溶解，混合均匀，消毒配制成200mg/2ml/支的注射剂，装瓶制成品。
实施例2用1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将100g氧化苦参碱溶解，混合均匀，消毒配制成100mg/1ml/支的注射剂，装瓶制成品。
实施例3按本领域技术人员公知的方法制备氧化苦参碱胶囊，以淀粉为填充剂，以8％淀粉浆为粘合剂，制成颗粒，然后装胶囊，制成的胶囊规格为100mg/囊。配方如下氧化苦参碱100克淀粉 85克淀粉浆8％ 适量。
权利要求
1.氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的新用途。该物质具有较好的抗肝纤维化的作用,可明显抑制肝星状细胞和NIH 3T3细胞的增殖及细胞外基质的合成;其能明显降低肝纤维化大鼠血清肝纤维化标志物水平及减轻肝纤维化组织学变化;其对肝纤维化患者有较好的降酶效果,ALT复常率在55.22%～66.67%,肝纤维化血清标志物及肝组织学有明显的改善,且能够改善肝纤维化患者的临床症状;氧化苦参碱毒性低,临床使用安全、方便。
文档编号A61K31/4545GK1350849SQ0012589
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月31日 优先权日2000年10月31日
发明者王忠效, 吴同新, 陆伦根, 何志锋 申请人:上海绿谷伟业生态工程有限公司
技术领域：
本发明涉及氧化苦参碱的用途，尤其涉及氧化苦参碱在制药领域中的用途。
1979年Ibragimov等(Chem Anal 1979；9020431-9)用X-射线衍射法研究了氧化苦参碱的结构，其分子式为C15H24N2O2，其结构式为 该化合物可通过常规的提取方法从豆科槐植物苦参(Sophora FlavescensAit)或苦豆子(Sophora alopecuroides L.)中提取，为一种白色水溶性固体。文献“中药化学成分提取分离手册”，中国中医药出版社，1998年8月第1版详细报道了所述化合物的提取方法。
氧化苦参碱是一种用途十分广泛的氧化生物碱，中国专利96109782.5公开了氧化苦参碱在制备治疗乙型肝炎药物中的应用，而该化合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用尚未见报道。
肝纤维化是一种病理状态，临床医生常将此同肝病慢性化等同起来。1984年著名肝病学家Hans Popper曾提出肝纤维性增生疾病。临床医生如何把这种状态与慢性肝病区别，对诊断、治疗及预后的判断将有很大的启发。肝纤维化是慢性肝损伤的代偿性修复反应，肝脏内结缔组织呈异常增生。生物化学测定表明，每克正常肝组织湿重平均有5.5～6.5毫克的胶原，而肝硬化的肝脏高达20毫克以上。肝纤维化是慢性肝病进一步向肝硬化发展的主要中间环节，故阻止和逆转肝纤维化的发展，促进肝纤维化的逐步分解吸收，不仅能减轻肝脏损害程度，而且能防止肝硬化的发生。各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，其中25％-40％最终发展为肝硬化甚至肝癌。在过去的几十年里，肝纤维化能否发生逆转，一直是医学界有争议的问题，现已知肝纤维化是一个可逆性的病变，而肝硬化是不可逆性病变。
肝纤维化的治疗应包括祛除原发病因、抗肝纤维化及对症治疗三方面。最有效的治疗是病因治疗。然而这在临床上有时不易做到，且不少病例病因治疗后，主动性肝纤维化仍然继续发展。因此抗肝纤维化治疗是控制肝纤维化进展的重要途径。近年来人们对肝纤维化发病机制有不少的新认识和了解，目前认为肝纤维化形成和发展中肝星状细胞是主要效应细胞，起中心环节作用，参与细胞外基质(ECM)及细胞因子的调控，近来某些新干预研究已初步用于临床。如Rockey等报道γ-干扰素是肝星状细胞激活的强烈抑制剂；维甲酸也可能对肝星状细胞激活有抑制作用；α和γ干扰素可抑制肝星状细胞增生和基质蛋白的合成和/或装配；基质金属蛋白酶的活性受生理性抑制物如α2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶抑制剂-1和-2的抑制；多不饱和卵磷脂对狒狒的酒精性肝病发展为肝纤维化有明显的保护作用；近来有人观察到Relaxin可降低胶原合成、刺激胶原酶的表达而显示抗肝纤维化作用；糖蛋白decorin可与TGFβ1结合，可抑制TGFβ1活性，有利于肝纤维化的改善；近年来国内有报道中药复方等有抗肝纤维化作用。尽管治疗的药物很多，但目前尚未发现对肝纤维化有特效的药物。因此寻找确切有效的抗肝纤维化药物是今后努力发展的方向。
本发明的目的在于提供氧化苦参碱的新用途，即在制药中的新用途，根据氧化苦参碱可抑制肝星状细胞和NIH3T3细胞增殖和活化的特性，提供氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，以下将用氧化苦参碱的毒性试验、药理试验和临床试验的结果来说明其在制药领域中的新用途。
氧化苦参碱是从苦参和苦豆子中提取的白色固体，其分子式为C15H24N2O2，采用文献“中药化学成分提取分离手册”，中国中医药出版社，1998年8月第1版报道的方法提取氧化苦参碱，纯度为98％以上，余量是槐定碱。用无热源去离子的纯净蒸馏水将氧化苦参碱溶解，消毒配制成100mg/ml/支或200mg/2ml/支的注射剂备用。
具体实验和临床结果分述如下一.动物实验1.小鼠口服氧化苦参碱急性毒性实验昆明种小鼠一次灌胃，根据预试验，最高剂量定为443mg/kg，以0.75的比例递减，即为443、332、249、186.9、140.2 mg/kg 5个剂量组。连续观察14天，大剂量组(443、332mg/kg)药后5～10分钟活动稍减少，20分钟左右呈现双耳发红。各给药组均出现大便湿软，但成形。死亡发生在24小时内，尸检可见心脏淤血，其他各脏器未见明显异常。存活者第15天全部解剖，肉眼检查主要脏器未见明显病变。死亡率用Bliss法求得LD50为234.55mg/kg；95％可信限为202.15～272.14mg/kg。2.氧化苦参碱小鼠肌肉注射急性毒性试验对昆明种小鼠肌肉注射氧化苦参碱的急性毒性进行检验，用Bliss法计算，其LD50为452.24mg/kg，95％可信限为366.77～551.35mg/kg。死亡动物尸检肉眼未见任何病变。
上述结果说明氧化苦参碱毒性非常低，临床使用安全。二.体外实验一).氧化苦参碱对NIH 3T3细胞增殖的影响(一)方法1.细胞种板采用市售的NIH 3T3细胞株(该细胞的制备方法为现有技术，有公开的文献报道，也可购于中科院上海细胞生物所)，用含10％胎牛血清(上海浦东高桥兽医站)的1640培养液(Giboco公司产品)进行培养。待细胞长满单层后，用0.1％胰酶消化，按1传2进行传代，培养于50ml细胞培养瓶中。约24小时后，细胞处于对数生长期。取2瓶细胞，用0.1％胰酶进行消化，用培养液调细胞浓度为0.5×105个/ml。取4块96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液。留下6个孔不加细胞悬液，为空白对照。将细胞板放入湿盒内保持湿润并置于37℃、5％CO2培养箱中孵育。
2.药物干预用含5％胎牛血清的1640培养液将氧化苦参碱注射液稀释成一系列浓度。氧化苦参碱稀释为8000、6000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6(μg/ml)共11个水平；将孵育24h的96孔板取出，吸尽各孔的培养上清液，每孔加入100μl药液，每个药物水平设6个复孔。取6个孔各加入100μl含5％胎牛血清的1640培养液，为正常对照孔。6个空白对照孔则不加任何液体。将96孔板放湿盒内并置37℃、5％CO2温箱中孵育。
3.加MTT药物作用48小时后加入MTT(Fluka公司产品)。加入MTT之前观察药物的毒性作用并将细胞生长状况在倒置显微镜拍照。MTT用PBS配成5mg/ml的浓度，每孔加入20μl MTT溶液。空白对照孔中不加MTT。继续在37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时。
4.加入二甲基亚枫(DMSO)将作用4小时的96孔板取出，迅速吸尽每孔内液体，弃掉。每孔各加入100μl PBS洗一次，将PBS吸尽弃掉。每孔各加入150μl DMSO溶液，包括6个空白对照孔。于摇床上摇匀作用20min后测吸光度。
5.测吸光度将96孔板置酶标仪(型号为E-Liza Mat-3000，Beckman公司产品)在单波长570nm和双波长570nm-630nm下分别测吸光度值(OD)。各孔的吸光度值减去6个空白对照孔吸光度值的平均值即为实际的吸光度值。
6.统计分析数据以mean±SD表示，用SPSS软件进行方差齐性检验及配对t检验，P＜0.05有统计学意义。
(二)结果1.氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的毒性作用显微镜下观察发现氧化苦参碱浓度在8000、6000和4000μg/ml有毒性作用，表现为细胞坏死和裂解。
2.氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的增殖抑制作用氧化苦参碱浓度在2000、1000、500、250、125和62.25μg/ml有抑制作用，与正常生长的细胞相比，表现为细胞的数量较少，形态基本正常。
3.氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的增殖影响结果见表1，氧化苦参碱浓度在8000、6000和4000μg/ml有毒性作用；2000、1000、500、250、125和62.25μg/ml有抑制作用。
注与正常对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01表1氧化苦参碱对NIH 3T3细胞的增殖影响二)氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响(一)方法1.实验试剂及仪器Nycodenz为美国Sigma产品，Pronase E为德国Merck产品，DMEM培养基为GIBCO公司产品，胶原酶粗制品为上海医药工业研究院产品，MTT为Fluka公司产品，CO2培养箱为Flow Laboratories公司产品，倒置和荧光显微镜为Olympus公司产品，离心机和酶标仪(E-Liza Mat-3000)为Beckman产品.
2.试验方法1).肝星状细胞(HSC)分离Wistar雄性大鼠，体重400～450g，中国科学院上海实验动物中心提供。大鼠经1.5％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，门静脉插管输入无Ca2+灌注液，同时剪断下腔静脉放血，灌注30min后，小心分离肝脏，待肝组织软化后，剪碎，酶消化振荡30min过200目网后，滤液离心450g 7min，弃上清，沉淀物以1∶2的体积与18％(W/V)的Nycodenz混匀，上覆少许DMEM培养液，行密度梯度离心，1450g，17min，离心后取界面处细胞，用DMEM清洗1次，450g 7min，取沉淀细胞悬浮于含20％小牛血清的DMEM中台盼蓝染色判断存活率并计算产率；2).肝星状细胞培养细胞以每平方厘米1×105接种于培养皿(Coring公司产品)，置5％CO2，95％空气培养箱中37℃，24小时细胞贴壁后换液，以后隔3-4天更换1次培养液；3).肝星状细胞鉴定新分离的的肝星状细胞悬液点涂片，置于荧光显微镜328nm波长紫外光照射下，细胞呈现蓝绿色自发荧光.兔抗人Desmin爬片作SP免疫组化染色示胞浆阳染者为肝星状细胞；4).MTT比色法原代培养的细胞长满单层后用胰酶消化后置20％DMEM培养液中，调整细胞数为1×108个/l，以每孔100ul加入96孔Nunc培养板内。置37℃，5％CO2培养箱内预培养72小时后，分为8组，一组为空白对照组，其余8组加入不同浓度(分别为0.25，0.5，1，2，4，8，16和32ug/ml)的氧化苦参碱，每组设6个复孔。48小时后，每孔加入5mg/ml的MTT液20ul，振荡后37℃，5％CO2继续孵育4小时后，用酶标仪(E-Liza Mat-3000)双波长测定其吸光度OD值，以OD值间接反映肝星状细胞在培养孔中的增殖密度，OD值越低则说明肝星状细胞的增殖越弱。测定波长为570nm，参考波长为630nm，酶标仪所示OD值为OD570减去OD630，以消除非特异性光吸收效应。
3.统计学方法用Student t检验，以P值＜0.05判断有显著性差异。(二)结果1.肝星状细胞的得率和纯度用本法分离的肝星状细胞，其得率每肝为5×106-1×107，以0.4％台盼兰染色，细胞存活率在98％以上。原代培养的肝星状细胞Desmin阳性在90％以上，传代培养后肝星状细胞Desmin阳性在98％以上。
2氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响见表2。组别 氧化苦参碱浓度 培养孔液OD值(ug/ml)X±SI 32 0.0731±0.0337**II16 0.0905±0.0081**III 80.1097±0.0199**IV40.1097±0.0310**V 20.1307±0.0247**VI10.1437±0.0326**VII 0.5 0.1307±0.0214**VIII 0.25 0.1677±0.0465正常对照 00.2033±0.0313注与正常对照组比较**p＜0.01表2不同浓度的氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响氧化苦参碱浓度≥0.5ug/ml之培养孔液OD值均低于0.25ug/ml孔，与正常对照组相比统计学有非常显著意义(P＜0.01)。显微镜下观察发现氧化苦参碱浓度在32ug/ml显示毒性作用，表现为细胞裂解和坏死；氧化苦参碱浓度在16、8、4、2、1和0.5ug/ml有抑制作用，表现为细胞数量减少，细胞形态基本正常。三)氧化苦参碱对体外培养肝星状细胞合成细胞外基质的影响(一).材料与方法1.材料雄性Wistar大鼠，体重400～450g，清洁级，由中科院上海实验动物中心提供；胶原酶粗制品购于上海医药工业研究院，链酶蛋白酶E为德国Merck公司产品，Nycodenz为美国Sigma公司产品；DMEM培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清购于上海浦东高桥兽医站；兔抗人Desmin单克隆抗体为丹麦DAKO公司产品；III型前胶原氨基末端多肽(PIIINP)放免试剂盒为美国Biotech公司产品、透明质酸(HA)和层粘素(LN)放免试剂盒为上海海军医学研究所产品、IV型胶原7S(IV 7S)ELISA检测试剂盒为芬兰Orien公司产品。采用上述的氧化苦参碱注射液，200毫克/2毫升/支。
2.方法1).HSC的分离与培养同前。
2).IV 7S、PIIINP、HA和LN含量的测定原代细胞经胰酶消化后，调细胞数为1×105/ml，按每孔1ml种24孔板。48h后换含1、2、4ug/ml不同药物浓度的培养液作用24h，弃掉上清，换无血清DMEM培养液继续培养24h。收集上清液，-20℃保存待测。PIIINP、HA和LN的放免法检测按试剂盒说明进行，各变量值均以ng/ml表示。
3).统计学处理数据以x±s表示，组间比较采用t检验。(二)结果氧化苦参碱对HSC合成IV 7S、PIIINP、HA和LN能力的影响，结果见表3。组别N IV7s(ng/ml) PIIINP(ng/ml) HA(ng/ml) LN(ng/ml)正常对照组 6 158.4±24.4 129.3±10.6 280.2±25.9208.4±25.81ug/ml 6 125.5±15.9*109.6±8.6*180.4±16.4*110.1±16.6**2ug/ml 6 103.4±21.0*67.4±9.9**105.7±15.2*63.2±10.4**4ug/ml 6 64.7±14.8**48.4±5.6**40.2±8.5**42.8±14.4**注与正常对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01
表3.氧化苦参碱对HSC培养上清中细胞外基质水平的影响氧化苦参碱在1、2、4ug/ml浓度可显著降低HSC培养上清液中IV 7S、PIIINP、HA、LN的水平(P＜0.05或P＜0.01)。三.体内试验一)氧化苦参碱对肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标水平的影响(一)材料与方法1.材料(1)动物清洁级雄性Wistar大鼠140只，体重230～250克，购于中科院上海实验动物中心。
(2)药物氧化苦参碱，规格为200mg/2ml；CCl4，分析纯。
2.方法动物饲养自由进食与饮水，室温24℃，相对湿度70％-80％。
动物分组140只大鼠随机分为2组，正常对照组20只，CCl4肝纤维化模型组120只。CCl4用精制花生油配成40％(V/V)浓度。正常对照组不加任何处理。CCl4模型组每周2次皮下注射CCl4，剂量为0.3ml/100g体重。在CCl4注射12周后，肝纤维化模型成功，按95年全国慢性肝炎病理诊断标准全部处于肝纤维化S3期。停止CCl4攻击，然后将肝纤维化模型组100只分成治疗对照组40只、氧化苦参碱治疗低剂量组20只、中剂量组20只、高剂量组20只，治疗对照组不加任何处理，氧化苦参碱治疗组肌肉注射氧化苦参碱，低、中、高剂量组剂量分别为20、40、80mg/kg体重，每日1次，直至剖杀。于治疗第6、8、10周分批处死动物，剩余动物在第12周时剖杀。剖杀前经腹主动脉采血，分离血清置-70℃保存待测。
(3)血清纤维化指标检测IV型胶原ELISA检测试剂盒为美国Biotech公司产品，PIIINP放免检测试剂盒为芬兰Orien公司产品，HA和LN放免检测试剂盒为上海海军医学研究所产品。
(4)统计分析数据以x±s表示，组间比较采用完全随机设计多样本均数的方差分析，P＜0.05时有统计学意义。
(二)结果治疗6周后，除氧化苦参碱低剂量组血清IV型胶原水平与治疗对照组相比未见显著性差异(P＞0.05)外，氧化苦参碱治疗其余各剂量组的血清纤维化指标血清IV型胶原、PIIINP、HA、LN水平较治疗对照组显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。氧化苦参碱治疗第12周的血清标本检测发现，除氧化苦参碱低剂量组血清IV型胶原、HA和LN水平与治疗对照组相比未见显著性差异(P＞0.05)外，氧化苦参碱治疗其余各剂量组的血清纤维化指标均较治疗对照组显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。本研究通过检测氧化苦参碱治疗各剂量组动物肝纤维化血清学指标的水平，证实氧化苦参碱对S3期肝纤维化有一定的逆转作用，提示它可用于肝纤维化的治疗，见表4和表5。
注与肝纤维化对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，ΔP＜0.01表4.氧化苦参碱治疗6周后肝纤维化血清学指标的改变
注与肝纤维化对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，ΔP＜0.01表5.氧化苦参碱治疗12周后肝纤维化血清学指标的改变二)氧化苦参碱抗肝纤维化的体内实验研究材料与方法1.材料(1)动物清洁级雄性Wister大鼠150只，体重230～250克，购于中科院上海实验动物中心。
(2)药物氧化苦参碱，200mg/2ml/支；CCl4，分析纯。
2.方法
(1)动物饲养自由进食与饮水，室温24℃，相对湿度70％-80％。
(2)动物分组150只大鼠随机分为5组，正常对照组20只，CCl4模型对照组40只，氧化苦参碱预防低剂量组30只、中剂量组30只、高剂量组30只。CCl4用精制花生油配成40％(V/V)浓度。正常对照组不加任何处理。CCl4模型对照组每周2次皮下注射CCl4，剂量为0.3ml/100g体重，氧化苦参碱预防组在皮下注射CCl40.3ml/100g体重同时，肌肉注射氧化苦参碱，低、中、高剂量组剂量分别为20、40、80mg/kg体重，每日1次，直至剖杀。于造模第6、8、10周分批处死5只动物，剩余动物在第12周时剖杀。剖杀前经腹主动脉采血，分离血清置-70℃保存待测。
(3)血清纤维化指标检测IV型胶原ELISA检测试剂盒为Biotech公司产品，PIIINP放免检测试剂盒为芬兰Orien公司产品，HA和LN放免检测试剂盒为上海海军医学研究所产品。
(4)肝组织学检查在肝右上叶的相同位置取肝组织，用10％福尔马林固定，制片后经HE染色观察肝细胞变性坏死和纤维化程度，采用95年全国肝纤维化分期标准进行评判。Masson三重胶原纤维染色和Gomori银网状纤维染色对胶原纤维和网状纤维进行半定量。
(5)统计分析数据以x±s表示，组间比较采用完全随机设计多样本均数的方差分析，分级资料采用秩和检验，P＜0.05时有统计学意义。
(二)结果1.动物一般情况CCl4模型组死亡5只，氧化苦参碱预防低剂量组死亡2只，中剂量组3只，高剂量组死亡2只，正常对照组无动物死亡。各组死亡率未见显著差异(P＜0.05)。
2.血清纤维化指标比较第12周时，CCl4模型对照组血清纤维化指标IV型胶原、PIIINP、HA、LN水平较正常对照组显著升高(P均＜0.01)，氧化苦参碱预防各剂量组较CCl4模型对照组低，以中高剂量组最明显(P＜0.01)。中高剂量组间除HA(P＜0.01)外，均无显著性差异。见表5。
3.肝组织学观察结果(表6)正常对照组肝脏呈红褐色，质软，表面光滑，镜下为正常结构。CCl4对照组肝脏体积缩小，质硬，色黄，肝表面呈细小结节状，镜下见肝组织正常结构大部破坏，肝小叶结构紊乱，汇管区周围纤维化明显，沿肝板延伸形成纤维间隔，部分区域有桥样间隔形成。氧化苦参碱预防低剂量组肝小叶结构尚可见，汇管区周围纤维化组织增生较明显，增生的纤维间隔向小叶内延伸形成纤维间隔，偶见桥样间隔形成，纤维化程度较CCl4造模对照组减轻(P＜0.05)；中剂量组肝小叶结构可见，纤维组织增生较对照组(P＜0.01)和低剂量组(P＜0.05)显著减轻。高剂量组肝小叶结构清晰可见，未见明显纤维间隔形成，纤维组织增生明显轻于对照组(P＜0.01)和低剂量组(P＜0.01)，但与中剂量组间无显著性差异(P＞0.05)。Masson和Gomori染色结果与HE染色结果基本一致。
组别 S0S1S2S3CCl4模型对照组00 1 9低剂量组(n＝10)00 5 4ΔΔ中剂量组(n＝10)05 5 0ΔΔ**高剂量组(n＝10)27 1 0ΔΔ**注与CCl4模型对照组比较，ΔΔp＜0.01；与预防低剂量组比较，**P＜0.01。
表6氧化苦参碱治疗后肝纤维化组织学程度的比较三.临床治疗1.选择216例慢性肝炎患者用氧化苦参碱进行治疗，入选标准为1)年龄18--65岁，性别不限；2)对慢性乙型肝炎患者(1)筛选前血清HBsAg阳性并至少6个月；(2)筛选前血清HBeAg阳性并至少6个月；(3)筛选时血清HBV DNA阳性。3)对慢性丙型肝炎患者(1)筛选前血清HCV RNA阳性并至少6个月；(2)筛选前血清抗HCV阳性并至少6个月。4)筛选前6个月及6个月以上曾有两次或两次以上异常(ALT至少是正常值的1.5倍)，两次试验间隔在8周；筛选时ALT异常(ALT在正常上限1.5倍以上10倍以下)。5)签署知情同意书。6)同意不服用其它观察药、不用全身抗病毒药、细胞毒药、激素、免疫调节剂、降酶退黄药物和中药(除非医疗上确实需要)。2.排除标准1)已知血清HIV阳性；2)失代偿期肝病，有以下表现(1)血清胆红素＞正常上限的2.5倍；(2)凝血酶原时间较正常对照延长3秒以上；(3)血清白蛋白在正常范围之外(＜35g/L)；(4)有腹水、静脉曲张破裂出血和肝性脑病病史者；3)有自身免疫性肝炎征象者(抗核抗体滴度＞1∶160)；4)骨髓抑制，有下列表现(1)血红蛋白＜10g/dl；(2)白细胞＜4×109/L；(3)血小板＜80×109/L；5)血清肌酐＞正常上限1.5倍；6)合并研究者认为影响本疗法的严重疾病者，如不稳定性糖尿病、肾功能不全、不稳定性心绞痛、嗜酒(每天饮酒量＞40g)、癫痫、临床有明显的神经病变、吸毒、精神病、胰腺炎、吸收不良及恶性疾病者；7)首剂前30天接受其它研究药者；8)筛选前6个月内接受全身抗病毒物、免疫调节剂、全身细胞毒药物或全身激素治疗者；9)对氧化苦参碱过敏者；10)妊娠及哺乳期；11)有受孕可能而未采取有效避孕措施者。3.病例数病例数共216例。氧化苦参碱胶囊组36例(比较治疗组)，氧化苦参碱针剂组36例(比较对照组)，氧化苦参碱胶囊组72例(治疗组)，空白对照组72例。4.药品来源1)采用实施例3所制备的氧化苦参碱胶囊；规格100mg/囊；2)氧化苦参碱针剂采用实施例1提供的针剂，规格200mg/2ml/支。5.给药方法1)氧化苦参碱胶囊组36例(比较治疗组)剂量胶囊300mg一日三次口服；针剂400mg/天肌注；疗程分二步前24周氧化苦参碱胶囊，以后改为氧化苦参碱针剂直至52周疗程结束；给药途径前24周口服氧化苦参碱胶囊，以后改为肌注氧化苦参碱针剂直至52周疗程结束。
2)氧化苦参碱针剂36例(比较对照组)剂量针剂400mg/天肌注 胶囊300mg一日三次口服；疗程分二步前24周氧化苦参碱针剂，以后改为氧化苦参碱胶囊直至52周疗程结束；给药途径前24周肌注氧化苦参碱针剂，以后改为口服氧化苦参碱胶囊直至52周疗程结束。
3)氧化苦参碱胶囊组72例(治疗组)剂量胶囊300mg一日三次口服；疗程52周；给药途径口服。
4)空白对照组72例剂量维生素C 2粒一日三次口服复合维生素B 2粒一日三次口服；疗程52周；给药途径口服。6.试验方法在筛选评价完成后，合格的病人将按顺序随机分配到氧化苦参碱胶囊组(比较治疗组)、氧化苦参碱针剂组(比较对照组)、氧化苦参碱胶囊组(治疗组)及空白对照组(维生素C和复合维生素B)。完成52周后，所有病人于停药后门诊随访3个月。7.观察项目和指标1)血液学指标血红蛋白(Hb)、红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)及分类、血小板计数。
2)生化指标肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白、A/G、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(SB)、直接胆红素(SB’)碱性磷酸酶(ALP)、凝血酶原时间(PT)、α2-巨球蛋白、转铁蛋白。
3)尿液检查尿常规。
4)肝纤维化相关指标检测血清标志物检测透明质酸(HA)、层粘素(LN)、III型前胶原肽(PIIIP)、IV型胶原-7S(IV-7S)。
5)病理学检查所有入选病例均行肝穿刺活检。8.结果(1)通过某医院对216例肝病患者进行了临床试验，试验结束后，实际病例199例，脱落17例，其中比较治疗组33例，比较对照组34例，治疗组67例，空白对照组65例。(2)一般情况至52周疗程结束后，比较治疗组、比较对照组和治疗组患者对氧化苦参碱耐受性良好，纳差、乏力肝区不适等症状有所好转，但体格检查肝脏和脾脏回缩不明显，疗程中未见发热，皮疹等副反应，但多数病例述说肌肉注射时局部疼痛较明显，改为深部肌肉注射后有所减轻。空白对照组患者52周内病情未见明显变化。氧化苦参碱比较治疗组、比较对照组和治疗组在治疗前后均检查外周血象、尿常规、肾功能等，均未见异常反应。(3)血清ALT复常率空白对照组65例患者中血清ALT 52周后仅5例患者完全降至正常，ALT复常率为7.69％；氧化苦参碱治疗组67例患者经氧化苦参碱治疗后，血清ALT均下降，52周后有37例患者降至正常，ALT复常率为55.22％，显著高于空白对照组(P＜0.05)；氧化苦参碱比较治疗组33例，52周后有22例患者降至正常，ALT复常率为66.67％，显著高于空白对照组(P＜0.05)；氧化苦参碱比较对照组34例，52周后有21例患者降至正常，ALT复常率为61.76％，亦显著高于空白对照组(P＜0.05)。ALT复常率在氧化苦参碱治疗组、比较治疗组和比较对照组之间未见差异(P＞0.05)，表明氧化苦参碱针剂和胶囊组之间无差异。(4)血清肝纤维化相关指标检测199例患者经治疗后其血清肝纤维化相关指标检测结果见表8和9
注与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01表8 199例患者经治疗后其血清透明质酸和层粘素的变化
注与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01表9 199例患者经治疗后其血清III型前胶原肽和IV型胶原的变化从上表可见，肝纤维化相关标志物经氧化苦参碱(针剂和胶囊)治疗后均明显下降(P＜0.05或P＜0.01)，而在氧化苦参碱针剂和胶囊组之间未见差异。2)氧化苦参碱治疗后肝组织学变化氧化苦参碱治疗组、比较治疗组和比较对照组经氧化苦参碱治疗后其组织学均较空白对照组有明显的改善。而在氧化苦参碱治疗组、比较治疗组和比较对比组之间无差异。
由上述公开的毒性试验、药理试验和临床试验可见(1)氧化苦参碱可明显抑制肝星状细胞和NIH 3T3细胞的增殖及细胞外基质的合成，体内动物实验显示其有抗肝纤维化的作用；(2)临床研究显示，氧化苦参碱有较好的降酶效果，ALT复常率在55.22％～66.67％，肝纤维化血清相关标志物及肝组织学均有明显改善，且氧化苦参碱针剂和胶囊之间无明显差异；(3)将氧化苦参碱用于制造治疗肝纤维化药物，能治疗肝纤维化，改善临床症状，效果明显。
(4)氧化苦参碱毒性非常低，临床使用安全、方便。
以下将通过实施例对本发明进行说明。
实施例1用1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将100g氧化苦参碱溶解，混合均匀，消毒配制成200mg/2ml/支的注射剂，装瓶制成品。
实施例2用1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将100g氧化苦参碱溶解，混合均匀，消毒配制成100mg/1ml/支的注射剂，装瓶制成品。
实施例3按本领域技术人员公知的方法制备氧化苦参碱胶囊，以淀粉为填充剂，以8％淀粉浆为粘合剂，制成颗粒，然后装胶囊，制成的胶囊规格为100mg/囊。配方如下氧化苦参碱100克淀粉 85克淀粉浆8％ 适量。
权利要求
1.氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的新用途。该物质具有较好的抗肝纤维化的作用,可明显抑制肝星状细胞和NIH 3T3细胞的增殖及细胞外基质的合成;其能明显降低肝纤维化大鼠血清肝纤维化标志物水平及减轻肝纤维化组织学变化;其对肝纤维化患者有较好的降酶效果,ALT复常率在55.22%～66.67%,肝纤维化血清标志物及肝组织学有明显的改善,且能够改善肝纤维化患者的临床症状;氧化苦参碱毒性低,临床使用安全、方便。
文档编号A61K31/4545GK1350849SQ0012589
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月31日 优先权日2000年10月31日
发明者王忠效, 吴同新, 陆伦根, 何志锋 申请人:上海绿谷伟业生态工程有限公司
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