钟蛋白穿膜肽药物载体的制作方法
专利名称：钟蛋白穿膜肽药物载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药，特别是一种药物载体。该药物载体命名为钟蛋白穿膜肽药物载体。
背景技术：
人体天然的生物屏障，如血脑屏障、细胞膜屏障等，虽有重要的保护作用，但使许多药物达不到治疗部位或在治疗部位的浓度远低于有效治疗浓度而不能充分发挥药效，不利于这些部位病变的治疗。为了克服血脑屏障、细胞膜屏障对药物转运的限制，已有用渗透压来打开内皮细胞间的紧密连接以打开血脑屏障，但这样做极具侵袭性，易使不需要的甚至是有害的物质进入颅内；有用脂质体包裹药物来突破细胞膜屏障，效果虽好，但有一定细胞毒性；有用亲脂性的前体药物来通过亲脂性生物膜，虽然能通过血脑屏障和细胞膜屏障，但这种方法通常不易实现。此外，病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒等)用于基因治疗时，也能跨越血脑屏障和细胞膜屏障，但是由于病毒基因易突变性，使病毒载体对人体有潜在的致病性。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种能携带药物直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障的钟蛋白穿膜肽药物载体。
研究发现一类蛋白结构域具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等极性大分子直接穿过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一蛋白结构域命名为穿膜肽(MembranePenetrating Peptide，MPP)。这一类蛋白可以作为药物载体携带药物穿过血脑屏障、细胞膜屏障等，提高药物的疗效。
本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，结构式为X-C-Y，其中，X和Y均是任意的氨基酸序列、核酸序列或无，C是一种穿膜肽其氨基酸序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体中，C是人的节律蛋白中CLOCK蛋白(钟蛋白)里的一段氨基酸序列。由于C来源于人，应用于人体上时不会引起免疫上的问题。C具有穿膜肽的特性，可以直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障等。钟蛋白穿膜肽药物载体可以单独或携带药物穿过血脑屏障、细胞膜屏障等，提高药物在特定区域的浓度，提高药物的疗效。上述穿膜肽具有如下特性1)非能量依赖性，非经典胞吞作用。实验证明在4℃时，尽管胞吞作用已失活，但是MPP和MPP融合蛋白仍能快速有效地进入细胞，且穿膜效率与在37℃时没有明显差别。(2)可以与其它较大分子的多肽、蛋白质、核酸及金属螯合物共价连接，仍能保持MPP穿膜活性和被介导物质的活性。本发明所述钟蛋白穿膜肽药物载体中C连接药物的方法，即在多肽上连接药物的方法，是本领域技术人员所熟知的方法。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体，其结构式可以是只有单独的穿膜肽C。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体，其结构式可以是X-C-Y、C-Y、X-C，即可以在穿膜肽C的两端的氨基端或羧基端加上基团进行修饰但不影响其生物学性质的组合物，或者是其连接上任意氨基酸序列或核酸序列或其它分子。
在上述X-C-Y结构式中，Y可以为多肽p53(12-26)，多肽p53(12-26)连接在穿膜肽C的羧基端，其序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25在上述X-C-Y结构式中，Y可以为多肽p53(12-26)，而X可以无。其结构式为X-C-多肽p53(12-26)、C-多肽p53(12-26)。
上述的多肽p53(12-26)，是人来源p53蛋白中包含第12到第26个氨基酸的氨基酸序列，Y连接在穿膜肽C的羧基端。该钟蛋白穿膜肽药物载体可以是指将编码上述氨基酸序列穿膜肽C的核酸序列和编码Y多肽p53(12-26)的核酸序列放置于同一阅读框内，通过表达这一阅读框中的核酸序列而形成钟蛋白穿膜肽药物载体X-C-Y。
上述的氨基酸序列中的氨基酸可以是未经修饰的天然氨基酸，也可以是经化学或其它方式修饰过的氨基酸而不影响该序列的生物学特性。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体可以采用通常的化学合成法合成。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体穿过细胞膜屏障、血脑屏障的实验氨基端标记荧光素FITC(异硫氰酸荧光素)，高效液相色谱法分析纯度，纯度大于95％。取两个六孔板，加入载玻片，接种ECV(血管内皮细胞)，密度为2*105/孔，培养过夜(约16h)，在细胞贴壁后，更换新鲜培养液，一个6孔板放入4℃冰箱中，一个继续在37℃的孵箱中，30分钟后，去掉培养液，更换含有上述穿膜肽C的1640培养液1ml。细胞与穿膜肽C孵化一定时间后，去掉培养液，细胞用PBS洗3次，用3.7％的多聚甲醛溶液(PBS配置)在室温下固定5分钟，再用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗3次，在荧光显微镜下观察。可见带有荧光的肽段穿过细胞膜聚集在核中。穿膜肽C在浓度为1μM/L时，分别在4℃和37℃时二者穿膜效率相当。由于在4℃时，细胞的胞吞作用失活，说明胞吞作用在穿膜肽的内化过程中不占主导作用。
对照组采用FITC荧光素在浓度为10μM/L时对血管内皮细胞ECV-304的作用，显示FITC荧光素不能直接进入细胞内。
大鼠颈动脉注射氨基端标记FITC荧光素的上述氨基酸序列的穿膜肽C，200nmol/只，在30分钟后取脑，做冠状切片，铺片后荧光显微镜下观察。可见带有荧光的肽段进入脑中。
小鼠腹腔注射氨基端标记FITC荧光素上述氨基酸序列的穿膜肽C，40nmol/只，在40分钟后取脑，做冠状切片，铺片后荧光显微镜下观察。可见带有荧光的穿膜肽C进入脑中。
实验证明，本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体能携带药物直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障，使药物能直达病变部位，从而能提高药物的疗效。可用于携带药物治疗肿瘤，尤其可用于治疗乳腺癌，使肿瘤细胞坏死而不影响正常细胞。
下面将用实施例来进一步说明本发明。
具体实施例方式
实施例1本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其结构式为X-C-Y，其中X、Y为无，即只有单独的穿膜肽C，其氨基酸序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。
采用已有的固相多肽化学合成方法来合成穿膜肽C。Merrifield的(Merrifield RB.1963 J Am Chem soc.852149)。其步骤如下取适量的肽合成树脂放入反应管中。加入溶剂使树脂溶胀。按穿膜肽C的序列依次加入Fomc保护的氨基酸适量于容器中。按多肽固相化学合成方法，根据穿膜肽C的序列从C端开始进行多肽合成。向反应管中加入含六氢吡啶20％的DMF Deblock液洗脱树脂的Fomc保护基团。加入DMF溶解的Fomc保护的氨基酸适量于反应管中。然后加入二异丙基乙胺和氮杂苯并三唑甲基脲六磷酸盐的DMF溶液进行偶联反应。再用DMF洗去未反应的Fomc保护的氨基酸，采用惰性气体吹干。反复循环进行上述步骤，直至按穿膜肽C的序列合成的多肽序列完成。从反应管中取出树脂，在冷冻干燥机中冷冻干燥备用。把干燥后的树脂放入合适的容器中。向容器中加入裂解液，裂解液配方为三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶苯甲醚1，2-乙二硫醇为90∶5∶2∶3(体积比)。在室温下避光静置两小时。过滤，保留滤液，将滤液浓缩。浓缩滤液加入冰冻的无水乙醚中，冰冻静置12小时。离心，保留沉淀。沉淀用冰醋酸溶解后，再冷冻干燥，得到粗制品。将粗制品用高效液相法精制得到结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体。高效液相法采用C-18反相柱，流动相A液为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液。
实施例2本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，是一种结构式为C-Y的融合蛋白，其序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25采用与实施例1相同的固相多肽化学合成方法合成，其步骤如下取适量的肽合成树脂放入反应管中。加入溶剂使树脂溶胀。按该融合蛋白的序列依次加入Fomc保护的氨基酸适量于容器中。按多肽固相化学合成方法，根据融合蛋白的序列从C端开始进行多肽合成。向反应管中加入含六氢吡啶20％的DMF Deblock液洗脱树脂的Fomc保护基团。加入DMF溶解的Fomc保护的氨基酸适量于反应管中。然后加入二异丙基乙胺和氮杂苯并三唑甲基脲六磷酸盐的DMF溶液进行偶联反应。再用DMF洗去未反应的Fomc保护的氨基酸，采用惰性气体吹干。反复循环进行上述步骤，直至按融合蛋白的序列合成的多肽序列完成。从反应管中取出树脂，在冷冻干燥机中冷冻干燥备用。把干燥后的树脂放入合适的容器中。向容器中加入裂解液，裂解液配方为三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶苯甲醚∶1，2-乙二硫醇为90∶5∶2∶3(体积比)。在室温下避光静置两小时。过滤，保留滤液，将滤液浓缩。浓缩滤液加入冰冻的无水乙醚中，冰冻静置12小时。离心，保留沉淀。沉淀用冰醋酸溶解后，再冷冻干燥，得到粗制品。将粗制品用高效液相法精制得到结构式为C-Y的融合蛋白。高效液相法采用C-18反相柱，流动相A液为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液。
实施例3本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，是一种结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体。合成编码结构式为C，其中，穿膜肽C的核酸序列即合成编码序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10的核酸序列即穿膜肽C基因。
其制备方法用质粒抽提试剂盒提取纯化质粒pET32a，将质粒用BamHI和Xho I酶切。把穿膜肽C基因和酶切后的质粒以摩尔比3∶1的比例混合，使用连接试剂盒，按操作指南在16℃反应12小时。使用质粒回收试剂盒回收质粒，将质粒转化入感受态菌中。筛选阳性转化菌落。将筛选出的菌落用LB培养基37℃培养过夜。收集菌液使用质粒小量抽提试剂盒抽提纯化质粒即得到所要的结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体的表达载体。再将穿膜肽C的上述表达载体转化入感受态菌JM109。挑取阳性单克隆，过夜培养，加入IPTG至终浓度为1mol/L。诱导后，离心收集菌体进行分析。挑取表达水平高的克隆扩大培养，诱导表达后收集菌体，悬浮于PBS中，超声裂菌、离心，弃去上清。向沉淀中加入2mol/L尿素，悬浮沉淀后，离心弃去上清，以除去杂蛋白。再用8mol/L尿素溶解沉淀的蛋白，用变性稀释液稀释4倍，过滤除去不溶性组分后，在Ni-NTA-agarose柱上进行亲和层析。用6mol/L盐酸胍洗去杂蛋白，最后用250mmol/L尿素洗脱。收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存。得到结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体。
实施例4本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，是一种结构为C-Y融合蛋白，其中，C为穿膜肽，序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10的氨基酸序列，其中Xaa＝Val或Ala，Y为多肽p53(12-26)是人来源p53蛋白中包含第12到第26个氨基酸的氨基酸序列，Y连接在穿膜肽C的羧基端。
该融合蛋白的序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25其制备方法合成编码穿膜肽C的核酸序列，再合成编码Y为p53(12-26)的核酸序列。将两段核酸用Qiagen公司的连接试剂盒，16℃连接12h，具体步骤参见Qiagen公司的连接试剂盒说明书。将上面合成的DNA片段插入经BamHI和Xho I酶切的质粒pET32a中，回收纯化质粒，即得C-Y融合蛋白的质粒。将C-Y融合蛋白质粒转化入感受态菌JM109。挑取阳性单克隆，过夜培养，加入IPTG至终浓度为1mol/L。诱导后，离心收集菌体进行分析。挑取表达水平高的克隆扩大培养，诱导表达后收集菌体，悬浮于PBS中，超声裂菌、离心，弃去上清。向沉淀中加入2mol/L尿素，悬浮沉淀后，离心弃去上清，以除去杂蛋白。再用8mol/L尿素溶解沉淀的蛋白，用变性稀释液稀释4倍，过滤除去不溶性组分后，在Ni-NTA-agarose柱上进行亲和层析。用6mol/L盐酸胍洗去杂蛋白，最后用250mmol/L尿素洗脱。收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存。得到结构为C-Y的融合蛋白。
实施例5本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，结构式为C-Y，其中Y为核酸分子。
按实施例1中所述固相法合成序列如下的穿膜肽CLys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其制备方法高相液相法分离纯化穿膜肽C。固相法合成反义核酸HS-(CH2)6-5’-O-CACTGCACAGTCAGATGCTAGTGA-3’-O-CH2CH(CH2OH)-(CH2)4NH2，高效液相法分离纯化。将反义核酸溶解在1.5ml含有0.1mol/L KH2PO4(PH7.5)，0.3mol/L KBr，8mol/L尿素的缓冲液中，溶液中导入氩气，再加入穿膜肽C，反应过夜后，用高效液相法分离纯化反应产物，得到本实施例结构为C-Y的钟蛋白穿膜肽药物载体。
<110>四川大学 王正荣<120>钟蛋白穿膜肽药物载体<160>2<210>1<211>13<212>PRT<213>人种(Homo sapiens.)<220>
<221>SITE<222>(3)<223>Xaa＝Val或Ala<400>1Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10<210>2
<211>28<212>PRT<213>人种(Homo sapiens.)<220>
<221>SITE<222>(3)<223>Xaa＝Val或Ala<400>2Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 2权利要求
1.一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其特征是结构式为X-C-Y，其中，X和Y均是氨基酸序列、核酸序列或无，C是一种穿膜肽，其氨基酸序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。
2.根据权利要求1的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其特征是Y为多肽p53(12-26)，是人来源p53蛋白中包含第12到第26个氨基酸的氨基酸序列，p53(12-26)连接在穿膜肽C的羧基端，其序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25
3.根据权利要求2的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其特征是X为无。
全文摘要
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体，涉及医药，特别是一种能穿过血脑屏障、细胞膜屏障的药物载体。旨在解决已有不能穿过血脑屏障、细胞膜屏障的药物不能直达变病部位的问题。本药物载体的结构式为X－C－Y，其中，X和Y均是氨基酸序列、核酸序列或无，C是一种穿膜肽，其氨基酸序列为上式。其中Xaa＝Val或Ala。本药物载体能携带药物直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障，直达病变部位，从而能提高药物的疗效。可用于携带药物治疗肿瘤，尤其可用于治疗乳腺癌，使肿瘤细胞坏死而不影响正常细胞。
文档编号A61K47/42GK1600372SQ0313591
公开日2005年3月30日 申请日期2003年9月26日 优先权日2003年9月26日
发明者王正荣, 彭涛, 杨春蕾, 王跃锜 申请人:王正荣, 四川大学
技术领域：
本发明涉及医药，特别是一种药物载体。该药物载体命名为钟蛋白穿膜肽药物载体。
背景技术：
人体天然的生物屏障，如血脑屏障、细胞膜屏障等，虽有重要的保护作用，但使许多药物达不到治疗部位或在治疗部位的浓度远低于有效治疗浓度而不能充分发挥药效，不利于这些部位病变的治疗。为了克服血脑屏障、细胞膜屏障对药物转运的限制，已有用渗透压来打开内皮细胞间的紧密连接以打开血脑屏障，但这样做极具侵袭性，易使不需要的甚至是有害的物质进入颅内；有用脂质体包裹药物来突破细胞膜屏障，效果虽好，但有一定细胞毒性；有用亲脂性的前体药物来通过亲脂性生物膜，虽然能通过血脑屏障和细胞膜屏障，但这种方法通常不易实现。此外，病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒等)用于基因治疗时，也能跨越血脑屏障和细胞膜屏障，但是由于病毒基因易突变性，使病毒载体对人体有潜在的致病性。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种能携带药物直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障的钟蛋白穿膜肽药物载体。
研究发现一类蛋白结构域具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等极性大分子直接穿过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一蛋白结构域命名为穿膜肽(MembranePenetrating Peptide，MPP)。这一类蛋白可以作为药物载体携带药物穿过血脑屏障、细胞膜屏障等，提高药物的疗效。
本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，结构式为X-C-Y，其中，X和Y均是任意的氨基酸序列、核酸序列或无，C是一种穿膜肽其氨基酸序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体中，C是人的节律蛋白中CLOCK蛋白(钟蛋白)里的一段氨基酸序列。由于C来源于人，应用于人体上时不会引起免疫上的问题。C具有穿膜肽的特性，可以直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障等。钟蛋白穿膜肽药物载体可以单独或携带药物穿过血脑屏障、细胞膜屏障等，提高药物在特定区域的浓度，提高药物的疗效。上述穿膜肽具有如下特性1)非能量依赖性，非经典胞吞作用。实验证明在4℃时，尽管胞吞作用已失活，但是MPP和MPP融合蛋白仍能快速有效地进入细胞，且穿膜效率与在37℃时没有明显差别。(2)可以与其它较大分子的多肽、蛋白质、核酸及金属螯合物共价连接，仍能保持MPP穿膜活性和被介导物质的活性。本发明所述钟蛋白穿膜肽药物载体中C连接药物的方法，即在多肽上连接药物的方法，是本领域技术人员所熟知的方法。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体，其结构式可以是只有单独的穿膜肽C。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体，其结构式可以是X-C-Y、C-Y、X-C，即可以在穿膜肽C的两端的氨基端或羧基端加上基团进行修饰但不影响其生物学性质的组合物，或者是其连接上任意氨基酸序列或核酸序列或其它分子。
在上述X-C-Y结构式中，Y可以为多肽p53(12-26)，多肽p53(12-26)连接在穿膜肽C的羧基端，其序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25在上述X-C-Y结构式中，Y可以为多肽p53(12-26)，而X可以无。其结构式为X-C-多肽p53(12-26)、C-多肽p53(12-26)。
上述的多肽p53(12-26)，是人来源p53蛋白中包含第12到第26个氨基酸的氨基酸序列，Y连接在穿膜肽C的羧基端。该钟蛋白穿膜肽药物载体可以是指将编码上述氨基酸序列穿膜肽C的核酸序列和编码Y多肽p53(12-26)的核酸序列放置于同一阅读框内，通过表达这一阅读框中的核酸序列而形成钟蛋白穿膜肽药物载体X-C-Y。
上述的氨基酸序列中的氨基酸可以是未经修饰的天然氨基酸，也可以是经化学或其它方式修饰过的氨基酸而不影响该序列的生物学特性。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体可以采用通常的化学合成法合成。
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体穿过细胞膜屏障、血脑屏障的实验氨基端标记荧光素FITC(异硫氰酸荧光素)，高效液相色谱法分析纯度，纯度大于95％。取两个六孔板，加入载玻片，接种ECV(血管内皮细胞)，密度为2*105/孔，培养过夜(约16h)，在细胞贴壁后，更换新鲜培养液，一个6孔板放入4℃冰箱中，一个继续在37℃的孵箱中，30分钟后，去掉培养液，更换含有上述穿膜肽C的1640培养液1ml。细胞与穿膜肽C孵化一定时间后，去掉培养液，细胞用PBS洗3次，用3.7％的多聚甲醛溶液(PBS配置)在室温下固定5分钟，再用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗3次，在荧光显微镜下观察。可见带有荧光的肽段穿过细胞膜聚集在核中。穿膜肽C在浓度为1μM/L时，分别在4℃和37℃时二者穿膜效率相当。由于在4℃时，细胞的胞吞作用失活，说明胞吞作用在穿膜肽的内化过程中不占主导作用。
对照组采用FITC荧光素在浓度为10μM/L时对血管内皮细胞ECV-304的作用，显示FITC荧光素不能直接进入细胞内。
大鼠颈动脉注射氨基端标记FITC荧光素的上述氨基酸序列的穿膜肽C，200nmol/只，在30分钟后取脑，做冠状切片，铺片后荧光显微镜下观察。可见带有荧光的肽段进入脑中。
小鼠腹腔注射氨基端标记FITC荧光素上述氨基酸序列的穿膜肽C，40nmol/只，在40分钟后取脑，做冠状切片，铺片后荧光显微镜下观察。可见带有荧光的穿膜肽C进入脑中。
实验证明，本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体能携带药物直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障，使药物能直达病变部位，从而能提高药物的疗效。可用于携带药物治疗肿瘤，尤其可用于治疗乳腺癌，使肿瘤细胞坏死而不影响正常细胞。
下面将用实施例来进一步说明本发明。
具体实施例方式
实施例1本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其结构式为X-C-Y，其中X、Y为无，即只有单独的穿膜肽C，其氨基酸序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。
采用已有的固相多肽化学合成方法来合成穿膜肽C。Merrifield的(Merrifield RB.1963 J Am Chem soc.852149)。其步骤如下取适量的肽合成树脂放入反应管中。加入溶剂使树脂溶胀。按穿膜肽C的序列依次加入Fomc保护的氨基酸适量于容器中。按多肽固相化学合成方法，根据穿膜肽C的序列从C端开始进行多肽合成。向反应管中加入含六氢吡啶20％的DMF Deblock液洗脱树脂的Fomc保护基团。加入DMF溶解的Fomc保护的氨基酸适量于反应管中。然后加入二异丙基乙胺和氮杂苯并三唑甲基脲六磷酸盐的DMF溶液进行偶联反应。再用DMF洗去未反应的Fomc保护的氨基酸，采用惰性气体吹干。反复循环进行上述步骤，直至按穿膜肽C的序列合成的多肽序列完成。从反应管中取出树脂，在冷冻干燥机中冷冻干燥备用。把干燥后的树脂放入合适的容器中。向容器中加入裂解液，裂解液配方为三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶苯甲醚1，2-乙二硫醇为90∶5∶2∶3(体积比)。在室温下避光静置两小时。过滤，保留滤液，将滤液浓缩。浓缩滤液加入冰冻的无水乙醚中，冰冻静置12小时。离心，保留沉淀。沉淀用冰醋酸溶解后，再冷冻干燥，得到粗制品。将粗制品用高效液相法精制得到结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体。高效液相法采用C-18反相柱，流动相A液为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液。
实施例2本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，是一种结构式为C-Y的融合蛋白，其序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25采用与实施例1相同的固相多肽化学合成方法合成，其步骤如下取适量的肽合成树脂放入反应管中。加入溶剂使树脂溶胀。按该融合蛋白的序列依次加入Fomc保护的氨基酸适量于容器中。按多肽固相化学合成方法，根据融合蛋白的序列从C端开始进行多肽合成。向反应管中加入含六氢吡啶20％的DMF Deblock液洗脱树脂的Fomc保护基团。加入DMF溶解的Fomc保护的氨基酸适量于反应管中。然后加入二异丙基乙胺和氮杂苯并三唑甲基脲六磷酸盐的DMF溶液进行偶联反应。再用DMF洗去未反应的Fomc保护的氨基酸，采用惰性气体吹干。反复循环进行上述步骤，直至按融合蛋白的序列合成的多肽序列完成。从反应管中取出树脂，在冷冻干燥机中冷冻干燥备用。把干燥后的树脂放入合适的容器中。向容器中加入裂解液，裂解液配方为三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶苯甲醚∶1，2-乙二硫醇为90∶5∶2∶3(体积比)。在室温下避光静置两小时。过滤，保留滤液，将滤液浓缩。浓缩滤液加入冰冻的无水乙醚中，冰冻静置12小时。离心，保留沉淀。沉淀用冰醋酸溶解后，再冷冻干燥，得到粗制品。将粗制品用高效液相法精制得到结构式为C-Y的融合蛋白。高效液相法采用C-18反相柱，流动相A液为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液。
实施例3本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，是一种结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体。合成编码结构式为C，其中，穿膜肽C的核酸序列即合成编码序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10的核酸序列即穿膜肽C基因。
其制备方法用质粒抽提试剂盒提取纯化质粒pET32a，将质粒用BamHI和Xho I酶切。把穿膜肽C基因和酶切后的质粒以摩尔比3∶1的比例混合，使用连接试剂盒，按操作指南在16℃反应12小时。使用质粒回收试剂盒回收质粒，将质粒转化入感受态菌中。筛选阳性转化菌落。将筛选出的菌落用LB培养基37℃培养过夜。收集菌液使用质粒小量抽提试剂盒抽提纯化质粒即得到所要的结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体的表达载体。再将穿膜肽C的上述表达载体转化入感受态菌JM109。挑取阳性单克隆，过夜培养，加入IPTG至终浓度为1mol/L。诱导后，离心收集菌体进行分析。挑取表达水平高的克隆扩大培养，诱导表达后收集菌体，悬浮于PBS中，超声裂菌、离心，弃去上清。向沉淀中加入2mol/L尿素，悬浮沉淀后，离心弃去上清，以除去杂蛋白。再用8mol/L尿素溶解沉淀的蛋白，用变性稀释液稀释4倍，过滤除去不溶性组分后，在Ni-NTA-agarose柱上进行亲和层析。用6mol/L盐酸胍洗去杂蛋白，最后用250mmol/L尿素洗脱。收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存。得到结构式为C的钟蛋白穿膜肽药物载体。
实施例4本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，是一种结构为C-Y融合蛋白，其中，C为穿膜肽，序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10的氨基酸序列，其中Xaa＝Val或Ala，Y为多肽p53(12-26)是人来源p53蛋白中包含第12到第26个氨基酸的氨基酸序列，Y连接在穿膜肽C的羧基端。
该融合蛋白的序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25其制备方法合成编码穿膜肽C的核酸序列，再合成编码Y为p53(12-26)的核酸序列。将两段核酸用Qiagen公司的连接试剂盒，16℃连接12h，具体步骤参见Qiagen公司的连接试剂盒说明书。将上面合成的DNA片段插入经BamHI和Xho I酶切的质粒pET32a中，回收纯化质粒，即得C-Y融合蛋白的质粒。将C-Y融合蛋白质粒转化入感受态菌JM109。挑取阳性单克隆，过夜培养，加入IPTG至终浓度为1mol/L。诱导后，离心收集菌体进行分析。挑取表达水平高的克隆扩大培养，诱导表达后收集菌体，悬浮于PBS中，超声裂菌、离心，弃去上清。向沉淀中加入2mol/L尿素，悬浮沉淀后，离心弃去上清，以除去杂蛋白。再用8mol/L尿素溶解沉淀的蛋白，用变性稀释液稀释4倍，过滤除去不溶性组分后，在Ni-NTA-agarose柱上进行亲和层析。用6mol/L盐酸胍洗去杂蛋白，最后用250mmol/L尿素洗脱。收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存。得到结构为C-Y的融合蛋白。
实施例5本发明的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，结构式为C-Y，其中Y为核酸分子。
按实施例1中所述固相法合成序列如下的穿膜肽CLys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其制备方法高相液相法分离纯化穿膜肽C。固相法合成反义核酸HS-(CH2)6-5’-O-CACTGCACAGTCAGATGCTAGTGA-3’-O-CH2CH(CH2OH)-(CH2)4NH2，高效液相法分离纯化。将反义核酸溶解在1.5ml含有0.1mol/L KH2PO4(PH7.5)，0.3mol/L KBr，8mol/L尿素的缓冲液中，溶液中导入氩气，再加入穿膜肽C，反应过夜后，用高效液相法分离纯化反应产物，得到本实施例结构为C-Y的钟蛋白穿膜肽药物载体。
<110>四川大学 王正荣<120>钟蛋白穿膜肽药物载体<160>2<210>1<211>13<212>PRT<213>人种(Homo sapiens.)<220>
<221>SITE<222>(3)<223>Xaa＝Val或Ala<400>1Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10<210>2
<211>28<212>PRT<213>人种(Homo sapiens.)<220>
<221>SITE<222>(3)<223>Xaa＝Val或Ala<400>2Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 2权利要求
1.一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其特征是结构式为X-C-Y，其中，X和Y均是氨基酸序列、核酸序列或无，C是一种穿膜肽，其氨基酸序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。
2.根据权利要求1的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其特征是Y为多肽p53(12-26)，是人来源p53蛋白中包含第12到第26个氨基酸的氨基酸序列，p53(12-26)连接在穿膜肽C的羧基端，其序列为Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25
3.根据权利要求2的一种钟蛋白穿膜肽药物载体，其特征是X为无。
全文摘要
本发明的钟蛋白穿膜肽药物载体，涉及医药，特别是一种能穿过血脑屏障、细胞膜屏障的药物载体。旨在解决已有不能穿过血脑屏障、细胞膜屏障的药物不能直达变病部位的问题。本药物载体的结构式为X－C－Y，其中，X和Y均是氨基酸序列、核酸序列或无，C是一种穿膜肽，其氨基酸序列为上式。其中Xaa＝Val或Ala。本药物载体能携带药物直接穿过血脑屏障、细胞膜屏障，直达病变部位，从而能提高药物的疗效。可用于携带药物治疗肿瘤，尤其可用于治疗乳腺癌，使肿瘤细胞坏死而不影响正常细胞。
文档编号A61K47/42GK1600372SQ0313591
公开日2005年3月30日 申请日期2003年9月26日 优先权日2003年9月26日
发明者王正荣, 彭涛, 杨春蕾, 王跃锜 申请人:王正荣, 四川大学
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