具有肝细胞保护功能的药物组合物的制作方法
专利名称：具有肝细胞保护功能的药物组合物的制作方法
发明的所属领域本发明涉及抑酶肽，特别是涉及具有肝细胞保护功能的天然或重组来源的抑酶肽。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的抑酶肽及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所说的药物组合物在预防和治疗病理性肝损伤中的应用。
背景技术：
抑酶肽是一种由58个氨基酸组成的并且分子量为6512道尔顿的单链碱性多肽。因为抑酶肽的分子量相对较小、结构稳定而且功能明确，所以已对其进行了较为深入的研究。抑酶肽是一种天然存在于牛的肺、淋巴结、腮腺、脾、肝和胰腺等多种器官和组织中的丝氨酸蛋白酶家族成员的抑制剂，所以又称为牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)。
另外，抑酶肽也可作为某些重组蛋白质产品和蛋白质类免疫检测试剂的保护剂，以防止它们遭受蛋白酶的破坏。
虽然可以从牛的肺、脾、肝和胰腺等组织中分离并提取得到基本上纯的抑酶肽，但从动物中提取是一种十分费时耗力的方法，而且还需要大量的牛器官和组织。为了适应对抑酶肽的客观需求，人们现在不仅能够利用原核、真核(包括植物细胞)和酵母表达系统表达天然抑酶肽，而且同样以基因重组方法制备了许多改善了理化和生物学性质的抑酶肽类似物或突变体(例如参见美国专利5,231,010、5,373,090、5,571,603、5,707,831、5,770,568、5,824,870和6,482,798号)。
已知可被抑酶肽抑制的酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶和纤溶酶等(HFritz And G.Wunderer，Drug.Res.，33，479-494，1983)。作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和活性药物成分，抑酶肽的基本作用在于将病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，例如用于治疗创伤出血性休克和抑制纤溶酶活性等(J.McMichan et al.，Circulatory Shock 9，107，1982；L.M.Auer et al.，Acta Neurochir.49，207，1979)。
天然胰蛋白酶抑制剂存在于胰腺的腺泡细胞内，正常情况下随各种胰酶一起分泌，从而使胰蛋白酶不能在胰组织内发挥其蛋白水解作用。当发生急性胰腺炎时，胰蛋白酶和胰蛋白酶原及其他某些前体酶通过一系列级联反应被激活，因此很可能导致胰腺的自身消化。在这种情况下，使用包括抑酶肽在内的胰蛋白酶抑制剂治疗将是很有效的。
然而，迄今为止尚未见使用抑酶肽治疗各种原因导致的病理性肝组织损伤的报道。
发明的目的本发明的一个目的是提供一种用于预防和治疗病理性肝损伤的基本上由抑酶肽或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑肽酶是天然来源的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑肽酶是重组来源的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物还可含有一种或多种具有协同或辅助作用的天然或合成或重组来源的其他成分。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道途径给药的剂型。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道外途径给药的剂型。
本发明的另一个目的是提供天然或重组来源的抑酶肽或其类似物在生产用于预防和治疗病理牲肝损伤的药物中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑酶肽或其类似物通过抑制肝细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高受损肝细胞的存活性。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
发明的详细描述本发明涉及抑酶肽，特别是涉及具有肝细胞保护活性的天然或重组来源的抑酶肽或其类似物。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的抑酶肽或其类似物及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所说的药物组合物在预防和治疗病理性肝损伤中的应用。
Horiuti和Asami等人(J.Biochem.92，1985-1994，1982；J.Biochem.95，299-309，1984)的早期研究发现，牛垂体中纯化的被鉴定为牛胰蛋白酶抑制剂的因子可作用于大鼠肝细胞的表面并使细胞在无血清培养基中的存活期延长。进一步的研究表明，牛血清中的胰蛋白酶抑制剂对肝细胞存活性的这种刺激作用可能是通过抑制定位于细胞浆膜表面上的丝氨酸蛋白酶实现的。
为了证实Horiuti和Asami等人的早期发现，本发明人在体外细胞学实验中进一步观察了由牛肺组织中提取的胰蛋白酶抑制剂(抑酶肽)对野生型甲型肝炎病毒感染的和高浓度庆大霉素(作为一种肝细胞毒性因子)处理的大鼠肝细胞生长的影响。结果发现，抑酶肽不仅对正常肝细胞，而且对遭受生物和化学损伤的肝细胞的存活性也有明显的改善作用。特别是我们的观察还发现，与对照组相比，用抑酶肽处理的受损肝细胞基本上保持了原代细胞较为完整的细胞形态和功能。
在上述体外实验的基础上，我们进一步观察了抑酶肽和其药物组合物对活体肝炎动物模型的血清转氨酶水平的影响，同时对各实验组动物的肝脏组织进行了组织病理学观察。结果令人惊奇地发现，与对照组相比，静脉内接受抑酶肽治疗的实验组动物的血清转氨酶显著降低。而且病理学检查结果可见，出现肝组织散在小坏死病灶和汇管区少数炎性细胞侵润的动物数明显减少。
基于这些实验结果，我们初步认定抑酶肽有可能作为一种新的肝细胞保护剂，用于预防和治疗各种原因特别是毒性因子导致的急性肝细胞损伤。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有肝细胞保护活性的基本上由抑酶肽及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑酶肽可以是天然来源的，例如可以是使用硫酸铵和碱沉淀、离子交换、凝胶过滤和高压液相层析等常规方法从牛的肺、肝或胰腺组织中提取的。或者，用于本发明的抑酶肽也可以是重组来源的，例如，可以是按照已知的DNA重组方法，使用原核、真核或酵母表达系统表达产生的。另外，用于本发明的抑酶肽可以是具有天然野生序列的生物学活性多肽，但也可以是为改善产物的生物学活性，或为提高产物的产率或药物动力学性质目的而在基因水平上进行了必要的修饰的抑酶肽类似物或突变体。这里所说的修饰可以是内部或N末端个别或部分氨基酸的加入、缺失或取代。例如，这样的修饰可以是分子中第15位赖氨酸被其他氨基酸取代的抑酶肽类似物(美国专利4,595,674号)，或者可以是分子中第17和38位氨基酸分别被Ala和Thr取代的抑酶肽类似物(Market al.，Science 2351370-1373)。
本发明涉及的抑酶肽可以单独使用，也可以作为有各种不同剂型的药物组合物的形式使用。可以使用制药工业领域已知的方法(参见Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以适于口服或非口服给药的单位计量形式制备本发明的药物组合物。例如，可将作为活性成分的有效量的抑酶肽与医药上可接受的载体或赋形剂均匀地混合，制成溶液或悬浮液形式的适于静脉内、肌肉内、器官腔内、皮内和皮下等胃肠道外途径给药的药物组合物；或者也可以制成片剂、胶囊剂、粉末剂、乳剂、颗粒剂等形式的适于经胃肠道途径给药的药物组合物。
根据本发明的药物组合物，其中所使用的医药上可接受的载体或赋形剂将依据所制备的本发明药物组合物的剂型而有不同的选择。
适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油和氢化萘等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，以控制活性成分的缓慢释放。在其他适于胃肠道外给药的制剂中，还包括含有水杨酸的直肠给药制剂和含有甘胆酸盐的含服给药制剂。
具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、甜味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂。
可以使用乳糖和甘露醇等赋形剂，淀粉等崩解剂，明胶等黏结剂，以常规方法制备颗粒剂。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等赋形剂，以常规方法制备粉末剂。使用明胶、水、蔗糖、阿拉伯胶、山梨醇、甘油、结晶纤维素、硬脂酸镁和滑石等，以常规方法制备胶囊剂。
可以使用水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，苯甲酸钠，水杨酸钠和氨基甲酸乙酯等增溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，青霉素和链霉素及其他抗真菌剂等抗生素，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备可注射剂。
在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并且能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。
另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。
本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分的天然或重组产生的抑酶肽或其类似物或突变体外，还可含有一种或多种合成的、天然的或重组来源的具有协同或辅助作用的其他活性成分。这些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或调节活性、病毒复制抑制活性、功能性肝细胞修复活性的其他成分，例如可以是干扰素、白介素、胸腺素、肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子等。
本发明的药物组合物对功能性肝细胞具有良好的保护作用。虽然有关作用机理目前尚不明确，但我们推测可能与抑酶肽或其类似物作用于肝细胞并抑制细胞表面上的丝氨酸蛋白酶类有关。
可使用本发明的药物组合物预防或治疗的疾病包括但不只限于人或哺乳动物的急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭等。
基于以上的描述，本领域技术人员完全可以理解到也可以单独将天然或重组来源的抑酶肽或其类似物用于生产预防和治疗病理性肝损伤的药物。
因此，本发明的另一个目的是提供天然或重组来源的抑酶肽或其类似物在生产用于预防和治疗病理性肝损伤的药物中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑酶肽或其类似物通过抑制肝细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高受损肝细胞的存活性。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤包括但不只限于急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭等。
一般说来，本发明药物组合物的口服给药剂量为0.1-100单位/kg/天，较好为1-80单位/kg/天，最好为5-60单位/kg/天；腹腔内或肌肉内注射给药剂量为0.05-100单位/kg/天，较好为0.1-80单位/kg/天，最好为0.5-50单位/kg/天；静脉内注射给药剂量为0.1-100单位/kg/天，较好为0.5-80单位/kg/天，最好为1-50单位/kg/天。当然，本领域技术人员可以理解到，为有效地治疗病人所需的确切的给药剂量应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重和一般健康状态，所用药物的剂型、病人对所用药物的敏感性和耐受性，以及所使用给药途径等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例实施例1抑酶肽对急性肝损伤小鼠模型的肝细胞保护作用本实施例举例说明抑肽酶对四氯化碳诱导的急性肝炎小鼠模型的功能性肝细胞保护作用。
将50只平均体重20～22g的小鼠随机分为5组空白对照组、模型对照组、包括小、中、大三个不同剂量抑肽酶溶液(分别投用7.5、15、30ml/kg)(53单位/ml)的治疗组，每组10只动物。治疗组动物每日灌胃给药1次，连续7天。空白对照组及模型对照组给予等体积生理盐水。末次给药后1小时，除空白对照组给橄榄油外，其余4组动物均腹腔注射1％CCL4橄榄油溶液(10ml/kg)造成急性肝损伤。24小时后摘除一侧眼球取血，分离血清检测丙氨酸氨基转换酶(ALT)及天门冬氨酸酸氨基转换酶(AST)活力水平。然后，断颈处死动物并解剖分离部分左叶肝组织。肝组织经用10％甲醛固定并按常规方法制备切片，然后于光学显微镜下进行病理学检查。
从下列表1所示的结果可以看出，与空白对照组相比较，模型对照组动物的血清ALT和AST活力水平均明显升高(p＜0.001)。投用抑酶肽后，可见中和大剂量治疗组动物的ALT和AST活力水平均显著降低(与模型对照组比较差异性显著p＜0.05或p＜0.01)。同时小剂量治疗组动物的血清ALT和AST活力水平亦表现有降低趋势。
表1抑酶肽对CCL4诱导的急性肝损伤小鼠模型的肝细胞保护作用(x±s，n＝10)
与空白对照组比较#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001；与模型对照组比较*p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001另一方面，肝脏组织病理检查结果显示，空白对照组10只小鼠的肝组织结构均未见任何病理改变。模型对照组8/10只小鼠可见有肝细胞肿大，肝小叶中央区大片肝细胞溶解性坏死和脂肪变性；2/10只动物的肝坏死稍轻，但肝细胞普遍发生脂肪变性。相反，投用小、中和大剂量抑酶肽的治疗组动物则可见肝小叶中央区有肝细胞坏死，分别为6/10、3/10和1/10，并且肝细胞坏死和脂肪变性的程度明显低于模型对照组。
实施例2抑酶肽对急性肝损伤大鼠模型的肝细胞保护作用本实施例举例说明抑肽酶对四氯化碳诱导的急性肝炎小鼠模型的功能性肝细胞保护作用。
将50只平均体重20～22g的大鼠随机分为5组空白对照组、模型对照组、包括小、中、大三个不同剂量抑肽酶溶液(分别投用5、10、20ml/kg)(53单位/ml)的治疗组，每组10只动物。治疗组动物每日经尾静脉注射给药1次，连续7天。空白对照组及模型对照组尾静脉注射等体积生理盐水。于第1次和第5次给药前0.5小时，除空白对照组给橄榄油外，其余4组动物均腹腔注射1％CCL4橄榄油溶液(5ml/kg)造成急性肝损伤。第7天晚8时动物禁食，第8天给各组动物腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)造成全身麻醉。然后经腹主动脉插管取血并分离血清检测ALT及AST活力水平水平。然后，断颈处死动物并解剖分离部分左叶肝组织。肝组织经用10％甲醛固定并按常规方法制备切片，然后于光学显微镜下进行病理学检查。
从下列表1所示的结果可以看出，与空白对照组相比较，模型对照组动物的血清ALT和AST活力水平均明显升高(p＜0.001)。投用抑酶肽后，可见中、大剂量治疗组动物的ALT和AST活力水平均显著降低(与模型对照组比较差异性显著p＜0.05或p＜0.01)。同时，小剂量治疗组动物的血清ALT和AST活力水平亦可见有降低趋势。
表2 抑酶肽对CCL4诱导的急性肝损伤大鼠模型的肝细胞保护作用(x±s，n＝10)
与空白对照组比较#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001与模型对照组比较 *p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001另一方面，肝脏组织病理检查结果显示，空白对照组10只大鼠中只有2只偶见肝细胞小坏死灶或汇管区炎性细胞浸润，其余未见任何病理改变。模型对照组10只大鼠肝结构均出现不同程度的病理改变，其中9只动物有偶见或散在肝细胞小坏死灶，而且所有动物均可见中或重度细胞脂肪变性。这些结果表明CCL4引起大鼠严重的肝损伤。相反，不同剂量药物治疗组动物发生肝细胞坏死和脂肪变性的程度较模型对照组明显减轻。
权利要求
1，用于预防和治疗病理性肝损伤的基本上由抑酶肽或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
2，根据权利要求1的药物组合物，其中所说的抑肽酶是天然来源的。
3，根据权利要求1的药物组合物，其中所说的抑肽酶是重组来源的。
4，根据权利要求1的药物组合物，所说的药物组合物还可含有一种或多种具有协同或辅助作用的天然或合成或重组来源的其他成分。
5，根据权利要求1的药物组合物，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
6，根据权利要求1的药物组合物，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道途径给药的剂型。
7，根据权利要求1的药物组合物，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道外途径给药的剂型。
8，天然或重组来源的抑酶肽或其类似物在生产用于预防和治疗病理性肝损伤的药物中的应用。
9，根据权利要求8的应用，其中所说的抑酶肽或其类似物通过抑制肝细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高受损肝细胞的存活性。
10，根据权利要求8的应用，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
全文摘要
本发明涉及抑酶肽，特别是涉及具有肝细胞保护功能的天然或重组来源的抑酶肽。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的抑酶肽及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所说的药物组合物在预防和治疗病理性肝损伤中的应用。
文档编号A61K38/16GK1602954SQ0313599
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者颜炜群 申请人:吉林圣元科技有限责任公司
发明的所属领域本发明涉及抑酶肽，特别是涉及具有肝细胞保护功能的天然或重组来源的抑酶肽。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的抑酶肽及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所说的药物组合物在预防和治疗病理性肝损伤中的应用。
背景技术：
抑酶肽是一种由58个氨基酸组成的并且分子量为6512道尔顿的单链碱性多肽。因为抑酶肽的分子量相对较小、结构稳定而且功能明确，所以已对其进行了较为深入的研究。抑酶肽是一种天然存在于牛的肺、淋巴结、腮腺、脾、肝和胰腺等多种器官和组织中的丝氨酸蛋白酶家族成员的抑制剂，所以又称为牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)。
另外，抑酶肽也可作为某些重组蛋白质产品和蛋白质类免疫检测试剂的保护剂，以防止它们遭受蛋白酶的破坏。
虽然可以从牛的肺、脾、肝和胰腺等组织中分离并提取得到基本上纯的抑酶肽，但从动物中提取是一种十分费时耗力的方法，而且还需要大量的牛器官和组织。为了适应对抑酶肽的客观需求，人们现在不仅能够利用原核、真核(包括植物细胞)和酵母表达系统表达天然抑酶肽，而且同样以基因重组方法制备了许多改善了理化和生物学性质的抑酶肽类似物或突变体(例如参见美国专利5,231,010、5,373,090、5,571,603、5,707,831、5,770,568、5,824,870和6,482,798号)。
已知可被抑酶肽抑制的酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶和纤溶酶等(HFritz And G.Wunderer，Drug.Res.，33，479-494，1983)。作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和活性药物成分，抑酶肽的基本作用在于将病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，例如用于治疗创伤出血性休克和抑制纤溶酶活性等(J.McMichan et al.，Circulatory Shock 9，107，1982；L.M.Auer et al.，Acta Neurochir.49，207，1979)。
天然胰蛋白酶抑制剂存在于胰腺的腺泡细胞内，正常情况下随各种胰酶一起分泌，从而使胰蛋白酶不能在胰组织内发挥其蛋白水解作用。当发生急性胰腺炎时，胰蛋白酶和胰蛋白酶原及其他某些前体酶通过一系列级联反应被激活，因此很可能导致胰腺的自身消化。在这种情况下，使用包括抑酶肽在内的胰蛋白酶抑制剂治疗将是很有效的。
然而，迄今为止尚未见使用抑酶肽治疗各种原因导致的病理性肝组织损伤的报道。
发明的目的本发明的一个目的是提供一种用于预防和治疗病理性肝损伤的基本上由抑酶肽或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑肽酶是天然来源的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑肽酶是重组来源的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物还可含有一种或多种具有协同或辅助作用的天然或合成或重组来源的其他成分。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道途径给药的剂型。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道外途径给药的剂型。
本发明的另一个目的是提供天然或重组来源的抑酶肽或其类似物在生产用于预防和治疗病理牲肝损伤的药物中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑酶肽或其类似物通过抑制肝细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高受损肝细胞的存活性。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
发明的详细描述本发明涉及抑酶肽，特别是涉及具有肝细胞保护活性的天然或重组来源的抑酶肽或其类似物。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的抑酶肽或其类似物及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所说的药物组合物在预防和治疗病理性肝损伤中的应用。
Horiuti和Asami等人(J.Biochem.92，1985-1994，1982；J.Biochem.95，299-309，1984)的早期研究发现，牛垂体中纯化的被鉴定为牛胰蛋白酶抑制剂的因子可作用于大鼠肝细胞的表面并使细胞在无血清培养基中的存活期延长。进一步的研究表明，牛血清中的胰蛋白酶抑制剂对肝细胞存活性的这种刺激作用可能是通过抑制定位于细胞浆膜表面上的丝氨酸蛋白酶实现的。
为了证实Horiuti和Asami等人的早期发现，本发明人在体外细胞学实验中进一步观察了由牛肺组织中提取的胰蛋白酶抑制剂(抑酶肽)对野生型甲型肝炎病毒感染的和高浓度庆大霉素(作为一种肝细胞毒性因子)处理的大鼠肝细胞生长的影响。结果发现，抑酶肽不仅对正常肝细胞，而且对遭受生物和化学损伤的肝细胞的存活性也有明显的改善作用。特别是我们的观察还发现，与对照组相比，用抑酶肽处理的受损肝细胞基本上保持了原代细胞较为完整的细胞形态和功能。
在上述体外实验的基础上，我们进一步观察了抑酶肽和其药物组合物对活体肝炎动物模型的血清转氨酶水平的影响，同时对各实验组动物的肝脏组织进行了组织病理学观察。结果令人惊奇地发现，与对照组相比，静脉内接受抑酶肽治疗的实验组动物的血清转氨酶显著降低。而且病理学检查结果可见，出现肝组织散在小坏死病灶和汇管区少数炎性细胞侵润的动物数明显减少。
基于这些实验结果，我们初步认定抑酶肽有可能作为一种新的肝细胞保护剂，用于预防和治疗各种原因特别是毒性因子导致的急性肝细胞损伤。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有肝细胞保护活性的基本上由抑酶肽及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑酶肽可以是天然来源的，例如可以是使用硫酸铵和碱沉淀、离子交换、凝胶过滤和高压液相层析等常规方法从牛的肺、肝或胰腺组织中提取的。或者，用于本发明的抑酶肽也可以是重组来源的，例如，可以是按照已知的DNA重组方法，使用原核、真核或酵母表达系统表达产生的。另外，用于本发明的抑酶肽可以是具有天然野生序列的生物学活性多肽，但也可以是为改善产物的生物学活性，或为提高产物的产率或药物动力学性质目的而在基因水平上进行了必要的修饰的抑酶肽类似物或突变体。这里所说的修饰可以是内部或N末端个别或部分氨基酸的加入、缺失或取代。例如，这样的修饰可以是分子中第15位赖氨酸被其他氨基酸取代的抑酶肽类似物(美国专利4,595,674号)，或者可以是分子中第17和38位氨基酸分别被Ala和Thr取代的抑酶肽类似物(Market al.，Science 2351370-1373)。
本发明涉及的抑酶肽可以单独使用，也可以作为有各种不同剂型的药物组合物的形式使用。可以使用制药工业领域已知的方法(参见Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以适于口服或非口服给药的单位计量形式制备本发明的药物组合物。例如，可将作为活性成分的有效量的抑酶肽与医药上可接受的载体或赋形剂均匀地混合，制成溶液或悬浮液形式的适于静脉内、肌肉内、器官腔内、皮内和皮下等胃肠道外途径给药的药物组合物；或者也可以制成片剂、胶囊剂、粉末剂、乳剂、颗粒剂等形式的适于经胃肠道途径给药的药物组合物。
根据本发明的药物组合物，其中所使用的医药上可接受的载体或赋形剂将依据所制备的本发明药物组合物的剂型而有不同的选择。
适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油和氢化萘等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，以控制活性成分的缓慢释放。在其他适于胃肠道外给药的制剂中，还包括含有水杨酸的直肠给药制剂和含有甘胆酸盐的含服给药制剂。
具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、甜味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂。
可以使用乳糖和甘露醇等赋形剂，淀粉等崩解剂，明胶等黏结剂，以常规方法制备颗粒剂。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等赋形剂，以常规方法制备粉末剂。使用明胶、水、蔗糖、阿拉伯胶、山梨醇、甘油、结晶纤维素、硬脂酸镁和滑石等，以常规方法制备胶囊剂。
可以使用水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，苯甲酸钠，水杨酸钠和氨基甲酸乙酯等增溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，青霉素和链霉素及其他抗真菌剂等抗生素，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备可注射剂。
在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并且能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。
另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。
本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分的天然或重组产生的抑酶肽或其类似物或突变体外，还可含有一种或多种合成的、天然的或重组来源的具有协同或辅助作用的其他活性成分。这些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或调节活性、病毒复制抑制活性、功能性肝细胞修复活性的其他成分，例如可以是干扰素、白介素、胸腺素、肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子等。
本发明的药物组合物对功能性肝细胞具有良好的保护作用。虽然有关作用机理目前尚不明确，但我们推测可能与抑酶肽或其类似物作用于肝细胞并抑制细胞表面上的丝氨酸蛋白酶类有关。
可使用本发明的药物组合物预防或治疗的疾病包括但不只限于人或哺乳动物的急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭等。
基于以上的描述，本领域技术人员完全可以理解到也可以单独将天然或重组来源的抑酶肽或其类似物用于生产预防和治疗病理性肝损伤的药物。
因此，本发明的另一个目的是提供天然或重组来源的抑酶肽或其类似物在生产用于预防和治疗病理性肝损伤的药物中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抑酶肽或其类似物通过抑制肝细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高受损肝细胞的存活性。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤包括但不只限于急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭等。
一般说来，本发明药物组合物的口服给药剂量为0.1-100单位/kg/天，较好为1-80单位/kg/天，最好为5-60单位/kg/天；腹腔内或肌肉内注射给药剂量为0.05-100单位/kg/天，较好为0.1-80单位/kg/天，最好为0.5-50单位/kg/天；静脉内注射给药剂量为0.1-100单位/kg/天，较好为0.5-80单位/kg/天，最好为1-50单位/kg/天。当然，本领域技术人员可以理解到，为有效地治疗病人所需的确切的给药剂量应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重和一般健康状态，所用药物的剂型、病人对所用药物的敏感性和耐受性，以及所使用给药途径等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例实施例1抑酶肽对急性肝损伤小鼠模型的肝细胞保护作用本实施例举例说明抑肽酶对四氯化碳诱导的急性肝炎小鼠模型的功能性肝细胞保护作用。
将50只平均体重20～22g的小鼠随机分为5组空白对照组、模型对照组、包括小、中、大三个不同剂量抑肽酶溶液(分别投用7.5、15、30ml/kg)(53单位/ml)的治疗组，每组10只动物。治疗组动物每日灌胃给药1次，连续7天。空白对照组及模型对照组给予等体积生理盐水。末次给药后1小时，除空白对照组给橄榄油外，其余4组动物均腹腔注射1％CCL4橄榄油溶液(10ml/kg)造成急性肝损伤。24小时后摘除一侧眼球取血，分离血清检测丙氨酸氨基转换酶(ALT)及天门冬氨酸酸氨基转换酶(AST)活力水平。然后，断颈处死动物并解剖分离部分左叶肝组织。肝组织经用10％甲醛固定并按常规方法制备切片，然后于光学显微镜下进行病理学检查。
从下列表1所示的结果可以看出，与空白对照组相比较，模型对照组动物的血清ALT和AST活力水平均明显升高(p＜0.001)。投用抑酶肽后，可见中和大剂量治疗组动物的ALT和AST活力水平均显著降低(与模型对照组比较差异性显著p＜0.05或p＜0.01)。同时小剂量治疗组动物的血清ALT和AST活力水平亦表现有降低趋势。
表1抑酶肽对CCL4诱导的急性肝损伤小鼠模型的肝细胞保护作用(x±s，n＝10)
与空白对照组比较#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001；与模型对照组比较*p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001另一方面，肝脏组织病理检查结果显示，空白对照组10只小鼠的肝组织结构均未见任何病理改变。模型对照组8/10只小鼠可见有肝细胞肿大，肝小叶中央区大片肝细胞溶解性坏死和脂肪变性；2/10只动物的肝坏死稍轻，但肝细胞普遍发生脂肪变性。相反，投用小、中和大剂量抑酶肽的治疗组动物则可见肝小叶中央区有肝细胞坏死，分别为6/10、3/10和1/10，并且肝细胞坏死和脂肪变性的程度明显低于模型对照组。
实施例2抑酶肽对急性肝损伤大鼠模型的肝细胞保护作用本实施例举例说明抑肽酶对四氯化碳诱导的急性肝炎小鼠模型的功能性肝细胞保护作用。
将50只平均体重20～22g的大鼠随机分为5组空白对照组、模型对照组、包括小、中、大三个不同剂量抑肽酶溶液(分别投用5、10、20ml/kg)(53单位/ml)的治疗组，每组10只动物。治疗组动物每日经尾静脉注射给药1次，连续7天。空白对照组及模型对照组尾静脉注射等体积生理盐水。于第1次和第5次给药前0.5小时，除空白对照组给橄榄油外，其余4组动物均腹腔注射1％CCL4橄榄油溶液(5ml/kg)造成急性肝损伤。第7天晚8时动物禁食，第8天给各组动物腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)造成全身麻醉。然后经腹主动脉插管取血并分离血清检测ALT及AST活力水平水平。然后，断颈处死动物并解剖分离部分左叶肝组织。肝组织经用10％甲醛固定并按常规方法制备切片，然后于光学显微镜下进行病理学检查。
从下列表1所示的结果可以看出，与空白对照组相比较，模型对照组动物的血清ALT和AST活力水平均明显升高(p＜0.001)。投用抑酶肽后，可见中、大剂量治疗组动物的ALT和AST活力水平均显著降低(与模型对照组比较差异性显著p＜0.05或p＜0.01)。同时，小剂量治疗组动物的血清ALT和AST活力水平亦可见有降低趋势。
表2 抑酶肽对CCL4诱导的急性肝损伤大鼠模型的肝细胞保护作用(x±s，n＝10)
与空白对照组比较#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001与模型对照组比较 *p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001另一方面，肝脏组织病理检查结果显示，空白对照组10只大鼠中只有2只偶见肝细胞小坏死灶或汇管区炎性细胞浸润，其余未见任何病理改变。模型对照组10只大鼠肝结构均出现不同程度的病理改变，其中9只动物有偶见或散在肝细胞小坏死灶，而且所有动物均可见中或重度细胞脂肪变性。这些结果表明CCL4引起大鼠严重的肝损伤。相反，不同剂量药物治疗组动物发生肝细胞坏死和脂肪变性的程度较模型对照组明显减轻。
权利要求
1，用于预防和治疗病理性肝损伤的基本上由抑酶肽或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
2，根据权利要求1的药物组合物，其中所说的抑肽酶是天然来源的。
3，根据权利要求1的药物组合物，其中所说的抑肽酶是重组来源的。
4，根据权利要求1的药物组合物，所说的药物组合物还可含有一种或多种具有协同或辅助作用的天然或合成或重组来源的其他成分。
5，根据权利要求1的药物组合物，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
6，根据权利要求1的药物组合物，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道途径给药的剂型。
7，根据权利要求1的药物组合物，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道外途径给药的剂型。
8，天然或重组来源的抑酶肽或其类似物在生产用于预防和治疗病理性肝损伤的药物中的应用。
9，根据权利要求8的应用，其中所说的抑酶肽或其类似物通过抑制肝细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶提高受损肝细胞的存活性。
10，根据权利要求8的应用，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭。
全文摘要
本发明涉及抑酶肽，特别是涉及具有肝细胞保护功能的天然或重组来源的抑酶肽。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的抑酶肽及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所说的药物组合物在预防和治疗病理性肝损伤中的应用。
文档编号A61K38/16GK1602954SQ0313599
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者颜炜群 申请人:吉林圣元科技有限责任公司
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