促使骨髓间充质干细胞在大鼠脑内分化成神经元的新方法

xiaoxiao2020-6-23  44

专利名称:促使骨髓间充质干细胞在大鼠脑内分化成神经元的新方法
技术领域
本发明涉及一种通过病毒载体体外转导神经营养因子编码基因,促使脑内移植的骨髓间充质干细胞高效定向分化成神经元,同时旁分泌神经营养因子营养、支持周围神经细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)起源于中胚层,是成纤维细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种基质细胞的前体细胞,具有较强的增殖能力和多分化潜能。MSCs可通过贴壁培养达到较高的纯度。MSCs在体外可被诱导分化为表达NeuN的神经元和表达GFAP的神经胶质细胞。将MSCs移植到脑组织中,可长期存活,并向神经细胞分化。但实验表明植入脑的MSCs大部分分化为神经胶质细胞,分化为神经元样细胞的比例较小。过多的神经胶质细胞不但对改善神经功能无益,还可导致胶质疤痕形成等副作用。因此,如何提高脑内移植的MSCs向神经元分化,特别是能够建立正确突触联系的神经元,是间充质干细胞治疗退化性神经系统疾病的关键。 脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor, BDNF)是神经营养因子(neurotrophin)家族成员之一,对神经细胞具有普遍的营养、支持作用,可促使神经干细胞增殖并向神经元分化。当将BDNF和骨髓细胞混合移植到大鼠大脑中动脉闭塞梗塞边缘区时,BDNF可以促进脑内移植的MSCs增殖并向神经元分化。但是BDNF蛋白质在脑的半寿期很短,所以将BDNF与MSCs混合移植,并不能让BDNF充分发挥其生物功能,因此必须寻找一种可以使BDNF长期作用于植入的MSCs的方法。当代基因工程技术提供了各种载体,可将基因片段导入细胞中表达。其中逆转录病毒基因载体是较为广泛应用的一种。该载体可将外源基因整合到靶细胞的基因组中,因此可使目的基因在靶细胞中长期、稳定表达。已有实验表明逆转录病毒可将外源基因导入MSCs并稳定表达。因此,利用逆转录病毒将BDNF基因导入MSCs,然后将携带重组BDNF基因的MSCs植入脑内,在BDNF的作用下,可使这种基因修饰后的MSCs的脑内存活率及神经元分化比率大大提高,同时大量旁分泌的BDNF,可以营养、支持脑出血后遗症、帕金森症、阿尔茨海默症等病变组织及其周围的神经细胞。因此本发明可为干细胞移植治疗脑血管疾病、老年痴呆、脑外伤后遗症、神经系统变性疾病等提供来源充足、取自自体的种子细胞,并使种子细胞更好地修复补充受损神经元,维持残存神经元。另外,利用MSCs在体内的归巢性,还可将载有目的基因的MSCs用于治疗遗传性神经病和神经系统其他疾病,同时为相关的药物开发和筛选提供一种新的模式。

发明内容
本发明的目的是提供一种通过携带人BDNF编码基因的逆转录病毒,将BDNF基因导入MSCs,经筛选获得携带重组BDNF基因的MSCs (BDNF-MSCs),将BDNF-MSCs植入脑,在自分泌的BDNF诱导下定向分化成神经元的方法。技术方案如下从人骨髓中分离得到hMSCs,再利用反复贴壁培养纯化。从人的神经母细胞瘤细胞中克隆人BDNF的cDNA片段,构建重组质粒pMSCV-hBDNF,建立逆转录病毒细胞株。制备病毒并纯化。以重组BDNF基因的逆转录病毒感染MSCs,通过耐药基因筛选,使BDNF在MSCs内稳定表达。本发明能够在通过高效转导使外源性基因在MSCs中稳定表达的同时,保持MSCs在体内、体外的多能性和其他生物特性。本发明的另一个主要内容是通过特定的细胞密度和注射方式,使BNDF-MSCs在脑内分化为神经元细胞,同时通过旁分泌BDNF营养、支持周围神经细胞。通过DAPI核染色区分供体细胞和自体细胞,利用神经细胞特异表型蛋白可以证明BDNF-MSCs在脑内向神经元分化的比例为55%,而未经基因修饰的MSCs在脑内向神经元分化的比例为10%。
具体实施方式
实施例1、携带hBDNF编码基因的逆转录病毒的制备离心收集2 3X106神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞,抽提总RNA,构建cDNA文库,以SK-N-SH cDNA为模板,PCR引物为5 ’ -ATGACCATCCTTTTCCTTAC-3’,5 ’ -CTATCTTCCCCTTTTAATGG-3,克隆hBDNF的cDNA,并将其连接到T-载体上进行测序。得到的hBDNF的氨基酸序列如下MT ILFLTMVI SYFGCMKAAP MKEANIRGQG GLAYPGVRTH GTLESVNGPK AGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPN EENNKDADLY TSRVMLSSQV PLEPPLLFLL EEYKNYLDAA 匪SMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTA ADKKTAVDMS GGTVTVLEKV PVSKGQLKQY FYETKCNPMG YTKEGCRGIDK 丽 NSQCRTTQSYVRALTM DSKKRIGffRF IRIDTSCVCT构建的pMSCV-hBDNF逆转录病毒质粒以pMSCV_neo为载体,含有完整的hBDNF氨
基酸编码序列。在对数期生长的PT67细胞中加入pMSCV-hBDNF质粒和脂质体进行转染,然后用500ug/ml G418筛选耐药细胞。待抗性克隆形成后用不含G418的培养液培养3天,将培养瓶置于-20°C过夜,化冻后将培养液4°C 500gX5min离心,吸取上清,即得到含重组hBDNF基因的逆转录病毒原液。测定病毒原液滴度后,病毒原液4°C 50,000gX90min离心,弃上清,溶于1/50体积的TNE中即为病毒存储液,病毒存储液按一次用量分装,可在_70°C长期保存。实施例2、通过逆转录病毒感染转导BDNF编码基因将Pl代MSCs按lX104Cells/Cm2密度接种于培养皿中,然后按细胞与病毒颗粒比例1: 10感染8小时后,用无病毒培养液培养24小时,再用250ug/ml G418选择培养。待抗性克隆形成后,换用不含G418的培养液。ELISA法测定结果显示BDNF_MSCs培养液中BDNF水平显著高于未经BDNF基因修饰的MSCs培养液中的BDNF水平。实施例3、大鼠脑内移植的BDNF-MSCs定向诱导为神经元
用2. 4cGy Y射线照射Wistar大鼠,对其进行免疫消减。24小时后利用大鼠脑立体定向仪,按照《大鼠脑立体定向图谱》的指示,在大鼠纹状体前部注射经DAPI核染色的BDNF-MSCs。坐标为前囱前1. 0mm,旁开2. 5mm,硬膜下4. 5mm。注入细胞悬浮液量为20ul (含5X106 BDNF-MSCs),注射速度为lul/min,留针lOmin,缓慢退针lmm/min。细胞移植后I天、3天、6天、15天、30天,剪心处死大鼠,4%多聚甲醇/0.1M PBS固定液主动脉灌注固定脑组织,冰冻切片。用NeuN、GFAP、Nestin免疫组化抗体结合荧光二抗标记。结果BDNF-MSCs (DAPI阳性细胞)在正常大鼠及H)模型大鼠脑纹状体内长期存活,其中55%的BDNF-MSCs分化成神经元样细胞(NeuN阳性 细胞)。
权利要求
1.诱导移植的人骨髓间充质干细胞在脑内高效向神经元细胞定向分化的方法,其特征是移植前的干细胞携带表达hBNDF编码基因的病毒载体。
2.按照权利要求1对间充质干细胞进行诱导的方案,其特征在于该类干细胞表达人脑源性神经营养因子(hBNDF)编码基因。
3.按照权利要求1对间充质干细胞进行诱导的方案,其特征在于人脑源性神经营养因子(hBNDF)编码基因是通过逆转录病毒载体导入干细胞。
4.按照权利要求1或2对间充质干细胞进行诱导的方案,其特征在于重组逆转录病毒以特定时间和浓度感染间充质干细胞,可使外源基因在间充质干细胞内稳定表达。
5.按照权利要求1对间充质干细胞进行诱导的方案,其特征在于通过脑立体定向局部注射的方法将携带重组人脑源性神经营养因子(hBNDF)编码基因的间充质干细胞移植入脑内。
6.按照权利要求1或5对间充质干细胞进行诱导的方法,其特征在于移植部位为尾状核头部。
7.按照权利要求1或5对间充质干细胞进行诱导的方法,其特征在于以特定的细胞密度及注射体积进行移植。
全文摘要
本发明公开了一种使大鼠脑内移植的骨髓间充质干细胞定向分化成神经元的方法。具体步骤包括从骨髓分离间充质干细胞并进行扩增和纯化;并通过PCR克隆为人脑源性神经营养因子(hBNDF)蛋白编码的cDNA序列,构建携带hBNDF编码基因的表达载体,最终将表达hBNDF编码基因的间充质干细胞通过脑立体定向方法移植入大鼠脑内。在hBNDF的诱导下,间充质干细胞定向分化成神经元的数量明显增多。本发明提供的方法可大大提高脑内移植的间充质干细胞向神经元分化的数量,为神经系统疾病的干细胞治疗开拓了新方法,具有广阔的临床应用前景。
文档编号A61K35/28GK103045540SQ20111031049
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司

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