一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗及其制备方法
专利名称：一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
犬传染性气管支气管炎(或犬窝咳)是犬类流行最广的上呼吸道疾病之一，它具有高传染性和影响范围广等特点。目前此疾病在全球各个地区都有发现。学者目前普遍认为引起此疾病的主要病原体是犬副流感病毒和支气管败血波氏菌(EttingerJtephen J.； Feldman, Edward C. (1995). Textbook of Veterinary Internal Medicine(4th Edition). W. B. Saunders Company)。由于此病病原体在狗群之间传播的非常迅速，因此而得名“犬窝咳，，。犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus, CP I V)属于副粘液病毒亚科,副粘病毒属。其具有三种特异性抗原表面血球凝集抗原，表面神经胺酸酶抗原和内部核白衣抗原。当犬副流感病毒感染犬类后，病毒会破坏上呼吸道组织，引起干咳、尖咳、鼻塞等症状， 严重者可引起支气管肺炎。单独病毒感染可造成6日的轻度临床症状，但通常有其他细菌共同影响。支气管败血波氏菌(Bordetella bronchis印tica，)是革兰氏阴性、需氧球杆菌。 它是在患有气管支气管炎的狗中最常分离出的细菌。细菌潜伏期有2 14日，如不与其他病原体共同感染作用此细菌的临床症状通常会持续10日。然而即使感染症状已消失，但此细菌可继续在自然环境中生存6 14周，期间可再传染至易感动物。此菌通过口鼻分泌物传播，可通过直接或间接接触感染。此菌感染的临床症状包括黏液鼻塞、深咳、尖咳、干咳、不适，症状尤其在运动或情绪激动时会加重。若犬感染支气管败血波氏菌一般会引起其他病原体的感染。若感染第二病原体经常会引起严重肺炎。在狗场或庇护所或卫生欠缺饲养的狗具有更高被感染的几率。有文献报道称此菌可经由狗传染给其他种类动物，比如猫(Dwight C. H.，Nigel J. M.，Richard L. W. et al. (2004) Veterinary Microbiology (2nd Edition). Blackwell Publishing)。犬窝咳在世界各地区均有病例发生记录，传播性非常强，危害严重，极易引发其他高致死性病原体感染。仅甘肃省2004年-2009年犬窝咳的调查中此病的整体发病率就高达是34. 26% (卢旺银，(2010)甘肃省犬窝咳的流行病学调查与防治。畜牧兽医杂志；29(3))。 在宠物动物大量集中的中大型城市这种病传播的更为广泛。国内家庭饲养宠物的数量与日俱增，具不完全统计我国目前仅宠物犬的数量已超过1.5亿只，在许多经济发达城市的宠物数量与居民比例为1 10。因此对宠物犬的健康要求越来越高。国外在预防和治疗此犬窝咳早有大量研究，并已有多种有效预防产品，但是目前国内尚未有针对犬窝咳的疫苗，因此本发明填补了国内犬窝咳疫苗的空白。由于本发明选取的是国内分离弱化毒株，所以本发明对国内犬窝咳综合病症有着积极预防和高效控制的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种为预防和控制犬副流感/支气管败血波氏菌引起的犬窝咳的传播，可以有效预防该病的犬副流感/支气管败血波氏菌二联疫苗及其生产方法。
具体实施例方式本发明主要通过以下技术方案实施一、生产用菌毒种的来源及特性1.犬副流感病毒(1)犬副流感病毒的分离1)病毒由本发明人分离自大面积发生犬窝咳的肉狗养殖场中。将采集到的鼻腔拭子过滤除菌，接种生长至对数末期的Vero细胞上(购自Cambivac，Co. Ltd)。37°C静置培养7天，冻融2次后，获得含有病毒粒子的悬液。2)吸取上述病毒悬液，提取DNA及RNA模板，经RT-PCR鉴定，该病毒悬液中含有犬副流感病毒。按王凤雪等人(王凤雪，闰喜军，柴秀丽，等.核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立.中国动物检疫，2007,^(1 ，24-25.)提供的副流感病毒PCR鉴定引物和方法进行扩
+曰OPl 5，-TACAATCCCACCTACAACAC-3，；Ρ2 5，-GAATGATCCCTCCTCAAAGC-3，扩增后产物为测序结果与已报道的序列相符Tacaatcccacctacaacactaaaaccggtaatcagggtatttatactaacctctaataacccagagct aagatcccggcttcttctattctgcctacggattgttctcagtaatggtgcaagggattcccatcgctttggagcat tacttacaatgttttcgctaccatcagccacaatgctcaatcatgtcaaattagctgaccagtcaccagaagctgat atcgaaagggtagagatcgatggctttgaggagggatcattco(2)病毒的纯化取病毒悬液以蚀斑克隆的方法得到一株病毒的单克隆命名为CPIV-CY-7F株。(3)犬副流感病毒的弱化取CPIV-CY-7F X代次病毒接种Vero细胞系进行连续传代。每传20代，喷雾接种 5只CPI抗体阴性(血清中和效价低于1/4)的幼犬，每只接种IO7TCID5tl病毒悬液lml。如至少1只出现CPIV感染症状，则认为病毒仍然具有一定的毒力。经连续传代至+80代，攻毒易感犬只未出现CPIV感染症状，将该代次病毒，继续传代5次至+85代，得到一株犬副流感病毒(Canine parainf luenzavirus)弱化毒株，命名为CPIV-CY-c株，该病毒株已于2011 年09月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC No. 5268。(4)生产用犬副流感弱毒株CPIV-CY-c株毒种的纯净性检验1)无菌检验按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011.，本发明以下简称《中国兽药典》)规定的方法对CPIV-CY-c株X+85 X+90代毒种进行无菌检验，分别接种T. G、G. P小管和G. A斜面培养基各2支，每支0. 2mL，一支置37°C培养；一支置于25°C培养，观察3日，移植后的病毒培养物接种的T. G、G. P和G. A斜面培养基，观察五日均无细菌、霉菌生长，表明CPIV-CY-c 株毒种未受细菌与霉菌的污染。2)支原体检验按《中国兽药典》规定的方法对C90代原始种毒，X+85与X+90代基础种毒进行支原体检验，经过5日、10日、15日培养，观察液体培养基无颜色变化，再经移植后培养14日观察，支原体液体培养基仍然无颜色变化；接种毒种的琼脂平板上均未出现支原体菌落。表明CPIV-CY-c株毒种无支原体污染。3)外源病毒检验按《中国兽药典》要求，对X+85代原始种毒，X+85与X+90代基础种毒进行了外源病毒的检测。用间接免疫荧光法检测狂犬病病毒(RV)，结果未发现狂犬病病毒(RV)荧光细胞颗粒，表明CPIV-CY-c株毒种无RV污染；过Vero细胞检验犬瘟热病毒，结果表明CPIV-CY-c 株毒种无犬瘟热病毒污染；通过致细胞病变检查方法进行检测，结果无致细胞病变的外源病毒污染；红细胞吸附性外源病毒检验中，结果表明无吸附红细胞的外源病毒污染。以上结果表明，CPIV-CY-c株毒种无外源病毒污染。(5)犬副流感病毒CPIV-CY-c株的稳定性取CPIV-CY-c株病毒滴鼻接种易感犬只，将病毒在动物体内连续传代+10代，期间未观察到任何可疑CPIV感染症状，证明该病毒在+10代以内保持毒力稳定。2.犬的支气管败血波氏菌(1)支气管败血波氏菌的分离鉴定1)支气管败血波氏菌m3_SD25d株由本发明人分离自肉狗养殖场中。2)将临床采集的鼻腔拭子接种支气管败血波氏菌选择性平板Bordet-Gengou Agar(购自BD，Difco)进行培养，挑取边缘光滑的可疑菌落，接种至API 20 NE试纸条进行菌种生化鉴定，确定最终获得数十支气管败血波氏菌菌株。3)分子生物学鉴定按 Daniela Hozbor 等人(Daniela Hozbor, Frncose Fouque, Nicole Guiso. Detection of Bordetella bronchiseptica by the polymerase chain reaction. Gene, 1999，150 :333-341.)提供的支气管败血波氏菌PCR鉴定引物和方法进行扩增Pl 5' -AGGCTCCCAAGAGAAAGGCTT-3‘P2 5' -TGGCGCCTGCCCTATC-3‘扩增出的产物为237bp，测序结果与已报道的基因序列相符Tggcgcctgccctatcccgcccgcgccgcacggacgcctgtccccgcaggaacatgccctttgccgcca gattcccccgcacatttccgaacttcactttttttgcttaagtccgtcgcaaacctgccgtaatccaggcaacaaag gaaatcgcggcgctgtgcaagcgaaagtccgatgttacgaatgggcggcctagctgcccggtttgaagaagcctttc tctcttgggagcct。挑选10 个候选菌株，分别接种 Tryptose Phospate Broth 培养基，37°C 300r/min 震荡培养20小时，效价达到101(lCFU/ml左右。随机挑选支气管败血波氏菌抗体阴性的幼犬 4只，将其分别置于两个0. 8m3的无菌容器中，以小型喷雾装置，向犬鼻周围持续喷雾细菌悬液30ml/只进行攻毒。从20株候选菌株中筛选得到了一株不引起犬窝咳症状的支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica)菌株，命名为Bb_SD25d株。该菌株已于2011年09月洸日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC No. 5292。(2)支气管败血波氏菌m3_SD25d株的稳定性取m3_SD25d株支气管败血波氏菌喷雾接种易感犬1只。3天后，从犬鼻腔分离该菌，再次喷雾接种易感犬1只，如此在动物体内连续传代10代。试验发现，该菌株在传代过程中没有导致易感犬只出现任何症状。说明，该菌株毒力在10代以内稳定。3.犬副流感病毒CPIV-CY-c株/支气管败血波氏菌m3_SD25d株免疫原性取CPIV-CY-c株种毒接种Vero细胞进行传代，传代至第90代作为效力试验用病16只CPIV抗体阴性的三周龄实验犬随机分为4组，第一、二、三组各4只，分别滴鼻免疫接种m3-SD25d株支气管败血波氏菌105、IO7, IO9CFU/只，CPIV-CY-c第90代种毒102、 IO4UO6TCID50/只。第四组作为非免疫对照组。免疫攻毒所有分组免疫3周以后进行攻毒检验。攻毒检验用菌种选用同时期分离的可诱导易感犬只产生犬窝咳临床症状的分离株m3_JSK2株，每只犬选择喷雾接种 109CFU/ml菌悬液30ml，之后再滴鼻接种107TCID5(1/ml的CPIV D008株病毒液1ml。攻毒结果显示，第一组4只易感幼犬有2只出现咳嗽，另外2只未出现咳嗽症状， 但精神沉郁、食欲减退、有轻微发烧症状。第二、三组未出现任何异常症状。病理解剖结果表明，发病犬只呼吸道黏膜分泌物明显增加。证明免疫106CFU m3-SD25d细菌和IO4TCID5tl 的CPIV-CY-c病毒可以产生足够的免疫保护力。表1犬副流感病毒/支气管败血波氏菌免疫原性测定结果
权利要求
1.一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗，其特征在于本疫苗含有CPIV-CY-C株犬副流感病毒(Canine Pzrainfluenzavirus)和 Bb_SD25d 株支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica)。
2.如权利要求1所述一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗，其特征在于CPIV-CY-c 株犬副流感病毒，该病毒株经人工致弱，接种易感犬只不引起任何症状，并能够诱导产生针对副流感病毒的特异性免疫应答；该毒株已于2011年9月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5268。
3.如权利要求1所述一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗，其特征在于m3_SD25d株支气管败血波氏菌是一株经自然弱化的菌株，该菌株已于2011年9月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5292。
4.制备权利要求1所述一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗的方法，其特征在于 将保藏号为CGMCC 5268的犬副流感病毒接种Vero细胞，37°C培养80h，经冻融、离心、收获； 将保藏号为CGMCC No. 5四2的支气管败血波氏菌天然弱毒菌株接种"Tryptose Phosphate Broth培养基37°C 300r/min震荡培养，20h收获，将两种半成品按比例混合加入冻干保护剂，经过冷冻干燥制成犬传染性气管支气管炎二联活疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗及其制备方法。本发明是利用本发明人分离得到的有较好免疫原性的犬副流感病毒(Canine Pzrainfluenzavirus)及支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica)，病毒纯化后进行传代致弱，获得弱毒株CPIV-CY-c株与菌株Bb-SD25d，做为生产用毒种，制备出安全、有效的犬传染性气管支气管炎二联活疫苗。本发明采用的毒株能够针对目前犬传染性气管支气管炎的流行情况，有效预防犬副流感病毒及支气管败血波氏菌引起的犬传染性气管支气管炎(犬窝咳)的发生。
文档编号A61K39/295GK102343088SQ20111031157
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者孟超, 嵇康, 张鹏超, 沈元 申请人:浙江诺倍威生物技术有限公司
技术领域：
本发明涉及一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
犬传染性气管支气管炎(或犬窝咳)是犬类流行最广的上呼吸道疾病之一，它具有高传染性和影响范围广等特点。目前此疾病在全球各个地区都有发现。学者目前普遍认为引起此疾病的主要病原体是犬副流感病毒和支气管败血波氏菌(EttingerJtephen J.； Feldman, Edward C. (1995). Textbook of Veterinary Internal Medicine(4th Edition). W. B. Saunders Company)。由于此病病原体在狗群之间传播的非常迅速，因此而得名“犬窝咳，，。犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus, CP I V)属于副粘液病毒亚科,副粘病毒属。其具有三种特异性抗原表面血球凝集抗原，表面神经胺酸酶抗原和内部核白衣抗原。当犬副流感病毒感染犬类后，病毒会破坏上呼吸道组织，引起干咳、尖咳、鼻塞等症状， 严重者可引起支气管肺炎。单独病毒感染可造成6日的轻度临床症状，但通常有其他细菌共同影响。支气管败血波氏菌(Bordetella bronchis印tica，)是革兰氏阴性、需氧球杆菌。 它是在患有气管支气管炎的狗中最常分离出的细菌。细菌潜伏期有2 14日，如不与其他病原体共同感染作用此细菌的临床症状通常会持续10日。然而即使感染症状已消失，但此细菌可继续在自然环境中生存6 14周，期间可再传染至易感动物。此菌通过口鼻分泌物传播，可通过直接或间接接触感染。此菌感染的临床症状包括黏液鼻塞、深咳、尖咳、干咳、不适，症状尤其在运动或情绪激动时会加重。若犬感染支气管败血波氏菌一般会引起其他病原体的感染。若感染第二病原体经常会引起严重肺炎。在狗场或庇护所或卫生欠缺饲养的狗具有更高被感染的几率。有文献报道称此菌可经由狗传染给其他种类动物，比如猫(Dwight C. H.，Nigel J. M.，Richard L. W. et al. (2004) Veterinary Microbiology (2nd Edition). Blackwell Publishing)。犬窝咳在世界各地区均有病例发生记录，传播性非常强，危害严重，极易引发其他高致死性病原体感染。仅甘肃省2004年-2009年犬窝咳的调查中此病的整体发病率就高达是34. 26% (卢旺银，(2010)甘肃省犬窝咳的流行病学调查与防治。畜牧兽医杂志；29(3))。 在宠物动物大量集中的中大型城市这种病传播的更为广泛。国内家庭饲养宠物的数量与日俱增，具不完全统计我国目前仅宠物犬的数量已超过1.5亿只，在许多经济发达城市的宠物数量与居民比例为1 10。因此对宠物犬的健康要求越来越高。国外在预防和治疗此犬窝咳早有大量研究，并已有多种有效预防产品，但是目前国内尚未有针对犬窝咳的疫苗，因此本发明填补了国内犬窝咳疫苗的空白。由于本发明选取的是国内分离弱化毒株，所以本发明对国内犬窝咳综合病症有着积极预防和高效控制的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种为预防和控制犬副流感/支气管败血波氏菌引起的犬窝咳的传播，可以有效预防该病的犬副流感/支气管败血波氏菌二联疫苗及其生产方法。
具体实施例方式本发明主要通过以下技术方案实施一、生产用菌毒种的来源及特性1.犬副流感病毒(1)犬副流感病毒的分离1)病毒由本发明人分离自大面积发生犬窝咳的肉狗养殖场中。将采集到的鼻腔拭子过滤除菌，接种生长至对数末期的Vero细胞上(购自Cambivac，Co. Ltd)。37°C静置培养7天，冻融2次后，获得含有病毒粒子的悬液。2)吸取上述病毒悬液，提取DNA及RNA模板，经RT-PCR鉴定，该病毒悬液中含有犬副流感病毒。按王凤雪等人(王凤雪，闰喜军，柴秀丽，等.核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立.中国动物检疫，2007,^(1 ，24-25.)提供的副流感病毒PCR鉴定引物和方法进行扩
+曰OPl 5，-TACAATCCCACCTACAACAC-3，；Ρ2 5，-GAATGATCCCTCCTCAAAGC-3，扩增后产物为测序结果与已报道的序列相符Tacaatcccacctacaacactaaaaccggtaatcagggtatttatactaacctctaataacccagagct aagatcccggcttcttctattctgcctacggattgttctcagtaatggtgcaagggattcccatcgctttggagcat tacttacaatgttttcgctaccatcagccacaatgctcaatcatgtcaaattagctgaccagtcaccagaagctgat atcgaaagggtagagatcgatggctttgaggagggatcattco(2)病毒的纯化取病毒悬液以蚀斑克隆的方法得到一株病毒的单克隆命名为CPIV-CY-7F株。(3)犬副流感病毒的弱化取CPIV-CY-7F X代次病毒接种Vero细胞系进行连续传代。每传20代，喷雾接种 5只CPI抗体阴性(血清中和效价低于1/4)的幼犬，每只接种IO7TCID5tl病毒悬液lml。如至少1只出现CPIV感染症状，则认为病毒仍然具有一定的毒力。经连续传代至+80代，攻毒易感犬只未出现CPIV感染症状，将该代次病毒，继续传代5次至+85代，得到一株犬副流感病毒(Canine parainf luenzavirus)弱化毒株，命名为CPIV-CY-c株，该病毒株已于2011 年09月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC No. 5268。(4)生产用犬副流感弱毒株CPIV-CY-c株毒种的纯净性检验1)无菌检验按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011.，本发明以下简称《中国兽药典》)规定的方法对CPIV-CY-c株X+85 X+90代毒种进行无菌检验，分别接种T. G、G. P小管和G. A斜面培养基各2支，每支0. 2mL，一支置37°C培养；一支置于25°C培养，观察3日，移植后的病毒培养物接种的T. G、G. P和G. A斜面培养基，观察五日均无细菌、霉菌生长，表明CPIV-CY-c 株毒种未受细菌与霉菌的污染。2)支原体检验按《中国兽药典》规定的方法对C90代原始种毒，X+85与X+90代基础种毒进行支原体检验，经过5日、10日、15日培养，观察液体培养基无颜色变化，再经移植后培养14日观察，支原体液体培养基仍然无颜色变化；接种毒种的琼脂平板上均未出现支原体菌落。表明CPIV-CY-c株毒种无支原体污染。3)外源病毒检验按《中国兽药典》要求，对X+85代原始种毒，X+85与X+90代基础种毒进行了外源病毒的检测。用间接免疫荧光法检测狂犬病病毒(RV)，结果未发现狂犬病病毒(RV)荧光细胞颗粒，表明CPIV-CY-c株毒种无RV污染；过Vero细胞检验犬瘟热病毒，结果表明CPIV-CY-c 株毒种无犬瘟热病毒污染；通过致细胞病变检查方法进行检测，结果无致细胞病变的外源病毒污染；红细胞吸附性外源病毒检验中，结果表明无吸附红细胞的外源病毒污染。以上结果表明，CPIV-CY-c株毒种无外源病毒污染。(5)犬副流感病毒CPIV-CY-c株的稳定性取CPIV-CY-c株病毒滴鼻接种易感犬只，将病毒在动物体内连续传代+10代，期间未观察到任何可疑CPIV感染症状，证明该病毒在+10代以内保持毒力稳定。2.犬的支气管败血波氏菌(1)支气管败血波氏菌的分离鉴定1)支气管败血波氏菌m3_SD25d株由本发明人分离自肉狗养殖场中。2)将临床采集的鼻腔拭子接种支气管败血波氏菌选择性平板Bordet-Gengou Agar(购自BD，Difco)进行培养，挑取边缘光滑的可疑菌落，接种至API 20 NE试纸条进行菌种生化鉴定，确定最终获得数十支气管败血波氏菌菌株。3)分子生物学鉴定按 Daniela Hozbor 等人(Daniela Hozbor, Frncose Fouque, Nicole Guiso. Detection of Bordetella bronchiseptica by the polymerase chain reaction. Gene, 1999，150 :333-341.)提供的支气管败血波氏菌PCR鉴定引物和方法进行扩增Pl 5' -AGGCTCCCAAGAGAAAGGCTT-3‘P2 5' -TGGCGCCTGCCCTATC-3‘扩增出的产物为237bp，测序结果与已报道的基因序列相符Tggcgcctgccctatcccgcccgcgccgcacggacgcctgtccccgcaggaacatgccctttgccgcca gattcccccgcacatttccgaacttcactttttttgcttaagtccgtcgcaaacctgccgtaatccaggcaacaaag gaaatcgcggcgctgtgcaagcgaaagtccgatgttacgaatgggcggcctagctgcccggtttgaagaagcctttc tctcttgggagcct。挑选10 个候选菌株，分别接种 Tryptose Phospate Broth 培养基，37°C 300r/min 震荡培养20小时，效价达到101(lCFU/ml左右。随机挑选支气管败血波氏菌抗体阴性的幼犬 4只，将其分别置于两个0. 8m3的无菌容器中，以小型喷雾装置，向犬鼻周围持续喷雾细菌悬液30ml/只进行攻毒。从20株候选菌株中筛选得到了一株不引起犬窝咳症状的支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica)菌株，命名为Bb_SD25d株。该菌株已于2011年09月洸日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC No. 5292。(2)支气管败血波氏菌m3_SD25d株的稳定性取m3_SD25d株支气管败血波氏菌喷雾接种易感犬1只。3天后，从犬鼻腔分离该菌，再次喷雾接种易感犬1只，如此在动物体内连续传代10代。试验发现，该菌株在传代过程中没有导致易感犬只出现任何症状。说明，该菌株毒力在10代以内稳定。3.犬副流感病毒CPIV-CY-c株/支气管败血波氏菌m3_SD25d株免疫原性取CPIV-CY-c株种毒接种Vero细胞进行传代，传代至第90代作为效力试验用病16只CPIV抗体阴性的三周龄实验犬随机分为4组，第一、二、三组各4只，分别滴鼻免疫接种m3-SD25d株支气管败血波氏菌105、IO7, IO9CFU/只，CPIV-CY-c第90代种毒102、 IO4UO6TCID50/只。第四组作为非免疫对照组。免疫攻毒所有分组免疫3周以后进行攻毒检验。攻毒检验用菌种选用同时期分离的可诱导易感犬只产生犬窝咳临床症状的分离株m3_JSK2株，每只犬选择喷雾接种 109CFU/ml菌悬液30ml，之后再滴鼻接种107TCID5(1/ml的CPIV D008株病毒液1ml。攻毒结果显示，第一组4只易感幼犬有2只出现咳嗽，另外2只未出现咳嗽症状， 但精神沉郁、食欲减退、有轻微发烧症状。第二、三组未出现任何异常症状。病理解剖结果表明，发病犬只呼吸道黏膜分泌物明显增加。证明免疫106CFU m3-SD25d细菌和IO4TCID5tl 的CPIV-CY-c病毒可以产生足够的免疫保护力。表1犬副流感病毒/支气管败血波氏菌免疫原性测定结果
权利要求
1.一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗，其特征在于本疫苗含有CPIV-CY-C株犬副流感病毒(Canine Pzrainfluenzavirus)和 Bb_SD25d 株支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica)。
2.如权利要求1所述一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗，其特征在于CPIV-CY-c 株犬副流感病毒，该病毒株经人工致弱，接种易感犬只不引起任何症状，并能够诱导产生针对副流感病毒的特异性免疫应答；该毒株已于2011年9月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5268。
3.如权利要求1所述一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗，其特征在于m3_SD25d株支气管败血波氏菌是一株经自然弱化的菌株，该菌株已于2011年9月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5292。
4.制备权利要求1所述一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗的方法，其特征在于 将保藏号为CGMCC 5268的犬副流感病毒接种Vero细胞，37°C培养80h，经冻融、离心、收获； 将保藏号为CGMCC No. 5四2的支气管败血波氏菌天然弱毒菌株接种"Tryptose Phosphate Broth培养基37°C 300r/min震荡培养，20h收获，将两种半成品按比例混合加入冻干保护剂，经过冷冻干燥制成犬传染性气管支气管炎二联活疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗及其制备方法。本发明是利用本发明人分离得到的有较好免疫原性的犬副流感病毒(Canine Pzrainfluenzavirus)及支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica)，病毒纯化后进行传代致弱，获得弱毒株CPIV-CY-c株与菌株Bb-SD25d，做为生产用毒种，制备出安全、有效的犬传染性气管支气管炎二联活疫苗。本发明采用的毒株能够针对目前犬传染性气管支气管炎的流行情况，有效预防犬副流感病毒及支气管败血波氏菌引起的犬传染性气管支气管炎(犬窝咳)的发生。
文档编号A61K39/295GK102343088SQ20111031157
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者孟超, 嵇康, 张鹏超, 沈元 申请人:浙江诺倍威生物技术有限公司
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