一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法
一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法
【专利摘要】本发明涉及一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法，将I型胶原(COL1A1)小分子RNA(siRNA)化合物和转染试剂或细胞渗透缩氨酸(CADY或MPG)封装到直径为550～600nm的纳米纤维里，siRNA的持续释放至少会维持28天(负载效率～60-67％)。试管实验中，支架调控转染能够非常显著地增强低核苷酸的细胞吞噬，相对于传统的siRNA的药丸传递其基因沉寂的周期延长2～3倍。活体实验中，同纯的纳米纤维相比，皮下移植的siRNA支架在数周后能够明显降低纤维状胶囊的厚度。本发明为长期控制纤维状胶囊的形成提供了非常有效的方法。
【专利说明】一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织移植物领域，尤其涉及一种用于控制有机体内纤维素胶囊的形成的方法。
【背景技术】
[0002]发生在组织-移植物界面的异物反应(FBR)经常会引起发炎，伤口反应和组织的损坏，一般来说，单核细胞/巨噬细胞在移植物的表面被激活然后调控局部成纤维细胞的功能。这常常会造成移植设备周围的胶原基质沉积，纤维封装现象。结果移植物周围纤维胶囊的形成会引发一系列现象的发生，如神经点附近结疤，乳腺移植物附近纤维组织的形成，葡萄糖传感器功能性的丧失，起搏器损坏，这些都会降低移植物的应用性能。材料表面化学/物理性能的改性，生物因子和蛋白质的嵌入已经被用来提高移植设备的生物相容性，同时产生了几个潜在的缺点和不足。例如，基于水凝胶的涂层材料可能会造成对基地材料较差的粘合性和一些应用中的力学不足问题，并且化学交联剂的使用会造成安全问题。
[0003]一种可以选择的方法就是RNA干扰(RNAAi)技术。基于小分子干扰RNA(siRNA)传输的RNA干扰技术在很多领域，如癌症和基因疾病的治疗领域，已经展示出了非常好的应用性。RNA干扰技术之所以会流行是因为其能够彻底摧毁目的基因，从而导致靶向蛋白的特殊的下降调节。RNA干扰技术调控纤维胶囊形成的一个目标就是纤维状组织的主要成分I型胶原。从静电纺ε -聚己内酯和ε -聚己内酯-乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)共聚物纳米纤维中的持续传输现象。小分子干扰RNA(SiRNA)的封装保护这些不稳定分子较长周期内的降解，并且增强种子细胞的细胞吞噬。基于聚乙烯醇的水溶胶中的siRNA针对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的传输能够降低有机体中成纤维细胞的繁殖和I型胶原的表达。但是，在有机体中这样的平台不能明显地减小纤维状胶囊的厚度和mTOR蛋白的水平。
【发明内容】
[0004]本发明涉及一种基于纳米纤维调节的小分子RNA基因沉寂技术通过长期I型胶原达的降调节控制纤维状胶囊形成的方法。纤维状胶囊可调节RNA的干涉，会在移植位产生局部持续的小分子RNA传输，转染试剂(TransIT-TKO)用来进行有效的细胞吞噬，为了解决TKO引起的细胞毒性的问题，引入细胞穿透肽(CPPs)作为siRNA络合的另一种方法。CPPs (如MPG和CADY)是基于天然缩氨酸的分子，能够和核酸通过稳定的单共价键结合，调节转染从而提高有机体内的细胞内传输。另外，同阳离子脂类和阳离子聚合物相比，CPPs能够更好地降低毒性。
[0005]具体步骤如下:
[0006](1) ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)的制备:含有1~3%乙基乙烯磷酸酯(EEP)的聚ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP，Mw=94000, Mn=48000)通过ε-聚己内酯和乙基乙烯磷酸酯的开环聚合合成。ε-聚己内酯和EEP混合后在110~130°C在异辛酸亚锡作为催化剂的条件下聚合48~72h，得到的聚合物溶解在二氯甲烷中然后在冷的乙基乙醚/甲醇(10 / I~8 / 1，V / V)的混合溶剂中沉淀，然后过滤、真空干燥。沉淀出来的聚合物进一步溶解到四氢呋喃(THF)中在室温下沉淀，混合物过滤后冷冻干燥。
[0007](2)封装有基于小分子干扰RNA(siRNA)的ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备=PCLEEP溶解到三氟乙醇(TFE)中制备成10~12% (w / v)的溶液，15 μ L的siRNA原始溶液和35~42 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液混合，混合物加入到500 μ L的PCLEEP溶液中进行静电纺丝，5 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液加入到30 μ L的转染剂TKO中，10~20min后，加入15 μ L的siRNA原始溶液；10~20min后，得到的50 μ LsiRNA / TKO混合物溶液加入到500 μ L的PCLEEL溶液中进行静电纺丝，静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm。
[0008](3)封装有CPP的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备:为了制备封装有siRNA / CPP络合物的PCLEEP纳米纤维，首先配制浓度为15~20% (w / v) PCLEEP的三氟乙醇(TFE)溶液，siNEG或SiCOLlAl在不含有核糖核酸酶的水中重新配制成浓度为50 μ mol / L 的溶液；然后，将 15 μ LsiRNA 和 30、45、60 μ L 的 CPP (350 μ L 的 MPG 的焦碳酸二乙酯处理水溶液和370 μ L的CADY的2%的二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理水溶液)混合制备成体积比为I / 2，1 / 3和I / 4的混合溶液，将溶液培养20min后添加二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液至100yL。siRNA / CPP混合也然后加入到500 μ L的PCLEEP溶液中，均一的siRNA / CPP-聚合物混合物装到注射泵中，进行静电纺丝。静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm，有序排列的PCLEEP纳米纤维制备时，纤维是沉积到覆盖在接地的转筒上(2500rpm)的ε -聚己内酯(PCL)膜上，聚乳酸膜是用0.15g / mL的PCL-三氯甲烷溶液通过溶剂浇铸的方法制备 的，浇铸完后冷冻干燥12~24h去除多余的溶剂。
[0009]本发明中，将I型胶原(COLlAl)小分子RNA(siRNA)化合物和转染试剂或细胞渗透缩氨酸(CADY或MPG)封装到直径为550~600nm的纳米纤维里，siRNA的持续释放至少会维持28天(负载效率~60-67% )。试管实验中，支架调控转染能够非常显著地增强低核苷酸的细胞吞噬，相对于传统的siRNA的药丸传递其基因沉寂的周期延长2~3倍。活体实验中，同纯的纳米纤维相比，皮下移植的siRNA支架在数周后能够明显降低纤维状胶囊的厚度，为长期控制纤维状胶囊的形成提供了非常有效的方法。
【具体实施方式】
[0010]为了加深对本发明的理解，下面结合具体实例对本发明做进一步的详述。
[0011](I) ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)的制备:含有I %乙基乙烯磷酸酯(EEP)的聚ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP，Mw=94000，Mn=48000)通过ε -聚己内酯和乙基乙烯磷酸酯的开环聚合合成。ε -聚己内酯和EEP混合后在120°C在异辛酸亚锡作为催化剂的条件下聚合48h。得到的聚合物溶解在二氯甲烷中然后在冷的乙基乙醚/甲醇(体积比为10 / I)的混合溶剂中沉淀，然后过滤、真空干燥，沉淀出来的聚合物进一步溶解到四氢呋喃(THF)中然后在室温下水中沉淀，然后混合物过滤后冷冻干燥。
[0012](2)封装有siRNA的ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备:PCLEEP溶解到三氟乙醇(TFE)中制备成10% (w / v)的溶液，15μ L的siRNA原始溶液和35 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液混合，然后，混合物加入到500μ L的PCLEEP溶液中进行静电纺丝，5 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液加入到30 μ L的转染剂TKO中。IOmin后，加入15 μ L的siRNA原始溶液，IOmin后，得到的50 μ LsiRNA / TKO混合物溶液加入到500yL的PCLEEL溶液中进行静电纺丝，静电纺丝电压为12kV，带负电荷(3kV)的铝箔作为接收板，纺丝距离为12cm。
[0013](3)封装有CPP的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备:为了制备封装有siRNA / CPP络合物的PCLEEP纳米纤维，首先配制浓度为20% (w / v)PCLEEP的三氟乙醇(TFE)溶液，siNEG或SiCOLlAl在不含有核糖核酸酶的水中重新配制成浓度为50 μ mol / L的溶液，将15 μ LsiRNA和60 μ L的CPP (350 μ L的MPG的焦碳酸二乙酯处理水溶液和370 μ L的CADY的2%的二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理水溶液)混合制备成体积比为I / 3的混合溶液；然后，将溶液培养20min后添加二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液至100 μ L，siRNA / CPP混合也然后加入到500 μ L的PCLEEP溶液中，均一的siRNA / CPP-聚合物混合物装到注射泵中，然后进行静电纺丝(放纺丝液推进速度为1.5mL / h，纺丝电压为+12kV，接收距离12cm)。带负电的固定的铝箔(_4kV，5X5cm2)用作接收随即沉积纳米纤维的接收板，有序排列的PCLEEP纳米纤维制备时，纤维是沉积到覆盖在接地的转筒上(2500rpm)的ε -聚己内酯(PCL)膜上，聚乳酸膜是用0.15g / mL的PCL-三氯甲烷溶液通过溶剂浇铸的方法制备的，浇铸完后冷冻干燥12h去除多余的溶剂。`
【权利要求】
1.一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法，其步骤如下: (1)ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)的制备: 含有1~3%乙基乙烯磷酸酯(EEP)的聚ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP，Mw=94000,Mn=48000)通过ε -聚己内酯和乙基乙烯磷酸酯的开环聚合合成的；得到的聚合物溶解在二氯甲烷中然后在冷的乙基乙醚/甲醇(10 /1~8 / 1，V/V)的混合溶剂中沉淀，然后过滤、真空干燥；沉淀出来的聚合物进一步溶解到四氢呋喃(THF)中在20~25°C下沉淀、过滤，最后冷冻干燥； (2)封装有基于小分子干扰RNA(SiRNA)的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备: PCLEEP溶解到三氟乙醇(TFE)中制备成10~12% (w / v)的溶液，15 μ L的siRNA原始溶液和35~42μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液混合，混合物加入到500μ L的PCLEEP溶液中进行静电纺丝；5 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液加入到30 μ L的转染剂TKO中，10~20min后，加入15 μ L的siRNA原始溶液；10~20min后，得到的50 μ LsiRNA / TKO混合物溶液加入到500 μ L的PCLEEL溶液中进行静电纺丝；静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm ； (3)封装有CPP的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备: 为了制备封装有siRNA / CPP络合物的PCLEEP纳米纤维，首先配制浓度为15~20%(w / V) PCLEEP的三氟乙醇(TFE)溶液，siNEG或siCOLlAl在不含有核糖核酸酶的水中重新配制成浓度为50 μ mol / L的溶液，将15 μ LsiRNA和30、45、60 μ L的特殊混合处理水溶液(CPP)混合制备成体积比为1 / 2，1 / 3和1 / 4的混合溶液；将溶液培养20min后添加二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液至lOOyL，siRNA /CPP混合也然后加入到500 μ L的PCLEEP溶液中，均一的siRNA / CPP-聚合物混合物装到注射泵中，然后进行静电纺丝；静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm ;有序排列的PCLEEP纳米纤维制备时，纤维是沉积到覆盖在转速为2500rpm的接地转筒上的ε -聚己内酯(PCL)膜上；聚乳酸膜是用0.15g / mL的PCL-三氯甲烷溶液通过溶剂浇铸的方法制备的，浇铸完后冷冻干燥12~24h去除多余的溶剂。
2.如权利要求1所述的纤维状胶囊形成的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的开环聚合反应过程为:ε -聚己内酯和EEP混合后在110~130°C在异辛酸亚锡作为催化剂的条件下聚合48~72h。
3.如权利要求1所述的纤维状胶囊形成的方法，其特征在于:步骤(3)所述的特殊混合处理水溶液CPP的组成为:350 μ L的MPG的焦碳酸二乙酯处理水溶液和370 μ L的CADY的2%的二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理水溶液。
【文档编号】A61L31/16GK103599571SQ201310586361
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】韩志超, 许杉杉 申请人:无锡中科光远生物材料有限公司
【专利摘要】本发明涉及一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法，将I型胶原(COL1A1)小分子RNA(siRNA)化合物和转染试剂或细胞渗透缩氨酸(CADY或MPG)封装到直径为550～600nm的纳米纤维里，siRNA的持续释放至少会维持28天(负载效率～60-67％)。试管实验中，支架调控转染能够非常显著地增强低核苷酸的细胞吞噬，相对于传统的siRNA的药丸传递其基因沉寂的周期延长2～3倍。活体实验中，同纯的纳米纤维相比，皮下移植的siRNA支架在数周后能够明显降低纤维状胶囊的厚度。本发明为长期控制纤维状胶囊的形成提供了非常有效的方法。
【专利说明】一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织移植物领域，尤其涉及一种用于控制有机体内纤维素胶囊的形成的方法。
【背景技术】
[0002]发生在组织-移植物界面的异物反应(FBR)经常会引起发炎，伤口反应和组织的损坏，一般来说，单核细胞/巨噬细胞在移植物的表面被激活然后调控局部成纤维细胞的功能。这常常会造成移植设备周围的胶原基质沉积，纤维封装现象。结果移植物周围纤维胶囊的形成会引发一系列现象的发生，如神经点附近结疤，乳腺移植物附近纤维组织的形成，葡萄糖传感器功能性的丧失，起搏器损坏，这些都会降低移植物的应用性能。材料表面化学/物理性能的改性，生物因子和蛋白质的嵌入已经被用来提高移植设备的生物相容性，同时产生了几个潜在的缺点和不足。例如，基于水凝胶的涂层材料可能会造成对基地材料较差的粘合性和一些应用中的力学不足问题，并且化学交联剂的使用会造成安全问题。
[0003]一种可以选择的方法就是RNA干扰(RNAAi)技术。基于小分子干扰RNA(siRNA)传输的RNA干扰技术在很多领域，如癌症和基因疾病的治疗领域，已经展示出了非常好的应用性。RNA干扰技术之所以会流行是因为其能够彻底摧毁目的基因，从而导致靶向蛋白的特殊的下降调节。RNA干扰技术调控纤维胶囊形成的一个目标就是纤维状组织的主要成分I型胶原。从静电纺ε -聚己内酯和ε -聚己内酯-乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)共聚物纳米纤维中的持续传输现象。小分子干扰RNA(SiRNA)的封装保护这些不稳定分子较长周期内的降解，并且增强种子细胞的细胞吞噬。基于聚乙烯醇的水溶胶中的siRNA针对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的传输能够降低有机体中成纤维细胞的繁殖和I型胶原的表达。但是，在有机体中这样的平台不能明显地减小纤维状胶囊的厚度和mTOR蛋白的水平。
【发明内容】
[0004]本发明涉及一种基于纳米纤维调节的小分子RNA基因沉寂技术通过长期I型胶原达的降调节控制纤维状胶囊形成的方法。纤维状胶囊可调节RNA的干涉，会在移植位产生局部持续的小分子RNA传输，转染试剂(TransIT-TKO)用来进行有效的细胞吞噬，为了解决TKO引起的细胞毒性的问题，引入细胞穿透肽(CPPs)作为siRNA络合的另一种方法。CPPs (如MPG和CADY)是基于天然缩氨酸的分子，能够和核酸通过稳定的单共价键结合，调节转染从而提高有机体内的细胞内传输。另外，同阳离子脂类和阳离子聚合物相比，CPPs能够更好地降低毒性。
[0005]具体步骤如下:
[0006](1) ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)的制备:含有1~3%乙基乙烯磷酸酯(EEP)的聚ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP，Mw=94000, Mn=48000)通过ε-聚己内酯和乙基乙烯磷酸酯的开环聚合合成。ε-聚己内酯和EEP混合后在110~130°C在异辛酸亚锡作为催化剂的条件下聚合48~72h，得到的聚合物溶解在二氯甲烷中然后在冷的乙基乙醚/甲醇(10 / I~8 / 1，V / V)的混合溶剂中沉淀，然后过滤、真空干燥。沉淀出来的聚合物进一步溶解到四氢呋喃(THF)中在室温下沉淀，混合物过滤后冷冻干燥。
[0007](2)封装有基于小分子干扰RNA(siRNA)的ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备=PCLEEP溶解到三氟乙醇(TFE)中制备成10~12% (w / v)的溶液，15 μ L的siRNA原始溶液和35~42 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液混合，混合物加入到500 μ L的PCLEEP溶液中进行静电纺丝，5 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液加入到30 μ L的转染剂TKO中，10~20min后，加入15 μ L的siRNA原始溶液；10~20min后，得到的50 μ LsiRNA / TKO混合物溶液加入到500 μ L的PCLEEL溶液中进行静电纺丝，静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm。
[0008](3)封装有CPP的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备:为了制备封装有siRNA / CPP络合物的PCLEEP纳米纤维，首先配制浓度为15~20% (w / v) PCLEEP的三氟乙醇(TFE)溶液，siNEG或SiCOLlAl在不含有核糖核酸酶的水中重新配制成浓度为50 μ mol / L 的溶液；然后，将 15 μ LsiRNA 和 30、45、60 μ L 的 CPP (350 μ L 的 MPG 的焦碳酸二乙酯处理水溶液和370 μ L的CADY的2%的二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理水溶液)混合制备成体积比为I / 2，1 / 3和I / 4的混合溶液，将溶液培养20min后添加二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液至100yL。siRNA / CPP混合也然后加入到500 μ L的PCLEEP溶液中，均一的siRNA / CPP-聚合物混合物装到注射泵中，进行静电纺丝。静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm，有序排列的PCLEEP纳米纤维制备时，纤维是沉积到覆盖在接地的转筒上(2500rpm)的ε -聚己内酯(PCL)膜上，聚乳酸膜是用0.15g / mL的PCL-三氯甲烷溶液通过溶剂浇铸的方法制备 的，浇铸完后冷冻干燥12~24h去除多余的溶剂。
[0009]本发明中，将I型胶原(COLlAl)小分子RNA(siRNA)化合物和转染试剂或细胞渗透缩氨酸(CADY或MPG)封装到直径为550~600nm的纳米纤维里，siRNA的持续释放至少会维持28天(负载效率~60-67% )。试管实验中，支架调控转染能够非常显著地增强低核苷酸的细胞吞噬，相对于传统的siRNA的药丸传递其基因沉寂的周期延长2~3倍。活体实验中，同纯的纳米纤维相比，皮下移植的siRNA支架在数周后能够明显降低纤维状胶囊的厚度，为长期控制纤维状胶囊的形成提供了非常有效的方法。
【具体实施方式】
[0010]为了加深对本发明的理解，下面结合具体实例对本发明做进一步的详述。
[0011](I) ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)的制备:含有I %乙基乙烯磷酸酯(EEP)的聚ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP，Mw=94000，Mn=48000)通过ε -聚己内酯和乙基乙烯磷酸酯的开环聚合合成。ε -聚己内酯和EEP混合后在120°C在异辛酸亚锡作为催化剂的条件下聚合48h。得到的聚合物溶解在二氯甲烷中然后在冷的乙基乙醚/甲醇(体积比为10 / I)的混合溶剂中沉淀，然后过滤、真空干燥，沉淀出来的聚合物进一步溶解到四氢呋喃(THF)中然后在室温下水中沉淀，然后混合物过滤后冷冻干燥。
[0012](2)封装有siRNA的ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备:PCLEEP溶解到三氟乙醇(TFE)中制备成10% (w / v)的溶液，15μ L的siRNA原始溶液和35 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液混合，然后，混合物加入到500μ L的PCLEEP溶液中进行静电纺丝，5 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液加入到30 μ L的转染剂TKO中。IOmin后，加入15 μ L的siRNA原始溶液，IOmin后，得到的50 μ LsiRNA / TKO混合物溶液加入到500yL的PCLEEL溶液中进行静电纺丝，静电纺丝电压为12kV，带负电荷(3kV)的铝箔作为接收板，纺丝距离为12cm。
[0013](3)封装有CPP的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备:为了制备封装有siRNA / CPP络合物的PCLEEP纳米纤维，首先配制浓度为20% (w / v)PCLEEP的三氟乙醇(TFE)溶液，siNEG或SiCOLlAl在不含有核糖核酸酶的水中重新配制成浓度为50 μ mol / L的溶液，将15 μ LsiRNA和60 μ L的CPP (350 μ L的MPG的焦碳酸二乙酯处理水溶液和370 μ L的CADY的2%的二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理水溶液)混合制备成体积比为I / 3的混合溶液；然后，将溶液培养20min后添加二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液至100 μ L，siRNA / CPP混合也然后加入到500 μ L的PCLEEP溶液中，均一的siRNA / CPP-聚合物混合物装到注射泵中，然后进行静电纺丝(放纺丝液推进速度为1.5mL / h，纺丝电压为+12kV，接收距离12cm)。带负电的固定的铝箔(_4kV，5X5cm2)用作接收随即沉积纳米纤维的接收板，有序排列的PCLEEP纳米纤维制备时，纤维是沉积到覆盖在接地的转筒上(2500rpm)的ε -聚己内酯(PCL)膜上，聚乳酸膜是用0.15g / mL的PCL-三氯甲烷溶液通过溶剂浇铸的方法制备的，浇铸完后冷冻干燥12h去除多余的溶剂。`
【权利要求】
1.一种可控制有机体中纤维状胶囊形成的方法，其步骤如下: (1)ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP)的制备: 含有1~3%乙基乙烯磷酸酯(EEP)的聚ε -聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯(PCLEEP，Mw=94000,Mn=48000)通过ε -聚己内酯和乙基乙烯磷酸酯的开环聚合合成的；得到的聚合物溶解在二氯甲烷中然后在冷的乙基乙醚/甲醇(10 /1~8 / 1，V/V)的混合溶剂中沉淀，然后过滤、真空干燥；沉淀出来的聚合物进一步溶解到四氢呋喃(THF)中在20~25°C下沉淀、过滤，最后冷冻干燥； (2)封装有基于小分子干扰RNA(SiRNA)的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备: PCLEEP溶解到三氟乙醇(TFE)中制备成10~12% (w / v)的溶液，15 μ L的siRNA原始溶液和35~42μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液混合，混合物加入到500μ L的PCLEEP溶液中进行静电纺丝；5 μ L的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液加入到30 μ L的转染剂TKO中，10~20min后，加入15 μ L的siRNA原始溶液；10~20min后，得到的50 μ LsiRNA / TKO混合物溶液加入到500 μ L的PCLEEL溶液中进行静电纺丝；静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm ； (3)封装有CPP的ε-聚己内酯共聚乙基乙烯磷酸酯纳米纤维的制备: 为了制备封装有siRNA / CPP络合物的PCLEEP纳米纤维，首先配制浓度为15~20%(w / V) PCLEEP的三氟乙醇(TFE)溶液，siNEG或siCOLlAl在不含有核糖核酸酶的水中重新配制成浓度为50 μ mol / L的溶液，将15 μ LsiRNA和30、45、60 μ L的特殊混合处理水溶液(CPP)混合制备成体积比为1 / 2，1 / 3和1 / 4的混合溶液；将溶液培养20min后添加二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理的三羟甲基甲胺-乙二胺四乙酸缓冲液至lOOyL，siRNA /CPP混合也然后加入到500 μ L的PCLEEP溶液中，均一的siRNA / CPP-聚合物混合物装到注射泵中，然后进行静电纺丝；静电纺丝电压为10~12kV，带负电荷(3~4V)的铝箔作为接收板，纺丝距离为10~12cm ;有序排列的PCLEEP纳米纤维制备时，纤维是沉积到覆盖在转速为2500rpm的接地转筒上的ε -聚己内酯(PCL)膜上；聚乳酸膜是用0.15g / mL的PCL-三氯甲烷溶液通过溶剂浇铸的方法制备的，浇铸完后冷冻干燥12~24h去除多余的溶剂。
2.如权利要求1所述的纤维状胶囊形成的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的开环聚合反应过程为:ε -聚己内酯和EEP混合后在110~130°C在异辛酸亚锡作为催化剂的条件下聚合48~72h。
3.如权利要求1所述的纤维状胶囊形成的方法，其特征在于:步骤(3)所述的特殊混合处理水溶液CPP的组成为:350 μ L的MPG的焦碳酸二乙酯处理水溶液和370 μ L的CADY的2%的二甲基亚砜-焦碳酸二乙酯处理水溶液。
【文档编号】A61L31/16GK103599571SQ201310586361
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】韩志超, 许杉杉 申请人:无锡中科光远生物材料有限公司
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