包括凝血酶抑制化合物和凝血因子Vlla抑制剂的复合产物的制作方法
专利名称：包括凝血酶抑制化合物和凝血因子Vlla抑制剂的复合产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新复合药用活性化合物。
背景和已有技术血液凝固是涉及止血(即防止血管损伤失血)和血栓形成(即血管中血块形成，有时导致血管阻塞)二者中的关键过程。
凝固是复杂系列酶促反应的结果。
在此系列反应中最终的一个步骤是前酶凝血酶原(proenzymeprothrombin)转化为活性酶凝血酶(active enzyme thrombin)。
已知凝血酶在凝固中起重要作用。它活化血小板，导致血小板凝集，转化纤维蛋白原为纤维蛋白单体，它自发聚合为纤维蛋白多聚体，接着又交联该多聚体，形成不溶性血纤维蛋白。此外，凝血酶活化凝血因子V及凝血因子VIII，导致由凝血酶原产生凝血酶的一种“正反馈”。
WO94/29336披露了一族凝血酶抑制化合物，其包括HOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-H(其中Cgl代表环己基甘氨酸，Aze代表S-三甲叉亚胺-2-羧酸及Pab-H代表4-氨甲基脒基苯(aminomethylamidinobenzene))，它亦被称为melagatran(参见实施例1的WO94/29336)。WO97/23499披露了尤其是melagatran的前体药物。
凝血因子VII是与经体外途径触发连串凝血相关的两种蛋白质的一种(与组织因子一起)。普遍认为，血液凝固实际上是在形成组织因子/凝血因子VIIa复合物后开始的。一旦这种复合物形成了，它就通过激活凝血因子IX及X引起凝固。
某些化合物已知是具有凝血因子VIIa的抑制特性。参见，例如，WO96/25427，WO92/15686，WO92/06711，WO96/12021，WO98/50420，WO96/12800、WO97/47651、WO99/03498、WO94/07528、WO96/20689、WO95/23860、WO97/49684、WO99/41276、WO99/41231、WO99/48878、WO99/50254、WO99/50257、WO99/50263、WO99/12936、WO99/13063、WO99/67215、WO00/15658、WO00/30646、WO00/35858、WO00/35886、WO00/40601、WO00/41531、WO00/51989、WO00/58346、WO00/66545、WO00/69826、WO00/69832、WO00/69834、WO01/10892、WO94/27631、WO95/12674、WO97/20939、WO97/48687、WO97/48706、WO98/09987、WO98/22619及WO99/00371；US5,437,864、5,833,982、5,834,244、5,863,893、5,023,236、6,020,331及5,639,739；EP921116、EP931793、EP669317及EP987274；及德国专利申请DE19829964、DE19834751、DE19835950、DE19839499、DE19845153、DE19900355及DE19900471。
上述文件均没公开或提出给用与凝血因子VIIa抑制剂的melagatran或其药用衍生物相结合的药。我们现在发现，令人惊奇地是，刚好这种结合的用药产生了一种显著的协同抗凝剂效应。
发明内容
按照本发明的第一个方面，提供了一种复合产物，包括(A)melagatran或其一种药用的衍生物；及(B)凝血因子VIIa抑制剂或其药用的衍生物，其中各组分(A)及(B)是按与药用的辅剂、稀释剂或载体成混合物的形式而制剂的。
按照本发明的复合产物提供了给用melagatran(或其衍生物)与凝血因子VIIa抑制剂相结合的药物，并由此可提供或作为单独制剂，其中至少一种制剂包括melagatran，至少一种包括凝血因子VIIa抑制剂，或可提供(配制)它作为一种复合制剂(即提供为包括melagatran及凝血因子VIIa抑制剂的单一制剂)。
因此，这里还提供了(1)、一种与药用的辅剂、稀释剂或载体成混合物的药物制剂，其包括melagatran或其药用衍生物，和凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，(此制剂以下简称“复合制剂”)；和(2)一种含有下列组分的试剂盒(a)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的melagatran或其药用衍生物的一种药物制剂，；和(b)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的凝血因子VII抑制剂或其药用衍生物的一种药物制剂，
其组分(a)和(b)是各以适合于与另一组分结合用药的形式提供的。
按照本发明的另一方面，这里提供了一种制备上述定义的试剂盒的方法，该方法包括使定义同上的组分(a)与定义同上的组分(b)相组合，从而提供适合于彼此结合用药的两个组分。
通过使该二组分彼此“相组合”，包括试剂盒的组分(a)和(b)可以是(i)提供单独制剂(即彼此无关)，随后将它们组合一起，彼此结合用于联合治疗中；或(ii)作为“复合包装”的单独组分被包装，并被同时提供，彼此结合用于联合治疗中。
因此，这里进一步提供一种试剂盒，包括(I)按这里所定义的组分(a)和(b)中的一种；与(II)与二组分中另一组分相结合的那个组分的使用说明书。
这里所述试剂盒可包括一种以上的包括适宜量/剂量的melagatran或其衍生物的制剂，及/或一种以上的包括适宜量/剂量的凝血因子VIIa抑制剂或其衍生物的制剂，以提供重复剂量。如果存在有一种以上的制剂(包括二活性化合物之一)，这种制剂在melagatran(或衍生物)或凝血因子VIIa抑制剂(或衍生物)的剂量、化学组成及/或外观方面，可以是相同的，或是不同的。
本发明还有一方面，提供了一种指示抗凝血疗法条件治疗方法，它包括给用一种与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的药物制剂，包含melagatran(或其药用衍生物)和凝血因子VIIa抑制剂(或其药用的衍生物)。
本发明的另一方面，提供一种指示抗凝血疗法条件的治疗方法(通过它指示需要抗凝血的场合)，它包括病人对这种条件容忍或敏感的用药(a)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的melagatran或其药用衍生物的一种药物制剂；结合(b)包括与药用的辅剂、稀释剂或载体成混合物的凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物的一种药物制剂。
为避免疑问，这里所用术语“治疗”包括治疗及/或预防性治疗。
对于此处所述试剂盒，所谓“与...结合用药”，包括在可能急性或慢性的相关条件下治疗过程中，顺序、单独及/或同时地给用各自包括melagatran(或其衍生物)和凝血因子VIIa抑制剂(或其衍生物)的制剂药物。
因此，关于按照本发明的复合产物，术语“与...结合用药”包括(任选反复)给用两组分复合产物(melagatran/衍生物和凝血因子VIIa抑制剂/衍生物)的药物，或在相关条件治疗过程中，(在复合制剂情况下)同时地，或(在试剂盒的情况下)及时充分密切地，(任选反复)单独地用药，以求达到有利病人的效果，即高于在同一疗程中或制剂包含melagatran/衍生物，或制剂包含凝血因子VIIa抑制剂/衍生物，而没有其它组分时的效果。关于具体条件和在治疗过程中，确定一种结合是否产生较大有利的效果，将取决于接受治疗或预防治疗的条件，但是对于技术熟练人员通常都可以实现的。
此外，在按照本发明试剂盒的上下文中，术语“结合”包括在给用另一组分药之前，之后及/或同时，可(任选反复)给用两种制剂中一种或另一种药物。凡本文中在使用时，术语“同时用药”和“与...同时用药”包括在彼此48小时(如24小时)内给用单独剂量的melagatran(或其衍生物)和凝血因子VIIa抑制剂(或其衍生物)的药物。
melagatran和凝血因子VIIa抑制剂的“药用衍生物”包括盐类(如药用的无毒有机酸的或无机酸的加成盐类)和溶剂化物。应当知道，该术语视情况而定还包括具有与melagatran或凝血因子VIIa抑制剂同样生物学功能及/或活性衍生物。此外，对于本发明目的，该术语也包括melagatran或凝血因子VIIa抑制剂的前体药物。melagatran或凝血因子VIIa抑制剂的“前体药物”，视情况而定，包括在口服或肠胃外用药后，其剂量可实验检测，并在预定时间内(如在6-24小时之间的间隔内(即每日一次到四次”))可在体内代谢形成melagatran或各自凝血因子VIIa抑制剂二物质的任一组合物。为避免疑问，该术语“肠胃外”用药包括所有非口服用药的形式。
可提及的melagatran的前体药物包括在WO97/23499中公开的那些。优选前体药物为化学式R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH(参见以上或WO97/23499中的略语表)的那些，其中R1代表C1-10烷基或苄基烷基，诸如直链或分支链的C1-6烷基(如C1-4烷基，尤其甲基、正丙基、异丙基、叔丁基及，特别，乙基)和OH基团替代Pab中的脒基氢。
可以应用于按照本发明的复合产物中的凝血因子VII抑制剂包括国际专利申请中所述的那些WO96/25427、WO92/15686、WO92/06711、WO96/12021、WO98/50420、WO96/12800、WO97/47651、WO99/03498、WO94/07528、WO96/20689、WO95/23860、WO97/49684、WO99/41276、WO99/41231、WO99/48878、WO99/50254、WO99/50257、WO99/50263、WO99/12936、WO99/13063、WO99/67215、WO00/15658、WO00/30646、WO00/35886、WO00/35886、WO00/40601、WO00/41531、WO00/51989、WO00/58346、WO00/66545、WO00/69826、WO00/69832、WO00/69834、WO01/10892、WO94/27631、WO95/12674、WO97/20939、WO97/48687、WO97/48706、WO98/09987、WO98/22619和WO99/00371；US5,437,864、5,833,982、5,834,244、5,863,893、5,023,236、6,020,331和5,639,739；欧洲专利申请EP921116、EP931793、EP669317和EP987274；德国专利申请DE19829964、DE19834751、DE19835950、DE19839499、DE19845153、DEl9900355及DE19900471。在所有文件中具体和一般披露均在此引以参考。
优选的凝血因子VIIa抑制剂包括在国际专利申请所述的那些WO98/50420、WO97/47651、WO99/03498、WO96/20689、WO00/15658、WO00/35858、WO00/35886、WO00/41531、WO00/58346、WO00/66545、WO00/69826、WO00/69832、WO00/69834、WO98/22619、和US5,639,739，和尤其在国际专利申请所述的那些WO92/15686、WO96/12021和WO99/41231和欧洲专利申请中所述的那些EP987274和EP921116，其中所有文件具体和一般披露在此引以参考，以及N[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[氨基(亚氨基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺(leucinamide)和其药用衍生物，对它们均可按如下所述方法制备。
对于术语“指示抗凝血疗法条件”，本领域技术人员应当明白包括以下治疗及/或预防包括人类的动物血液及/或组织中的血栓形成和过高血液凝固性。众所周知，过高血液凝固性可导致血栓栓塞的疾病。可以提及的有关过高血液凝固性和血栓栓塞的疾病条件包括遗传的或后天的激活蛋白质C阻力，诸如凝血因子V-突变(凝血因子V Leiden)，和在抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、肝素辅因子II方面的遗传或后天缺陷。已知与过高血液凝固性和血栓栓塞疾病相关的另一些条件，除凝固综合症(如弥漫性血管内凝血(DIC))和一般血管损伤(如由于手术)之外，还包括循环抗磷脂抗体(狼疮抗凝物)、高胱氨酸血、诱导血小板减少的肝素和纤维蛋白溶解中的缺陷。
在神经变性疾病诸如阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)治疗条件中遇到一种不理想的过量凝血酶而无过高血液凝固性病征的情况。
可以提及的具体疾病状态包括，治疗及/或预防性治疗各种静脉血栓形成(如DVT)及肺栓塞、动脉血栓形成(如在心肌梗死，不稳定绞痛，血栓形成基脉搏和外动脉血栓形成中)，和系统栓塞，通常在心房纤维性颤动过程中来自心房或在透壁性心肌梗塞后来自左侧心室，或由充血性心力衰竭所引起的；预防血栓溶解之后再闭塞(即血栓形成)，经皮肤的反鲁米那血管成形术(PTA)和冠状动脉架搭桥术操作；一般在显微手术及血管手术后防止血栓再形成。
更进一步指示包括由细菌、多处外伤、中毒或任何其它机制所引起的弥漫性血管内凝血的治疗及/或预防性治疗；当血液与体内的外来表面诸如血管接枝、血管斯坦特印模(vascular stents)、血管导管、机械及生物人工瓣膜或任何其它医用器材接触时的抗凝血治疗；及当血液与人体外部医用器械接触时，诸如在利用心肺机或在血液透析进行心血管的手术过程中抗凝血的治疗；自发及成人呼吸窘迫综合症、随后用辐射或化疗法治疗的肺纤维化、脓毒性休g、败血病、炎症反应的治疗及/或预防性治疗，包括，但不局限于，浮肿、急性或慢性的动脉粥样硬化诸如冠状动脉疾病及动脉粥样硬化的噬菌斑的形成、大脑动脉疾病、脑梗死、脑血栓形成、脑栓塞、外部动脉疾病、局部缺血、绞痛(包括不稳定绞痛)、再灌注损害、经皮肤反鲁米那血管成形术(PTA)及冠状动脉旁路手术之后再狭窄。
优选条件包括血栓形成。
按照本发明，给用melagatran、凝血因子VIIa抑制剂及二者之一的衍生物药物，均可通过口、静脉内、皮下、向颊、直肠、皮肤、鼻、气管、支气管、局部地用药，通过任何其它肠胃外路径、或经由吸入，以包括药用剂型的melagatran及/或凝血因子VII抑制剂的药物制剂形式用药。除用药途径以外，还可根据所治疗的病症及病人，以不同剂量给用这些组合物药。
释放优选方式是内吸收的。对于melagatran及其衍生物，优选用药方式是肠胃外的，更优选静脉内的，尤其是皮下的。对于melagatran的前体药物，优选用药方式是口服。
对于哺乳动物的治疗法，尤其对人类，一般按与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的药物制剂，按所设想的用药途径和标准药用惯例加以选择，给用melagatran，凝血因子VII抑制剂及二者之一的衍生物药物。
文献中对给用melagatran及其衍生物(包括前体药物)的适宜制剂有所描述，例如尤其WO94/29336、WO96/14084、WO96/16671、WO97/23499、WO97/39770、WO97/45138、WO98/16252，WO99/27912，WO99/27913,WO00/12043及WO00/13671，其中文件披露在此引以参考。
同样，文献中对给用凝血因子VIIa抑制剂及其衍生物(包括前体药物)的适宜制剂也有描述，例如已有技术文件中对以上提及的凝血因子VIIa抑制剂所描述的那些，其文件披露在此引以参考。另外，对于技术熟练的人员利用常规技术，易于实现适宜制剂的制备，和在包括melagatran/衍生物及凝血因子VII抑制剂/衍生物二者的具体结合的制备。
在各自制剂中melagatran、凝血因子VII抑制剂或二者的衍生物的用量，取决于治疗条件严重程度及病人，以及所用化合物，但对于技术熟练的人员这些都是易于确定的。
对哺乳动物患者，尤其对人的治疗及/或预防性治疗，通常可由开业医生或技术熟练人员确定，而且包括已有技术文件关于melagatran(或其衍生物(包括前体药物)及凝血因子VII抑制剂中所论述的各自剂量，即以上提及的，其中文件披露在此引以参考。
对于melagatran，在对哺乳动物患者，尤其对病人的治疗及/或预防性治疗中，活性化合物、前体药物及其衍生物的适宜剂量包括在有关治疗条件的过程中，使平均血浆浓度最多5μmol/L，例如在0.001到5μmol/L范围。因此，适宜剂量对melagatran，可以在每日一次0.1毫克到每日三次25毫克的范围，及/或最多24小时内肠胃外注入100毫克，而对melagatran前体药物，包括以上具体提及的，其范围在每日一次0.1毫克到每日的三次100毫克的范围。
至于凝血因子VIIa抑制剂，治疗或预防目的的适宜剂量是在例如接受10-500毫克的范围，在如需要时，分为数剂。当采用肠胃外的路径时，一般应给药剂量较低，例如对于静脉注射，一般应采用给药剂量在例如1-50mg范围。在连续输注时，一般采用0.1-5毫克/公斤/小时的剂量。
在任何情况下，医师，或技术熟练的人员，应当能确定最适合于各个患者的实际剂量，其实际剂量，除随年龄、体重、性别和具体患者对治疗的反应而变外，很可能会随治疗条件而变化。上述剂量是普通案例的范例；当然会有各种较高或较低剂量范围适宜的个别情况，而且这些都在本发明范畴内。
当用药为分离的制剂时，其中包括melagatran(或其衍生物)和凝血因子VII抑制剂(或其衍生物)制剂的用药顺序(即是否，什么位置、顺序、分离及/或同时用药)，可以由医师或技术熟练的人员确定。例如，用药顺序可能取决于对技术熟练人员很明显的许多因素，诸如在治疗过程或治疗期间任何时候，因为实际原因不能对患者给一种或另一种药制剂(如患者不省人事，而因此不能采取口服包括melagatran或凝血因子VII抑制剂二者的制剂)。
与已有技术已知相同方法的这种治疗条件相比，这里所述的方法可能优点在于，它们在指示抗凝血疗法条件治疗中，对于医师及/或患者都会更方便，更有效，毒性更小，活性范围更宽，更有效力，产生的副作用更少，或者可能会有其它适用药理学特性。
通过以下实施例说明本发明，但非对其限制。
实施例1N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[氨基(亚氨基)甲基]-苄基}-L-亮氨酸酰胺(a)N2-(叔-丁氧羰基)-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺对在冰浴上的4-氨甲基苄腈(15.0g，41.0mmol)、DMAP(37.0g，303mmol)和在DMF(200ml)中的EDC(13.8g，72mmol)的搅拌溶液加入2-叔(L)-丁氧羰基氨基-4-甲基-戊酸(5.4g)。移开冰浴。24小时之后加水(500ml)。用DCM(500ml)萃取该产物。用1MHCl(2×250ml)、H2O(250ml)、1M NaHCO3(2×250ml)、H2O(250ml)和盐水(250ml)洗涤该有机相。用MgSO4干燥有机层，并对其过滤及提浓，得到16.92g的干固体。收率75％。1H-NMR(400MHz，DMF-d7)δ0.71(d，3H)，0.74(d，3H)，1.22(s，9H)，1.41(m，2H)，1.69(m，1H)，3.98(m，1H)，4.31(d，2H)，6.73(d，1H)，7.36(d，2H)，7.61(d，2H)，8.35(t，1H)。MS m/e346(M+H)+。
(b)N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺将盐酸饱和EtOAc(250ml)滴加到在冰浴上的反应烧瓶中，反应烧瓶内有N2-(叔丁氧羰基)-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(16.9g，48.9mmol，参见以上步骤(a))。移开冰浴。30分钟之后，蒸发该反应，得到副标题产物的HCl盐类(13.0g，46.1mmol)。收率94％。1H-NMR(400MHz，DMF-d7)δ0.77(d，3H)，0.79(d，3H)，1.66(m，3H)，3.99(m，1H)，4.35(ddd，2H)，7.45(d，2H)，7.63(d，2H)，8.77(broad，s，3H)。
MS m/e246(M+H)+。
(c)N-{[3-(甲氧基羰基)苄基]磺酰基}-D-缬氨酰-N1-(4-氰基苄基)-L-亮氨酸酰胺将N-{[3-(甲氧基羰基)苄基]磺酰基}-D-缬氨酸(0.60g，1.8mmol)加至在冰浴中冷却的搅拌溶液中，该搅拌溶液内有N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(0.56g，2.0mmol，参见步骤以上(b))、DMAP(1.1g，9mmol)及在DMF(10ml)中的EDC(0.42g，2.2mmol)。移开冰浴，24小时之后加入H2O(80mL)。用EtOAc(3×30ml)萃取该混合物。用1M HCl(2×100ml)、H2O(100ml)、1M NaHCO3(2×100ml)、H2O(100ml)及盐水(100ml)洗涤该合并有机相。分离有机相，并用MgSO4对其加以干燥、过滤及在真空中提浓，得到0.79g的副标题化合物千固体。收率71％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.92(d，3H)，0.94(d，3H)，0.95(d，3H)，0.98(d，3H)，1.60(m，2H)，1.80(m，1H)，1.95(m，1H)，3.44(m，1H)，3.93(s，3H)，4.23(dd，2H)，4.44(ddd，2H)，4.60(m，1H)，6.29(d，1H)，7.33(d，2H)，7.50(m，3H)，8.04(d，2H)。MS m/e557(M+H)+。
(d)N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺将在H2O(20ml)中0.4M氢氧化锂溶液滴加至一种搅拌溶液中，该溶液内有在THF中的N-{[3-(甲氧基羰基)苄基]磺酰基)-D-缬氨酰-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(0.76g，1.37mmol，参见以上步骤(c))。2小时之后用1M盐酸调节反应pH至7。在真空中蒸干该反应混合物(1.06g)。该粗品，被LiCl污染，直接用于下一步，而不用进一步提纯。1H-NMR(400MHz，MeOD)δ0.90(d，3H)，0.91(d，3H)，0.95(d，3H)，0.96(d，3H)，1.65(m，3H)，1.91(m，1H)，3.52(d，1H)，3.72(m，1H)，4.35(m，4H)，7.39(m，4H)，7.58(d，2H)，7.92(d，1H)，7.97(s，1H)。MS m/e543(M+H)+。
(e)N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1{4-[(Z)-氨基(肟基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺将三乙胺(0.74ml)和盐酸羟胺(0.22g)在氮保护气氛下加至N[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(0.89g，粗品，参见以上步骤(d))的乙醇搅拌溶液中。加热回流该反应混合物。18小时之后，在真空下提浓该反应混合物至干燥(0.74g)。粗品直接用于下一步而不必进一步提纯。
MS m/e576(M+H)+。
(f)N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[氨基(亚氨基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺将10％Pd/C(0.13g)和乙酸酐(0.13ml)加至N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[(Z)-氨基(肟基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺(0.74g，粗品，参见以上步骤(e))的乙酸(40ml)搅拌溶液中。在氢气氛(5巴)下完成该反应。3.5小时之后，通过硅藻土过滤该反应混合物。用乙酸洗涤硅藻土，将合并后的滤液在真空中浓缩，并在乙腈/1M NH40Ac中使残余物沉淀出，对其过滤和干燥，得到0.34g的标题产物。1H-NMR(400MHz，CD3COOD)旋转异构体δ0.91(d，3H)，0.95(d，3H)，0.96(d，3H)，0.98(d，3H)，1.71(m，2H)，1.96(m，1H)，3.71(d，1H，主旋转异构体)，3.74(d，1H，次旋转异构体)，4.26(d，2H，次旋转异构体)，4.32(d，2H，主旋转异构体)，4.45(d，1H)，4.60(d，1H)，4.70(m，1H)，7.46(m，3H)，7.66(d，1H)，7.73(d，2H，主旋转异构体)，7.77(d，2H，次旋转异构体)，8.05(宽s，2H)。MS m/e560(M+H)+。
缩写词DCM＝二氯甲烷DMF＝二甲基甲酰胺DMAP＝4-二甲基氨基吡啶EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二酰亚胺盐酸盐MS＝质谱按下述检验法测试实施例1的化合物。
试验A用于凝血因子VIIa的显色机械手法显色底物Spectrozyme FVIIa，CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA(pefachrome 5979来自Pentapharm，Switzerland)是从AmericanDiagnostica Inc.(Greenwich，CT，USA)购买的。单独确定在测定条件下的KM。重组人体凝血因子VIIa(rFVIIa，产物号407)和非脂质化(non-lipidated)重组人体组织-凝血因子(rTF，产物号4500)是从American Diagnostica Inc购买的。将rFVIIa的原液(用1ml水溶解1.08毫克蛋白质至21.6μM，在20mM Tris-HCl，100mM NaCl中，pH7.4)和rTF(用1.5ml水溶解1mg蛋白质至19μM，在50mMTris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，CHAPS(3-((3-胆酰胺基丙基)二甲基氨醇)-1-磺酸丙烷；10mM中)和200mM甘露糖醇)存放在-80℃下的0.5ml试剂管中。通过添加8μL的21.6μM rFVIIa和22μL的19μM rTF至6ml有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的测定缓冲液中，制成一种29nM rFVIIa和68nM TF的混合物。在室温下培育该混合物30分钟。该测定缓冲液装有50mM Tris与100mM NaCl，0.1％BSA，5mM CaCl2调节pH7.4该测定缓冲液含50mM Tris和100mMNaCl、0.1％BSA、5mM CaCl2在37℃用HCl调节pH至7.4。将该化合物溶于100％DMSO中，使浓度在96孔微量滴定板中达到10mM。用DMSO(二甲亚砜)在2栏至11栏中按1∶3分级稀释为10个浓度，配制一个新平皿。在最后测定中，从该平皿的所有加样孔中转移4μL至量测平面皿，使150μL/孔中的最终测定浓度为2.7％DMSO。该凝血因子VIIa机械手测定是按150uL总测定体积在ROSYSPlato3000机械手微量滴定板处理机中完成的。在室温下对在2-11栏中的4μL抑制剂添加122μL的测定缓冲液，然后将12μL的FVIIa-rTF工作液多次分配至所有加样孔中，并最后在混合12μL的Spectrozyme FVIIa工作液之后，使之达至最后浓度0.2mM。在37℃下混合和培育40分钟后，读取405nm(纳米)光吸光率差异。用非线性回归方法计算各化合物IC50值，其公式AI/A0＝1/(1+([I]/IC50)s)此处AI＝在抑制剂存在下405nm处最后吸光率，A0＝没有抑制剂时的吸光率，和s为剂量滴定曲线斜率，对于纯竞争性抑制物其理论值为1。然后可根据以下关联式估算此Ki值Ki＝IC50/(1+S/Km)＝IC50/1.32试验B用显色机器手检验法确定凝血酶抑制作用利用96孔的半容积微滴定平皿(Costar，Cambrige，MA，USA；Cat No3690)，在Plato 3300机械手微平皿处理机(Rosys AG，CH-8634Hombrechtikon，Switzerland)中，以显色底物方法测定凝血抑制因子效力。测试物质在DMSO(72μL)中0.1-1mmol/升的原液，用DMSO连续1∶3(24+48μL)地加以稀释，获得十个不同浓度，在此试验中对其样品加以分析。用124μL测定缓冲液稀释2μL的试样，在测定缓冲液中加入12μL显色底物溶液(S-2366，ChromogenixMolndal，Sweden)和最后在测定缓冲液中加入12μL的α-凝血酶溶液(人的α-凝血酶，Sigma Chemical Co.Or HematologicTechnologies)，并混合样品。最后测定浓度是测试物质0.00068-13.3μmol/L，S-2366 0.30μmol/L，α-凝血酶0.020NIHU/ml。用在37℃下培育40分钟期间的线性吸光率增量，计算试样的抑制百分率，与无抑制剂的空白试验比较。由log浓度对％抑制曲线计算IC50-机械手值，相当于引起抑制50％的凝血酶活性的抑制剂浓度。
试验C前凝血酶时间(PT)测定制备以下试剂取等分量的冷冻人血浆郁血，其内含柠檬酸盐抗凝血剂，将其在37℃下迅速解冻。用含0.1％BSA的生理盐水，稀释在DMSO中10mM抑制剂原液至最后DMSO为1％。按1∶3分级制备一系列稀释液，用于剂量反应滴定。按照厂家说明书，用25mM CaCl2按1∶10重组来自DadeBehring GmbH(Marburg，Germany)有限公司的ThromborelS。混合2.5μL抑制剂与22.5μL人血浆，在37℃下在Amelung KC10微血凝度计杯中(来自HeinrichAmelungGmbH(Lemgo，Germany))培育1分钟。添加在37℃下预加热的50μL Thromborel S，促使凝固。确定在duplo中各抑制剂浓度([I])的凝结时间(CTI)。按逆凝固时间对抑制剂浓度作图，构成滴定曲线。采用非线性回归方法，确定IC50值，即凝固时间的加倍时间，其公式CT0/CTI＝1/(1+([I]/IC50)s)此处“CT0”＝没添加抑制剂的凝固时间，“s“″是斜率。
对于实施例1的标题化合物结果是试验A-IC50(凝血因子VIIa)＝64nM试验B-IC50(凝血酶)＝6.2μM试验C-IC50(PT)＝3.8μM表明所述的化合物是一种凝血因子VIIa的选择性抑制剂。
实施例2melagatran和凝血因子VIIa抑制剂的协同效应把来自健康志愿者，包括男人和妇女的人血，收集在50ml锥形塑料管中，塑料管内装有5ml的0.13mol/L的柠檬酸三钠缓冲液。迅即在冰上冷却此血液，并以200xg离心20分钟。然后将贫血小板的血浆分为各10ml的馏分，并用melagatran(化合物A)或用以上实施例1的标题化合物(化合物B)将其“固定(spiked)”，达至延长APTT的最后浓度，分别约20％、40％、60％和100％。
按如下测定APTT将100μL的预加热APTT试剂(StagoDiagnostica)加至100μL的预加热血浆中，并在37℃下培育180秒。添加100μL CaCl2(0.025mol/L)，促使其凝固。用一台KC10血凝度计与CR-A计算器、CR10打印机和PR60热块(Amelung GmbH，Lemago Germany)连接一起，测定凝固时间。每次凝结测试各重复完成一次，用其平均凝固时间。
对于化合物A和化合物B的APTT，按4种不同的浓度测试，其结果示于表1，其中CpA和CpB分别是化合物A和B的血浆浓度。APTT值以秒表示，在方括号内的是超过基准值的延长百分率。
表1
对于两种化合物在其测试浓度间隔内APTT较好地被关联为线性函数，并可以描述为以下公式化合物Ay＝52.9x+43.3R2＝0.98.......(式1)化合物By＝4.2x+38.2R2＝1.00.......(式2)为了测试化合物A和B间可能的协同效应，采用了以下模型。首先确定促使APTT延长20％、40％和60％的化合物A和B的浓度(表1)。然后混合均等浓度的化合物A和B，如0.08μmol/L的A和1.5mol/L的B，同上确定混合物的APTT。获得一种协同作用的指示，指示是否这种混合物的APTT比等浓度化合物A本身的“混合物”(即化合物A+APTT延长20％(0.08μmol/L+0.08μmol/L＝0.16μmol/L)浓度下的化合物A)的APTT更长。但是，两种化合物之间的真实协同效应将永不会被确定，除非两种单独化合物的剂量反应曲线已知，而且用于Berenbaum公式的代数模型所有数据已知(参见Clin.Exp.Immlmol.(1977)28，18)(混合物中CpA/Ae)+(混合物中CpB/Be)＜1在该公式中CpA和CpB分别是在混合物中的化合物A和B的血浆浓度，Ae和Be是化合物A和B的各自单一浓度，是获得与该混合物相同的APTT结果所需要的。根据化合物A和B的线性剂量反应分别计算这些浓度(公式1和2)。化合物A单独的或其与化合物B结合的试验所有APTT结果概括于表2中。
表2
表2表明化合物A单独的或其与化合物B不同混合物的APTT。最后两栏表明为了达到与其混合物相同APTT延长所需要的A和B的浓度。
在将这些表2结果用于Berenbaum公式时，获得以下馏分A(μmol/L) B(μmol/)混合物1(0.08/0.21)+(1.5/3.87)＝0.38+0.38＝0.76混合物2(0.18/0.53)+(3.2/7.98)＝0.34+0.40＝0.74混合物3(0.27/0.83)+(4.9/11.8)＝0.33+0.41＝0.74因此，按照Berenbaum，满足该协同作用判据。呈现真实的协同效应。
权利要求
1.一种复合产物，包括(A)melagatran或其药用衍生物；及(B)凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，其中各组分(A)及(B)是按照与药用辅剂、稀释剂或载体的混合物而配制的。
2.按照权利要求1的复合产物，其包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的一种药物制剂，所述制剂包括melagatran或其药用衍生物，和凝血因子VIIa抑制剂或其药用的衍生物。
3.按照权利要求1的复合产物，它包括含有下列组分的试剂盒(a)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的melagatran或其药用的衍生物的一种药物制剂；和(b)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物的一种药物制剂；这些组分(a)和(b)是各自以适宜于与另一组分结合用药的形式提供的。
4.按照权利要求3的试剂盒，其中组分(a)和(b)适合于在指示抗凝血疗法条件的治疗中顺序、单独及/或同时使用。
5.按照权利要求1-4任一项的复合产物，其中melagatran的衍生物是一种melagatran的前体药物。
6.按照权利要求5的复合产物，其中该前体药物化学式是R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH，其中R1代表直链或分支链C1-6烷基，而OH基团替代Pab中的一个脒基氢。
7.按照权利要求6的复合产物，其中R1代表甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基。
8.按照权利要求1-7任一项的复合产物，其中凝血因子VIIa抑制剂的衍生物是该抑制剂的一种前体药物。
9.一种制备按照权利要求3-8任一项定义的试剂盒的方法，该方法包括使按照权利要求3-8任一项所定义的组分(a)与按照权利要求3-8任一项所定义的组分(b)相组合，从而提供适合于彼此结合用药的两个组分。
10.一试剂盒包括(I)按照权利要求3-8任一项所定义的组分(a)和(b)中的一个；和(II)与二组分中另一组分相结合的那个组分的使用说明书。
11.一种指明抗凝血疗法条件的治疗方法，它包括给用按照权利要求1-8任一项所定义的复合产物药，或给用患者对这种条件忍受的，或敏感的按照权利要求10所定义的试剂盒。
12.对于按照权利要求1-8任一项所定义的复合产物，或按照权利要求10中所定义的试剂盒，用于配制针对指示抗凝血疗法条件的治疗或预防药物方面的应用。
13.melagatran或其药用衍生物和凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，用于配制针对指示抗凝血疗法条件的治疗或预防药物方面的应用。
全文摘要
提供了一种复合产物，包括(A)melagatran或其药用衍生物；及(B)凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，其中各组分(A)及(B)是按与药用的辅剂、稀释剂或载体的混合物而配制的，以及这种复合产物在指示抗凝血疗法条件的治疗中的应用。
文档编号A61P31/04GK1446101SQ0181395
公开日2003年10月1日 申请日期2001年6月6日 优先权日2000年6月10日
发明者R·拜伦, C·马特松 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司
技术领域：
本发明涉及一种新复合药用活性化合物。
背景和已有技术血液凝固是涉及止血(即防止血管损伤失血)和血栓形成(即血管中血块形成，有时导致血管阻塞)二者中的关键过程。
凝固是复杂系列酶促反应的结果。
在此系列反应中最终的一个步骤是前酶凝血酶原(proenzymeprothrombin)转化为活性酶凝血酶(active enzyme thrombin)。
已知凝血酶在凝固中起重要作用。它活化血小板，导致血小板凝集，转化纤维蛋白原为纤维蛋白单体，它自发聚合为纤维蛋白多聚体，接着又交联该多聚体，形成不溶性血纤维蛋白。此外，凝血酶活化凝血因子V及凝血因子VIII，导致由凝血酶原产生凝血酶的一种“正反馈”。
WO94/29336披露了一族凝血酶抑制化合物，其包括HOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-H(其中Cgl代表环己基甘氨酸，Aze代表S-三甲叉亚胺-2-羧酸及Pab-H代表4-氨甲基脒基苯(aminomethylamidinobenzene))，它亦被称为melagatran(参见实施例1的WO94/29336)。WO97/23499披露了尤其是melagatran的前体药物。
凝血因子VII是与经体外途径触发连串凝血相关的两种蛋白质的一种(与组织因子一起)。普遍认为，血液凝固实际上是在形成组织因子/凝血因子VIIa复合物后开始的。一旦这种复合物形成了，它就通过激活凝血因子IX及X引起凝固。
某些化合物已知是具有凝血因子VIIa的抑制特性。参见，例如，WO96/25427，WO92/15686，WO92/06711，WO96/12021，WO98/50420，WO96/12800、WO97/47651、WO99/03498、WO94/07528、WO96/20689、WO95/23860、WO97/49684、WO99/41276、WO99/41231、WO99/48878、WO99/50254、WO99/50257、WO99/50263、WO99/12936、WO99/13063、WO99/67215、WO00/15658、WO00/30646、WO00/35858、WO00/35886、WO00/40601、WO00/41531、WO00/51989、WO00/58346、WO00/66545、WO00/69826、WO00/69832、WO00/69834、WO01/10892、WO94/27631、WO95/12674、WO97/20939、WO97/48687、WO97/48706、WO98/09987、WO98/22619及WO99/00371；US5,437,864、5,833,982、5,834,244、5,863,893、5,023,236、6,020,331及5,639,739；EP921116、EP931793、EP669317及EP987274；及德国专利申请DE19829964、DE19834751、DE19835950、DE19839499、DE19845153、DE19900355及DE19900471。
上述文件均没公开或提出给用与凝血因子VIIa抑制剂的melagatran或其药用衍生物相结合的药。我们现在发现，令人惊奇地是，刚好这种结合的用药产生了一种显著的协同抗凝剂效应。
发明内容
按照本发明的第一个方面，提供了一种复合产物，包括(A)melagatran或其一种药用的衍生物；及(B)凝血因子VIIa抑制剂或其药用的衍生物，其中各组分(A)及(B)是按与药用的辅剂、稀释剂或载体成混合物的形式而制剂的。
按照本发明的复合产物提供了给用melagatran(或其衍生物)与凝血因子VIIa抑制剂相结合的药物，并由此可提供或作为单独制剂，其中至少一种制剂包括melagatran，至少一种包括凝血因子VIIa抑制剂，或可提供(配制)它作为一种复合制剂(即提供为包括melagatran及凝血因子VIIa抑制剂的单一制剂)。
因此，这里还提供了(1)、一种与药用的辅剂、稀释剂或载体成混合物的药物制剂，其包括melagatran或其药用衍生物，和凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，(此制剂以下简称“复合制剂”)；和(2)一种含有下列组分的试剂盒(a)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的melagatran或其药用衍生物的一种药物制剂，；和(b)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的凝血因子VII抑制剂或其药用衍生物的一种药物制剂，
其组分(a)和(b)是各以适合于与另一组分结合用药的形式提供的。
按照本发明的另一方面，这里提供了一种制备上述定义的试剂盒的方法，该方法包括使定义同上的组分(a)与定义同上的组分(b)相组合，从而提供适合于彼此结合用药的两个组分。
通过使该二组分彼此“相组合”，包括试剂盒的组分(a)和(b)可以是(i)提供单独制剂(即彼此无关)，随后将它们组合一起，彼此结合用于联合治疗中；或(ii)作为“复合包装”的单独组分被包装，并被同时提供，彼此结合用于联合治疗中。
因此，这里进一步提供一种试剂盒，包括(I)按这里所定义的组分(a)和(b)中的一种；与(II)与二组分中另一组分相结合的那个组分的使用说明书。
这里所述试剂盒可包括一种以上的包括适宜量/剂量的melagatran或其衍生物的制剂，及/或一种以上的包括适宜量/剂量的凝血因子VIIa抑制剂或其衍生物的制剂，以提供重复剂量。如果存在有一种以上的制剂(包括二活性化合物之一)，这种制剂在melagatran(或衍生物)或凝血因子VIIa抑制剂(或衍生物)的剂量、化学组成及/或外观方面，可以是相同的，或是不同的。
本发明还有一方面，提供了一种指示抗凝血疗法条件治疗方法，它包括给用一种与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的药物制剂，包含melagatran(或其药用衍生物)和凝血因子VIIa抑制剂(或其药用的衍生物)。
本发明的另一方面，提供一种指示抗凝血疗法条件的治疗方法(通过它指示需要抗凝血的场合)，它包括病人对这种条件容忍或敏感的用药(a)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的melagatran或其药用衍生物的一种药物制剂；结合(b)包括与药用的辅剂、稀释剂或载体成混合物的凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物的一种药物制剂。
为避免疑问，这里所用术语“治疗”包括治疗及/或预防性治疗。
对于此处所述试剂盒，所谓“与...结合用药”，包括在可能急性或慢性的相关条件下治疗过程中，顺序、单独及/或同时地给用各自包括melagatran(或其衍生物)和凝血因子VIIa抑制剂(或其衍生物)的制剂药物。
因此，关于按照本发明的复合产物，术语“与...结合用药”包括(任选反复)给用两组分复合产物(melagatran/衍生物和凝血因子VIIa抑制剂/衍生物)的药物，或在相关条件治疗过程中，(在复合制剂情况下)同时地，或(在试剂盒的情况下)及时充分密切地，(任选反复)单独地用药，以求达到有利病人的效果，即高于在同一疗程中或制剂包含melagatran/衍生物，或制剂包含凝血因子VIIa抑制剂/衍生物，而没有其它组分时的效果。关于具体条件和在治疗过程中，确定一种结合是否产生较大有利的效果，将取决于接受治疗或预防治疗的条件，但是对于技术熟练人员通常都可以实现的。
此外，在按照本发明试剂盒的上下文中，术语“结合”包括在给用另一组分药之前，之后及/或同时，可(任选反复)给用两种制剂中一种或另一种药物。凡本文中在使用时，术语“同时用药”和“与...同时用药”包括在彼此48小时(如24小时)内给用单独剂量的melagatran(或其衍生物)和凝血因子VIIa抑制剂(或其衍生物)的药物。
melagatran和凝血因子VIIa抑制剂的“药用衍生物”包括盐类(如药用的无毒有机酸的或无机酸的加成盐类)和溶剂化物。应当知道，该术语视情况而定还包括具有与melagatran或凝血因子VIIa抑制剂同样生物学功能及/或活性衍生物。此外，对于本发明目的，该术语也包括melagatran或凝血因子VIIa抑制剂的前体药物。melagatran或凝血因子VIIa抑制剂的“前体药物”，视情况而定，包括在口服或肠胃外用药后，其剂量可实验检测，并在预定时间内(如在6-24小时之间的间隔内(即每日一次到四次”))可在体内代谢形成melagatran或各自凝血因子VIIa抑制剂二物质的任一组合物。为避免疑问，该术语“肠胃外”用药包括所有非口服用药的形式。
可提及的melagatran的前体药物包括在WO97/23499中公开的那些。优选前体药物为化学式R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH(参见以上或WO97/23499中的略语表)的那些，其中R1代表C1-10烷基或苄基烷基，诸如直链或分支链的C1-6烷基(如C1-4烷基，尤其甲基、正丙基、异丙基、叔丁基及，特别，乙基)和OH基团替代Pab中的脒基氢。
可以应用于按照本发明的复合产物中的凝血因子VII抑制剂包括国际专利申请中所述的那些WO96/25427、WO92/15686、WO92/06711、WO96/12021、WO98/50420、WO96/12800、WO97/47651、WO99/03498、WO94/07528、WO96/20689、WO95/23860、WO97/49684、WO99/41276、WO99/41231、WO99/48878、WO99/50254、WO99/50257、WO99/50263、WO99/12936、WO99/13063、WO99/67215、WO00/15658、WO00/30646、WO00/35886、WO00/35886、WO00/40601、WO00/41531、WO00/51989、WO00/58346、WO00/66545、WO00/69826、WO00/69832、WO00/69834、WO01/10892、WO94/27631、WO95/12674、WO97/20939、WO97/48687、WO97/48706、WO98/09987、WO98/22619和WO99/00371；US5,437,864、5,833,982、5,834,244、5,863,893、5,023,236、6,020,331和5,639,739；欧洲专利申请EP921116、EP931793、EP669317和EP987274；德国专利申请DE19829964、DE19834751、DE19835950、DE19839499、DE19845153、DEl9900355及DE19900471。在所有文件中具体和一般披露均在此引以参考。
优选的凝血因子VIIa抑制剂包括在国际专利申请所述的那些WO98/50420、WO97/47651、WO99/03498、WO96/20689、WO00/15658、WO00/35858、WO00/35886、WO00/41531、WO00/58346、WO00/66545、WO00/69826、WO00/69832、WO00/69834、WO98/22619、和US5,639,739，和尤其在国际专利申请所述的那些WO92/15686、WO96/12021和WO99/41231和欧洲专利申请中所述的那些EP987274和EP921116，其中所有文件具体和一般披露在此引以参考，以及N[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[氨基(亚氨基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺(leucinamide)和其药用衍生物，对它们均可按如下所述方法制备。
对于术语“指示抗凝血疗法条件”，本领域技术人员应当明白包括以下治疗及/或预防包括人类的动物血液及/或组织中的血栓形成和过高血液凝固性。众所周知，过高血液凝固性可导致血栓栓塞的疾病。可以提及的有关过高血液凝固性和血栓栓塞的疾病条件包括遗传的或后天的激活蛋白质C阻力，诸如凝血因子V-突变(凝血因子V Leiden)，和在抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、肝素辅因子II方面的遗传或后天缺陷。已知与过高血液凝固性和血栓栓塞疾病相关的另一些条件，除凝固综合症(如弥漫性血管内凝血(DIC))和一般血管损伤(如由于手术)之外，还包括循环抗磷脂抗体(狼疮抗凝物)、高胱氨酸血、诱导血小板减少的肝素和纤维蛋白溶解中的缺陷。
在神经变性疾病诸如阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)治疗条件中遇到一种不理想的过量凝血酶而无过高血液凝固性病征的情况。
可以提及的具体疾病状态包括，治疗及/或预防性治疗各种静脉血栓形成(如DVT)及肺栓塞、动脉血栓形成(如在心肌梗死，不稳定绞痛，血栓形成基脉搏和外动脉血栓形成中)，和系统栓塞，通常在心房纤维性颤动过程中来自心房或在透壁性心肌梗塞后来自左侧心室，或由充血性心力衰竭所引起的；预防血栓溶解之后再闭塞(即血栓形成)，经皮肤的反鲁米那血管成形术(PTA)和冠状动脉架搭桥术操作；一般在显微手术及血管手术后防止血栓再形成。
更进一步指示包括由细菌、多处外伤、中毒或任何其它机制所引起的弥漫性血管内凝血的治疗及/或预防性治疗；当血液与体内的外来表面诸如血管接枝、血管斯坦特印模(vascular stents)、血管导管、机械及生物人工瓣膜或任何其它医用器材接触时的抗凝血治疗；及当血液与人体外部医用器械接触时，诸如在利用心肺机或在血液透析进行心血管的手术过程中抗凝血的治疗；自发及成人呼吸窘迫综合症、随后用辐射或化疗法治疗的肺纤维化、脓毒性休g、败血病、炎症反应的治疗及/或预防性治疗，包括，但不局限于，浮肿、急性或慢性的动脉粥样硬化诸如冠状动脉疾病及动脉粥样硬化的噬菌斑的形成、大脑动脉疾病、脑梗死、脑血栓形成、脑栓塞、外部动脉疾病、局部缺血、绞痛(包括不稳定绞痛)、再灌注损害、经皮肤反鲁米那血管成形术(PTA)及冠状动脉旁路手术之后再狭窄。
优选条件包括血栓形成。
按照本发明，给用melagatran、凝血因子VIIa抑制剂及二者之一的衍生物药物，均可通过口、静脉内、皮下、向颊、直肠、皮肤、鼻、气管、支气管、局部地用药，通过任何其它肠胃外路径、或经由吸入，以包括药用剂型的melagatran及/或凝血因子VII抑制剂的药物制剂形式用药。除用药途径以外，还可根据所治疗的病症及病人，以不同剂量给用这些组合物药。
释放优选方式是内吸收的。对于melagatran及其衍生物，优选用药方式是肠胃外的，更优选静脉内的，尤其是皮下的。对于melagatran的前体药物，优选用药方式是口服。
对于哺乳动物的治疗法，尤其对人类，一般按与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的药物制剂，按所设想的用药途径和标准药用惯例加以选择，给用melagatran，凝血因子VII抑制剂及二者之一的衍生物药物。
文献中对给用melagatran及其衍生物(包括前体药物)的适宜制剂有所描述，例如尤其WO94/29336、WO96/14084、WO96/16671、WO97/23499、WO97/39770、WO97/45138、WO98/16252，WO99/27912，WO99/27913,WO00/12043及WO00/13671，其中文件披露在此引以参考。
同样，文献中对给用凝血因子VIIa抑制剂及其衍生物(包括前体药物)的适宜制剂也有描述，例如已有技术文件中对以上提及的凝血因子VIIa抑制剂所描述的那些，其文件披露在此引以参考。另外，对于技术熟练的人员利用常规技术，易于实现适宜制剂的制备，和在包括melagatran/衍生物及凝血因子VII抑制剂/衍生物二者的具体结合的制备。
在各自制剂中melagatran、凝血因子VII抑制剂或二者的衍生物的用量，取决于治疗条件严重程度及病人，以及所用化合物，但对于技术熟练的人员这些都是易于确定的。
对哺乳动物患者，尤其对人的治疗及/或预防性治疗，通常可由开业医生或技术熟练人员确定，而且包括已有技术文件关于melagatran(或其衍生物(包括前体药物)及凝血因子VII抑制剂中所论述的各自剂量，即以上提及的，其中文件披露在此引以参考。
对于melagatran，在对哺乳动物患者，尤其对病人的治疗及/或预防性治疗中，活性化合物、前体药物及其衍生物的适宜剂量包括在有关治疗条件的过程中，使平均血浆浓度最多5μmol/L，例如在0.001到5μmol/L范围。因此，适宜剂量对melagatran，可以在每日一次0.1毫克到每日三次25毫克的范围，及/或最多24小时内肠胃外注入100毫克，而对melagatran前体药物，包括以上具体提及的，其范围在每日一次0.1毫克到每日的三次100毫克的范围。
至于凝血因子VIIa抑制剂，治疗或预防目的的适宜剂量是在例如接受10-500毫克的范围，在如需要时，分为数剂。当采用肠胃外的路径时，一般应给药剂量较低，例如对于静脉注射，一般应采用给药剂量在例如1-50mg范围。在连续输注时，一般采用0.1-5毫克/公斤/小时的剂量。
在任何情况下，医师，或技术熟练的人员，应当能确定最适合于各个患者的实际剂量，其实际剂量，除随年龄、体重、性别和具体患者对治疗的反应而变外，很可能会随治疗条件而变化。上述剂量是普通案例的范例；当然会有各种较高或较低剂量范围适宜的个别情况，而且这些都在本发明范畴内。
当用药为分离的制剂时，其中包括melagatran(或其衍生物)和凝血因子VII抑制剂(或其衍生物)制剂的用药顺序(即是否，什么位置、顺序、分离及/或同时用药)，可以由医师或技术熟练的人员确定。例如，用药顺序可能取决于对技术熟练人员很明显的许多因素，诸如在治疗过程或治疗期间任何时候，因为实际原因不能对患者给一种或另一种药制剂(如患者不省人事，而因此不能采取口服包括melagatran或凝血因子VII抑制剂二者的制剂)。
与已有技术已知相同方法的这种治疗条件相比，这里所述的方法可能优点在于，它们在指示抗凝血疗法条件治疗中，对于医师及/或患者都会更方便，更有效，毒性更小，活性范围更宽，更有效力，产生的副作用更少，或者可能会有其它适用药理学特性。
通过以下实施例说明本发明，但非对其限制。
实施例1N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[氨基(亚氨基)甲基]-苄基}-L-亮氨酸酰胺(a)N2-(叔-丁氧羰基)-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺对在冰浴上的4-氨甲基苄腈(15.0g，41.0mmol)、DMAP(37.0g，303mmol)和在DMF(200ml)中的EDC(13.8g，72mmol)的搅拌溶液加入2-叔(L)-丁氧羰基氨基-4-甲基-戊酸(5.4g)。移开冰浴。24小时之后加水(500ml)。用DCM(500ml)萃取该产物。用1MHCl(2×250ml)、H2O(250ml)、1M NaHCO3(2×250ml)、H2O(250ml)和盐水(250ml)洗涤该有机相。用MgSO4干燥有机层，并对其过滤及提浓，得到16.92g的干固体。收率75％。1H-NMR(400MHz，DMF-d7)δ0.71(d，3H)，0.74(d，3H)，1.22(s，9H)，1.41(m，2H)，1.69(m，1H)，3.98(m，1H)，4.31(d，2H)，6.73(d，1H)，7.36(d，2H)，7.61(d，2H)，8.35(t，1H)。MS m/e346(M+H)+。
(b)N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺将盐酸饱和EtOAc(250ml)滴加到在冰浴上的反应烧瓶中，反应烧瓶内有N2-(叔丁氧羰基)-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(16.9g，48.9mmol，参见以上步骤(a))。移开冰浴。30分钟之后，蒸发该反应，得到副标题产物的HCl盐类(13.0g，46.1mmol)。收率94％。1H-NMR(400MHz，DMF-d7)δ0.77(d，3H)，0.79(d，3H)，1.66(m，3H)，3.99(m，1H)，4.35(ddd，2H)，7.45(d，2H)，7.63(d，2H)，8.77(broad，s，3H)。
MS m/e246(M+H)+。
(c)N-{[3-(甲氧基羰基)苄基]磺酰基}-D-缬氨酰-N1-(4-氰基苄基)-L-亮氨酸酰胺将N-{[3-(甲氧基羰基)苄基]磺酰基}-D-缬氨酸(0.60g，1.8mmol)加至在冰浴中冷却的搅拌溶液中，该搅拌溶液内有N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(0.56g，2.0mmol，参见步骤以上(b))、DMAP(1.1g，9mmol)及在DMF(10ml)中的EDC(0.42g，2.2mmol)。移开冰浴，24小时之后加入H2O(80mL)。用EtOAc(3×30ml)萃取该混合物。用1M HCl(2×100ml)、H2O(100ml)、1M NaHCO3(2×100ml)、H2O(100ml)及盐水(100ml)洗涤该合并有机相。分离有机相，并用MgSO4对其加以干燥、过滤及在真空中提浓，得到0.79g的副标题化合物千固体。收率71％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.92(d，3H)，0.94(d，3H)，0.95(d，3H)，0.98(d，3H)，1.60(m，2H)，1.80(m，1H)，1.95(m，1H)，3.44(m，1H)，3.93(s，3H)，4.23(dd，2H)，4.44(ddd，2H)，4.60(m，1H)，6.29(d，1H)，7.33(d，2H)，7.50(m，3H)，8.04(d，2H)。MS m/e557(M+H)+。
(d)N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺将在H2O(20ml)中0.4M氢氧化锂溶液滴加至一种搅拌溶液中，该溶液内有在THF中的N-{[3-(甲氧基羰基)苄基]磺酰基)-D-缬氨酰-N1-(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(0.76g，1.37mmol，参见以上步骤(c))。2小时之后用1M盐酸调节反应pH至7。在真空中蒸干该反应混合物(1.06g)。该粗品，被LiCl污染，直接用于下一步，而不用进一步提纯。1H-NMR(400MHz，MeOD)δ0.90(d，3H)，0.91(d，3H)，0.95(d，3H)，0.96(d，3H)，1.65(m，3H)，1.91(m，1H)，3.52(d，1H)，3.72(m，1H)，4.35(m，4H)，7.39(m，4H)，7.58(d，2H)，7.92(d，1H)，7.97(s，1H)。MS m/e543(M+H)+。
(e)N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1{4-[(Z)-氨基(肟基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺将三乙胺(0.74ml)和盐酸羟胺(0.22g)在氮保护气氛下加至N[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1(4-氰苄基)-L-亮氨酸酰胺(0.89g，粗品，参见以上步骤(d))的乙醇搅拌溶液中。加热回流该反应混合物。18小时之后，在真空下提浓该反应混合物至干燥(0.74g)。粗品直接用于下一步而不必进一步提纯。
MS m/e576(M+H)+。
(f)N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[氨基(亚氨基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺将10％Pd/C(0.13g)和乙酸酐(0.13ml)加至N-[(3-羧苄基)磺酰基]-D-缬氨酰-N1-(4-[(Z)-氨基(肟基)甲基]苄基}-L-亮氨酸酰胺(0.74g，粗品，参见以上步骤(e))的乙酸(40ml)搅拌溶液中。在氢气氛(5巴)下完成该反应。3.5小时之后，通过硅藻土过滤该反应混合物。用乙酸洗涤硅藻土，将合并后的滤液在真空中浓缩，并在乙腈/1M NH40Ac中使残余物沉淀出，对其过滤和干燥，得到0.34g的标题产物。1H-NMR(400MHz，CD3COOD)旋转异构体δ0.91(d，3H)，0.95(d，3H)，0.96(d，3H)，0.98(d，3H)，1.71(m，2H)，1.96(m，1H)，3.71(d，1H，主旋转异构体)，3.74(d，1H，次旋转异构体)，4.26(d，2H，次旋转异构体)，4.32(d，2H，主旋转异构体)，4.45(d，1H)，4.60(d，1H)，4.70(m，1H)，7.46(m，3H)，7.66(d，1H)，7.73(d，2H，主旋转异构体)，7.77(d，2H，次旋转异构体)，8.05(宽s，2H)。MS m/e560(M+H)+。
缩写词DCM＝二氯甲烷DMF＝二甲基甲酰胺DMAP＝4-二甲基氨基吡啶EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二酰亚胺盐酸盐MS＝质谱按下述检验法测试实施例1的化合物。
试验A用于凝血因子VIIa的显色机械手法显色底物Spectrozyme FVIIa，CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA(pefachrome 5979来自Pentapharm，Switzerland)是从AmericanDiagnostica Inc.(Greenwich，CT，USA)购买的。单独确定在测定条件下的KM。重组人体凝血因子VIIa(rFVIIa，产物号407)和非脂质化(non-lipidated)重组人体组织-凝血因子(rTF，产物号4500)是从American Diagnostica Inc购买的。将rFVIIa的原液(用1ml水溶解1.08毫克蛋白质至21.6μM，在20mM Tris-HCl，100mM NaCl中，pH7.4)和rTF(用1.5ml水溶解1mg蛋白质至19μM，在50mMTris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，CHAPS(3-((3-胆酰胺基丙基)二甲基氨醇)-1-磺酸丙烷；10mM中)和200mM甘露糖醇)存放在-80℃下的0.5ml试剂管中。通过添加8μL的21.6μM rFVIIa和22μL的19μM rTF至6ml有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的测定缓冲液中，制成一种29nM rFVIIa和68nM TF的混合物。在室温下培育该混合物30分钟。该测定缓冲液装有50mM Tris与100mM NaCl，0.1％BSA，5mM CaCl2调节pH7.4该测定缓冲液含50mM Tris和100mMNaCl、0.1％BSA、5mM CaCl2在37℃用HCl调节pH至7.4。将该化合物溶于100％DMSO中，使浓度在96孔微量滴定板中达到10mM。用DMSO(二甲亚砜)在2栏至11栏中按1∶3分级稀释为10个浓度，配制一个新平皿。在最后测定中，从该平皿的所有加样孔中转移4μL至量测平面皿，使150μL/孔中的最终测定浓度为2.7％DMSO。该凝血因子VIIa机械手测定是按150uL总测定体积在ROSYSPlato3000机械手微量滴定板处理机中完成的。在室温下对在2-11栏中的4μL抑制剂添加122μL的测定缓冲液，然后将12μL的FVIIa-rTF工作液多次分配至所有加样孔中，并最后在混合12μL的Spectrozyme FVIIa工作液之后，使之达至最后浓度0.2mM。在37℃下混合和培育40分钟后，读取405nm(纳米)光吸光率差异。用非线性回归方法计算各化合物IC50值，其公式AI/A0＝1/(1+([I]/IC50)s)此处AI＝在抑制剂存在下405nm处最后吸光率，A0＝没有抑制剂时的吸光率，和s为剂量滴定曲线斜率，对于纯竞争性抑制物其理论值为1。然后可根据以下关联式估算此Ki值Ki＝IC50/(1+S/Km)＝IC50/1.32试验B用显色机器手检验法确定凝血酶抑制作用利用96孔的半容积微滴定平皿(Costar，Cambrige，MA，USA；Cat No3690)，在Plato 3300机械手微平皿处理机(Rosys AG，CH-8634Hombrechtikon，Switzerland)中，以显色底物方法测定凝血抑制因子效力。测试物质在DMSO(72μL)中0.1-1mmol/升的原液，用DMSO连续1∶3(24+48μL)地加以稀释，获得十个不同浓度，在此试验中对其样品加以分析。用124μL测定缓冲液稀释2μL的试样，在测定缓冲液中加入12μL显色底物溶液(S-2366，ChromogenixMolndal，Sweden)和最后在测定缓冲液中加入12μL的α-凝血酶溶液(人的α-凝血酶，Sigma Chemical Co.Or HematologicTechnologies)，并混合样品。最后测定浓度是测试物质0.00068-13.3μmol/L，S-2366 0.30μmol/L，α-凝血酶0.020NIHU/ml。用在37℃下培育40分钟期间的线性吸光率增量，计算试样的抑制百分率，与无抑制剂的空白试验比较。由log浓度对％抑制曲线计算IC50-机械手值，相当于引起抑制50％的凝血酶活性的抑制剂浓度。
试验C前凝血酶时间(PT)测定制备以下试剂取等分量的冷冻人血浆郁血，其内含柠檬酸盐抗凝血剂，将其在37℃下迅速解冻。用含0.1％BSA的生理盐水，稀释在DMSO中10mM抑制剂原液至最后DMSO为1％。按1∶3分级制备一系列稀释液，用于剂量反应滴定。按照厂家说明书，用25mM CaCl2按1∶10重组来自DadeBehring GmbH(Marburg，Germany)有限公司的ThromborelS。混合2.5μL抑制剂与22.5μL人血浆，在37℃下在Amelung KC10微血凝度计杯中(来自HeinrichAmelungGmbH(Lemgo，Germany))培育1分钟。添加在37℃下预加热的50μL Thromborel S，促使凝固。确定在duplo中各抑制剂浓度([I])的凝结时间(CTI)。按逆凝固时间对抑制剂浓度作图，构成滴定曲线。采用非线性回归方法，确定IC50值，即凝固时间的加倍时间，其公式CT0/CTI＝1/(1+([I]/IC50)s)此处“CT0”＝没添加抑制剂的凝固时间，“s“″是斜率。
对于实施例1的标题化合物结果是试验A-IC50(凝血因子VIIa)＝64nM试验B-IC50(凝血酶)＝6.2μM试验C-IC50(PT)＝3.8μM表明所述的化合物是一种凝血因子VIIa的选择性抑制剂。
实施例2melagatran和凝血因子VIIa抑制剂的协同效应把来自健康志愿者，包括男人和妇女的人血，收集在50ml锥形塑料管中，塑料管内装有5ml的0.13mol/L的柠檬酸三钠缓冲液。迅即在冰上冷却此血液，并以200xg离心20分钟。然后将贫血小板的血浆分为各10ml的馏分，并用melagatran(化合物A)或用以上实施例1的标题化合物(化合物B)将其“固定(spiked)”，达至延长APTT的最后浓度，分别约20％、40％、60％和100％。
按如下测定APTT将100μL的预加热APTT试剂(StagoDiagnostica)加至100μL的预加热血浆中，并在37℃下培育180秒。添加100μL CaCl2(0.025mol/L)，促使其凝固。用一台KC10血凝度计与CR-A计算器、CR10打印机和PR60热块(Amelung GmbH，Lemago Germany)连接一起，测定凝固时间。每次凝结测试各重复完成一次，用其平均凝固时间。
对于化合物A和化合物B的APTT，按4种不同的浓度测试，其结果示于表1，其中CpA和CpB分别是化合物A和B的血浆浓度。APTT值以秒表示，在方括号内的是超过基准值的延长百分率。
表1
对于两种化合物在其测试浓度间隔内APTT较好地被关联为线性函数，并可以描述为以下公式化合物Ay＝52.9x+43.3R2＝0.98.......(式1)化合物By＝4.2x+38.2R2＝1.00.......(式2)为了测试化合物A和B间可能的协同效应，采用了以下模型。首先确定促使APTT延长20％、40％和60％的化合物A和B的浓度(表1)。然后混合均等浓度的化合物A和B，如0.08μmol/L的A和1.5mol/L的B，同上确定混合物的APTT。获得一种协同作用的指示，指示是否这种混合物的APTT比等浓度化合物A本身的“混合物”(即化合物A+APTT延长20％(0.08μmol/L+0.08μmol/L＝0.16μmol/L)浓度下的化合物A)的APTT更长。但是，两种化合物之间的真实协同效应将永不会被确定，除非两种单独化合物的剂量反应曲线已知，而且用于Berenbaum公式的代数模型所有数据已知(参见Clin.Exp.Immlmol.(1977)28，18)(混合物中CpA/Ae)+(混合物中CpB/Be)＜1在该公式中CpA和CpB分别是在混合物中的化合物A和B的血浆浓度，Ae和Be是化合物A和B的各自单一浓度，是获得与该混合物相同的APTT结果所需要的。根据化合物A和B的线性剂量反应分别计算这些浓度(公式1和2)。化合物A单独的或其与化合物B结合的试验所有APTT结果概括于表2中。
表2
表2表明化合物A单独的或其与化合物B不同混合物的APTT。最后两栏表明为了达到与其混合物相同APTT延长所需要的A和B的浓度。
在将这些表2结果用于Berenbaum公式时，获得以下馏分A(μmol/L) B(μmol/)混合物1(0.08/0.21)+(1.5/3.87)＝0.38+0.38＝0.76混合物2(0.18/0.53)+(3.2/7.98)＝0.34+0.40＝0.74混合物3(0.27/0.83)+(4.9/11.8)＝0.33+0.41＝0.74因此，按照Berenbaum，满足该协同作用判据。呈现真实的协同效应。
权利要求
1.一种复合产物，包括(A)melagatran或其药用衍生物；及(B)凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，其中各组分(A)及(B)是按照与药用辅剂、稀释剂或载体的混合物而配制的。
2.按照权利要求1的复合产物，其包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的一种药物制剂，所述制剂包括melagatran或其药用衍生物，和凝血因子VIIa抑制剂或其药用的衍生物。
3.按照权利要求1的复合产物，它包括含有下列组分的试剂盒(a)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的melagatran或其药用的衍生物的一种药物制剂；和(b)包括与药用辅剂、稀释剂或载体成混合物的凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物的一种药物制剂；这些组分(a)和(b)是各自以适宜于与另一组分结合用药的形式提供的。
4.按照权利要求3的试剂盒，其中组分(a)和(b)适合于在指示抗凝血疗法条件的治疗中顺序、单独及/或同时使用。
5.按照权利要求1-4任一项的复合产物，其中melagatran的衍生物是一种melagatran的前体药物。
6.按照权利要求5的复合产物，其中该前体药物化学式是R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH，其中R1代表直链或分支链C1-6烷基，而OH基团替代Pab中的一个脒基氢。
7.按照权利要求6的复合产物，其中R1代表甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基。
8.按照权利要求1-7任一项的复合产物，其中凝血因子VIIa抑制剂的衍生物是该抑制剂的一种前体药物。
9.一种制备按照权利要求3-8任一项定义的试剂盒的方法，该方法包括使按照权利要求3-8任一项所定义的组分(a)与按照权利要求3-8任一项所定义的组分(b)相组合，从而提供适合于彼此结合用药的两个组分。
10.一试剂盒包括(I)按照权利要求3-8任一项所定义的组分(a)和(b)中的一个；和(II)与二组分中另一组分相结合的那个组分的使用说明书。
11.一种指明抗凝血疗法条件的治疗方法，它包括给用按照权利要求1-8任一项所定义的复合产物药，或给用患者对这种条件忍受的，或敏感的按照权利要求10所定义的试剂盒。
12.对于按照权利要求1-8任一项所定义的复合产物，或按照权利要求10中所定义的试剂盒，用于配制针对指示抗凝血疗法条件的治疗或预防药物方面的应用。
13.melagatran或其药用衍生物和凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，用于配制针对指示抗凝血疗法条件的治疗或预防药物方面的应用。
全文摘要
提供了一种复合产物，包括(A)melagatran或其药用衍生物；及(B)凝血因子VIIa抑制剂或其药用衍生物，其中各组分(A)及(B)是按与药用的辅剂、稀释剂或载体的混合物而配制的，以及这种复合产物在指示抗凝血疗法条件的治疗中的应用。
文档编号A61P31/04GK1446101SQ0181395
公开日2003年10月1日 申请日期2001年6月6日 优先权日2000年6月10日
发明者R·拜伦, C·马特松 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司
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