一种鮸鱼α类趋化因子基因CXCL10、检测方法和应用的制作方法
专利名称：一种鮸鱼α类趋化因子基因CXCL10、检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鱼类免疫器官中表达的基因序列，更具体涉及一种从鯢鱼脾脏和肾脏 SMART cDNA文库中筛选出的一个新α类趋化因子基因CXCLlO的核苷酸序列、氨基酸序列及其时空表达图谱。
背景技术：
动物免疫包括先天性免疫和获得性免疫两种。先天性免疫是指生物体所具有的对病原体和有害异物的基本天生抵抗性和防御性。先天免疫对绝大多数的病原体和有害异物具有快速、有力和非特异性作用的特点，尤其是在应对一些毒力发挥快，极易造成疫病暴发的病原体入侵中，能否对入侵病原体进行有效的先天免疫往往是宿主动物存活与否的关键。先天免疫包括从体表到体内细胞及分子等不同层次的防御体系。体表屏障较易被病原体突破，且一旦突破后则经常引起组织损伤，为其他潜在的病原体入侵提供有利途径，此时在细胞及分子层次上以炎症反应为主的一系列复杂免疫反应对杀灭入侵病原体具至关重要的作用。趋化因子大多是能结合肝素的多肽，主要由白细胞分泌，通过受体介导引起粒细胞、单核细胞及淋巴细胞的定向迁移和活化，对淋巴细胞再循环，炎症反应以及抗肿瘤等方面具有重要作用。依照保守的半胱氨酸残基，可分为CXC ( α )，CC ( β )，C ( γ )和CX3C (S)四类。α类趋化因子是最早鉴定的具有趋化嗜中性粒细胞的趋化因子，同时其也具有趋化单核细胞和淋巴细胞的功能。α类趋化因子专门吸引能表达CXCRl和CXCR2的嗜中性粒细胞。它们能在很广泛的细胞中对许多刺激物作出反应，特别是对像白细胞介素I和肿瘤坏死因子这样的前炎症细胞因子。主要的作用是促进嗜中性粒细胞与内皮细胞的黏附以及随后的相关基质蛋白和细胞表面物质沿着趋化因子的浓度梯度向炎症灶的定向移动并清除入侵病原体和有害异物。因此，对趋化因子基因超家族成员的克隆鉴定及其蛋白产物的结构和功能研究无疑能为鱼类先天免疫分子机制解析及提高鱼体抗病力提供坚实的技术支撑。
发明内容
本发明旨在提供一种新的鯢鱼α类趋化因子基因序列及对应氨基酸序列、检测方法和在制备鯢鱼抵抗病原微生物入侵产品中的应用。为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案
一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，它编码的蛋白质具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本发明所述的基因CXCLlO是从鯢鱼脾脏、肾脏的SMART cDNA质粒文库中筛选到的一个基因，其cDNA序列和编码的蛋白质序列如下。该基因cDNA全长1157bp，自74bp 到442bp区段为其开放阅读框，编码122个氨基酸，5’端非翻译区长73bp，3’端非翻译区长7Mbp，有1个mRNA半衰期信号，多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)及多聚腺苷酸尾巴。在 Genbmk中进行同源性分析确定其为趋化因子基因超家族成员。CXCLlO基因的cDNA序列如下 ggggactacagatagtccagactgaagaaagactgagtgcactgtgatccagaacccgtctacagcaacaac
tATGAATTCAGCTGCTGTTGCCTTTCTCGTCTGCCTGCTTGTCTTCTATACACAAGGGCAACCAACCAACAGATCTA TTAAGTGTAAGTGTTTAAACGGTTATGTGGGCAAAATCAAACCACAAGACATCAAGGCAGGGCCTGTCACACATGAG CCAAGTATCTTCTGTCCACGTACAGAGATTATTATTACAACAACAGAAAATAGGGAGAAATGTGTGAATCCACGCTC ACCACTCGGAAAACTCATCCTGAAAAACAAAAACAAGTACCAGAAAAATGCAACTGTGAATACGACAGCAGCTTCAA GCTCAACGGACACGACAGCAGCTTCAAGCTCAACAAGACACCACACAACATCCAGGCTGTAGgactctgccactgca ctgaagaggatggagctgaaacactttttattgttgttgttcaccatcactgccttttatcaagtaaatacaataag tgggtagaagtgatcaaagtgtctgtttgtcctcttatatttgttgtggagaaattgctgaagtcagtggtcaatgg tgaggtcaggaaggaagaaagtgttcaggagcctctgatgtcttatgctgtatta^tttattgacgcttggccaagaa gaattagagacactctcaaagtacatcagaagtgcctgagtcggtctcacattctgccaaactcatcctggtggata gactttaaacccctacagataacaccacaaatactatacgcccagaattagccaaagagaatgtttttacccatgca ggtgttattctcagcatattctagtctggagacacagatgtctgtttacacagattggaacgtcaacggccagctat ctattatgtctatgaaggcagcaatagtctcttcgaccctggccaccacactgttgagatagactggcacctactgt tcccaatcaaagccaaacaattaatactgccgaggaccttaaggcccacacgtgaccttgtgtaagctaaggataaa aaattccataacaacattgtcttcatgtgtacataccaaataaatcatctgtatatactttttaagcaaaaaaaaaaCXCLlO基因编码的蛋白质序列如下 MNSAAVAFLVCLLVFYTQGQPTNRSIKCKCLNGYVGKIKPQDIKAGPVTHEPSIFCPRTEIIITTTENREKCV
NPRSPLGKLILKNKNKYQKNATVNTTAASSSTDTTAASSSTRHHTTSRL。本发明还提供了一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCLlO的检测方法，其中，所述的检测方法至少包括使用一对荧光定量PCR引物，所述的一对荧光定量PCR引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物(CXCL10-RT-F)具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物(CXCL10-RT-R)具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。本发明还提供了上述的一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCLlO在制备鯢鱼抵抗病原微生物入侵产品中的应用。作为优选，根据本发明所述的一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCLlO在制备鯢鱼抵抗病原微生物入侵产品中的应用，其中，所述的病原微生物包括鳗弧菌。发明人运用实时荧光定量PCR技术检测了 CXCLlO在鯢鱼的鳔、眼球、鳍条、鳃、心脏、小肠、肾脏、肝脏、肌肉、脾脏中的转录本水平，结果表明该基因在所检测的十个组织中均有mRNA转录本存在，其中在小肠中的丰度最高，其次在眼球中，而在其他组织中则只检测到较少量的mRNA转录本存在。另外还检测到经鳗弧菌刺激后的脾脏和肾脏中的CXCLlO 基因表达量呈上升趋势，明显较正常水平高，这提示该基因在鯢鱼抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。与现有技术相比，本发明具有如下优点
本发明的基因的获得不仅为研究鱼类趋化因子CXCLlO分子在先天免疫反应中的作用机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步研究CXCLlO的免疫学功能提供理论基础。此外，本发明的基因还可以用于抗病相关性研究。
图1为荧光定量检测基因CXCLlO在鯢鱼组织中的表达。图2-1、2_2和2-3是鯢鱼经鳗弧菌感染后肝脏、脾脏和肾脏组织中的CXCLlO基因表达的时空图谱，其中图2-1代表肝脏；图2-2代表脾脏；图2-3代表肾脏。
具体实施例方式下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。主要材料、试剂和仪器设备手术刀，眼科剪，镊子，解剖盘，充氧泵，水箱，1.5ml 离心管，微量移液器、微量移液器枪头，一次性培养皿，陶瓷研钵。脱氧核糖核苷酸dNTP， 热聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 总 RNA 提取试剂盒，RealMasterMix(SYBRGreen)试剂，Quant cDNA第一链合成试剂盒以及DH5a感受态细胞，SMART cDNA Library Construction Kit,小型离心机(Qspin ，BAYGENE),涡旋振荡器(QL-866型，QILINEBEIER),核酸蛋白仪 (SmartSpace Plus, Bio-feid)，超净工作台(SW — CJ一IG型，名牌之星)，恒温培养箱(型号或生产商)，_80°超低温冰箱(Thermo scientific)，荧光定量PCR系统(ABI 7300型)pH计 (Mettler Toledo 320PH Meter)、高压蒸气灭菌锅(SANYO)、高速冷冻离心机(Centrifuge 5417R, eppendorf)、电泳仪(DYY-6C型，北京六一)、水浴锅(上海精宏)、凝胶成像系统 (Bio-Rad GD2000)、PCR 仪(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)、自动测序仪(ABI 3730 型)。实验样本鯢鱼采集于浙江省海洋水产研究所。本发明实施例所用的常规药品氯仿(分析纯)，异丙醇(分析纯)，氯霉素，氯化钠(分析纯)购自国药集团，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-gal)，胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂糖，溴化乙锭，焦碳酸二乙酯 (DEPC)等购自Takara公司，液氮为浙江省舟山亿洋气体有限公司产品，脱氧核糖核苷酸 dNTP,热聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 总 RNA提取试剂盒，RealMasterMix (SYBRGreen)试剂，Quant cDNA第一链合成试剂盒以及DH5a感受态细胞购自TIANGEN公司，SMART cDNA Library Construction Kit购自Clontech公司，质粒文库测序由华大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本发明实施例所用主要仪器包括小型离心机(Qspin ，BAYGENE),涡旋振荡器 (QL-866 型，QILINEBEIER),核酸蛋白仪(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超净工作台 (SW—CJ一IG型，名牌之星)，恒温培养箱(型号或生产商)，-80°超低温冰箱(Thermo scientific)，荧光定量 PCR 系统(ABI 7300 型)pH 计(Mettler Toledo 320PH Meter)、高压蒸气灭菌锅(SANYO)、高速冷冻离心机(Centrifuge 5417R,印pendorf)、电泳仪(DYY-6C 型，北京六一)、水浴锅(上海精宏)、凝胶成像系统(Bio-Rad⑶2000)、PCR仪(ABI Veriti96well Thermal Cycler)、自动测序仪(ABI 3730 型)。实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1
1.利用Trnzol-A+总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取鯢鱼脾脏、肾脏总RNA 取健康的鯢鱼(体重约750g)在充氧水箱养殖14日后，腹腔注射Iml的鳗弧菌 (1. 2X108 cfu/ml)。刺激24h后，解剖鱼体取出脾脏和肾脏，液氮速冻后放入_80°C超低温冰箱备用。分别取备用脾脏和肾脏组织约IOOmg用液氮研磨后加入Iml的Trnzol-A+总 RNA提取试剂(TIANGEN)勻浆，按照试剂盒说明提取总RNA。将两个组织所得的总RNA合并于一个1. 5ml的离心管中，取2μ 1分别用核酸蛋白仪和电泳检测总RNA浓度和质量。2. SMART cDNA 文库构建
SMART cDNA 的合成步骤详见 SMART cDNA Library Construction Kit 试剂盒操作手册。取鯢鱼脾肾组织mRNA lug，按试剂盒用户手册所提供的文库构建方法合成第一链 cDNA 加入3，-CDS引物和SMART II寡核苷酸各1 μ 1，72°C孵育^iiin后，冰上急冷2min， 然后在终体积为10 μ 1的反应体系中，加入5Χ第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-Hcl, PH8.3; 375mmol/L Kcl ； 30mmol/L MgC12)2μ 1，DTT (20mmol/L)1 μ 1，dNTP (lOmmol/L) 1 μ 1和Powerscript逆转录酶1 μ 1，42°C保温Ih合成第一链cDNA。取2 μ 1第一链cDNA 加入 dNTP 2 μ 1, SMART cDNA Library Construction Kit 试剂盒中对应的 PCR 引物 4 μ 1， 禾口 2μ1 50 X Advantage 2 cDNA Polymerase Mix 于 100 μ 1 的反应体系中进行如下 PCR 循环95°C预变性Imin后，以95°C 5s, 65°C 5s, 68°C 6min反应沈个循环。反应结束后，取 5μ 1电泳检测。取50μ 1上述双链cDNA，加入蛋白酶K(20ug/y υ2μ 1，45°C温育20min， 灭活DNA聚合酶，用100 μ 1等体积苯酚/氯仿/异戊醇(1 1 1 )，氯仿/异戊醇(1:1)各抽提1次，上清夜经醋酸钠，糖原，酒精共沉淀后，80%的酒精漂洗，风干后溶解于79 μ 1灭菌双蒸水中，加入SfiI酶(20υ/μ 1)10μ 1，IOXsfiI缓冲液10 μ 1及1μ 1100XBSA，总体积 100 μ 1，50°C酶切池。酶切产物用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，收集1_16管，每管1 滴。分别取3 μ 1于1. 1%的琼脂糖凝胶上150V电泳lOmin，收集含cDNA前3管，混合后加入醋酸钠，糖原和酒精共沉淀，沉淀的cDNA用灭菌双蒸水溶解。合成的SMART cDNA连接入pDNR-LIB载体中，并转化入DH5 α感受态细胞中。涂平板(内含氯霉素、异丙基硫代- β -D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)，37 °C恒温培养箱中培养过夜。3.质粒文库随机筛选及测序
通过蓝白斑鉴定后随机筛选含cDNA插入片段的阳性重组子，将挑取的每个单克隆子分别接种到Iml氯霉素抗性的LB培养液中，摇菌2个小时，菌液PCR确认阳性克隆子，剔除假阳性克隆子。将经过菌液PCR鉴定的阳性克隆子寄送华大基因公司测序，测序在ABI 3730测序仪上进行。在Genbank中对测得的序列进行Blast同源比对，鉴定到α类趋化因子基因 CXCL10，该基因cDNA全长为1157bp，自74bp到44^p区段为其开放阅读框，编码122个氨基酸，5’端非编码区长73bp，3’端非编码区长7Kbp，包含1个mRNA半衰期信号，多聚腺苷酸加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。4.十个正常组织和经鳗弧菌刺激的肝脏、脾脏和肾脏组织总RNA提起和荧光定量PCR反应。利用Trnzol-A+总RNA提取试剂盒提取鯢鱼鳔、眼球、鳍条、鳃、心脏、小肠、 肾脏、肝脏、肌肉、脾脏以及经鳗弧菌刺激的不同时间点肝脏、脾脏和肾脏组织的总RNA， 利用Quant cDNA第一链合成试剂盒反转录合成cDNA第一链为模板进行实时荧光定量 PCR 反应。用鯢鱼的 β-actin 基因(上游引物5，-GTGATGAAGCC CAGAGCA-3，(SEQ ID NO. 5)；下游引物5，-CGACCAGAGGCATACAGG-3，(SEQ ID NO. 6))作为对照，确证各个组织逆转录的效率都符合要求。CXCLlO基因的荧光定量PCR引物为CXCL10-RT-F (上游引物)5，-GCCTTTCTCGTCTGCCTGCTT-3，(SEQ ID NO. 3) ； CSX10-RT-R (下游引物) 5，-CCGAGTGGTGAGCGTGGATT-3，(SEQ ID NO. 4)。荧光定量反应程序模板设置为 ddCt (Relative Quantitation)Study，反应条件设置为95 度 20s ；95 度 5s，60 度 30s，共 40 个循环。利用2_ΔΔσ法计算相对表达量。发明人运用实时荧光定量PCR技术检测了 CXCLlO在鯢鱼的鳔、眼球、鳍条、鳃、心脏、小肠、肾脏、肝脏、肌肉、脾脏中的转录本水平，结果表明该基因在所检测的十个组织中均有mRNA转录本存在，其中在小肠中的丰度最高，其次在眼球中，而在其他组织中则只检测到较少量的mRNA转录本存在(如图1所示)。另外还检测到经鳗弧菌刺激后的脾脏和肾脏中的CXCLlO基因表达量呈上升趋势，明显较正常水平高，这提示该基因在鯢鱼抵抗病原微生物入侵中具有重要功能(如图2-1、2-2和2-3所示)。尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。
权利要求
1.一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，它编码的蛋白质具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCLlO的检测方法，其特征在于，所述的检测方法至少包括使用一对荧光定量PCR引物，所述的一对荧光定量PCR引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1或2所述的一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCLlO在制备鯢鱼抵抗病原微生物入侵产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的病原微生物包括鳗弧菌。
全文摘要
本发明涉及鱼类免疫器官中表达的基因序列领域，具体是一种鮸鱼α类趋化因子基因CXCL10、检测方法和应用。本发明的基因的获得不仅为研究鱼类趋化因子CXCL10分子在先天免疫反应中的作用机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步研究CXCL10的免疫学功能提供理论基础；此外，本发明的基因还可以用于抗病相关性研究，该基因在鮸鱼抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。
文档编号A61P31/04GK102250915SQ20111013987
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者孙悦娜, 徐田军, 王日昕, 石戈, 程远志 申请人:浙江海洋学院
技术领域：
本发明涉及鱼类免疫器官中表达的基因序列，更具体涉及一种从鯢鱼脾脏和肾脏 SMART cDNA文库中筛选出的一个新α类趋化因子基因CXCLlO的核苷酸序列、氨基酸序列及其时空表达图谱。
背景技术：
动物免疫包括先天性免疫和获得性免疫两种。先天性免疫是指生物体所具有的对病原体和有害异物的基本天生抵抗性和防御性。先天免疫对绝大多数的病原体和有害异物具有快速、有力和非特异性作用的特点，尤其是在应对一些毒力发挥快，极易造成疫病暴发的病原体入侵中，能否对入侵病原体进行有效的先天免疫往往是宿主动物存活与否的关键。先天免疫包括从体表到体内细胞及分子等不同层次的防御体系。体表屏障较易被病原体突破，且一旦突破后则经常引起组织损伤，为其他潜在的病原体入侵提供有利途径，此时在细胞及分子层次上以炎症反应为主的一系列复杂免疫反应对杀灭入侵病原体具至关重要的作用。趋化因子大多是能结合肝素的多肽，主要由白细胞分泌，通过受体介导引起粒细胞、单核细胞及淋巴细胞的定向迁移和活化，对淋巴细胞再循环，炎症反应以及抗肿瘤等方面具有重要作用。依照保守的半胱氨酸残基，可分为CXC ( α )，CC ( β )，C ( γ )和CX3C (S)四类。α类趋化因子是最早鉴定的具有趋化嗜中性粒细胞的趋化因子，同时其也具有趋化单核细胞和淋巴细胞的功能。α类趋化因子专门吸引能表达CXCRl和CXCR2的嗜中性粒细胞。它们能在很广泛的细胞中对许多刺激物作出反应，特别是对像白细胞介素I和肿瘤坏死因子这样的前炎症细胞因子。主要的作用是促进嗜中性粒细胞与内皮细胞的黏附以及随后的相关基质蛋白和细胞表面物质沿着趋化因子的浓度梯度向炎症灶的定向移动并清除入侵病原体和有害异物。因此，对趋化因子基因超家族成员的克隆鉴定及其蛋白产物的结构和功能研究无疑能为鱼类先天免疫分子机制解析及提高鱼体抗病力提供坚实的技术支撑。
发明内容
本发明旨在提供一种新的鯢鱼α类趋化因子基因序列及对应氨基酸序列、检测方法和在制备鯢鱼抵抗病原微生物入侵产品中的应用。为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案
一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，它编码的蛋白质具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本发明所述的基因CXCLlO是从鯢鱼脾脏、肾脏的SMART cDNA质粒文库中筛选到的一个基因，其cDNA序列和编码的蛋白质序列如下。该基因cDNA全长1157bp，自74bp 到442bp区段为其开放阅读框，编码122个氨基酸，5’端非翻译区长73bp，3’端非翻译区长7Mbp，有1个mRNA半衰期信号，多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)及多聚腺苷酸尾巴。在 Genbmk中进行同源性分析确定其为趋化因子基因超家族成员。CXCLlO基因的cDNA序列如下 ggggactacagatagtccagactgaagaaagactgagtgcactgtgatccagaacccgtctacagcaacaac
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本发明的基因的获得不仅为研究鱼类趋化因子CXCLlO分子在先天免疫反应中的作用机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步研究CXCLlO的免疫学功能提供理论基础。此外，本发明的基因还可以用于抗病相关性研究。
图1为荧光定量检测基因CXCLlO在鯢鱼组织中的表达。图2-1、2_2和2-3是鯢鱼经鳗弧菌感染后肝脏、脾脏和肾脏组织中的CXCLlO基因表达的时空图谱，其中图2-1代表肝脏；图2-2代表脾脏；图2-3代表肾脏。
具体实施例方式下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。主要材料、试剂和仪器设备手术刀，眼科剪，镊子，解剖盘，充氧泵，水箱，1.5ml 离心管，微量移液器、微量移液器枪头，一次性培养皿，陶瓷研钵。脱氧核糖核苷酸dNTP， 热聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 总 RNA 提取试剂盒，RealMasterMix(SYBRGreen)试剂，Quant cDNA第一链合成试剂盒以及DH5a感受态细胞，SMART cDNA Library Construction Kit,小型离心机(Qspin ，BAYGENE),涡旋振荡器(QL-866型，QILINEBEIER),核酸蛋白仪 (SmartSpace Plus, Bio-feid)，超净工作台(SW — CJ一IG型，名牌之星)，恒温培养箱(型号或生产商)，_80°超低温冰箱(Thermo scientific)，荧光定量PCR系统(ABI 7300型)pH计 (Mettler Toledo 320PH Meter)、高压蒸气灭菌锅(SANYO)、高速冷冻离心机(Centrifuge 5417R, eppendorf)、电泳仪(DYY-6C型，北京六一)、水浴锅(上海精宏)、凝胶成像系统 (Bio-Rad GD2000)、PCR 仪(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)、自动测序仪(ABI 3730 型)。实验样本鯢鱼采集于浙江省海洋水产研究所。本发明实施例所用的常规药品氯仿(分析纯)，异丙醇(分析纯)，氯霉素，氯化钠(分析纯)购自国药集团，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-gal)，胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂糖，溴化乙锭，焦碳酸二乙酯 (DEPC)等购自Takara公司，液氮为浙江省舟山亿洋气体有限公司产品，脱氧核糖核苷酸 dNTP,热聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 总 RNA提取试剂盒，RealMasterMix (SYBRGreen)试剂，Quant cDNA第一链合成试剂盒以及DH5a感受态细胞购自TIANGEN公司，SMART cDNA Library Construction Kit购自Clontech公司，质粒文库测序由华大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本发明实施例所用主要仪器包括小型离心机(Qspin ，BAYGENE),涡旋振荡器 (QL-866 型，QILINEBEIER),核酸蛋白仪(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超净工作台 (SW—CJ一IG型，名牌之星)，恒温培养箱(型号或生产商)，-80°超低温冰箱(Thermo scientific)，荧光定量 PCR 系统(ABI 7300 型)pH 计(Mettler Toledo 320PH Meter)、高压蒸气灭菌锅(SANYO)、高速冷冻离心机(Centrifuge 5417R,印pendorf)、电泳仪(DYY-6C 型，北京六一)、水浴锅(上海精宏)、凝胶成像系统(Bio-Rad⑶2000)、PCR仪(ABI Veriti96well Thermal Cycler)、自动测序仪(ABI 3730 型)。实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1
1.利用Trnzol-A+总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取鯢鱼脾脏、肾脏总RNA 取健康的鯢鱼(体重约750g)在充氧水箱养殖14日后，腹腔注射Iml的鳗弧菌 (1. 2X108 cfu/ml)。刺激24h后，解剖鱼体取出脾脏和肾脏，液氮速冻后放入_80°C超低温冰箱备用。分别取备用脾脏和肾脏组织约IOOmg用液氮研磨后加入Iml的Trnzol-A+总 RNA提取试剂(TIANGEN)勻浆，按照试剂盒说明提取总RNA。将两个组织所得的总RNA合并于一个1. 5ml的离心管中，取2μ 1分别用核酸蛋白仪和电泳检测总RNA浓度和质量。2. SMART cDNA 文库构建
SMART cDNA 的合成步骤详见 SMART cDNA Library Construction Kit 试剂盒操作手册。取鯢鱼脾肾组织mRNA lug，按试剂盒用户手册所提供的文库构建方法合成第一链 cDNA 加入3，-CDS引物和SMART II寡核苷酸各1 μ 1，72°C孵育^iiin后，冰上急冷2min， 然后在终体积为10 μ 1的反应体系中，加入5Χ第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-Hcl, PH8.3; 375mmol/L Kcl ； 30mmol/L MgC12)2μ 1，DTT (20mmol/L)1 μ 1，dNTP (lOmmol/L) 1 μ 1和Powerscript逆转录酶1 μ 1，42°C保温Ih合成第一链cDNA。取2 μ 1第一链cDNA 加入 dNTP 2 μ 1, SMART cDNA Library Construction Kit 试剂盒中对应的 PCR 引物 4 μ 1， 禾口 2μ1 50 X Advantage 2 cDNA Polymerase Mix 于 100 μ 1 的反应体系中进行如下 PCR 循环95°C预变性Imin后，以95°C 5s, 65°C 5s, 68°C 6min反应沈个循环。反应结束后，取 5μ 1电泳检测。取50μ 1上述双链cDNA，加入蛋白酶K(20ug/y υ2μ 1，45°C温育20min， 灭活DNA聚合酶，用100 μ 1等体积苯酚/氯仿/异戊醇(1 1 1 )，氯仿/异戊醇(1:1)各抽提1次，上清夜经醋酸钠，糖原，酒精共沉淀后，80%的酒精漂洗，风干后溶解于79 μ 1灭菌双蒸水中，加入SfiI酶(20υ/μ 1)10μ 1，IOXsfiI缓冲液10 μ 1及1μ 1100XBSA，总体积 100 μ 1，50°C酶切池。酶切产物用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，收集1_16管，每管1 滴。分别取3 μ 1于1. 1%的琼脂糖凝胶上150V电泳lOmin，收集含cDNA前3管，混合后加入醋酸钠，糖原和酒精共沉淀，沉淀的cDNA用灭菌双蒸水溶解。合成的SMART cDNA连接入pDNR-LIB载体中，并转化入DH5 α感受态细胞中。涂平板(内含氯霉素、异丙基硫代- β -D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)，37 °C恒温培养箱中培养过夜。3.质粒文库随机筛选及测序
通过蓝白斑鉴定后随机筛选含cDNA插入片段的阳性重组子，将挑取的每个单克隆子分别接种到Iml氯霉素抗性的LB培养液中，摇菌2个小时，菌液PCR确认阳性克隆子，剔除假阳性克隆子。将经过菌液PCR鉴定的阳性克隆子寄送华大基因公司测序，测序在ABI 3730测序仪上进行。在Genbank中对测得的序列进行Blast同源比对，鉴定到α类趋化因子基因 CXCL10，该基因cDNA全长为1157bp，自74bp到44^p区段为其开放阅读框，编码122个氨基酸，5’端非编码区长73bp，3’端非编码区长7Kbp，包含1个mRNA半衰期信号，多聚腺苷酸加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。4.十个正常组织和经鳗弧菌刺激的肝脏、脾脏和肾脏组织总RNA提起和荧光定量PCR反应。利用Trnzol-A+总RNA提取试剂盒提取鯢鱼鳔、眼球、鳍条、鳃、心脏、小肠、 肾脏、肝脏、肌肉、脾脏以及经鳗弧菌刺激的不同时间点肝脏、脾脏和肾脏组织的总RNA， 利用Quant cDNA第一链合成试剂盒反转录合成cDNA第一链为模板进行实时荧光定量 PCR 反应。用鯢鱼的 β-actin 基因(上游引物5，-GTGATGAAGCC CAGAGCA-3，(SEQ ID NO. 5)；下游引物5，-CGACCAGAGGCATACAGG-3，(SEQ ID NO. 6))作为对照，确证各个组织逆转录的效率都符合要求。CXCLlO基因的荧光定量PCR引物为CXCL10-RT-F (上游引物)5，-GCCTTTCTCGTCTGCCTGCTT-3，(SEQ ID NO. 3) ； CSX10-RT-R (下游引物) 5，-CCGAGTGGTGAGCGTGGATT-3，(SEQ ID NO. 4)。荧光定量反应程序模板设置为 ddCt (Relative Quantitation)Study，反应条件设置为95 度 20s ；95 度 5s，60 度 30s，共 40 个循环。利用2_ΔΔσ法计算相对表达量。发明人运用实时荧光定量PCR技术检测了 CXCLlO在鯢鱼的鳔、眼球、鳍条、鳃、心脏、小肠、肾脏、肝脏、肌肉、脾脏中的转录本水平，结果表明该基因在所检测的十个组织中均有mRNA转录本存在，其中在小肠中的丰度最高，其次在眼球中，而在其他组织中则只检测到较少量的mRNA转录本存在(如图1所示)。另外还检测到经鳗弧菌刺激后的脾脏和肾脏中的CXCLlO基因表达量呈上升趋势，明显较正常水平高，这提示该基因在鯢鱼抵抗病原微生物入侵中具有重要功能(如图2-1、2-2和2-3所示)。尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。
权利要求
1.一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCL10，它编码的蛋白质具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCLlO的检测方法，其特征在于，所述的检测方法至少包括使用一对荧光定量PCR引物，所述的一对荧光定量PCR引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1或2所述的一种鯢鱼α类趋化因子基因CXCLlO在制备鯢鱼抵抗病原微生物入侵产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的病原微生物包括鳗弧菌。
全文摘要
本发明涉及鱼类免疫器官中表达的基因序列领域，具体是一种鮸鱼α类趋化因子基因CXCL10、检测方法和应用。本发明的基因的获得不仅为研究鱼类趋化因子CXCL10分子在先天免疫反应中的作用机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步研究CXCL10的免疫学功能提供理论基础；此外，本发明的基因还可以用于抗病相关性研究，该基因在鮸鱼抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。
文档编号A61P31/04GK102250915SQ20111013987
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者孙悦娜, 徐田军, 王日昕, 石戈, 程远志 申请人:浙江海洋学院
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