具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚满酮衍生物、其制备方法...的制作方法
专利名称：具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚满酮衍生物、其制备方法 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及同时具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚 满酮衍生物、其合成及在治疗与蛋白激酶活性异常以及组蛋白去乙酰化酶活性异常相关 的疾病方面的临床应用。
背景技术：
蛋白激酶是催化蛋白磷酸化的一类酶，特别是催化蛋白中特定的酪氨酸、丝氨 酸和苏氨酸残基上的羟基的磷酸化。蛋白激酶在调节许多细胞生理过程中都起到关键作 用，包括代谢、细胞增殖、细胞分化、细胞存活、环境-主体反应、免疫应答和血管生 成。许多疾病都与由蛋白激酶调节所引发的反常的细胞应有关。这些疾病包括炎症、 自身免疫性疾病、癌症、神经系统疾病和神经退化性疾病、心血管疾病、过敏、哮喘以 及与激素相关疾病(Tan，S-L.，2006，J.Immunol.，176 2872-2879 ； Healy, A.eaal.， 2006，J.Immunol., 177 1886-1893; Salek-Ardakani, S.et al.，2005，J.Immunol., 175 7635-7641 ； Kim, J.etal.，2004，J.Clin.Invest.，114 823-827)。因此，人们一直 致力于寻求能够有效地治疗这些疾病的蛋白激酶抑制剂。
蛋白激酶通常分为两类，即蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶 (STKs)。
蛋白酪氨酸激酶(PTKs)可分为两类，即非跨膜酪氨酸激酶和跨膜生长因子受体 酪氨酸激酶(RTKs)。目前，至少已经确定了 RTKs的19种不同的亚族，如表皮生长因 子受体(EGFR)，血管内皮生长因子受体(VEGFR)，血小板源生长因子受体(PDGFR)和 纤维母细胞生长因子受体(FGFR)。
表皮生长因子受体(EGFR)家族包含了四种跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，即 HERU HER2、HER3和HER4。当一组特定的配体与受体的结合后，促进了 EGFR的二 聚，并且导致受体中酪氨酸残基的自磷酸化(Arteiiga，C-L., 2001，Curr.Opin.Oncol.， 6:491-498)。一旦受体自磷酸化后，EGFR的几个信号转导通路的下游就被激活了。 EGFR的信号转导通路与肿瘤生成的过程密切相关，包括细胞周期进程、细胞凋亡的抑 制、肿瘤细胞的运动、入侵和转移。EGFR的激活也刺激了血管内皮生长因子(VEGF)， 它是血管生成的主要诱导体(Petit，A-M.etal.，1997，Am.J.Pathol., 151 1523-1530)。 在实验模型中，EGFR介导的信号转导通路的下调与肿瘤的发生密切相关(Wikstnmd， C-J.etal.，1998，JNatlCancerInst., 90: 799-800)。在许多人体肿瘤中可以观察到突变 导致的EGFR蛋白的连续扩增激活和过度表达，包括胸部、肺部、卵巢和肾脏的肿瘤。 这些突变是肿瘤侵润的决定因素(Wikstrand，C-J.etal., 1998，J Natl Cancer Inst.，90: 799-800)。EGFR过度表达在非小细胞肺癌(NSCLC)中是非常常见的。EGFR的活性 可以通过使用抗-EGFR抗体进行阻断胞外配体结合区或通过使用小分子抑制EGFR酪 氨酸激酶来进行抑制，从而达到抑制EGFR通路下游信号传递的目的(Mendelsohn，J.，1997，Clin.Can.Res.，3 2707-2707)。
几乎所有的实体瘤和间质瘤在低氧情况下都会分泌血管内皮生长因子(VEGF)。 它对血管内皮是高度专一的，并且对血管增殖和渗透都能起到调节作用。VEGF水平 的过度表达与微脉管密度的增加、癌症复发和存活率降低均密切相关(Parikh，A-A.， 2004 ； ，Hematol. Oncol.Clin.N.Am.，18 951-971 Parikh, A-A., 2004 ； ，Hematol. Oncol. Clin.N.Am., 18: 951-971)。对 VEGF 受体来说有 6 种不同的配体VEGF-A 到 E 和胎盘生长因子。配体与内皮细胞上的特定受体(主要是VEGFR-2)相结合。VEGF-A与 VEGFR-I的结合引起内皮细胞的迁移，与VEGFR-2的结合引起内皮细胞增殖、渗透和 存活，VEGFR-3被认为调节淋巴血管生成。VEGF与VEGFR-2受体的结合导致了细胞内 酪氨酸激酶区域的活化和自磷酸化，并进一步触发了细胞内一连串信号的产生(Parikh， A-A.，2004，Hematol. Oncol.Clin.N.Am., 18 951-971)。
丝氨酸-苏氨酸激酶6TKs)主要存在于细胞内。也存在少数几种STKs类型的 受体激酶。STKs是胞液激酶最常见的形式，它们在细胞质部位执行它们的功能，而不是 细胞质中的细胞器和细胞骨架。
糖原合成酶激酶-3(GSK_3)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，包含了 α和β 两种异构形式，这两种异构形式各自以独特的基因编码。人们发现GSK-3能够使许多 调控蛋白磷酸化，并可以调节它们的活性。GSK-3与多种疾病相关，包括糖尿病、老年 痴呆症、中枢神经系统障碍如狂躁抑郁障碍和神经退化疾病、心肌肥大等(Haq，etal.， 2000，J. Cell Biol., 151 117)。
Aurora-2是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它与人体癌症密切相关，如结肠癌、 乳房癌和其它实体瘤。人们认为它与调节细胞周期的蛋白磷酸化有关。尤其，有丝分 裂过程中，Aurora-2在控制染色体的准确分离上起了作用。细胞周期的异常调节可以 导致细胞增殖和其它异常。在人体结肠癌组织中，人们发现Aurora-2蛋白被过度表达 (Schumache r, etal.，1998，J. CellBiol.，143 1635-1646； Kimuraetal., 1997，J.Biol. Chem.，272 13766-13771)。
细胞周期依赖性激酶(CDKs)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它调节哺乳动物 的细胞分裂。目前，人们已经确定了九个激酶亚基(CDK 1-9)。每一个激酶都和一个特 定的调节对象相结合，一起构成了活性催化位点。增殖失控是癌细胞的一个特点，在许 多重要的实体瘤中，常常发生CDK功能的异常调节。人们对CDK2和CDK4尤其感兴 趣，因为在许多人体肿瘤中，它们的活性常常被异常调节。
Raf激酶是一种ras肿瘤蛋白的下游效应蛋白。它是由细胞表面到细胞核的信号 转导通路的一个关键调节器。抑制Raf激酶与在体内和体外抑制许多人体肿瘤的生长密 切相关(Moniaet al.，1996，Nat.Med.，2 668-675)。
其它的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶包括蛋白激酶A、B和C。这些激酶(即PKA， PKB和PKC)在信号转导通路中起着关键作用。
人们一直致力于寻求具有蛋白激酶抑制活性并能治疗与蛋白激酶活性异常动相 关的疾病的小分子化合物。文献报道的化合物有环状化合物(美国专利US 7,151,096)、 双环化合物(美国专利US 7,189,721)、三环化合物(美国专利US 7,132,533)、(2-羟 基吲哚基-3-亚甲基)乙酸衍生物(美国专利US 7,214,700)、3-(4-酰胺吡咯基-2-基亚甲基)-2-吲哚满酮衍生物(美国专利US 7,179,910)、稠合吡唑衍生物(美国专利 US7,166,597)、胺基呋咱化合物(美国专利US 7,157,476)、吡咯取代的的2-吲哚满酮化 合物(美国专利US 7,125,905)、三唑化合物(美国专利US 7,115,739)、吡唑基胺基取代 的喹唑啉化合物(美国专利US7,098,330)和吲唑化合物(美国专利US 7,041,687)等。有 几个蛋白激酶抑制剂已被FDA批准用于癌症治疗，如Glivec、Sutent和Sorafenib。临床 使用表明，与传统的化疗相比，这些药物优势明显。由此激发人们基于机理对治疗方法 进行改进，优化化合物分子骨架，以期发现具有更好口服生物利用度、更高的抗癌活性 和更低毒性的新化合物。发明内容
本发明目的之一在于公开一类具有蛋白激酶选择性抑制活性和同时具有组蛋白 去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚满酮衍生物；
本发明目的之二在于公开这一类所述的化合物的制备方法；
本发明目的之三在于公开这一类所述的化合物作为治疗与蛋白激酶活性异常以 及组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病方面的临床应用。
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)蛋白在调控体内的基因表达方面起着关键作用， 它改变转录因子结合到染色体组DNA的可达性。尤其是HDAC能去除组蛋白中乙酰 化赖氨酸残基的乙酰基，从而导致核小体重构(Granstein，M.，1997，Nature, 389 349-352)。由于HDAC蛋白在基因表达中起着关键作用，所以它们与许多细胞功能密 切相关，包括细胞周期调控、细胞增殖、分化、基因程序化表达和癌症发生(Ruijter， A-J-M., 2003，Biochem.J., 370 737—749; Grignani, F., 1998，Nature, 391 815-818 ； Lin, R-J.，1998，391 811—814; Marks, P-A., 2001，NatureReviews Cancer, 1: 194)。由组蛋白去乙酰化酶误调所致的异常去乙酰化与许多临床疾病密切 相关，如鲁-泰(Rubinstdn-Taybi) 二氏综合征、脆性X染色体综合症、白血病和其它各 种癌症(Langley B et al.，2005，Current Drag Targets—CNS&Neurological Disorders, 4 41-50)。试验表明，HDAC抑制剂能够抑制人类及动物体内的肿瘤的生长，包括肺癌、 胃癌、乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤等(Dokmanovic，M.，2005，J.Cell Biochenm., 96: 293-304)。
组蛋白去乙酰化酶活性异常与各种神经系统疾病及神经退化疾病密切相关，包 括中风、亨廷顿舞蹈(Huntington)疾病、肌萎缩侧索硬化(AmyotrophicLateral Sclerosis) 和阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease)。抑制组蛋白去乙酰化酶能够诱导抗有丝分裂和 抗凋亡基因的表达，如p21和HSP-70，有利于正常细胞的存活。HDAC抑制剂也能够作 用于中枢神经系统的其他神经细胞，如反应性星形胶质细胞和小神经胶质细胞，降低在 神经损伤或疾病中的炎症和二次伤害。通过HDAC抑制剂增加乙酰化，可以诱导树突发 芽(突触数量增加)，重建学习行为，进入长期记忆。HDAC抑制剂可以逆转弗里德赖希 共济失调症(Friedreich’ s ataxia)的基因沉默。这些数据表明，HDAC抑制是一种极具希 望的治疗许多中枢神经系统疾病的方法(Langley B etal.，2005，Current Drag Targets-CNS & Neurological Disorders, 4 41-50; FischerA., et al, 2007, Nature 447 (10) 178-183 ； Herman D.，etal., 2006，Nature Chemical Biology 2 (10) 551-558)。
依据序列同源性，哺乳动物的HDACs可以分为三类。第一类由酵母Rpd3_类 蛋白组成(HDAC 1，2，3，8和11)。第二类由酵母HDAl-类蛋白组成(HDAC 4，5， 6，7，9和10)。第三类由酵母SIR2-类蛋白组成6IRT 1，2，3，4，5，6和7)。
HDACl的活性和细胞增殖(癌症的标志)相关。哺乳动物细胞通过SiRNA降 低 HDACl 表达，具有抗增殖性(Glaser，K-B., 2003，Biochem.Biophys.Res.Comm., 310 529-536) 0 HDACl基因敲除鼠是胚胎致死的，其余细胞表现出不一样的细胞生长 (Lagger，G.，2002，EMBO J., 21:洸72_2681)。HDACl 过度表达的老鼠细胞显示 G2 和 M 期延长及生长速度降低(Bartl.S.，1997，Mol.Cell Biol.，17:5033-5043)。因此， 试验数据表明，HDACl与细胞周期调控及细胞增殖密切相关。
HDAC2调控许多胎心肌蛋白异构体的表达。HDAC2缺乏或是通过化学方法抑 制组蛋白去乙酰化酶可以阻止胚胎基因的再表达，减少心室肥大。抗肥大和肌醇多磷酸 盐-5-磷酸酶f(Inpp5f)编码基因表达增加有关，这种增加导致胸腺瘤滤过性病毒的原癌 基因(Akt)和3-磷酸肌醇-依赖的蛋白激酶-1失活，激活了糖原合成酶激酶3 (Gsk3)。 相反，HDAC2转基因鼠心室肥大增加，这与失活的Gsk3i3有关。通过化学方法抑制 活化的Gsk3i3使得HDAC2-缺乏的成人对心室肥大的刺激变得敏感。这些结果表明， 在心脏中HDAC2是HDAC抑制剂的一个重要的分子靶标。HDAC2和Gsk3 β都是调控 通路的组成部分，这为治疗心室肥大和心力衰竭提供了极具吸引力的治疗靶标(Trivedi， C-M.，2007，Nat.Med，.13 324-331)。
HDAC3在正常小肠的增殖隐窝细胞中表达最多。在结肠癌细胞系中HDAC3表 达沉默导致细胞生长抑制、细胞存活降低和细胞凋亡增加。沉默HDAC2表达可以观察到 类似的效果，而对于HDAC1，效果则没有那么显著。HDAC3基因沉默也选择性的引起 碱性磷酸酯酶的表达(结肠细胞成熟的标志)。HDAC3的过度表达抑制基础转录及丁酸 酯诱导的P21转录，而沉默HDAC3则刺激P21基因启动子的活性和表达。这些发现表 明HDAC3是在人体结肠癌中进行下调的基因，是结肠细胞成熟和P21表达的一种新型的 调节剂(Wilson，A-J.，2006，J.Biol.Chem.，281 13548-13558)
HDAC6是HDAC家族的一个亚型，它脱去_微管蛋白的乙酰基，增加细胞运动 性。在九组口腔鳞状细胞癌(OSCC)的细胞系和正常的口腔角化细胞(NOKs)上运用定量 实时逆转录聚合酶链反应和Western Blots技术分析，与NOKs相比，HDAC6mRNA和蛋 白表达水平在所有的癌细胞中都升高了。通过免疫荧光法分析，在OSCC细胞系的细胞 质中检测到了 HDAC6蛋白。和OSCC细胞系相似，在早期的人体OSCC肿瘤中HDAC6 上调明显，mRNA达74%，蛋白达51%。通过对临床变量的分析，人们发现临床肿瘤 的发展阶段和HDAC6的表达状态相关。分析表明，HDAC6的表达水平在肿瘤早期(I和 II期)和晚期(III和IV期)存在显著差异(P = 0.014)。这些结果表明HDAC6的表达 可能和肿瘤的恶性程度有关，这也为设计新的治疗方法提供了线索Makuma，T.，2006， Int.J.Oncol., 29: 117-124)。
IIa类HDAC包括HDAC4，5和7。在过去几年中，研究人员确定了 IIa类HDAC在活体中的一些重要生理功能。令人吃惊的是，这些看似没有联系的生理过程有着共同 的特征，它们都依赖于na类HDAC对MEF2转录活动的严密控制。诸如骨骼肌的形成、 心肥大、骨发育、T-细胞分化和神经元存活等关键生理过程都被ILi类HDAC所控制，这7一事实意味着许多人类病理学的干预疗法是有可能的，包括血管类疾病如动脉硬化、中 风和动脉瘤、肿瘤血管生成和转移、侏儒症、骨骼畸形、自身免疫和淋巴增生综合征、 神经退化性疾病和心肌肥大(Martin M.etal，2007, Oncogene 26 5450-5467)。
HDAC使功能染色体表观基因沉默是许多病理过程的主要机制之一。其中，功 能相关基因被HDAC抑制或重调，导致在终末分化、成熟和生长控制中表型缺失，并且 丧失组织功能。例如，肿瘤抑制基因经常在癌症的发展过程中被沉默，HDAC抑制剂能 够诱导这些肿瘤抑制基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生长和分化(Glaros Setal.，2007， Oncogene June 4Epub aheadof print ； Mai, A, etal.，2007, Int J.Biochem Cell Bio., April 4, Epub ahead ofprint ； Vincent A. et al.，2007, Oncogene, April 30, Epub ahead of print ； our unpublished results)。结构基因(如与Friedreich，s运动失调相关的FXN基因和与脊 柱肌肉萎缩相关的SMN基因)的抑制可以被HDAC逆转，使得FXN和SMN基因重新表 达，并恢复组织功能(HermanD etal.，2006，NatureChemical Biology, 2(10) 551-8 ； Avila AM et al.，2007，J Clinic Investigation, 117(3)659-71 ； deBore J, 2006，Tissue Eng.l2(10):四27-37)。HDAC抑制剂在染色体6p21_22重调HDAC “热点”程序， 诱导了整个MHC II家族基因表达，进一步延伸了免疫识别和免疫响应的表观基因调控 (Gialitakis Metal.，2007，Nucleic Acids Res.，34(1) ； 765-72)。
目前已经确定了几类HDAC抑制剂，包括1)短链脂肪酸，如丁酸和苯丁酸； 2)有机羟肟酸，如 suberoylanilide hydroxamic acicKSAHA)禾Π trichostatin A(TSA) ； 3)含 有2-胺基-8-氧-9，10-环氧癸酰基(AOE)的环四肽，如trapohn和HC-tohn ； 4)不 含2-氨基-8-氧-9，10-环氧癸酰基的环四肽，如apicidin和FK228 ； 5)苯酰胺类，如 M8-275(欧洲专利 EP0847992A1，美国专利 2002/0103192A1，世界专利 02/26696A1，世 界专利01/70675A2，世界专利01/18171A2)。尽管HDAC是一个极具前景的药物靶标， 但目前Merck公司研制的SAHA仅仅局限于对皮肤T细胞淋巴瘤的治疗，而对实体瘤疗 效并不明显。因此，有必要继续研制新的化合物，使其具有更强的HDAC抑制活性、更 强的抗癌活性、更好的HDAC亚型选择性和更低的毒性。
靶向治疗一直为抗癌药物研发人员所推崇。人们希望设计药物，它既能准确的 到达肿瘤细胞的某个特定靶标并杀死肿瘤细胞，同时又对正常细胞又没有伤害。然而， 肿瘤细胞能够运用多种生物引发器和通路来进行生长和传播。在一个靶点对肿瘤细胞进 行打击，它们会沿着新的生长通路重组和重新部署。由此人们发展了组合靶向治疗，并 正在成为癌症治疗的新范例。几个多靶点激酶抑制剂现正在研发中，其中Sorafenib和 Sutent已经在美国获得批准上市。Sorafenib (Bayer公司开发)是第一个同时以RAF/MEK/ ERK通路(与细胞增殖有关)和VEGFR2/PDGFRi3级联信号通路(与血管生成有关)为 靶点的药物，该药在2005年12月获得批准用于治疗晚期肾癌。尽管这些靶向治疗药物 在治疗一些实体瘤时是有效的，但是在治疗其它实体瘤时，疗效并不理想且具有毒副作 用。
本发明所述的化合物，结合了 RTK抑制剂的抗血管生成和抗增殖活性以及 HDAC抑制剂的所具有的诱导分化、免疫调制、阻碍细胞周期、促使细胞凋亡的活性， 旨在对实体瘤具有更好的疗效，同时克服市售的RTK抑制剂的毒副作用，如高血压、QT 间期延长、甲状腺退化、皮疹和皮肤变色、疼痛等。8
本发明所述的化合物，其化学结构如通式⑴所示
权利要求
1. 一种具有通式⑴的2-吲哚满酮衍生物
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物为 X 为=CH-或=N-N = CH-；R1 > R2> R3和R4分别为氢或卤素； R5> R6> R7和R8分别为氢或卤素； η为2到6的整数。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物为 X 为
4.通式⑴的化合物的制备方法，该方法包括如下步骤 (a)将6-氯烟酸与化合物1进行缩合反应得到化合物2 ；(b)将化合物2与化合物3进行缩合反应得到化合物4 ；
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于反应步骤(a)和(C)均使用肽缩合剂 作催化剂。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述肽缩合剂选自1-乙基-3-(3-二 甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)，N，N，-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N，-碳酰二 咪唑(CDI)。
7.—种用于治疗与蛋白激酶活性异常或组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病的药 用制剂，其特征在于该制剂包括作为活性组分的权利要求1所述通式⑴的化合物以及 药用载体、辅料或稀释剂。
8.如权利要求7所述的药用制剂，其特征在于所述药用制剂的规格为0.0001 200mg。
9.如权利要求7所述的药用制剂，其特征在于所述药用制剂为片剂、胶囊、粉 剂、糖浆、液剂、悬浮剂或针剂。
10.如权利要求1所述的化合物在制备用于治疗炎症、自身免疫性疾病、癌症、神经 系统疾病和神经退化性疾病、过敏、哮喘、心血管疾病或与激素相关的疾病的药物中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚满酮衍生物、其制备方法及应用，其结构如通式(I)所示，其中，X、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和n的定义同说明书。该类化合物同时具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性，可以用于治疗与蛋白激酶活性异常或组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病，包括炎症、自身免疫性疾病、癌症、神经系统疾病和神经退化性疾病、心血管疾病、过敏、哮喘以及与激素相关的疾病。
文档编号A61P35/00GK102020638SQ20091017647
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者余金迪, 吴仲闻, 宁志强, 山松, 李志斌, 王祥辉, 马保顺, 鲁先平 申请人:深圳微芯生物科技有限责任公司
技术领域：
本发明涉及同时具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚 满酮衍生物、其合成及在治疗与蛋白激酶活性异常以及组蛋白去乙酰化酶活性异常相关 的疾病方面的临床应用。
背景技术：
蛋白激酶是催化蛋白磷酸化的一类酶，特别是催化蛋白中特定的酪氨酸、丝氨 酸和苏氨酸残基上的羟基的磷酸化。蛋白激酶在调节许多细胞生理过程中都起到关键作 用，包括代谢、细胞增殖、细胞分化、细胞存活、环境-主体反应、免疫应答和血管生 成。许多疾病都与由蛋白激酶调节所引发的反常的细胞应有关。这些疾病包括炎症、 自身免疫性疾病、癌症、神经系统疾病和神经退化性疾病、心血管疾病、过敏、哮喘以 及与激素相关疾病(Tan，S-L.，2006，J.Immunol.，176 2872-2879 ； Healy, A.eaal.， 2006，J.Immunol., 177 1886-1893; Salek-Ardakani, S.et al.，2005，J.Immunol., 175 7635-7641 ； Kim, J.etal.，2004，J.Clin.Invest.，114 823-827)。因此，人们一直 致力于寻求能够有效地治疗这些疾病的蛋白激酶抑制剂。
蛋白激酶通常分为两类，即蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶 (STKs)。
蛋白酪氨酸激酶(PTKs)可分为两类，即非跨膜酪氨酸激酶和跨膜生长因子受体 酪氨酸激酶(RTKs)。目前，至少已经确定了 RTKs的19种不同的亚族，如表皮生长因 子受体(EGFR)，血管内皮生长因子受体(VEGFR)，血小板源生长因子受体(PDGFR)和 纤维母细胞生长因子受体(FGFR)。
表皮生长因子受体(EGFR)家族包含了四种跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，即 HERU HER2、HER3和HER4。当一组特定的配体与受体的结合后，促进了 EGFR的二 聚，并且导致受体中酪氨酸残基的自磷酸化(Arteiiga，C-L., 2001，Curr.Opin.Oncol.， 6:491-498)。一旦受体自磷酸化后，EGFR的几个信号转导通路的下游就被激活了。 EGFR的信号转导通路与肿瘤生成的过程密切相关，包括细胞周期进程、细胞凋亡的抑 制、肿瘤细胞的运动、入侵和转移。EGFR的激活也刺激了血管内皮生长因子(VEGF)， 它是血管生成的主要诱导体(Petit，A-M.etal.，1997，Am.J.Pathol., 151 1523-1530)。 在实验模型中，EGFR介导的信号转导通路的下调与肿瘤的发生密切相关(Wikstnmd， C-J.etal.，1998，JNatlCancerInst., 90: 799-800)。在许多人体肿瘤中可以观察到突变 导致的EGFR蛋白的连续扩增激活和过度表达，包括胸部、肺部、卵巢和肾脏的肿瘤。 这些突变是肿瘤侵润的决定因素(Wikstrand，C-J.etal., 1998，J Natl Cancer Inst.，90: 799-800)。EGFR过度表达在非小细胞肺癌(NSCLC)中是非常常见的。EGFR的活性 可以通过使用抗-EGFR抗体进行阻断胞外配体结合区或通过使用小分子抑制EGFR酪 氨酸激酶来进行抑制，从而达到抑制EGFR通路下游信号传递的目的(Mendelsohn，J.，1997，Clin.Can.Res.，3 2707-2707)。
几乎所有的实体瘤和间质瘤在低氧情况下都会分泌血管内皮生长因子(VEGF)。 它对血管内皮是高度专一的，并且对血管增殖和渗透都能起到调节作用。VEGF水平 的过度表达与微脉管密度的增加、癌症复发和存活率降低均密切相关(Parikh，A-A.， 2004 ； ，Hematol. Oncol.Clin.N.Am.，18 951-971 Parikh, A-A., 2004 ； ，Hematol. Oncol. Clin.N.Am., 18: 951-971)。对 VEGF 受体来说有 6 种不同的配体VEGF-A 到 E 和胎盘生长因子。配体与内皮细胞上的特定受体(主要是VEGFR-2)相结合。VEGF-A与 VEGFR-I的结合引起内皮细胞的迁移，与VEGFR-2的结合引起内皮细胞增殖、渗透和 存活，VEGFR-3被认为调节淋巴血管生成。VEGF与VEGFR-2受体的结合导致了细胞内 酪氨酸激酶区域的活化和自磷酸化，并进一步触发了细胞内一连串信号的产生(Parikh， A-A.，2004，Hematol. Oncol.Clin.N.Am., 18 951-971)。
丝氨酸-苏氨酸激酶6TKs)主要存在于细胞内。也存在少数几种STKs类型的 受体激酶。STKs是胞液激酶最常见的形式，它们在细胞质部位执行它们的功能，而不是 细胞质中的细胞器和细胞骨架。
糖原合成酶激酶-3(GSK_3)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，包含了 α和β 两种异构形式，这两种异构形式各自以独特的基因编码。人们发现GSK-3能够使许多 调控蛋白磷酸化，并可以调节它们的活性。GSK-3与多种疾病相关，包括糖尿病、老年 痴呆症、中枢神经系统障碍如狂躁抑郁障碍和神经退化疾病、心肌肥大等(Haq，etal.， 2000，J. Cell Biol., 151 117)。
Aurora-2是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它与人体癌症密切相关，如结肠癌、 乳房癌和其它实体瘤。人们认为它与调节细胞周期的蛋白磷酸化有关。尤其，有丝分 裂过程中，Aurora-2在控制染色体的准确分离上起了作用。细胞周期的异常调节可以 导致细胞增殖和其它异常。在人体结肠癌组织中，人们发现Aurora-2蛋白被过度表达 (Schumache r, etal.，1998，J. CellBiol.，143 1635-1646； Kimuraetal., 1997，J.Biol. Chem.，272 13766-13771)。
细胞周期依赖性激酶(CDKs)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它调节哺乳动物 的细胞分裂。目前，人们已经确定了九个激酶亚基(CDK 1-9)。每一个激酶都和一个特 定的调节对象相结合，一起构成了活性催化位点。增殖失控是癌细胞的一个特点，在许 多重要的实体瘤中，常常发生CDK功能的异常调节。人们对CDK2和CDK4尤其感兴 趣，因为在许多人体肿瘤中，它们的活性常常被异常调节。
Raf激酶是一种ras肿瘤蛋白的下游效应蛋白。它是由细胞表面到细胞核的信号 转导通路的一个关键调节器。抑制Raf激酶与在体内和体外抑制许多人体肿瘤的生长密 切相关(Moniaet al.，1996，Nat.Med.，2 668-675)。
其它的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶包括蛋白激酶A、B和C。这些激酶(即PKA， PKB和PKC)在信号转导通路中起着关键作用。
人们一直致力于寻求具有蛋白激酶抑制活性并能治疗与蛋白激酶活性异常动相 关的疾病的小分子化合物。文献报道的化合物有环状化合物(美国专利US 7,151,096)、 双环化合物(美国专利US 7,189,721)、三环化合物(美国专利US 7,132,533)、(2-羟 基吲哚基-3-亚甲基)乙酸衍生物(美国专利US 7,214,700)、3-(4-酰胺吡咯基-2-基亚甲基)-2-吲哚满酮衍生物(美国专利US 7,179,910)、稠合吡唑衍生物(美国专利 US7,166,597)、胺基呋咱化合物(美国专利US 7,157,476)、吡咯取代的的2-吲哚满酮化 合物(美国专利US 7,125,905)、三唑化合物(美国专利US 7,115,739)、吡唑基胺基取代 的喹唑啉化合物(美国专利US7,098,330)和吲唑化合物(美国专利US 7,041,687)等。有 几个蛋白激酶抑制剂已被FDA批准用于癌症治疗，如Glivec、Sutent和Sorafenib。临床 使用表明，与传统的化疗相比，这些药物优势明显。由此激发人们基于机理对治疗方法 进行改进，优化化合物分子骨架，以期发现具有更好口服生物利用度、更高的抗癌活性 和更低毒性的新化合物。发明内容
本发明目的之一在于公开一类具有蛋白激酶选择性抑制活性和同时具有组蛋白 去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚满酮衍生物；
本发明目的之二在于公开这一类所述的化合物的制备方法；
本发明目的之三在于公开这一类所述的化合物作为治疗与蛋白激酶活性异常以 及组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病方面的临床应用。
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)蛋白在调控体内的基因表达方面起着关键作用， 它改变转录因子结合到染色体组DNA的可达性。尤其是HDAC能去除组蛋白中乙酰 化赖氨酸残基的乙酰基，从而导致核小体重构(Granstein，M.，1997，Nature, 389 349-352)。由于HDAC蛋白在基因表达中起着关键作用，所以它们与许多细胞功能密 切相关，包括细胞周期调控、细胞增殖、分化、基因程序化表达和癌症发生(Ruijter， A-J-M., 2003，Biochem.J., 370 737—749; Grignani, F., 1998，Nature, 391 815-818 ； Lin, R-J.，1998，391 811—814; Marks, P-A., 2001，NatureReviews Cancer, 1: 194)。由组蛋白去乙酰化酶误调所致的异常去乙酰化与许多临床疾病密切 相关，如鲁-泰(Rubinstdn-Taybi) 二氏综合征、脆性X染色体综合症、白血病和其它各 种癌症(Langley B et al.，2005，Current Drag Targets—CNS&Neurological Disorders, 4 41-50)。试验表明，HDAC抑制剂能够抑制人类及动物体内的肿瘤的生长，包括肺癌、 胃癌、乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤等(Dokmanovic，M.，2005，J.Cell Biochenm., 96: 293-304)。
组蛋白去乙酰化酶活性异常与各种神经系统疾病及神经退化疾病密切相关，包 括中风、亨廷顿舞蹈(Huntington)疾病、肌萎缩侧索硬化(AmyotrophicLateral Sclerosis) 和阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease)。抑制组蛋白去乙酰化酶能够诱导抗有丝分裂和 抗凋亡基因的表达，如p21和HSP-70，有利于正常细胞的存活。HDAC抑制剂也能够作 用于中枢神经系统的其他神经细胞，如反应性星形胶质细胞和小神经胶质细胞，降低在 神经损伤或疾病中的炎症和二次伤害。通过HDAC抑制剂增加乙酰化，可以诱导树突发 芽(突触数量增加)，重建学习行为，进入长期记忆。HDAC抑制剂可以逆转弗里德赖希 共济失调症(Friedreich’ s ataxia)的基因沉默。这些数据表明，HDAC抑制是一种极具希 望的治疗许多中枢神经系统疾病的方法(Langley B etal.，2005，Current Drag Targets-CNS & Neurological Disorders, 4 41-50; FischerA., et al, 2007, Nature 447 (10) 178-183 ； Herman D.，etal., 2006，Nature Chemical Biology 2 (10) 551-558)。
依据序列同源性，哺乳动物的HDACs可以分为三类。第一类由酵母Rpd3_类 蛋白组成(HDAC 1，2，3，8和11)。第二类由酵母HDAl-类蛋白组成(HDAC 4，5， 6，7，9和10)。第三类由酵母SIR2-类蛋白组成6IRT 1，2，3，4，5，6和7)。
HDACl的活性和细胞增殖(癌症的标志)相关。哺乳动物细胞通过SiRNA降 低 HDACl 表达，具有抗增殖性(Glaser，K-B., 2003，Biochem.Biophys.Res.Comm., 310 529-536) 0 HDACl基因敲除鼠是胚胎致死的，其余细胞表现出不一样的细胞生长 (Lagger，G.，2002，EMBO J., 21:洸72_2681)。HDACl 过度表达的老鼠细胞显示 G2 和 M 期延长及生长速度降低(Bartl.S.，1997，Mol.Cell Biol.，17:5033-5043)。因此， 试验数据表明，HDACl与细胞周期调控及细胞增殖密切相关。
HDAC2调控许多胎心肌蛋白异构体的表达。HDAC2缺乏或是通过化学方法抑 制组蛋白去乙酰化酶可以阻止胚胎基因的再表达，减少心室肥大。抗肥大和肌醇多磷酸 盐-5-磷酸酶f(Inpp5f)编码基因表达增加有关，这种增加导致胸腺瘤滤过性病毒的原癌 基因(Akt)和3-磷酸肌醇-依赖的蛋白激酶-1失活，激活了糖原合成酶激酶3 (Gsk3)。 相反，HDAC2转基因鼠心室肥大增加，这与失活的Gsk3i3有关。通过化学方法抑制 活化的Gsk3i3使得HDAC2-缺乏的成人对心室肥大的刺激变得敏感。这些结果表明， 在心脏中HDAC2是HDAC抑制剂的一个重要的分子靶标。HDAC2和Gsk3 β都是调控 通路的组成部分，这为治疗心室肥大和心力衰竭提供了极具吸引力的治疗靶标(Trivedi， C-M.，2007，Nat.Med，.13 324-331)。
HDAC3在正常小肠的增殖隐窝细胞中表达最多。在结肠癌细胞系中HDAC3表 达沉默导致细胞生长抑制、细胞存活降低和细胞凋亡增加。沉默HDAC2表达可以观察到 类似的效果，而对于HDAC1，效果则没有那么显著。HDAC3基因沉默也选择性的引起 碱性磷酸酯酶的表达(结肠细胞成熟的标志)。HDAC3的过度表达抑制基础转录及丁酸 酯诱导的P21转录，而沉默HDAC3则刺激P21基因启动子的活性和表达。这些发现表 明HDAC3是在人体结肠癌中进行下调的基因，是结肠细胞成熟和P21表达的一种新型的 调节剂(Wilson，A-J.，2006，J.Biol.Chem.，281 13548-13558)
HDAC6是HDAC家族的一个亚型，它脱去_微管蛋白的乙酰基，增加细胞运动 性。在九组口腔鳞状细胞癌(OSCC)的细胞系和正常的口腔角化细胞(NOKs)上运用定量 实时逆转录聚合酶链反应和Western Blots技术分析，与NOKs相比，HDAC6mRNA和蛋 白表达水平在所有的癌细胞中都升高了。通过免疫荧光法分析，在OSCC细胞系的细胞 质中检测到了 HDAC6蛋白。和OSCC细胞系相似，在早期的人体OSCC肿瘤中HDAC6 上调明显，mRNA达74%，蛋白达51%。通过对临床变量的分析，人们发现临床肿瘤 的发展阶段和HDAC6的表达状态相关。分析表明，HDAC6的表达水平在肿瘤早期(I和 II期)和晚期(III和IV期)存在显著差异(P = 0.014)。这些结果表明HDAC6的表达 可能和肿瘤的恶性程度有关，这也为设计新的治疗方法提供了线索Makuma，T.，2006， Int.J.Oncol., 29: 117-124)。
IIa类HDAC包括HDAC4，5和7。在过去几年中，研究人员确定了 IIa类HDAC在活体中的一些重要生理功能。令人吃惊的是，这些看似没有联系的生理过程有着共同 的特征，它们都依赖于na类HDAC对MEF2转录活动的严密控制。诸如骨骼肌的形成、 心肥大、骨发育、T-细胞分化和神经元存活等关键生理过程都被ILi类HDAC所控制，这7一事实意味着许多人类病理学的干预疗法是有可能的，包括血管类疾病如动脉硬化、中 风和动脉瘤、肿瘤血管生成和转移、侏儒症、骨骼畸形、自身免疫和淋巴增生综合征、 神经退化性疾病和心肌肥大(Martin M.etal，2007, Oncogene 26 5450-5467)。
HDAC使功能染色体表观基因沉默是许多病理过程的主要机制之一。其中，功 能相关基因被HDAC抑制或重调，导致在终末分化、成熟和生长控制中表型缺失，并且 丧失组织功能。例如，肿瘤抑制基因经常在癌症的发展过程中被沉默，HDAC抑制剂能 够诱导这些肿瘤抑制基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生长和分化(Glaros Setal.，2007， Oncogene June 4Epub aheadof print ； Mai, A, etal.，2007, Int J.Biochem Cell Bio., April 4, Epub ahead ofprint ； Vincent A. et al.，2007, Oncogene, April 30, Epub ahead of print ； our unpublished results)。结构基因(如与Friedreich，s运动失调相关的FXN基因和与脊 柱肌肉萎缩相关的SMN基因)的抑制可以被HDAC逆转，使得FXN和SMN基因重新表 达，并恢复组织功能(HermanD etal.，2006，NatureChemical Biology, 2(10) 551-8 ； Avila AM et al.，2007，J Clinic Investigation, 117(3)659-71 ； deBore J, 2006，Tissue Eng.l2(10):四27-37)。HDAC抑制剂在染色体6p21_22重调HDAC “热点”程序， 诱导了整个MHC II家族基因表达，进一步延伸了免疫识别和免疫响应的表观基因调控 (Gialitakis Metal.，2007，Nucleic Acids Res.，34(1) ； 765-72)。
目前已经确定了几类HDAC抑制剂，包括1)短链脂肪酸，如丁酸和苯丁酸； 2)有机羟肟酸，如 suberoylanilide hydroxamic acicKSAHA)禾Π trichostatin A(TSA) ； 3)含 有2-胺基-8-氧-9，10-环氧癸酰基(AOE)的环四肽，如trapohn和HC-tohn ； 4)不 含2-氨基-8-氧-9，10-环氧癸酰基的环四肽，如apicidin和FK228 ； 5)苯酰胺类，如 M8-275(欧洲专利 EP0847992A1，美国专利 2002/0103192A1，世界专利 02/26696A1，世 界专利01/70675A2，世界专利01/18171A2)。尽管HDAC是一个极具前景的药物靶标， 但目前Merck公司研制的SAHA仅仅局限于对皮肤T细胞淋巴瘤的治疗，而对实体瘤疗 效并不明显。因此，有必要继续研制新的化合物，使其具有更强的HDAC抑制活性、更 强的抗癌活性、更好的HDAC亚型选择性和更低的毒性。
靶向治疗一直为抗癌药物研发人员所推崇。人们希望设计药物，它既能准确的 到达肿瘤细胞的某个特定靶标并杀死肿瘤细胞，同时又对正常细胞又没有伤害。然而， 肿瘤细胞能够运用多种生物引发器和通路来进行生长和传播。在一个靶点对肿瘤细胞进 行打击，它们会沿着新的生长通路重组和重新部署。由此人们发展了组合靶向治疗，并 正在成为癌症治疗的新范例。几个多靶点激酶抑制剂现正在研发中，其中Sorafenib和 Sutent已经在美国获得批准上市。Sorafenib (Bayer公司开发)是第一个同时以RAF/MEK/ ERK通路(与细胞增殖有关)和VEGFR2/PDGFRi3级联信号通路(与血管生成有关)为 靶点的药物，该药在2005年12月获得批准用于治疗晚期肾癌。尽管这些靶向治疗药物 在治疗一些实体瘤时是有效的，但是在治疗其它实体瘤时，疗效并不理想且具有毒副作 用。
本发明所述的化合物，结合了 RTK抑制剂的抗血管生成和抗增殖活性以及 HDAC抑制剂的所具有的诱导分化、免疫调制、阻碍细胞周期、促使细胞凋亡的活性， 旨在对实体瘤具有更好的疗效，同时克服市售的RTK抑制剂的毒副作用，如高血压、QT 间期延长、甲状腺退化、皮疹和皮肤变色、疼痛等。8
本发明所述的化合物，其化学结构如通式⑴所示
权利要求
1. 一种具有通式⑴的2-吲哚满酮衍生物
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物为 X 为=CH-或=N-N = CH-；R1 > R2> R3和R4分别为氢或卤素； R5> R6> R7和R8分别为氢或卤素； η为2到6的整数。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物为 X 为
4.通式⑴的化合物的制备方法，该方法包括如下步骤 (a)将6-氯烟酸与化合物1进行缩合反应得到化合物2 ；(b)将化合物2与化合物3进行缩合反应得到化合物4 ；
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于反应步骤(a)和(C)均使用肽缩合剂 作催化剂。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述肽缩合剂选自1-乙基-3-(3-二 甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)，N，N，-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N，-碳酰二 咪唑(CDI)。
7.—种用于治疗与蛋白激酶活性异常或组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病的药 用制剂，其特征在于该制剂包括作为活性组分的权利要求1所述通式⑴的化合物以及 药用载体、辅料或稀释剂。
8.如权利要求7所述的药用制剂，其特征在于所述药用制剂的规格为0.0001 200mg。
9.如权利要求7所述的药用制剂，其特征在于所述药用制剂为片剂、胶囊、粉 剂、糖浆、液剂、悬浮剂或针剂。
10.如权利要求1所述的化合物在制备用于治疗炎症、自身免疫性疾病、癌症、神经 系统疾病和神经退化性疾病、过敏、哮喘、心血管疾病或与激素相关的疾病的药物中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的2-吲哚满酮衍生物、其制备方法及应用，其结构如通式(I)所示，其中，X、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和n的定义同说明书。该类化合物同时具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性，可以用于治疗与蛋白激酶活性异常或组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病，包括炎症、自身免疫性疾病、癌症、神经系统疾病和神经退化性疾病、心血管疾病、过敏、哮喘以及与激素相关的疾病。
文档编号A61P35/00GK102020638SQ20091017647
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者余金迪, 吴仲闻, 宁志强, 山松, 李志斌, 王祥辉, 马保顺, 鲁先平 申请人:深圳微芯生物科技有限责任公司
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