一种山药多糖提取物及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：一种山药多糖提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属食品、天然产物的加工提取与分离
技术领域：
，涉及一种食品、天然药物山药的多糖提取物，及其制备方法和用途。
背景技术：
：山药为薯蓣科多年生缠绕草本植物山药DioscoreaoppositeThunb.的块根。山药具有补脾、养肺、固肾、益精的作用。《神农本草经》列为上品。言其"主伤中补虚赢，除寒热邪气，补中益气力，长肌肉。久服耳聪目明，轻身不饥延年。"《本草纲目》云"山药性温味甘平无毒，健脾胃，益肺肾，止泄痢，化痰涎，润皮毛"。主治脾虚泄泻、久痢、虚痨咳嗽、消渴、遗精带下、小便频数等症。山药多糖可不同程度地提高T淋巴细胞的增殖能力、NK细胞活性、血清溶血素活性、血清IgG含量，也能增强巨噬细胞的吞噬能力。因此，山药多糖具有明显的抗肿瘤、增强免疫调节和抗突变的作用；既具有非特异性免疫功能，又具有提高特异性细胞免疫和体液免疫功能；对全面改善机体的免疫功能具有重要的意义。山药能供给人体大量的黏液蛋白，这是多糖与蛋白质相结合的复合物，能预防心血管系统的脂肪沉积，保持血管的弹性，防止动脉粥样硬化的发生，减少皮下脂肪沉积，避免出现肥胖。还能防止肝脏和肾脏结缔组织的萎縮、保持消化道、呼吸道及关节腔的润滑。山药中的黏多糖与无机盐结合后可以形成骨质，增强软骨的弹性。山药多糖对糖尿病的治疗作用与增加胰岛素分泌、改善受损的胰岛e细胞功能有关；体外实验证明，山药还可作为抗癌作用的扶正药，这可能与其具有很强的免疫调节功能有关(程林等，正交实验法优选山药多糖的提取工艺，中国药物与临床，2005，5(9)〕。从中医理论来讲，糖尿病表现为气阴两虚、痰浊瘀血、脉络瘀阻。山药为常用中药，药用历史悠久，其主要功效为健脾养胃、生津益肺、补肾涩精，是中医治疗"消渴证"的主要药物之一。(张忠泉等，山药多糖对大鼠血糖及胰岛释放影响的研究，上海中医药杂志，2003，37(10))。糖尿病是由胰岛素分泌不足或胰岛素受体不敏感导致的，以高血糖伴高血脂为主要特征的代谢性疾病，它可引起眼、肾脏、神经、心脏和血管的相关病变。据世界卫生组织报道，全球约有1.8亿糖尿病患者，而中国就有约6000万，其中80%为11型糖尿病，预计全球到2025年将突破3亿。糖尿病成为一种严重危害人类健康的非传染性慢性疾病，巳成为世界各国关注的重大公共卫生问题，也成为我国主要的公共卫生问题。口服西药治疗糖尿病虽然具有明确的降血糖作用，但由于西药具有明显的副作用、不便长期使用等难以克服的缺点。山药多糖对糖尿病的治疗具有既能增强免疫力，又能辅助降血糖的作用，长期服用没有任何副作用。由于糖尿病数量巨大，且为一种终生疾病，需要终生使用降血糖的药物或辅助降血糖的保健食品。所以从中草药、食品等天然产物中寻找有效治疗糖尿病的药物、保健食品，市场前景十分广阔。以往山药多糖大多按中药传统的方法，以山药饮片用水煎煮提取，山药多糖的提取率很低，而且山药提取物中存在大量的山药淀粉，因而难以准确测定山药提取物中多糖的含量，产品质量难以监控。除上述传统方法外，现有技术中有文献披露了山药多糖提取物的制备方法，一种方法是用山药粉水煎、过滤、浓缩，醇沉、离心得醇溶部分和醇沉部分，醇沉部分用水溶解，离心除去不溶物，水溶液用1%CTAB(十六垸基三甲基溴铵盐)溶液沉淀，上清液95%乙醇沉淀，沉淀经水溶后再沉淀，冷冻干燥得到中性多糖部分(SUP);CTAB沉淀用4mol/LNaCl溶解，离心除去不溶物，适当浓縮后用95%乙醇沉淀，沉淀经冷冻干燥得到酸性多糖部位(PPT)，SUP经S印hadexG-100凝胶层析。(山药多糖的提取分离和结构测定，天然葯物，2003,1(3))。该法工艺繁杂，没有报道山药多糖的得率及含量，没有说明山药多糖中是否含淀粉；用葡聚糖凝胶(S印hadexG-100)柱层析，葡聚糖凝胶材料十分昂贵，CTAB(十六烷基三甲基溴铵盐)有毒，不可用于食品加工，因此该方法难以实现工业化生产。另一种文献报导，将干燥的山药粉碎成40目，石油醚9(TC脱脂1次，80%乙醇90"提取2次，6064。C水提取2次，过滤，真空浓縮，加95%的乙醇(使乙醇浓度达70%以上)析出多糖，用无水乙醇洗涤多次，多糖再溶入水，冷冻干燥即得山药粗多糖。然后用Sevage(氯仿+正丁醇)法去除山药粗多糖中的蛋白质。(山药水溶性多糖提取工艺的研究，食品与机械，2006，22.(2)〕。该法山药粗多糖含量4757%，得率9.517%。由于该法石油醚90。C脱脂，80%乙醇90°〇提取，6064'C水提取，在这样的温度条件下山药多糖提取物中必然会混杂大量淀粉，而且难以除去，导致山药粗多糖提取物的多糖含量测定数据严重偏高，因此作者没有提及山药粗多糖中是否含淀粉。用Sevage法去蛋白，氯仿毒性大，不可用于食品加工。用石油醚脱脂，易燃易爆。该方法工艺繁杂，同样也难以实现工业化生产。还有一种文献方法将鲜山药浆料经石油醚回流脱脂，过滤，滤液回收石油醚。滤渣用80%的乙醇溶液浸泡过夜，回流提取。将滤渣加蒸馏水，5(TC热提，滤液减压浓缩，Sevage法脱蛋白，加活性炭脱色，离心，滤液加95%乙醇，4-C静置过夜。离心，沉淀物用无水乙醇、丙酮、无水乙醚多次洗涤，真空干燥得精制山药多糖(山药粗多糖的提取工艺，食品与生物技术学报，2006,25(3))。该法直接用鲜山药提取，以鲜山药计粗多糖得率仅为0.2449%(以干山药计粗多糖得率约为1.7143%)，得率低，没有披露山药多糖的含量；用Sevage法(氯仿+正丁醇)脱蛋白，丙酮、无水乙醚洗涤，溶剂毒性大、易燃易爆，成本高；用Sevage法脱蛋白，同时也脱除了具有生物活性的糖蛋白(复合多糖)；该方法工艺繁杂，同样难以实现工业化生产。
发明内容本发明的目的在于提供一种山药多糖提取物的制备方法，能够改变传统的山药饮片用水煎煮提取的方法，制取山药多糖提取物；克服现有技术中山药多糖提取方法所存在的工艺繁杂，使用有毒溶剂氯仿以及正丁醇、丙酮、石油醚或乙醚等易燃易爆溶剂，以及所用葡聚糖凝胶(S印hadexG-100)材料十分昂贵等缺点；解决现有的山药多糖提取物中存在大量山药淀粉、山药多糖含量低及收率低等技术问题。本发明的另一目的在于提供一种不含淀粉的山药多糖提取物。本发明的目的还在于提供所述山药多糖提取物用于制备具有降血糖、增强免疫力作用的药品或保健食品的用途。本发明所采用的技术方案如下一种山药多糖提取物的制备方法，其特征在于将干山药片粉碎成200目以上的山药粉，用山药粉重量210倍的40%95%乙醇水溶液，加热回流提取；乙醇提取液离心分离，沉渣加重量为520倍的水搅拌并用胶体磨研磨，加热回流提取；水提取液离心分离，上清液减压浓缩制得720波美度的流浸膏；加入流浸膏容积210倍量的95%乙醇醇沉后离心分离；沉渣加210倍重量的水搅拌溶解、离心分离；上清液干燥后制得山药多糖提取物。所述的加热回流提取，提取温度为4(TC6(TC，提取时间15小时；提取操作13次。所述的减压浓縮，其浓縮温度为50'C70'C。所述的干燥可采用喷雾干燥、真空微波干燥或真空冷冻干燥中的一种干燥方法。以干山药计，山药多糖提取物产品得率为1019%。本发明还涉及一种山药多糖提取物，其特征在于采用上述方法制备。所述的山药多糖提取物，其主要组分为多糖及矿物质、蛋白质等；其中多糖质量百分含量为3061%。所述的山药多糖提取物，不含淀粉。多糖提取物经碘试剂鉴别反应呈阴性，表明其中不含淀粉。不含淀粉的山药多糖提取物，多糖含量测定数据准确可靠。目前市场上未见所述的不含淀粉的山药多糖提取物。本发明还涉及所述的山药多糖提取物用于制备具有降血糖、增强免疫力作用的药品或保健食品的用途。所述的山药多糖提取物，其多糖含量高，具有显著的辅助降血糖、增强免疫力的保健功能，且在制备过程中不使用有毒溶剂，产品安全性高，可用于制备具有降血糖、增强免疫力作用的医药、保健食品。本发明的山药多糖提取物的制备方法，与现有技术相比，山药多糖含量高，产品收率高，生产工艺简化，可实现工业化生产。本发明的方法及所制得的产品，还具有以下技术效果1、本发明的制备方法不使用有毒、易燃、易爆等溶剂，生产安全性高，产品安全性高；2、本发明的制备方法，其生产过程不产生有害废水、废渣、废气等污染物；3、本发明的山药多糖提取物其多糖含量高，具有显著的辅助降血糖、增强免疫力的保健功能，可用于医药、保健食品等行业。下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。本发明的范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求的范围加以限定。具体实施例方式实施例1山药片粉碎成200目以上的山药粉；80%乙醇水溶液250L加入500L反应锅中，开动搅拌后再加入山药粉50kg，加热回流提取2小时，温度5(TC;离心分离，沉渣加250L水搅拌，用胶体磨研磨制成山药浆；用泵将山药浆输入提取罐中，加500L水，开动搅拌加热回流提取3小时，温度5(TC;水提取液离心分离，上清液6(TC减压浓縮，制得波美度为7的流浸膏；流浸膏加容积210倍量的95%乙醇醇沉，醇沉液离心分离；沉渣加210倍重量的水搅拌溶解，离心分离；上清液真空冷冻干燥，得到山药多糖提取物6.4kg;以干山药计，产品得率12.80%。所制得的山药多糖提取物，其主要组分为多糖60.63%，还含有矿物质、蛋白质等组分。所制得的山药多糖提取物，不含淀粉。取浓度为0.06%山药多糖提取物水溶液5滴，置于白瓷板中，加l滴碘试剂后不变蓝色，即多糖提取物碘试剂鉴别反应为阴性，表明其中不含淀粉。以0.06%可溶性淀粉作为对照。实例2山药片粉碎成200目以上的山药粉；85%乙醇水溶液500L加入1000L反应锅中，开动搅拌后再加入山药粉100kg，加热回流提取4小时，温度40。C;离心分离，沉渣加500L水搅拌，用胶体磨研磨制成山药浆；用泵将山药浆输入提取罐中，加1000L水，开动搅拌加热回流提取4小时，温度4(TC;水提取液离心分离，上清液7(TC减压浓縮，制得波美度为20的流浸膏；流浸膏加容积210倍量的95%乙醇醇沉，醇沉液离心分离；沉渣加2IO倍重量的水搅拌溶解，离心分离；上清液喷雾千燥，制得山药多糖提取物10.8kg;以干山药计，产品得率10.80%。所制得的山药多糖提取物，其主要组分为多糖36.61%，还含有矿物质、蛋白质等组分。所制得的山药多糖提取物，不含淀粉。本发明实例2山药多糖提取物经动物功能试验，证明具有显著的辅助降血糖的保健功能。1材料l.l受试样品实施例2所得的山药多糖提取物，为灰白色粉末状。1.2试验动物选用清洁级BI/Fi代健康雄性小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供1.3剂量设三个剂量组，即低剂量、中剂量、高剂量组，另设一个对照组。受试样品用无菌水配制，髙、中、低剂量，对照组用无菌水代替受试样品，小鼠灌胃量为10mL/kg.bw。2.试验方法按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)之辅助降血糖功能检验方法进行。2.1高血糖动物模型试验第一期为小鼠糖尿病模型制造期选用体重2426g的BI/Fi代健康雄性小鼠，在实验室检疫3日后，禁食24h，不限制饮水，用新鲜配制的四氧嘧啶以160mg/kg.bw剂量腹腔注射，l周后禁食5h，不限制饮水，测空腹血糖，以血糖1025mmol/L作为高血糖模型小鼠。第二期为高血糖模型小鼠降血糖试验期选用高血糖模型小鼠80只，根据血糖值的水平随机分为8组，每组10只，其中4组作为I组，剂量分别为对照组、低剂量、中剂量、高剂量组，进行空腹血糖测定；另4组作为II，剂量分别为对照组、低剂量、中剂量、高剂量组，进行糖耐量测定。经口每曰一次给予小鼠相应剂量的受试样品，对照组以无菌水代替受试样品，连续1个月。试验结束时进行小鼠空腹血糖及糖耐量测定。2.2指标与方法在不麻醉的状态下，采集小鼠眼眶内眦静脉血，进行下列指标测定。2.2.1空腹血糖测定小鼠禁食5h，不限制饮水，采集眼眶内眦静脉血，取血清用葡萄糖氧化酶一过氧化物酶法用721分光光度计进行血糖测定。在模型成立的前提下，受试样品剂量组与对照组比较，空腹血糖实测值降低或血糖下降百分率有统计学意义，可判定该受试样品降空腹血糖实验结果阳性。2.3.2糖耐量测定小鼠禁食5h，不限制饮水，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，20分钟后经口给予葡萄糖2.0g/kg,分别测定给葡萄糖后O、0.5、2h的血糖值，血糖测定方法同2.1.1。在模型成立的前提下，受试样品剂量组与对照组比较，在给葡萄糖后0、0.5、2h血糖曲线下面积降低有统计学意义，可判定该受试样品糖耐量实验结果阳性。2.4.结果判定空腹血糖及糖耐量二项指标中一项指标阳性，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。3结果3.1山药多糖提取物对四氧嘧啶引起的高血糖模型小鼠血糖的影响3.1.1山药多糖提取物对四氧嘧啶引起的高血糖模型小鼠空腹血糖的影响结果见表1:表1山药多糖提取物对高血糖模型小鼠空腹血糖(mmol/L)的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可见，高血糖模型小鼠血糖的试验前空腹血糖低剂量、中剂量、高剂量组与对照组Omg/kg相比较，差异无统计学意义。即小鼠的试验前空腹血糖在各组间较为均衡。经口给予小鼠不同剂量的山药多糖提取物1个月，所测定的各剂量组小鼠空腹血糖及血糖下降百分率进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表i结果可见高剂量组小鼠试验后空腹血糖显著低于对照组。3.1.2山药多糖提取物对四氧嘧啶引起的高血糖模型小鼠糖耐量的影响结果见表2:表2山药多糖提取物对高血糖模型小鼠糖耐量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>经口给予小鼠不同剂量的山药多糖提取物1个月，所测定的各剂量组高血糖模型小鼠血糖曲线下面积进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表2结果可见高剂量组小鼠血糖曲线下面积显著低于对照组。4.结论用四氧嘧淀引起的高血糖模型小鼠评价了山药多糖提取物辅助降血糖的作用。山药多糖提取物以低剂量、中剂量、高剂量连续给予高血糖模型小鼠1个月。结果显示高剂量组小鼠试验后空腹血糖及血糖曲线下面积显著低于对照组。表明山药多糖提取物具有辅助降血糖的功能。本发明实例2山药多糖提取物经动物功能试验，还证明具有显著的增强免疫力的保健功能。1.ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验结果表明山药多糖提取物在中剂量组、高剂量组时，具有增强细胞免疫功能的作用。结果见表3:表3山药多糖提取物对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验的影响组别动物数(只)加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值0100.028±0.005低剂量100.032±0.005中剂量100.040±0.011*高剂量100.042±0.014**Dunnett'st检验，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)2.二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应试验(耳肿胀法)结果表明山药多糖提取物在中剂量组、高剂量组时，具有增强细胞免疫功能的作用。结果见表4:表4山药多糖提取物对二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应的影响(均值土标准差)组别动物数(只)耳片重量差值(mg)010U.3士2.7低剂量1013.4±2.1中剂量1017.1±2.8*高剂量1018.5±2.5**DunneU'st检验，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)3.抗体生成细胞检测试验(Jerne改良玻片法)结果表明山药多糖提取物在中剂量组、高剂量组时，具有增强体液免疫功能的作用。结果见表5:表5山药多糖提取物对溶血空斑数的影响(均值士标准差)组别动物数(只)溶血空斑数(个/106脾细胞)010187土26低剂量10197±22中剂量10217±20*高剂量10239±14**Dunnett'st检验，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)4.血清溶血素的测定(血凝法)结果表明山药多糖提取物在高剂量组时，具有增强体液免疫功能的作用。结果见表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*Dunnett'st检验，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)5.小鼠碳廓清试验结果表明山药多糖提取物各剂量组小鼠单核吞噬细胞吞噬能力与阴性对照组一致。结果见表7:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*Dunnett'st检验，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)6.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果表明山药多糖提取物在中剂量组、高剂量组时，具有增强小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用。结果见表8:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*Dunnett'st检验，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)7.NK细胞活性测定试验(乳酸脱氢酶测定法)结果表明山药多糖提取物在中剂量组、高剂量组时，具有增强NK细胞活性的作用。结果见表9:表9山药多糖提取物对NK细胞活性的影响(均值土标准差)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*Dunnett'st检验，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)8.结论本发明方法制成的山药多糖提取物ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验结果表明，中剂量组、高剂量组时，具有增强小鼠细胞免疫功能的作用；二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应试验结果表明，中剂量组、高剂量组时，具有增强小鼠细胞免疫功能的作用；抗体生成细胞检测试验结果表明，中剂量组、高剂量组时，具有增强小鼠体液免疫功能的作用；血清溶血素的测定结果表明，中剂量组、高剂量组时，具有增强小鼠体液免疫功能的作用；小鼠碳廓清试验结果表明，各剂量组小鼠单核吞噬细胞吞噬能力与阴性对照组一致；小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果表明，中剂量组、高剂量组时，具有增强小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用；NK细胞活性测定试验(乳酸脱氢酶测定法)结果表明，中剂量组、高剂量组时，具有增强M细胞活性的作用。该山药多糖提取物具有增强免疫力的保健功能，可作为具有增强免疫力的保健食品。权利要求1、一种山药多糖提取物的制备方法，其特征在于将干山药片粉碎成200目以上的山药粉，用山药粉重量2～10倍的40％～95％乙醇水溶液，加热回流提取；乙醇提取液离心分离，沉渣加重量为5～20倍的水搅拌并用胶体磨研磨，加热回流提取；水提取液离心分离，上清液减压浓缩制得7～20波美度的流浸膏；加入流浸膏容积2～10倍量的95％乙醇醇沉后离心分离；沉渣加2～10倍重量的水搅拌溶解、离心分离；上清液干燥后制得山药多糖提取物。2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的加热回流提取，提取温度为40°C60°C，提取时间15小时；提取操作13次。3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的减压浓縮温度为50'C7(TC。4、根据权禾展求1所述的制备方法，其特征在于所述的干燥采用喷雾干燥、真空微波干燥或真空冷冻干燥。5、一种根据权利要求1所述的方法制备的山药多糖提取物。6、根据权利要求5所述的山药多糖提取物，其特征在于提取物中多糖质量百分含量为30%61%。7、根据权利要求5所述的山药多糖提取物，其特征在于所述的山药多糖提取物不含淀粉。8、权利要求5所述的山药多糖提取物用于制备具有降血糖、增强免疫力作用的药品或保健食品的用途。全文摘要本发明公开了一种山药多糖提取物及其制备方法和用途。将原料干山药片粉碎、乙醇提取后离心分离，沉渣加水搅拌、胶体磨研磨后水提取、离心分离，上清液减压浓缩制得流浸膏，流浸膏经醇沉、离心分离，沉渣加水搅拌溶解、离心分离，上清液干燥制得山药多糖提取物；得率为10～19％。本发明的山药多糖提取物不含淀粉，其主要组分多糖质量百分含量达30～61％。所述的山药多糖提取物具有辅助降血糖、增强免疫力的保健功能，可用于制备降血糖、增强免疫力的药品或保健食品。文档编号A61K36/88GK101628070SQ20091018300公开日2010年1月20日申请日期2009年8月4日优先权日2009年8月4日发明者冰夏,庞自洁,张宗和,浩徐,杨如同,潘福生,清秦,赵爱明,林陶,黄嘉玲申请人:江苏省中国科学院植物研究所;南京龙源天然多酚合成厂