用非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂刺激软骨生长的制作方法
专利名称：用非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂刺激软骨生长的制作方法
政府支持本发明整体或部分得到国家健康研究院/国家关节炎和粘膜骨架和皮肤疾病研究院的1 R43 AR463343-01的资金资助。政府在本发明中有一些权利。相关的申请本申请书要求了2000年7月20日递交的美国临时申请号60/219,800的权益，该申请的整个内容通过在此引证而合并于本文。
发明概述现在已经发现，从关节软骨分离的软骨细胞是应答非蛋白质水解凝血酶细胞表面受体(下文中称为“NPAR”)的化合物的。例如，软骨细胞的每个细胞约表达233,000个凝血酶结合位点，表观亲和力约为0.1nM(3000个位点)和27nM(230,000个位点)(实施例1)。另外，化合物TP508，非蛋白质水解凝血酶受体的激动剂在存在作为辅助有丝分裂原的凝血酶时，在培养物中刺激小牛软骨细胞的增殖，并且其自身刺激在三维基质的培养中培养的大鼠软骨细胞的增殖(实施例3A)。这一相同的TP508化合物也刺激糖蛋白的合成，如在小牛软骨细胞中掺入35S硫酸盐(实施例2B)和大鼠软骨细胞的3维培养(实施例3B)。这些体外实验证明，NPAR激动剂可以刺激从关节的软骨分离的软骨细胞中的增殖和基质的产生。其他的体内实验证明，将持续释放配方的TP508递送到大鼠滑车神经沟软骨缺陷处，扩展到下软骨能够修复软骨缺陷，包括下软骨的修复，正常软骨表面的恢复和新形成的软骨与未损伤的缺陷区的软骨外侧的整合(实施例5)。
根据前面的章节中报道的结果，本文公开了在受试者中刺激体内软骨细胞生长和软骨修复的方法，和将药物组合物递送到关节缺陷处辅助表面的修复和防止关节退化的新递送方法。
本发明是在需要软骨生长，修复或再生的受试者中，在有关位点刺激软骨生长，再生或修复的方法。该方法包括对损伤的位点给药治疗有效量的非蛋白质水解激活凝血酶受体的激动剂的步骤。
本发明的另一个实施方案是在体外刺激软骨细胞的增殖和扩展的方法。该方法包括在存在刺激NPAR激动剂的量时培养软骨细胞。本发明的详细说明在有骨关节炎的受试者中发现了需要软骨生长，修复或再生的位点。骨关节炎或退化性关节疾病是慢发展的，不可逆的，经常性的单关节疾病，特征是疼痛和失去功能。疼痛和虚弱的原因是软骨退化，这是该疾病的一个主要的症状。透明的软骨是灵活的组织，覆盖在骨的末端，位于关节之间，如膝盖中。同时，在沿着脊柱的骨之间也有发现。软骨是光滑的，允许稳定，灵活地运动，并且摩擦最小，但同时也抵抗压力和能够瓦解施加的负载。由于骨关节炎的发展，软骨的表面和暴露的下面的骨变得不规则。不是光滑地摩擦，骨关节炎表面相互摩擦，导致僵硬和疼痛。损伤的软骨的退化和这些关节位点的新的软骨的生长将缓解疼痛并且恢复与骨关节炎相关的功能的丧失。
软骨损伤也可以发生在创伤和外科手术导致的损伤中。运动损伤是软骨损伤的常见原因，特别是膝盖这样的关节中。对软骨的损伤可以导致相同类型的功能的损伤。所以，在软骨已经被创伤或疾病损伤的受试者中的位点需要恢复或促进软骨的生长的治疗。
申请人已经发现，刺激或激活非蛋白质水解激活的凝血酶受体(下文中的“NPAR”)的化合物可以刺激软骨细胞繁殖。软骨细胞是构成软骨的1％体积的细胞，它们可以替代已降解的基质分子维持准确的体积和组织的机械特性。申请人也已经发现，刺激或激活NPAR的化合物刺激软骨细胞中的糖蛋白的合成。糖蛋白是主要的软骨的成分。根据这些结果，申请人递送制备成持续释放配方的NPAR激动剂TP508到兔子的滑车神经沟软骨的缺陷处，并且发现该肽刺激缺陷的修复，包括在正常软骨表面的形成新软骨。该肽同时也刺激将这一新软骨放置和整合进邻近的，未受损的软骨和恢复软骨下的骨。结论是，当对需要软骨生长和/或修复的位点给药时，NPAR激动剂可以诱导软骨的生长和/或修复。
刺激或激活NPAR的化合物是NPAR激动剂。NPAR是大多数细胞的表面上存在的高亲和力凝血酶受体。NPAR很大程度上负责凝血酶，蛋白质水解激活的凝血酶和凝血酶派生的肽对细胞的高亲和力结合。NPAR激动剂和激抗剂可以竞争凝血酶与细胞的亲和性结合(参见例如，Glenn et al.，肽研究杂志，165(1988))。NPAR似乎是介导了不依赖蛋白质水解活性的凝血酶启动的许多细胞信号的。一个这样的信号的例子是消减杂交鉴定的附加物V和其他分子的上调(参见Sower，et al.，实验细胞研究247422(1999))。所以，NPAR的特征是，在细胞表面它与凝血酶有高的亲和反应，和它受凝血酶的蛋白质水解失活衍生物和如下所述的凝血酶派生肽激动剂的激活。根据激动剂在加入到成纤维细胞中时，在存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的分子时，刺激细胞繁殖的能力可以测试NPAR的激活，如美国专利号，5,352,664和5,500,412中公开。
NPAR有待于与其他凝血酶结合蛋白质和凝血酶的蛋白质水解激活受体的克隆家族包括受体PAR1，PAR2，PAR3和PAR4区别开来。PAR1占有一个特定的凝血酶裂解位点，允许凝血酶裂解，暴露一个新的氨基末端区，作为在诱导它的激活的自身回折的黏连配体起作用(参见例如，Vu，et al.，细胞，641057(1991))。PAR2具有相同的激活机制，但基本上是类似胰蛋白酶的酶激活的(参见，Zhong，et al.，生物化学杂志，26716975(1992))。PAR3也具有相同的激活机制，并且似乎是作为血小板中的第二个凝血酶受体起作用的(参见，Ishihara，et al.，自然，386502(1997))。在小鼠巨核细胞中已经检测了PAR4，并且研究表明，它也在人血小板中起作用(参见，Kahn，et al.，自然394690(1998))。与这些PAR受体相反，NPAR的激活需要非蛋白质水解的裂解。
几个证据表明，NPAR是与PAR受体不同的(1)已经分离了表达完全功能化的PAR1受体，但由于在NPAR信号转导途径中有缺陷而对凝血酶不应答的细胞的群体(参见，Kim，et al.，细胞生理学杂志，160573(1994))；(2)嗜中性粒细胞高亲和力结合125I凝血酶，它们的螯合受到蛋白质水解失活的凝血酶或NPAR激动剂的刺激(参见，Ramakrishnan and Carney，分子生物学，细胞41993(1993))，但它们仍然不表达PAR1(参见Jenkins，et al.，细胞科学杂志，1083059(1995))；(3)IIC9成纤维细胞过度表达PAR1，但没有高亲和力结合凝血酶(参见，Kim，D.Ph.D.Dissertation.德克萨斯医科大学，Galveston分院，1995；和Low，et al.，“癌症细胞3/生长因子和转化”，冷泉港实验室，纽约)；和(4)NPAR激动剂对来自PAR受体激动剂肽的那些的基因表达具有明显的效果(参见，Sower，et al.，实验细胞研究，247422(1999)。
NPAR激动剂的一个例子是凝血酶肽衍生物，即不超过50个氨基酸的多肽，优选地不超过30个氨基酸，并且与对应于前凝血酶氨基酸508-530(SEQ ID NO5)的人凝血酶的片段有足够的同源性，使该多肽激活NPAR。本文所述的凝血酶肽衍生物优选地具有约12和23个氨基酸，更优选地具有约19到23个氨基酸。凝血酶肽衍生物的一个例子包括结构式(I)的成分Asp-Ala-R (I)R是丝氨酸酯酶保守区。丝氨酸酯酶，例如，胰蛋白酶，凝血酶，胰凝乳蛋白酶等等具有一个高度保守的区域。“丝氨酸酯酶保守区”指具有一个这样的保守区的氨基酸序列的多肽，或与一个这样的保守区有足够的同源性，以致凝血酶肽衍生物保留了NPAR激活能力。
在一个实施方案中，丝氨酸酯酶保守序列具有氨基酸序列SEQ ID NO1(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的C末端截断的片段。但是，应该理解，在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3个氨基酸可以与SEQ ID NO1中的对应的氨基酸序列区别。优选地，与对应的SEQ ID NO1中的氨基酸不同的丝氨酸保守序列中的氨基酸是保守取代，并且更优选地是高度保守的取代。“C末端截断的片段”指从C末端除去一个氨基酸或氨基酸组后剩余的片段，所述的片段至少具有6个，更优选地至少具有9个氨基酸。
更优选地说，丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val；X1是Glu或Gln，并且X2是Phe，Met，Leu，His或Val)或其C末端截断的片段至少具有6个氨基酸，优选地至少9个氨基酸。
在优选地实施方案中，凝血酶肽衍生物包括丝氨酸酯酶保守序列和具有更多特异的凝血酶氨基酸序列Arg-Glu-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的多肽。这一类型的凝血酶肽的衍生物的一个例子包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)。X1和X2如上定义。当凝血酶肽衍生物包括SEQ ID NO4，优选地它具有SEQ ID NO5的氨基酸序列(Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9中的0，1，2或3个氨基酸是与SEQ ID NO5的对应位置上的氨基酸不同的。优选地，在与SEQ ID NO5中的对应的氨基酸不同的凝血酶肽衍生物中的氨基酸是保守取代，并且更优选地是高度保守的取代。“N末端截断的片段”指从N末端除去一个氨基酸或氨基酸组后剩下的片段，优选地氨基酸组不超过6个氨基酸，更优选地是不超过3个氨基酸的组。
TP508是凝血酶肽衍生物的例子，并且具有氨基酸序列SEQID NO5。
“保守取代”是用有同样的静电荷和大约同样大小和形状的另一个氨基酸取代。当在侧链中的总数碳和杂合原子的区别不超过约4个，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链大约是同样的大小。当在它们的侧链中的支链的数目区别不超过一个时，它们大约具有同样的大小。在它们的侧链中，具有酚或取代酚基团的氨基酸考虑约具有同样大小和形状。下面列出的是5个氨基酸的组。在多肽中用同一组的另一个氨基酸取代产生了一个保守取代组I甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羟基取代脂肪族侧链(直链或无分支)的非天然存在的氨基酸。
组II谷氨酸，天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组III赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组IV谷氨酸，天冬氨酸和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组V苯丙氨酸，苯甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。
“高度保守的取代”是在侧链中具有同样的官能团和具有相近的大小和形状的另一个氨基酸取代。当在侧链中的谈和杂合原子的区别不超过两个时，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有近似的大小。当在侧链中它们具有相同数目的分支时，它们具有相似的形状。高度保守的取代的例子包括缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，苯甘氨酸取代苯丙氨酸。不高度保守的取代的例子包括丙氨酸取代缬氨酸，丙氨酸取代丝氨酸和天冬氨酸取代丝氨酸。
其他NPAR激动剂包括结合和激活NPAR的小的有机分子。这一类型的激动剂可以常规地用高流通量的筛选鉴定，例如用评估分子在存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的分子时，加入到成纤维细胞中时刺激细胞增殖的能力的实验，或利用评估这些分子与125I凝血酶竞争结合具有表面NPAR受体的细胞的能力的实验，如Glenn et al.，出处同上，美国专利号，5,352,664和5,500,412中公开的。Glenn et al.，和美国专利号5,352,664和5,500,412的全部内容都通过在此引证合并于本文。
术语“NPAR激动剂”也包括已知能够激活NPAR的化合物和化合物的结合。例子公开在美国专利号5,352,664和5,500,412，并且包括凝血酶和DIP-α凝血酶。
用于本发明的方法的NPAR激动剂通常是作为药物组合物中的一个成分给药到需要软骨生长，修复或再生的位点的。对需要治疗的位点给药意味着，在需要治疗的位点给药含有NPAR激动剂的药物组合物的距离足够近以致在该位点发生软骨的生长或软骨的再生(例如，在存在NPAR激动剂时比没有它时更大量的软骨生长或更好质量的软骨生长)。
在一个给药的方法中，药物组合物是含有NPAR激动剂和适当载体的溶液。在需要治疗的位点直接施加或在附近施加该溶液。溶液的给药可以常规地完成，例如用针筒关节内给药，在损伤的组织的附近用针筒给药，或通过外科打开给药。可以利用标准的药物配方技术，如在Remington药典中，Mack出版社，Easton，PA中所述的。适当的药物载体例如包括生理盐水，无细菌盐水(含有约0.9％mg/ml苄二醇的盐水)，磷酸缓冲的盐水，Hank溶液，Ringer乳酸等等。
在另一个给药的方法中，药物组合物包括NPAR激动剂和可植入生物兼容载体。生物兼容载体应该是非毒性的，非炎性的，非免疫原的和在植入位点避免其他不需要的反应的。适当的载体提供活性成分的释放，优选地是慢地，在植入位点持续释放。
许多合成的生物可降解多聚体可作为具有持续释放特征的载体。这些多聚体的例子包括聚alpha羟酯，如聚乳酸/聚乙醇酸共聚物和聚酸酐。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)同聚物和共聚物是本领域已知的，可作为持续释放的载体。释放的速度可以通过技术人员改变聚乳酸与聚乙醇酸的比例和多聚物的分子量来调整(参见，Anderson，et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.285(1997)，其全部内容都通过在此引证而合并于本文)。在多聚物混合体中掺入聚(乙二醇)允许进一步减慢活性成分的释放过程(参见，Cleek et al.，控制释放杂志，48259(1997)，全部内容引入作为参考)。用作软骨生长因子的载体的适当的可植入PLGA多聚物公开在美国专利号6,013,853，5,607,474和5,876,452，这些文献的全部内容都通过在此引证而合并于本文。
结构式(II)中所示的聚酸酐已经定义了降解和释放的特征，这些特征可以通过包括改变疏水或亲水单体的量如葵二酸和1，3-二(p-羧基苯氧)丙烷的量来控制(参见Leong et al.，J.Biomed.Mater.Res.19941(1985)，其全部内容都通过在此引证而合并于本文)。为了提高机械强度，经常用酰胺共聚酸酐形成聚酸酐-共-酰胺。适用于orthopaedic应用的聚酸酐-共-酰胺的例子有聚(苯三亚氨-甘氨酸-共-1，6-双(羧基苯氧)己烷和焦苯三亚氨丙氨酸1，6-双-(p-羧基苯氧基)己烷共聚物。 这些药物组合物可以如愿针对手术来形成，或在外科手术过程中由医生或技术人员构成。优选的是，形成跨越组织缺陷处的基质，并且采用新组织的需要形式。在大的缺陷处的软骨修复的情况中，需要的是在各个方向上跨越缺陷处。在植入后，物质慢慢地被身体吸收，并且被植入体的形状或非常接近植入体的形状的软骨替代。
在一个方面，载体是多孔基质，其中祖先细胞可以迁移。细胞经常可以附着于这些多孔基质，然后可以作为组织生长的支架，从而加快骨生长的速度。可以在植入之前对这些基质施加软骨细胞，进一步加快愈合。胶原或胶原凝胶是适当的多孔基质的例子。
在另一方面，载体是黏性溶液或凝胶，可以在关节内或需要治疗的位点注射。透明质酸是这一类型的载体的一个例子。透明质酸产品是可以购买得到的，并且包括Anika开发的PRTHOVISC，Biomatrix开发的SYNVISC，Fidia开发的HYALGAN，和Seikagaku开发的ARTZ。多聚凝胶是这一类型的载体的另一个例子。多聚凝胶是非毒性环氧乙烷和环氧丙烷的封闭共聚物。它们展示了具有热设定特性，允许在室温下以黏性液体存在，担在体温下成凝胶。可注射组合物可以直接施加到需要治疗但不需要侵入性外科的位点。聚(环氧乙烷)和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物也适用于作为可注射的基质(参见Caoet al.，J.Biomater.Sci.9475(1998)和Sims et al.，Plast Reconstr.Surg.98843(196)，其全部内容都通过在此引证而合并于本文)。
“治疗有效量”是在存在NPAR激动剂时比没有时产生更大的软骨生长或修复的NPAR激动剂(软骨细胞)的量。或者，“治疗有效量”是导致减轻疼痛和/或缺少与软骨损伤相关的功能的NPAR激动剂(软骨细胞)的量。通常，给药足够时间的激动剂(软骨细胞)可以获得需要的治疗或效果。给药的量将决定于软骨生长需要的量，健康状况，大小，体重，年龄和性别和药物配方的释放特征。通常，在0.1ug/day和1毫克每天之间的激动剂(优选地是约5ug/day-100ug/day)是通过连续释放或直接施加到需要软骨生长或修复的位点来给药的。
“受试者”优选地是人，但也可以是需要治疗的动物，例如陪伴动物(例如，狗，猫等等)，农场动物(例如，牛，猪，马等等)和实验室动物(例如，大鼠，小鼠，滕鼠等等)。
NPAR激动剂可以用于加快生长或维持分离的软骨细胞的功能。在一个实施方案中，NPAR激动剂可以加入到组织培养基中刺激增殖和提供更快速的增殖和/或防止将初级细胞分离物放置于培养物中时经常遇到的细胞程序死亡或衰老。在另一个实施方案中，因为NPAR激动剂似乎是刺激基质生产的，例如NPAR激动剂可以用于维持培养物中的软骨的分化功能。NPAR激动剂可以单独在标准定义的组织培养基中使用或作为含有血清或其他生长因子的组织培养基的补充，以便对软骨细胞的体外生长或维持提供附加的或协同的效果。在培养基中加入足够量的NPAR激动剂可以提供更快速的生长，维持比没有激动剂时更大的软骨细胞功能，这一量即“刺激量”。通常，利用的是约0.1ug/ml和100ug/mlNPAR激动剂之间的量。
也可以通过在需要治疗的位点给药治疗有效量的软骨细胞，使用在存在NPAR激动剂时培养的软骨细胞治疗软骨损伤。关于软骨细胞，“治疗有效量”也指比没有时导致更大的软骨生长或修复。给药软骨细胞治疗软骨损伤在美国专利号4,846,835中有叙述，其全部内容都通过在此引证而合并于本文。
凝血酶肽衍生物可以通过固相肽合成(例如，BOC或FMOC)方法，液相合成，或其他适当的技术，包括结合前面的方法来合成。BPC和FMOC方法是已确定的并且广泛使用的，它们在Mrrifield，J.Am.Chem.Soc.882149(1963)；Meienhofer，激素蛋白质和肽，C.H.Li，Ed.，学术出版社，1983，pp.48-267；Barany andMerrifield，肽，E.Gross and J.Meienhofer，Eds.，学术出版社，纽约，1980，3-285页中有叙述。固相肽合成的方法在Merrifield，R.B.，科学，232341(1986)；Carpino，L.A.and Han，G.Y.，J.Org.Chem.，373404(1972)；and Gauspohl，H.et al.，合成，5315(1992))中有叙述。这6个文章的全部内容都通过在此引证而合并于本文。
本发明是通过下面的实施例进一步说明的，但不在任何方面构成对本发明的限制。实施例实验细节软骨细胞是软骨中发现的刺激细胞类型。在软骨中，这些细胞正常时是静止的，或非增殖的，并且具有相对低的代谢速度。在软骨损伤后，这些细胞不容易参与修复过程。由于软骨无血管的特性，这些细胞在推测上是不能修复过程的起始物的凝血酶。下面的实施例证明，软骨细胞具有凝血酶受体并且激活NPAR的这些化合物刺激软骨细胞的增殖和基质糖蛋白的合成。
实施例1与大鼠软骨细胞结合的凝血酶分离大鼠关节软骨细胞的初级培养物，并且制备用于体外的已确定方法的分析中(参见Kuettner，K.E.，et al.，细胞生物学杂志93743-750，1982)。简要地说，从大鼠的肩中离解出软骨片，在组织培养基(DMEM)中，37℃，搅拌，用胰蛋白酶消化片块一小时，用胶原酶消化3小时。在烧瓶中，高密度布展细胞(50,000/cm sq.)，并且在含有抗生素抗坏血酸的DMEM中，在37℃，在5％CO2的大气中培养。
利用已确定的凝血酶受体结合实验进行与125I凝血酶与软骨细胞的特异结合，实验方法如美国专利5,352,664中公开的，和Carney，DH和Cunningham，DD，细胞151341-1349，1978中所述。简要地说，将高纯度的人凝血酶碘化，并且加入到有或没有未标记的凝血酶的软骨细胞的培养过程中，以纠正非特异的结合。通过用不同浓度的已标记凝血酶温育细胞和测量凝血酶与细胞结合的量和培养基中的游离的凝血酶的量，估计每个细胞的受体的数目和凝血酶和结合位点的亲和力是可能的。
三个分离实验中的已标记凝血酶结合的Scatchard分析表明，大鼠软骨细胞表达了平均3000个非常高亲和力的结合位点(100pM亲和力)和230,000个高亲和力位点(27nM)。
实施例2ANPAR激动剂对小牛软骨细胞的增殖的刺激利用实施例1中关于大鼠软骨细胞所述的方法，制备小牛软骨细胞的初级培养物。在24孔的塑料盘中低密度亚培养这些培养物，放置于1％的血清。在本身浓度为1.0或10ug/ml时加入NPAR激动剂TP508到这些培养物中，不会刺激细胞的增殖。相反，在培养三天后，与单独加入凝血酶相比，加入这些浓度的TP508和小量的凝血酶共有丝分裂原导致小的，但明显的(p＜0.05)的细胞数目的增加，这个细胞数目的增加。
实施例2BNPAR激动剂刺激小牛软骨细胞糖蛋白合成为了确定NPAR激动剂对糖蛋白合成的效果，在96孔的平板上以每孔2×105个细胞的密度播种，并且用10％的胎牛血清在DMEM中培养。在确定这些多层的培养后，用含有已表明浓度的TP508，从1到100ug/ml的含有1％的血清的DMEM每天替代培养基(表1)。在每天改变有或没有TP508的培养基，培养6天后，在培养基中加入35S硫酸盐，继续温育24小时。如表1所示，用高浓度的TP508(100ug/ml)的处理比未处理的细胞增加35S硫酸盐的掺入有10倍以上。
表1.在小牛软骨细胞培养中，NPAR激动剂TP508对35S硫酸盐掺入的影响
实施例3A 在已培养的大鼠关节软骨细胞中，NPAR激动剂刺激繁殖合成如实施例1所述，利用胰蛋白酶和胶原酶消化，从关节的肩软骨的片中分离大鼠关节的软骨细胞。利用如Guo et al.(Conn.Tiss.Res.19277-297，1998)所述的已确定的技术确定对软骨细胞“3维”海藻酸胶的小珠培养物(Conn.Tiss.Res.19277-297，1998)。在用胰蛋白酶从组织培养烧瓶中除去细胞后，在海藻酸胶(1.2％w/v)中悬浮细胞，用22gauge的针，在102mMCaCl2中逐滴融合慢慢表达。当液滴接触CaCl2时，有几乎不间断的海藻酸的聚合产生凝胶小珠。然后，在DMEM培养基中洗涤小珠3次，转移到35mm的盘中，在37℃，在5％的CO2大气压下，通过每两天用培养基饲喂维持培养。
通过从35mm的盘中除去小珠，用0.9％的盐水洗涤和在37℃，加入1ml的55mM的柠檬酸钠，0.15M NaCl溶解海藻酸盐小珠10分钟确定3维海藻酸盐培养3天后，NPAR激动剂TP508对软骨细胞繁殖的影响。用磷酸缓冲的盐水(PBS)1∶10稀释1ml溶解的小珠确定细胞数，并且用Z-系列计数器计数细胞。如表2所示，TP508本身刺激3维培养中的软骨细胞的繁殖。
表2.NPAR激动剂TP508在3维培养中对大鼠软骨细胞的繁殖的影响
实施例3B在培养的大鼠关节软骨细胞中，NPAR激动剂刺激糖蛋白的合成为了确定NPAR激动剂TP508对糖蛋白合成的影响，如上所述制备了3维海藻酸培养物，并且测试了[35S]-硫酸盐的掺入。将小珠培养物与标明浓度的TP508以及[35S]硫酸盐(20uCi/ml)接触，每天改变培养基，在掺入[35S]硫酸盐后的第7天收获。在每个时间点，移取5-10个小珠，用0.9％的盐水洗涤3次，加入0.5ml的55mM的柠檬酸钠，0.15M NaCl在37℃，如上所述溶解10分钟，在液体闪烁计数器中计数。在每个样品中，对加入的小珠的数目，将[35S]硫酸盐的掺入归一化。如表3所示，在300nM(约0.7ug/ml)的浓度单独的TP508处理，刺激了[35S]硫酸盐掺入超过对照50％。也有30uM的TP508(约70ug/ml)的大刺激，但是，在这一浓度的测量中有一个大的相对标准的偏差。
表3.NPAR激动剂TP508对[35S]硫酸盐掺入进糖蛋白的影响
实施例4TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微球体的制备利用双乳化技术制备含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)的微球体。简要地说，在二氯甲烷和溶解于水中的TP508中溶解基质成分。当涡旋形成油中水(W/O)乳液时，将两者逐步混合在一起。将聚乙烯醇(水中0.3％)加入到乳液中，进一步涡旋形成第二个乳液(O/W)，从而形成双乳液(PLGA小滴组成的O/W乳液，在这些小滴中，第二个分散相由水中的TP508组成。在相分离的基础上，PLGA小滴形成分散的微球体，含有持有TP508的腔。为了引起微球体的相分离，加入2％的异丙醇溶液。通过离心收集颗粒，并且然后冻干除去残余的水分。改变基质的组成，形成不同释放动力学的微球体(表4)。
表4不同微球体配方的组成
在Coulter计数器中测量了微球体的平均直径，在二氯甲烷中溶解称重的微球体样品和萃取释放的药物进水中后，在276nm通过光谱实验测量药物诱捕效率(表5)。
表5配方直径和药物诱捕效率
为了测量从不同的PLGA基质释放TP508，在1.5ml的聚丙烯微型离心管中含有的1.0mlPBS中放置20mg的微球体。在37℃温育试管，在60rpm振摇。在各个时段，离心试管，移取含有释放的TP508的上清液，冷冻随后分析。在微球体中加入新鲜的PBS，连续温育。通过在276nm处的吸光值的测量，测量上清液中的TP508。对于每个配方，进行四等分的释放测定。配方B和D在37℃温育28天的过程中没有显示可检测的药物释放。其余的配方都释放了可检测量的TP508，虽然在所有的情况中，3-4天内释放的药物的量在可检测的限制值以下(＜1ug/mg基质/天)。配方A和C显示了TP508的最大释放，在3-4天释放了陷入药物的60-80％。配方C显示了最快的释放动力学，选择用于在实施例5中所述的大鼠软骨缺陷模型中进行测试。
实施例5在大鼠模型中，NPAR激动剂TP508刺激软骨的生长幼小的，雄性新西兰兔子(2-3kg)(n＝15)麻醉后，给予双侧的，医学纵裂副侧关节术。用electrocautery切出皮肤，皮下组织和关节囊，使出血最少。通过髌骨后侧的离解暴露关节表面。利用外科钻和点不锈钢钻在股骨的滑车沟中做一个1-2毫米深的完全厚度的缺陷处。目的是将缺陷处扩展成软骨下的平板，但不能刺到软骨下的骨。
将兔子分成3组。对每个兔子，用同样的处理来填充右边和左边的滑车沟缺陷处。在这一研究中，将TP508配制成如实施例4中所述制备的PLGA控制释放微球体(配方C)。将微球体与足够的多聚F68凝胶(5％w/v)混合，结合球体，一起成糊状的稠性，可以容易地填充进缺陷处。对照组在两个缺陷处接受没有TP508的PLGA微球体。处理的组接受含有10或50mgTP508/缺陷处的微球体。在4星期时杀死来自每个组的一个兔子，在6星期时杀死每个组中的2个兔子，剩下的动物在第9个星期杀死。固定样品，进行组织学分析。
在杀死的时候，在对照缺陷中，似乎有相当多的纤维颗粒组织，而没有类似白色的软骨物质。相反，在10ug的处理组和50ug的组中的缺陷处中，缺陷有近似均一的，浓密的，白色的物质填充。在外科手术后6个星期，在处理和对照缺陷之间，显微镜的差异不那么明显。
4个星期的样品的组织学分析表明，对照缺陷处确实填充了似乎是代表包括炎性和成纤维细胞的早期颗粒组织。相反，10和50微克的处理缺陷处似乎是具有大数目的软骨细胞和软骨形成的早期迹象。这一效果在6星期时更明显。对照具有小量的结缔组织，但软骨修复的迹象很少。相反，在10ug和50ug的处理缺陷处，似乎是在缺陷处的顶部与透明的软骨的形成有很好的整合，和大范围的软骨下的骨修复。
9个星期的TP508的处理缺陷处中主要占有透明的基质，通过阳性safranin-O-染色，可见明显的软骨量。在大多数情况中，在修复位点和天然的组织之间，软骨的量没有差异。组织学结果是用分级系统定量评估的，这一系统是Freed，et al.，生物医学物质研究杂志，28891-899(1944)采用了O’Driscoll，et al.，骨关节外科杂志1261448-1452(2000)中的方案进行的，正常的关节软骨的最小得分是25。实验TP508处理的缺陷得到了明显比对照缺陷高的平均得分(表6)。
表6-关节缺陷研究的组织学得分TP508毫克数 修复结果±SE0 9.4+1.610 18.6±1.450 19.8±1.0
修复的肽处理缺陷处具有光滑的关节表面，通常在修复和天然组织之间的连接处很好地连接。对照修复组织的质量是特征是纤维化软骨，和关节表面质量不好。在修复和天然组织之间的接合处的整合通常不好。全面地说，TP508修复的软骨的质量比对照非处理缺陷明显增强。提高修复组织的质量应该导致关节的生物机械更耐久和功能的恢复，并且减少了患有创伤软骨损伤的患者中骨关节炎的症状。
当对本发明根据优选的实施方案进行了表示和叙述后，本领域技术人员应该理解，在不脱离附加的权利要求书包括的本发明的范围的情况下，可以有各种形式和细节的变化。
权利要求
1.一种在需要软骨生长或修复的受试者中的位点刺激软骨的生长或修复的方法，所述的方法包括对该位点给药治疗有效量的非蛋白质水解激活凝血酶受体的激动剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中位点是关节。
3.根据权利要求1所述的方法，其中位点正在治疗软骨损伤或缺失。
4.根据权利要求1所述的方法，其中位点正在治疗由于创伤造成的软骨损伤或缺失。
5.根据权利要求1所述的方法，其中激动剂是包括下面的结构式代表的多肽的凝血酶肽衍生物Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有约12到23个氨基酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或具有至少6个氨基酸的C末端截断的片段，假设丝氨酸保守序列中的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO1的对应位置不同。
8.根据权利要求6所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或至少具有9个氨基酸的C末端截断的片段，假设丝氨酸保守序列中的0，1或2个氨基酸是对应于SEQ IDNO1中的氨基酸的保守取代。
9.根据权利要求6所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val，其中X1是Glu，X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或SEQ ID NO2的C末端截断片段，所述的片段至少具有6个氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)，其中X1是Glu或Gln，X2是Phe，Met，Leu，His或Val。
12.根据权利要求11所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO5的对应位置的氨基酸不同。
13.根据权利要求11所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO5的对应位置的氨基酸的保守取代。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在药物组合物中给药的凝血酶肽衍生物另外包括可植入的，生物兼容的载体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中载体包括聚乳酸/聚乙醇酸同多聚物或共聚物。
16.一种在需要软骨生长或修复的受试者中的位点刺激软骨生长或修复的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)序列的肽的步骤。
17.一种在受试者的关节中刺激软骨生长的方法，所述的方法包括在该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽的步骤。
18.一种在正在治疗软骨缺失的位点刺激受试者的软骨生长的方法，所述的方法包括在该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽。
19.一种在正在治疗由于创伤导致的软骨缺失的位点中，刺激受试者的软骨的生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽的步骤。
20.一种在体外培养软骨细胞的方法，其特征在于在存在刺激量的NPAR激动剂时培养软骨细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，进一步包括对需要软骨修复或生长的受试者的位点给予治疗有效量的培养的软骨细胞。
全文摘要
公开的是在需要生长，修复或再生的受试者中，在一个位点刺激软骨生长，修复或再生的方法。该方法包括在该位点给药治疗有效量的非蛋白质水解性激活凝血酶受体的激动剂的步骤。同时公开的是在体外刺激软骨细胞的增殖和扩展。该方法包括在存在刺激量的NPAR激动剂时培养软骨细胞。
文档编号A61P43/00GK1458974SQ01815821
公开日2003年11月26日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月20日
发明者达芮尔·H·卡尼, 罗杰·S·库劳泽尔, 珍妮特·斯蒂尔伯格, 约翰·伯格曼 申请人:德克萨斯系统大学董事会
政府支持本发明整体或部分得到国家健康研究院/国家关节炎和粘膜骨架和皮肤疾病研究院的1 R43 AR463343-01的资金资助。政府在本发明中有一些权利。相关的申请本申请书要求了2000年7月20日递交的美国临时申请号60/219,800的权益，该申请的整个内容通过在此引证而合并于本文。
发明概述现在已经发现，从关节软骨分离的软骨细胞是应答非蛋白质水解凝血酶细胞表面受体(下文中称为“NPAR”)的化合物的。例如，软骨细胞的每个细胞约表达233,000个凝血酶结合位点，表观亲和力约为0.1nM(3000个位点)和27nM(230,000个位点)(实施例1)。另外，化合物TP508，非蛋白质水解凝血酶受体的激动剂在存在作为辅助有丝分裂原的凝血酶时，在培养物中刺激小牛软骨细胞的增殖，并且其自身刺激在三维基质的培养中培养的大鼠软骨细胞的增殖(实施例3A)。这一相同的TP508化合物也刺激糖蛋白的合成，如在小牛软骨细胞中掺入35S硫酸盐(实施例2B)和大鼠软骨细胞的3维培养(实施例3B)。这些体外实验证明，NPAR激动剂可以刺激从关节的软骨分离的软骨细胞中的增殖和基质的产生。其他的体内实验证明，将持续释放配方的TP508递送到大鼠滑车神经沟软骨缺陷处，扩展到下软骨能够修复软骨缺陷，包括下软骨的修复，正常软骨表面的恢复和新形成的软骨与未损伤的缺陷区的软骨外侧的整合(实施例5)。
根据前面的章节中报道的结果，本文公开了在受试者中刺激体内软骨细胞生长和软骨修复的方法，和将药物组合物递送到关节缺陷处辅助表面的修复和防止关节退化的新递送方法。
本发明是在需要软骨生长，修复或再生的受试者中，在有关位点刺激软骨生长，再生或修复的方法。该方法包括对损伤的位点给药治疗有效量的非蛋白质水解激活凝血酶受体的激动剂的步骤。
本发明的另一个实施方案是在体外刺激软骨细胞的增殖和扩展的方法。该方法包括在存在刺激NPAR激动剂的量时培养软骨细胞。本发明的详细说明在有骨关节炎的受试者中发现了需要软骨生长，修复或再生的位点。骨关节炎或退化性关节疾病是慢发展的，不可逆的，经常性的单关节疾病，特征是疼痛和失去功能。疼痛和虚弱的原因是软骨退化，这是该疾病的一个主要的症状。透明的软骨是灵活的组织，覆盖在骨的末端，位于关节之间，如膝盖中。同时，在沿着脊柱的骨之间也有发现。软骨是光滑的，允许稳定，灵活地运动，并且摩擦最小，但同时也抵抗压力和能够瓦解施加的负载。由于骨关节炎的发展，软骨的表面和暴露的下面的骨变得不规则。不是光滑地摩擦，骨关节炎表面相互摩擦，导致僵硬和疼痛。损伤的软骨的退化和这些关节位点的新的软骨的生长将缓解疼痛并且恢复与骨关节炎相关的功能的丧失。
软骨损伤也可以发生在创伤和外科手术导致的损伤中。运动损伤是软骨损伤的常见原因，特别是膝盖这样的关节中。对软骨的损伤可以导致相同类型的功能的损伤。所以，在软骨已经被创伤或疾病损伤的受试者中的位点需要恢复或促进软骨的生长的治疗。
申请人已经发现，刺激或激活非蛋白质水解激活的凝血酶受体(下文中的“NPAR”)的化合物可以刺激软骨细胞繁殖。软骨细胞是构成软骨的1％体积的细胞，它们可以替代已降解的基质分子维持准确的体积和组织的机械特性。申请人也已经发现，刺激或激活NPAR的化合物刺激软骨细胞中的糖蛋白的合成。糖蛋白是主要的软骨的成分。根据这些结果，申请人递送制备成持续释放配方的NPAR激动剂TP508到兔子的滑车神经沟软骨的缺陷处，并且发现该肽刺激缺陷的修复，包括在正常软骨表面的形成新软骨。该肽同时也刺激将这一新软骨放置和整合进邻近的，未受损的软骨和恢复软骨下的骨。结论是，当对需要软骨生长和/或修复的位点给药时，NPAR激动剂可以诱导软骨的生长和/或修复。
刺激或激活NPAR的化合物是NPAR激动剂。NPAR是大多数细胞的表面上存在的高亲和力凝血酶受体。NPAR很大程度上负责凝血酶，蛋白质水解激活的凝血酶和凝血酶派生的肽对细胞的高亲和力结合。NPAR激动剂和激抗剂可以竞争凝血酶与细胞的亲和性结合(参见例如，Glenn et al.，肽研究杂志，165(1988))。NPAR似乎是介导了不依赖蛋白质水解活性的凝血酶启动的许多细胞信号的。一个这样的信号的例子是消减杂交鉴定的附加物V和其他分子的上调(参见Sower，et al.，实验细胞研究247422(1999))。所以，NPAR的特征是，在细胞表面它与凝血酶有高的亲和反应，和它受凝血酶的蛋白质水解失活衍生物和如下所述的凝血酶派生肽激动剂的激活。根据激动剂在加入到成纤维细胞中时，在存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的分子时，刺激细胞繁殖的能力可以测试NPAR的激活，如美国专利号，5,352,664和5,500,412中公开。
NPAR有待于与其他凝血酶结合蛋白质和凝血酶的蛋白质水解激活受体的克隆家族包括受体PAR1，PAR2，PAR3和PAR4区别开来。PAR1占有一个特定的凝血酶裂解位点，允许凝血酶裂解，暴露一个新的氨基末端区，作为在诱导它的激活的自身回折的黏连配体起作用(参见例如，Vu，et al.，细胞，641057(1991))。PAR2具有相同的激活机制，但基本上是类似胰蛋白酶的酶激活的(参见，Zhong，et al.，生物化学杂志，26716975(1992))。PAR3也具有相同的激活机制，并且似乎是作为血小板中的第二个凝血酶受体起作用的(参见，Ishihara，et al.，自然，386502(1997))。在小鼠巨核细胞中已经检测了PAR4，并且研究表明，它也在人血小板中起作用(参见，Kahn，et al.，自然394690(1998))。与这些PAR受体相反，NPAR的激活需要非蛋白质水解的裂解。
几个证据表明，NPAR是与PAR受体不同的(1)已经分离了表达完全功能化的PAR1受体，但由于在NPAR信号转导途径中有缺陷而对凝血酶不应答的细胞的群体(参见，Kim，et al.，细胞生理学杂志，160573(1994))；(2)嗜中性粒细胞高亲和力结合125I凝血酶，它们的螯合受到蛋白质水解失活的凝血酶或NPAR激动剂的刺激(参见，Ramakrishnan and Carney，分子生物学，细胞41993(1993))，但它们仍然不表达PAR1(参见Jenkins，et al.，细胞科学杂志，1083059(1995))；(3)IIC9成纤维细胞过度表达PAR1，但没有高亲和力结合凝血酶(参见，Kim，D.Ph.D.Dissertation.德克萨斯医科大学，Galveston分院，1995；和Low，et al.，“癌症细胞3/生长因子和转化”，冷泉港实验室，纽约)；和(4)NPAR激动剂对来自PAR受体激动剂肽的那些的基因表达具有明显的效果(参见，Sower，et al.，实验细胞研究，247422(1999)。
NPAR激动剂的一个例子是凝血酶肽衍生物，即不超过50个氨基酸的多肽，优选地不超过30个氨基酸，并且与对应于前凝血酶氨基酸508-530(SEQ ID NO5)的人凝血酶的片段有足够的同源性，使该多肽激活NPAR。本文所述的凝血酶肽衍生物优选地具有约12和23个氨基酸，更优选地具有约19到23个氨基酸。凝血酶肽衍生物的一个例子包括结构式(I)的成分Asp-Ala-R (I)R是丝氨酸酯酶保守区。丝氨酸酯酶，例如，胰蛋白酶，凝血酶，胰凝乳蛋白酶等等具有一个高度保守的区域。“丝氨酸酯酶保守区”指具有一个这样的保守区的氨基酸序列的多肽，或与一个这样的保守区有足够的同源性，以致凝血酶肽衍生物保留了NPAR激活能力。
在一个实施方案中，丝氨酸酯酶保守序列具有氨基酸序列SEQ ID NO1(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的C末端截断的片段。但是，应该理解，在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3个氨基酸可以与SEQ ID NO1中的对应的氨基酸序列区别。优选地，与对应的SEQ ID NO1中的氨基酸不同的丝氨酸保守序列中的氨基酸是保守取代，并且更优选地是高度保守的取代。“C末端截断的片段”指从C末端除去一个氨基酸或氨基酸组后剩余的片段，所述的片段至少具有6个，更优选地至少具有9个氨基酸。
更优选地说，丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val；X1是Glu或Gln，并且X2是Phe，Met，Leu，His或Val)或其C末端截断的片段至少具有6个氨基酸，优选地至少9个氨基酸。
在优选地实施方案中，凝血酶肽衍生物包括丝氨酸酯酶保守序列和具有更多特异的凝血酶氨基酸序列Arg-Glu-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的多肽。这一类型的凝血酶肽的衍生物的一个例子包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)。X1和X2如上定义。当凝血酶肽衍生物包括SEQ ID NO4，优选地它具有SEQ ID NO5的氨基酸序列(Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9中的0，1，2或3个氨基酸是与SEQ ID NO5的对应位置上的氨基酸不同的。优选地，在与SEQ ID NO5中的对应的氨基酸不同的凝血酶肽衍生物中的氨基酸是保守取代，并且更优选地是高度保守的取代。“N末端截断的片段”指从N末端除去一个氨基酸或氨基酸组后剩下的片段，优选地氨基酸组不超过6个氨基酸，更优选地是不超过3个氨基酸的组。
TP508是凝血酶肽衍生物的例子，并且具有氨基酸序列SEQID NO5。
“保守取代”是用有同样的静电荷和大约同样大小和形状的另一个氨基酸取代。当在侧链中的总数碳和杂合原子的区别不超过约4个，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链大约是同样的大小。当在它们的侧链中的支链的数目区别不超过一个时，它们大约具有同样的大小。在它们的侧链中，具有酚或取代酚基团的氨基酸考虑约具有同样大小和形状。下面列出的是5个氨基酸的组。在多肽中用同一组的另一个氨基酸取代产生了一个保守取代组I甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羟基取代脂肪族侧链(直链或无分支)的非天然存在的氨基酸。
组II谷氨酸，天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组III赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组IV谷氨酸，天冬氨酸和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组V苯丙氨酸，苯甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。
“高度保守的取代”是在侧链中具有同样的官能团和具有相近的大小和形状的另一个氨基酸取代。当在侧链中的谈和杂合原子的区别不超过两个时，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有近似的大小。当在侧链中它们具有相同数目的分支时，它们具有相似的形状。高度保守的取代的例子包括缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，苯甘氨酸取代苯丙氨酸。不高度保守的取代的例子包括丙氨酸取代缬氨酸，丙氨酸取代丝氨酸和天冬氨酸取代丝氨酸。
其他NPAR激动剂包括结合和激活NPAR的小的有机分子。这一类型的激动剂可以常规地用高流通量的筛选鉴定，例如用评估分子在存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的分子时，加入到成纤维细胞中时刺激细胞增殖的能力的实验，或利用评估这些分子与125I凝血酶竞争结合具有表面NPAR受体的细胞的能力的实验，如Glenn et al.，出处同上，美国专利号，5,352,664和5,500,412中公开的。Glenn et al.，和美国专利号5,352,664和5,500,412的全部内容都通过在此引证合并于本文。
术语“NPAR激动剂”也包括已知能够激活NPAR的化合物和化合物的结合。例子公开在美国专利号5,352,664和5,500,412，并且包括凝血酶和DIP-α凝血酶。
用于本发明的方法的NPAR激动剂通常是作为药物组合物中的一个成分给药到需要软骨生长，修复或再生的位点的。对需要治疗的位点给药意味着，在需要治疗的位点给药含有NPAR激动剂的药物组合物的距离足够近以致在该位点发生软骨的生长或软骨的再生(例如，在存在NPAR激动剂时比没有它时更大量的软骨生长或更好质量的软骨生长)。
在一个给药的方法中，药物组合物是含有NPAR激动剂和适当载体的溶液。在需要治疗的位点直接施加或在附近施加该溶液。溶液的给药可以常规地完成，例如用针筒关节内给药，在损伤的组织的附近用针筒给药，或通过外科打开给药。可以利用标准的药物配方技术，如在Remington药典中，Mack出版社，Easton，PA中所述的。适当的药物载体例如包括生理盐水，无细菌盐水(含有约0.9％mg/ml苄二醇的盐水)，磷酸缓冲的盐水，Hank溶液，Ringer乳酸等等。
在另一个给药的方法中，药物组合物包括NPAR激动剂和可植入生物兼容载体。生物兼容载体应该是非毒性的，非炎性的，非免疫原的和在植入位点避免其他不需要的反应的。适当的载体提供活性成分的释放，优选地是慢地，在植入位点持续释放。
许多合成的生物可降解多聚体可作为具有持续释放特征的载体。这些多聚体的例子包括聚alpha羟酯，如聚乳酸/聚乙醇酸共聚物和聚酸酐。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)同聚物和共聚物是本领域已知的，可作为持续释放的载体。释放的速度可以通过技术人员改变聚乳酸与聚乙醇酸的比例和多聚物的分子量来调整(参见，Anderson，et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.285(1997)，其全部内容都通过在此引证而合并于本文)。在多聚物混合体中掺入聚(乙二醇)允许进一步减慢活性成分的释放过程(参见，Cleek et al.，控制释放杂志，48259(1997)，全部内容引入作为参考)。用作软骨生长因子的载体的适当的可植入PLGA多聚物公开在美国专利号6,013,853，5,607,474和5,876,452，这些文献的全部内容都通过在此引证而合并于本文。
结构式(II)中所示的聚酸酐已经定义了降解和释放的特征，这些特征可以通过包括改变疏水或亲水单体的量如葵二酸和1，3-二(p-羧基苯氧)丙烷的量来控制(参见Leong et al.，J.Biomed.Mater.Res.19941(1985)，其全部内容都通过在此引证而合并于本文)。为了提高机械强度，经常用酰胺共聚酸酐形成聚酸酐-共-酰胺。适用于orthopaedic应用的聚酸酐-共-酰胺的例子有聚(苯三亚氨-甘氨酸-共-1，6-双(羧基苯氧)己烷和焦苯三亚氨丙氨酸1，6-双-(p-羧基苯氧基)己烷共聚物。 这些药物组合物可以如愿针对手术来形成，或在外科手术过程中由医生或技术人员构成。优选的是，形成跨越组织缺陷处的基质，并且采用新组织的需要形式。在大的缺陷处的软骨修复的情况中，需要的是在各个方向上跨越缺陷处。在植入后，物质慢慢地被身体吸收，并且被植入体的形状或非常接近植入体的形状的软骨替代。
在一个方面，载体是多孔基质，其中祖先细胞可以迁移。细胞经常可以附着于这些多孔基质，然后可以作为组织生长的支架，从而加快骨生长的速度。可以在植入之前对这些基质施加软骨细胞，进一步加快愈合。胶原或胶原凝胶是适当的多孔基质的例子。
在另一方面，载体是黏性溶液或凝胶，可以在关节内或需要治疗的位点注射。透明质酸是这一类型的载体的一个例子。透明质酸产品是可以购买得到的，并且包括Anika开发的PRTHOVISC，Biomatrix开发的SYNVISC，Fidia开发的HYALGAN，和Seikagaku开发的ARTZ。多聚凝胶是这一类型的载体的另一个例子。多聚凝胶是非毒性环氧乙烷和环氧丙烷的封闭共聚物。它们展示了具有热设定特性，允许在室温下以黏性液体存在，担在体温下成凝胶。可注射组合物可以直接施加到需要治疗但不需要侵入性外科的位点。聚(环氧乙烷)和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物也适用于作为可注射的基质(参见Caoet al.，J.Biomater.Sci.9475(1998)和Sims et al.，Plast Reconstr.Surg.98843(196)，其全部内容都通过在此引证而合并于本文)。
“治疗有效量”是在存在NPAR激动剂时比没有时产生更大的软骨生长或修复的NPAR激动剂(软骨细胞)的量。或者，“治疗有效量”是导致减轻疼痛和/或缺少与软骨损伤相关的功能的NPAR激动剂(软骨细胞)的量。通常，给药足够时间的激动剂(软骨细胞)可以获得需要的治疗或效果。给药的量将决定于软骨生长需要的量，健康状况，大小，体重，年龄和性别和药物配方的释放特征。通常，在0.1ug/day和1毫克每天之间的激动剂(优选地是约5ug/day-100ug/day)是通过连续释放或直接施加到需要软骨生长或修复的位点来给药的。
“受试者”优选地是人，但也可以是需要治疗的动物，例如陪伴动物(例如，狗，猫等等)，农场动物(例如，牛，猪，马等等)和实验室动物(例如，大鼠，小鼠，滕鼠等等)。
NPAR激动剂可以用于加快生长或维持分离的软骨细胞的功能。在一个实施方案中，NPAR激动剂可以加入到组织培养基中刺激增殖和提供更快速的增殖和/或防止将初级细胞分离物放置于培养物中时经常遇到的细胞程序死亡或衰老。在另一个实施方案中，因为NPAR激动剂似乎是刺激基质生产的，例如NPAR激动剂可以用于维持培养物中的软骨的分化功能。NPAR激动剂可以单独在标准定义的组织培养基中使用或作为含有血清或其他生长因子的组织培养基的补充，以便对软骨细胞的体外生长或维持提供附加的或协同的效果。在培养基中加入足够量的NPAR激动剂可以提供更快速的生长，维持比没有激动剂时更大的软骨细胞功能，这一量即“刺激量”。通常，利用的是约0.1ug/ml和100ug/mlNPAR激动剂之间的量。
也可以通过在需要治疗的位点给药治疗有效量的软骨细胞，使用在存在NPAR激动剂时培养的软骨细胞治疗软骨损伤。关于软骨细胞，“治疗有效量”也指比没有时导致更大的软骨生长或修复。给药软骨细胞治疗软骨损伤在美国专利号4,846,835中有叙述，其全部内容都通过在此引证而合并于本文。
凝血酶肽衍生物可以通过固相肽合成(例如，BOC或FMOC)方法，液相合成，或其他适当的技术，包括结合前面的方法来合成。BPC和FMOC方法是已确定的并且广泛使用的，它们在Mrrifield，J.Am.Chem.Soc.882149(1963)；Meienhofer，激素蛋白质和肽，C.H.Li，Ed.，学术出版社，1983，pp.48-267；Barany andMerrifield，肽，E.Gross and J.Meienhofer，Eds.，学术出版社，纽约，1980，3-285页中有叙述。固相肽合成的方法在Merrifield，R.B.，科学，232341(1986)；Carpino，L.A.and Han，G.Y.，J.Org.Chem.，373404(1972)；and Gauspohl，H.et al.，合成，5315(1992))中有叙述。这6个文章的全部内容都通过在此引证而合并于本文。
本发明是通过下面的实施例进一步说明的，但不在任何方面构成对本发明的限制。实施例实验细节软骨细胞是软骨中发现的刺激细胞类型。在软骨中，这些细胞正常时是静止的，或非增殖的，并且具有相对低的代谢速度。在软骨损伤后，这些细胞不容易参与修复过程。由于软骨无血管的特性，这些细胞在推测上是不能修复过程的起始物的凝血酶。下面的实施例证明，软骨细胞具有凝血酶受体并且激活NPAR的这些化合物刺激软骨细胞的增殖和基质糖蛋白的合成。
实施例1与大鼠软骨细胞结合的凝血酶分离大鼠关节软骨细胞的初级培养物，并且制备用于体外的已确定方法的分析中(参见Kuettner，K.E.，et al.，细胞生物学杂志93743-750，1982)。简要地说，从大鼠的肩中离解出软骨片，在组织培养基(DMEM)中，37℃，搅拌，用胰蛋白酶消化片块一小时，用胶原酶消化3小时。在烧瓶中，高密度布展细胞(50,000/cm sq.)，并且在含有抗生素抗坏血酸的DMEM中，在37℃，在5％CO2的大气中培养。
利用已确定的凝血酶受体结合实验进行与125I凝血酶与软骨细胞的特异结合，实验方法如美国专利5,352,664中公开的，和Carney，DH和Cunningham，DD，细胞151341-1349，1978中所述。简要地说，将高纯度的人凝血酶碘化，并且加入到有或没有未标记的凝血酶的软骨细胞的培养过程中，以纠正非特异的结合。通过用不同浓度的已标记凝血酶温育细胞和测量凝血酶与细胞结合的量和培养基中的游离的凝血酶的量，估计每个细胞的受体的数目和凝血酶和结合位点的亲和力是可能的。
三个分离实验中的已标记凝血酶结合的Scatchard分析表明，大鼠软骨细胞表达了平均3000个非常高亲和力的结合位点(100pM亲和力)和230,000个高亲和力位点(27nM)。
实施例2ANPAR激动剂对小牛软骨细胞的增殖的刺激利用实施例1中关于大鼠软骨细胞所述的方法，制备小牛软骨细胞的初级培养物。在24孔的塑料盘中低密度亚培养这些培养物，放置于1％的血清。在本身浓度为1.0或10ug/ml时加入NPAR激动剂TP508到这些培养物中，不会刺激细胞的增殖。相反，在培养三天后，与单独加入凝血酶相比，加入这些浓度的TP508和小量的凝血酶共有丝分裂原导致小的，但明显的(p＜0.05)的细胞数目的增加，这个细胞数目的增加。
实施例2BNPAR激动剂刺激小牛软骨细胞糖蛋白合成为了确定NPAR激动剂对糖蛋白合成的效果，在96孔的平板上以每孔2×105个细胞的密度播种，并且用10％的胎牛血清在DMEM中培养。在确定这些多层的培养后，用含有已表明浓度的TP508，从1到100ug/ml的含有1％的血清的DMEM每天替代培养基(表1)。在每天改变有或没有TP508的培养基，培养6天后，在培养基中加入35S硫酸盐，继续温育24小时。如表1所示，用高浓度的TP508(100ug/ml)的处理比未处理的细胞增加35S硫酸盐的掺入有10倍以上。
表1.在小牛软骨细胞培养中，NPAR激动剂TP508对35S硫酸盐掺入的影响
实施例3A 在已培养的大鼠关节软骨细胞中，NPAR激动剂刺激繁殖合成如实施例1所述，利用胰蛋白酶和胶原酶消化，从关节的肩软骨的片中分离大鼠关节的软骨细胞。利用如Guo et al.(Conn.Tiss.Res.19277-297，1998)所述的已确定的技术确定对软骨细胞“3维”海藻酸胶的小珠培养物(Conn.Tiss.Res.19277-297，1998)。在用胰蛋白酶从组织培养烧瓶中除去细胞后，在海藻酸胶(1.2％w/v)中悬浮细胞，用22gauge的针，在102mMCaCl2中逐滴融合慢慢表达。当液滴接触CaCl2时，有几乎不间断的海藻酸的聚合产生凝胶小珠。然后，在DMEM培养基中洗涤小珠3次，转移到35mm的盘中，在37℃，在5％的CO2大气压下，通过每两天用培养基饲喂维持培养。
通过从35mm的盘中除去小珠，用0.9％的盐水洗涤和在37℃，加入1ml的55mM的柠檬酸钠，0.15M NaCl溶解海藻酸盐小珠10分钟确定3维海藻酸盐培养3天后，NPAR激动剂TP508对软骨细胞繁殖的影响。用磷酸缓冲的盐水(PBS)1∶10稀释1ml溶解的小珠确定细胞数，并且用Z-系列计数器计数细胞。如表2所示，TP508本身刺激3维培养中的软骨细胞的繁殖。
表2.NPAR激动剂TP508在3维培养中对大鼠软骨细胞的繁殖的影响
实施例3B在培养的大鼠关节软骨细胞中，NPAR激动剂刺激糖蛋白的合成为了确定NPAR激动剂TP508对糖蛋白合成的影响，如上所述制备了3维海藻酸培养物，并且测试了[35S]-硫酸盐的掺入。将小珠培养物与标明浓度的TP508以及[35S]硫酸盐(20uCi/ml)接触，每天改变培养基，在掺入[35S]硫酸盐后的第7天收获。在每个时间点，移取5-10个小珠，用0.9％的盐水洗涤3次，加入0.5ml的55mM的柠檬酸钠，0.15M NaCl在37℃，如上所述溶解10分钟，在液体闪烁计数器中计数。在每个样品中，对加入的小珠的数目，将[35S]硫酸盐的掺入归一化。如表3所示，在300nM(约0.7ug/ml)的浓度单独的TP508处理，刺激了[35S]硫酸盐掺入超过对照50％。也有30uM的TP508(约70ug/ml)的大刺激，但是，在这一浓度的测量中有一个大的相对标准的偏差。
表3.NPAR激动剂TP508对[35S]硫酸盐掺入进糖蛋白的影响
实施例4TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微球体的制备利用双乳化技术制备含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)的微球体。简要地说，在二氯甲烷和溶解于水中的TP508中溶解基质成分。当涡旋形成油中水(W/O)乳液时，将两者逐步混合在一起。将聚乙烯醇(水中0.3％)加入到乳液中，进一步涡旋形成第二个乳液(O/W)，从而形成双乳液(PLGA小滴组成的O/W乳液，在这些小滴中，第二个分散相由水中的TP508组成。在相分离的基础上，PLGA小滴形成分散的微球体，含有持有TP508的腔。为了引起微球体的相分离，加入2％的异丙醇溶液。通过离心收集颗粒，并且然后冻干除去残余的水分。改变基质的组成，形成不同释放动力学的微球体(表4)。
表4不同微球体配方的组成
在Coulter计数器中测量了微球体的平均直径，在二氯甲烷中溶解称重的微球体样品和萃取释放的药物进水中后，在276nm通过光谱实验测量药物诱捕效率(表5)。
表5配方直径和药物诱捕效率
为了测量从不同的PLGA基质释放TP508，在1.5ml的聚丙烯微型离心管中含有的1.0mlPBS中放置20mg的微球体。在37℃温育试管，在60rpm振摇。在各个时段，离心试管，移取含有释放的TP508的上清液，冷冻随后分析。在微球体中加入新鲜的PBS，连续温育。通过在276nm处的吸光值的测量，测量上清液中的TP508。对于每个配方，进行四等分的释放测定。配方B和D在37℃温育28天的过程中没有显示可检测的药物释放。其余的配方都释放了可检测量的TP508，虽然在所有的情况中，3-4天内释放的药物的量在可检测的限制值以下(＜1ug/mg基质/天)。配方A和C显示了TP508的最大释放，在3-4天释放了陷入药物的60-80％。配方C显示了最快的释放动力学，选择用于在实施例5中所述的大鼠软骨缺陷模型中进行测试。
实施例5在大鼠模型中，NPAR激动剂TP508刺激软骨的生长幼小的，雄性新西兰兔子(2-3kg)(n＝15)麻醉后，给予双侧的，医学纵裂副侧关节术。用electrocautery切出皮肤，皮下组织和关节囊，使出血最少。通过髌骨后侧的离解暴露关节表面。利用外科钻和点不锈钢钻在股骨的滑车沟中做一个1-2毫米深的完全厚度的缺陷处。目的是将缺陷处扩展成软骨下的平板，但不能刺到软骨下的骨。
将兔子分成3组。对每个兔子，用同样的处理来填充右边和左边的滑车沟缺陷处。在这一研究中，将TP508配制成如实施例4中所述制备的PLGA控制释放微球体(配方C)。将微球体与足够的多聚F68凝胶(5％w/v)混合，结合球体，一起成糊状的稠性，可以容易地填充进缺陷处。对照组在两个缺陷处接受没有TP508的PLGA微球体。处理的组接受含有10或50mgTP508/缺陷处的微球体。在4星期时杀死来自每个组的一个兔子，在6星期时杀死每个组中的2个兔子，剩下的动物在第9个星期杀死。固定样品，进行组织学分析。
在杀死的时候，在对照缺陷中，似乎有相当多的纤维颗粒组织，而没有类似白色的软骨物质。相反，在10ug的处理组和50ug的组中的缺陷处中，缺陷有近似均一的，浓密的，白色的物质填充。在外科手术后6个星期，在处理和对照缺陷之间，显微镜的差异不那么明显。
4个星期的样品的组织学分析表明，对照缺陷处确实填充了似乎是代表包括炎性和成纤维细胞的早期颗粒组织。相反，10和50微克的处理缺陷处似乎是具有大数目的软骨细胞和软骨形成的早期迹象。这一效果在6星期时更明显。对照具有小量的结缔组织，但软骨修复的迹象很少。相反，在10ug和50ug的处理缺陷处，似乎是在缺陷处的顶部与透明的软骨的形成有很好的整合，和大范围的软骨下的骨修复。
9个星期的TP508的处理缺陷处中主要占有透明的基质，通过阳性safranin-O-染色，可见明显的软骨量。在大多数情况中，在修复位点和天然的组织之间，软骨的量没有差异。组织学结果是用分级系统定量评估的，这一系统是Freed，et al.，生物医学物质研究杂志，28891-899(1944)采用了O’Driscoll，et al.，骨关节外科杂志1261448-1452(2000)中的方案进行的，正常的关节软骨的最小得分是25。实验TP508处理的缺陷得到了明显比对照缺陷高的平均得分(表6)。
表6-关节缺陷研究的组织学得分TP508毫克数 修复结果±SE0 9.4+1.610 18.6±1.450 19.8±1.0
修复的肽处理缺陷处具有光滑的关节表面，通常在修复和天然组织之间的连接处很好地连接。对照修复组织的质量是特征是纤维化软骨，和关节表面质量不好。在修复和天然组织之间的接合处的整合通常不好。全面地说，TP508修复的软骨的质量比对照非处理缺陷明显增强。提高修复组织的质量应该导致关节的生物机械更耐久和功能的恢复，并且减少了患有创伤软骨损伤的患者中骨关节炎的症状。
当对本发明根据优选的实施方案进行了表示和叙述后，本领域技术人员应该理解，在不脱离附加的权利要求书包括的本发明的范围的情况下，可以有各种形式和细节的变化。
权利要求
1.一种在需要软骨生长或修复的受试者中的位点刺激软骨的生长或修复的方法，所述的方法包括对该位点给药治疗有效量的非蛋白质水解激活凝血酶受体的激动剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中位点是关节。
3.根据权利要求1所述的方法，其中位点正在治疗软骨损伤或缺失。
4.根据权利要求1所述的方法，其中位点正在治疗由于创伤造成的软骨损伤或缺失。
5.根据权利要求1所述的方法，其中激动剂是包括下面的结构式代表的多肽的凝血酶肽衍生物Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有约12到23个氨基酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或具有至少6个氨基酸的C末端截断的片段，假设丝氨酸保守序列中的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO1的对应位置不同。
8.根据权利要求6所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或至少具有9个氨基酸的C末端截断的片段，假设丝氨酸保守序列中的0，1或2个氨基酸是对应于SEQ IDNO1中的氨基酸的保守取代。
9.根据权利要求6所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val，其中X1是Glu，X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或SEQ ID NO2的C末端截断片段，所述的片段至少具有6个氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)，其中X1是Glu或Gln，X2是Phe，Met，Leu，His或Val。
12.根据权利要求11所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO5的对应位置的氨基酸不同。
13.根据权利要求11所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO5的对应位置的氨基酸的保守取代。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在药物组合物中给药的凝血酶肽衍生物另外包括可植入的，生物兼容的载体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中载体包括聚乳酸/聚乙醇酸同多聚物或共聚物。
16.一种在需要软骨生长或修复的受试者中的位点刺激软骨生长或修复的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)序列的肽的步骤。
17.一种在受试者的关节中刺激软骨生长的方法，所述的方法包括在该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽的步骤。
18.一种在正在治疗软骨缺失的位点刺激受试者的软骨生长的方法，所述的方法包括在该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽。
19.一种在正在治疗由于创伤导致的软骨缺失的位点中，刺激受试者的软骨的生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽的步骤。
20.一种在体外培养软骨细胞的方法，其特征在于在存在刺激量的NPAR激动剂时培养软骨细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，进一步包括对需要软骨修复或生长的受试者的位点给予治疗有效量的培养的软骨细胞。
全文摘要
公开的是在需要生长，修复或再生的受试者中，在一个位点刺激软骨生长，修复或再生的方法。该方法包括在该位点给药治疗有效量的非蛋白质水解性激活凝血酶受体的激动剂的步骤。同时公开的是在体外刺激软骨细胞的增殖和扩展。该方法包括在存在刺激量的NPAR激动剂时培养软骨细胞。
文档编号A61P43/00GK1458974SQ01815821
公开日2003年11月26日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月20日
发明者达芮尔·H·卡尼, 罗杰·S·库劳泽尔, 珍妮特·斯蒂尔伯格, 约翰·伯格曼 申请人:德克萨斯系统大学董事会
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