用凝血酶肽衍生物刺激骨生长的制作方法
专利名称：用凝血酶肽衍生物刺激骨生长的制作方法
政府支持本发明全部或部分是由国家健康研究院的I R43 AR4550801和2 R44 AR45508-02援助基金的资助。政府在本发明中有一定的权利。
相关的申请本申请要求保护2000年7月19日递交的美国临时申请第60/219,300号的权益，其全部内容通过在此引证而合并于本文。
背景技术：
哺乳动物骨组织具有明显的再生能力，从而修复损伤和其他缺陷处。例如，骨生长通常足以引起最简单的和细微的骨折完全恢复。但是，不幸的是，在许多损伤，缺陷或症状中，骨生长是不能恰如其分地获得可接受的结果的。例如，在大的空间，通常不发生骨再生。所以，骨折不能愈合，除非这些碎片是在近处。如果损伤的结果丢失了明显量的骨组织，愈合过程可能是不完全的，导致不如意的外观和/或机械的结果。这经常是非联合的骨折或来自大的创伤的骨损伤。组织生长通常在例如外科除去肿瘤或囊腔引起的骨中的空隙中也是不适当的。在其他情况中，可能需要刺激骨不正常的，即异位的生长。当两个或多个脊柱骨诱导融合时，脊柱融合释放更低的背部疼痛是一个需要的异位骨形成的例子。通常，裂隙和区段缺陷需要骨移植来成功地修复或裂隙填充。开发有效的骨移植取代方法将消除在移植过程中从第二外科位点收获骨的需要，从而明显地减少患者经受的不舒服，和发生供体位点愈合综合症的危险。
在那些通常无法发生骨生长的未经处理的位点中刺激或诱导骨生长的化合物是“骨诱导”性的。骨诱导化合物作为处理如上所述的症状的药物具有巨大的价值。许多骨诱导蛋白质已经利用重组技术鉴定，分离和表达。例子包括在WO95/16035中的美国专利号5,902,705中公开的骨形态蛋白质(BMP)。但是，利用重组蛋白质作为治疗试剂通常具有许多缺点，包括生产的耗价，体内生物降解和短的半衰期。随后，科学家连续地研究没有前面提到的缺点的新的骨诱导试剂。
发明的概述已经发现，激活非蛋白质凝血酶受体的化合物是骨诱导的。例如，化合物TP508，非蛋白质水解凝血酶受体的激动剂刺激雄性新西兰兔子的尺骨中产生的区段性关键大小的缺陷处(实施例2)。正如X衍射所示，和组织学和机械测试证明，在与未处理的对照比较时，剂量100ug和200ug的TP508诱导的骨形成中有明显的增加。根据这些结果，本文公开了受试者中刺激骨的生长的新方法和新的可移植药物组合物。
本发明的一个实施方案是在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法。该方法包括对该位点给药治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。
本发明的另一个实施方案是含有可移植的，可生物兼容的载体和非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的药物组合物。
本发明的方法涉及在受试者中刺激骨生长，并且可以用于不发生骨生长，没有用自身骨移植治疗或给药骨生长因子的位点。该方法包括给药非蛋白质水解的凝血酶受体的激动剂。这样的激动剂包括与人的前凝血酶的氨基酸508到530之间的区段有同源性的小肽。这些小肽并不昂贵，可以大量制备，并且在低剂量时也是骨诱导的。另外，它们的冻干形式当在5℃和60％的相对湿度下，至少在30个月中是稳定的。
本发明的详细说明“骨诱导”指如果位点保持未处理，在很少或没有骨生长的受试者中的位点刺激骨生长。可以从骨生长的诱导得到治疗益处的位点认为是“需要骨诱导的”。例子包括非联合性的骨折或其他严重的或大面积的骨损伤。应该注意到，骨生长通常发生在骨损伤的时候，如简单的或细微的骨折和只有小裂隙的对抗很好的复合骨折，不需要其他治疗。这样的损伤不认为是“需要骨诱导的”。
简单的骨折修复似乎是与填充非联合性的骨折，区段性裂隙或除去骨肿瘤或囊引起的骨空腔需要的骨形成的诱导是非常不一样的。这些情况中需要骨的移植或新的骨生长的诱导，通常利用了一些类型的基质或支架作为骨生长的替代物。已诱导的骨生长也可以在受试者中的一些位点具有治疗优势，这些位点指“异位”位点，其中通常没有发现骨组织，如需要骨移植或骨融合的位点。融合通常用于治疗通过物理地结合一个或几个椎骨和它们的四周来治疗的较低的背疼痛。这样的融合产生的骨定位于通常不是骨组织占据的位点。在这些异位位点的骨诱导可作为“移植取代物”，从而在脊柱之间诱导骨生长，取代移植体的位置，避免了二次手术收集移植过程中的骨。骨生长的诱导也是治疗后天的和先天的craniofacial和其他骨骼或牙齿畸形所需要的(参见，例如，Glowacki et al.，Lancet 1959(1981))；进行牙齿和牙周的再构建，其中需要失去的骨的替代或骨的增大如颌骨；补充牙周疾病产生的牙周骨的损失，推迟落牙(参见例如，Sigurdsson et al.，牙周杂志，66511(1995))。
申请人已经发现，刺激或激活非蛋白质水解激活的凝血酶受体的化合物(下文中称为“NPAR”)是骨诱导的。这样的化合物称为NPAR激动剂。NPAR是大多数细胞表面上存在的高亲和力凝血酶受体。这一NPAR成分是负责凝血酶，蛋白质水解激活的凝血酶和凝血酶派生的肽与细胞的高亲和力结合的。NPAR似乎是介导不依赖它的蛋白质水解活性的凝血酶启动的许多细胞信号的。一个这样的信号的例子是膜联蛋白V和消减杂交鉴定的其他分子的上调(参见Sower，et al.，实验细胞研究247422(1999))。所以，NPAR的特征是，它在细胞表面与凝血酶有高亲和力反应，并且它被凝血酶和如下所述的凝血酶派生的肽激动剂的蛋白质水解失活的衍生物激活。NPAR激活可以根据当在存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C或与125I凝血酶高亲和力结合竞争凝血酶受体的分子时，加到成纤维细胞中时刺激细胞的繁殖的能力来进行测试，如美国专利号5,352,664和5,500,412和Glenn et al.，肽研究杂志，165(1988)中所述。NPAR是与其他凝血酶结合蛋白质和凝血酶的蛋白质水解激活受体的克隆家族，包括PAR1，PAR2，PAR3和PAR4受体是有区别的。PAR1具有特异的凝血酶裂解位点，允许裂解凝血酶暴露新的氨基末端区，作为在其自身回折诱导它的激活的黏连配体(参见，Vu et al.，细胞641057(1991))。PAR2具有相似的激活机制，但原则上是胰蛋白酶类似酶激活的(参见，Zhong，et al.，生物化学杂志，26716975(1992))。PAR3也具有相似的激活机制，并且似乎是作为血小板中的第二个凝血酶受体起作用的(参见，Ishihara，et al.，自然386502(1997))。PAR4已经在小鼠巨核细胞中检测，研究表明，它也在人血小板中起作用(参见，Kahn，et al.，自然，394690(1998))。与这些PAR受体相反，NPAR的激活不需要蛋白质水解的裂解。
几个证据表明，NPAR是与PAR受体不同的(1)细胞的群体已经分离，完全表达了功能性PAR1受体，但由于在NPAR信号转导途径中有缺陷，所以对凝血酶没有应答(参见，Kim，et al.，细胞生理学，160573(1994))；(2)嗜中性粒细胞以高亲和力结合125I凝血酶，它们的趋化性是受蛋白质水解激活的凝血酶或NPAR激动剂刺激的(参见，Ramakrishnan和Carney，细胞分子生物学41993(1993))，但是它们不表达PAR1(参见Jenkins，et al.，细胞科学杂志，1083059(1995))；(3)IIC9成纤维细胞过度表达PAR1，但不以高亲和力结合凝血酶(参见，Kim，D.Ph.D.Dissertation.Galveston，Texas大学医学分院，1995；和Low et al.，“癌症细胞3/生长因子和转化”，冷泉港实验室，纽约)；和(4)NPAR激动剂对来自PAR受体激动剂肽的那些的基因表达有明显的影响(参见，Sower，et al.，实验细胞研究247422(1999)。
NPAR激动剂的一个例子是凝血酶肽衍生物，即不超过约50个氨基酸，优选地不超过约30个氨基酸，与对应于前凝血酶氨基酸508-530(SEQ ID NO5)的人凝血酶具有足够的同一性能激活NPAR的多肽。本文所述的凝血酶肽衍生物优选地具有12-23个氨基酸，更优选地具有19-23个氨基酸，凝血酶肽衍生物的一个例子包括结构式(I)代表的成分Asp-Ala-R(I)
R是丝氨酸酯酶保守区域。丝氨酸酯酶，例如胰蛋白酶，凝血酶胰凝乳蛋白酶等等，具有高度保守的区域。“丝氨酸酯酶保守区域”指，具有一个这样的保守区域的氨基酸序列，并且足以与一个这样的保守区域同源，使凝血酶肽衍生物保留了NPAR激活能力的多肽。
在一个实施方案中，丝氨酸保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或具有SEQ ID NO1中的氨基酸序列的多肽的C末端截断的片段。但是，应该理解，在丝氨酸保守序列中的0，1，2或3个氨基酸可以与SEQ ID NO1的对应的氨基酸相区别。优选地，与对应的SEQ ID NO1中的氨基酸不同的丝氨酸保守序列中的氨基酸是保守的取代，并且更优选地是高度保守的取代。“C末端截断的片段”指在从C末端除去一个氨基酸或氨基酸的组后剩余的一个片段，所述的片段至少具有6个，更优选地至少9个氨基酸。
更优选地，丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val；X1是Glu或Gln，X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或其C末端截断的片段至少具有6个氨基酸，优选地至少具有9个氨基酸。
在优选的实施方案中，凝血酶肽衍生物包括一个丝氨酸酯酶保守序列和一个具有特异凝血酶氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的多肽。这一类型的凝血酶肽衍生物的一个例子包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)。X1和X2如上定义。当凝血酶肽衍生物包括SEQ ID NO4时，优选地它具有SEQ ID NO5的氨基酸序列(Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其N末端截断的片段，假设凝血酶肽衍生物位置1-9中的0，1，2或3个氨基酸与SEQID NO5的对应的位置的氨基酸不同。优选地，与SEQ ID NO5中的对应的氨基酸不同的凝血酶肽的衍生物中的氨基酸是保守取代，更优选地是高度保守的取代。“N末端截断的片段”指在从N末端除去一个氨基酸或氨基酸的组后剩余的片段，优选地是不超过6个氨基酸的组，更优选地是不超过3个氨基酸的组。
TP508是凝血酶肽衍生物的例子，并且具有SEQ ID NO5的氨基酸序列。
“保守取代”是用具有相同的静电荷和大约同样大小和形状的另一个氨基酸取代。当在它们的侧链中的碳数目和杂合原子的区别不超过约4个，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有大约相同的大小。当它们的侧链中的分支的数目的区别不超过一个时，它们约具有相同的形状。在它们的侧链中的具有酚或取代酚基团的氨基酸认为约具有相同的大小和形状。下面列出的是5个氨基酸组。用来自相同组的另一个氨基酸取代多肽中的一个氨基酸产生了保守取代组1甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，和具有C1-C4脂肪族的或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链(直链或单分支)的非天然存在的氨基酸。
组2谷氨酸，天冬氨酸和具有羧基取代C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组III赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍基取代C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组IV谷氨酸，天冬氨酸和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组V苯丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。
“高度保守的取代”是用在侧链中的和大小和形状接近的相同功能的基团的另一个氨基酸取代。有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸当侧链中的碳和杂合原子的总数的差别不超过两个时，它们的大小几乎相同。当在它们的侧链中，它们具有相同数目的分支时，它们具有相近的形状。高度保守的取代的例子包括，缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，苯丙甘氨酸取代苯丙氨酸。不高度保守的取代的例子包括丙氨酸取代缬氨酸，丙氨酸取代丝氨酸和天冬氨酸取代丝氨酸。
其他NPAR激动剂包括结合和激活NPAR的小的有机分子。这一类型的激动剂通常可以用高流量筛选，例如，评估当存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的分子时，加到成纤维细胞中时分子刺激细胞繁殖的能力的实验来鉴定，如美国专利号，5,352,664和5,500,412中所公开的。美国专利号5,352,664和5,500,412的全部内容都通过在此引述而合并于本文。
术语“NPAR激动剂”也包括已知激活NPAR的化合物和化合物的结合体。例子公开在美国专利号，5,352,664和5,500,412中，包括DIP-alpha凝血酶与乙酸肉豆蔻佛波醇的结合体。
用于本文所述的药物组合物的可移植生物兼容载体可作为NPAR激动剂的适当的递送或支持系统。生物兼容载体应该是非毒性的，非炎性的，非免疫原性的，在移植位点可避免不需要的反应的。适当的载体用于释放活性成分，优选地是在移植位点慢慢地，持续的释放。
适当的载体包括多孔的基质，其中骨祖先细胞可以迁移。成骨细胞经常可以附着于这样的多孔基质，然后可以作为骨和组织生长的支架。在一些申请中，载体应该具有足够的机械强度以维持它的三维结构，和辅助正在联合或移植到一起的骨的部分的固定。提供组织生长的支架的多孔基质可以加速骨的生长速度，可以说是“骨诱导性的”。骨传导载体用于本文所述的药物组合物中是非常优选的。
适当的骨传导载体的例子包括胶原(例如，小牛皮胶原)，纤维蛋白，磷酸钙神经酰胺(例如，羟磷灰石和磷酸三钙)，硫酸钙，胍萃取的异种骨和其联合。许多适当的载体是可以购买得到的，如COLLOGRAFT(Collagen Corporation，Palo Alto，CA)，是羟磷灰石，磷酸三钙和原纤维胶原的混合物，和INTERPORE(InterporeInternational，Irvine CA)，是羟磷灰石生物基质(是海洋核心碳酸钙转化成结晶的羟磷灰石而形成的)。
许多合成的生物降解多聚物可以作为骨传导的载体，具有持续释放的特征。这些多聚物的说明可以在Behravesh et al.，Clinical Orthopaedics 367S118(1999)，和Lichun et al.，“将来的控制药物递送的设计技术”中的骨生长因子的多聚体递送载体，Park and Mrsny编辑，美国化学协会，华盛顿，DC(2000)中找到。这些参考文献的全部内容都通过在此引述而合并于本文。这些多聚物的例子包括聚alpha羟基酯，如聚乳酸/聚乙醇酸同聚物和共聚物，PPHOS，聚酸酐和聚(丙烯富马酸)。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)同聚物和共聚物是本领域已知的持续释放的载体。释放的速度可以通过技术人员改变聚乳酸与聚乙醇酸的比例和多聚物的分子量来调整(参见，Anderson，et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.285(1997)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。将聚(乙二醇)作为混合体掺入多聚物形成微型颗粒载体另外允许改变活性成分的释放方案(参见，Cleek et al.，控制释放杂志，48259(1997)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。陶瓷，如磷酸钙和羟磷灰石也可以掺入配方提高机械质量。
PPHOS多聚物在多聚物骨架中含有替代的氮和没有碳的磷，如下面的结构式(II)所示 多聚物的特性可以通过适当改变与多聚物骨架结合的侧链基团R和R’来调整。例如，通过PPHOS降解和释放药物可以通过改变对水解不稳定的侧链基团的量来控制。咪唑基和乙二醇取代的PPHOS的更多的掺入后，可以观察到降解速度的增加(参见Laurencin et al.，J Biomed Mater.Res.27963(1993)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)，从而增加了药物释放的速度。
结构通式(III)所示的聚酸酐具有已经确定的降解和释放特性，可以通过改变疏水或亲水单体如葵二酸和1，3-双(p-羧氧苯氧基)丙烷(参见Leong et al.，J.Biomed.Mater.Res.19941(1985)，其全部内容引入作为参考)。为了改变机械强度，酸酐经常与酰胺共聚化形成聚酸酐共酰胺。适用于外科应用的聚酸酐共酰胺的例子是聚(苯三亚氨-甘氨酸-共-1，6-双(羧氧苯氧基)己烷和焦苯三亚氨丙氨酸1，6-双(p-羧氧苯氧基)己烷共聚物。
聚丙烷富马酸(PPF)是非常需要的生物兼容可移植载体，因为它们是可注射的，原位可聚合的，可生物降解的物质。“可注射”指物质可以通过针筒，通过用于注射糊和凝胶的标准的针来注射。PPF，结合了乙烯基单体(N-乙烯吡咯烷酮)和起始物(苄甲酰过氧化物)，形成了可以原位聚合的可注射溶液。特别适于填充多种大小和形状的骨骼缺陷(参见Suggs et al.，大分子304318(1997)，Peter et al.，J.Biomater.Sci.Poly.Ed.10363(1999)和Yaszemski et al.，Tissue Eng.141(1995)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。
本发明的药物组合物可以通过在需要骨诱导的位点移植给药。“移植”或“在一个位点给药”指，当NPAR激动剂从药物组合物中释放时，在需要治疗的位点的足够的附近从而使发生骨诱导(例如，在存在NPAR激动剂时有骨生长，没有时少而没有生长)。
药物组合物可以如需要在外科手术的参与下构型，或由外科手术过程中的技术人员构型。优选地，将基质构型成跨越组织缺陷处，和采取需要的新的组织的形式。例如，在非联合缺陷的骨的修复的情况中，利用跨越非联合缺陷的维向是需要的。在骨形成过程中，物质是通过人体慢慢吸收的，并且是由非常接近移植体形状的骨来替代的。或者，药物组合物可以在该位点中以微颗粒或微球体的形式给药。微颗粒可以通过外科暴露该位点与需要骨诱导的位点接触或放置在该位点的附近，和将微颗粒通过涂抹，喷洒，注射等等施加到该位点上或其附近。微颗粒也可以通过内部手术或剖开术递送到位点。PLGA微颗粒的制备和它们刺激骨生长的用途在实施例1和2中有叙述。
仍然在另一个或选方案中，药物组合物可以部分地内限在支持性的物理结构中，如网，线基质，不锈钢笼中，线的内体融合笼等等，然后在对需要骨诱导的位点给药。
应用本发明的的药物组合物的另一个或选方法是注射。可注射的组合物包括如上所述的聚(丙烯富马酸)共聚物的溶液和磷酸钙陶瓷的糊(参见Schmitz et al.，J.Oral Maxillofacial Surgery571122(1999)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。可注射的组合物可以直接注射到需要骨诱导的位点，并且可以常规地用于填充空隙和融合骨，而不需要侵入性的外科。
NPAR激动剂也可以通过移植的方法给药，例如将包含可接受的药物载体中的NPAR激动剂的溶液直接应用到位点或其附近。溶液的给药可以常规地通过针筒，通过外科打开或通过肠胃外给药到需要的位点来完成。可以利用标准的药物配方技术如Remington药物科学中所述的，Mack出版社，Easton，PA。适当的肠胃外给药的药物载体包括例如，无菌水，生理盐水，无菌盐水(含有约0.9％mg/ml的苄甲醇的盐水)，磷酸缓冲盐，Hank溶液，Ringer乳酸盐等等。
“治疗有效量”是导致骨生长的NPAR激动剂的量，其中在没有激动剂时只有少的或没有骨的生长。通常，给药激动剂足够的时期，达到需要的治疗或外观效果，即，足够的骨生长。给药的量将依赖于需要的骨生长的量，受试者的健康，大小，体重，年龄和性别，和药物配方的释放特征。通常，通过连续释放或直接应用到需要骨生长的位点给药约1ug/day到约1mg/day NPAR激动剂之间(优选地约5ug/day和约100ug/day)。
NPAR激动剂或本发明的可移植的药物组合物可以用于与可移植的假器官装置结合使用。例如，治疗有效量的药物组合物可以放置于假器官移植体上，它们放置在可植入的表面区上，与需要骨诱导的位点邻接。或者，构建假器官装置，使其能够以预定的速度连续地释放可移植的药物组合物或NPAR激动剂。修复可以通过包含金属或陶瓷的物质来进行。修复装置的例子包括髋骨装置，螺旋，杆和钛的笼，可用于脊柱的融合。
所以，本发明也提供了在受试者的需要骨诱导的位点植入家器官装置来刺激骨生长的方法。假器官至少是部分地用可植入的如本文所述的药物组合物包衣，并且可植入在需要骨诱导的位点，和在该位点维持足够的时期，允许刺激骨的生长。
“受试者”优选地是人，但也可以是需要治疗的动物，如伴侣动物(例如，狗，猫等等)，农场动物(例如，牛，猪，马等等)，和实验室动物(例如，大鼠，小鼠，滕鼠等等)。
凝血酶肽衍生物可以通过固相肽合成方法(例如，BOC或FMOC)，通过液相合成，或其他适当的技术包括前面提到的方法的结合来合成。BOC和FMOC方法是已确立和广泛使用的，在下面的文献中有叙述，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.882149(1963)；Meienhofer，激素蛋白质和肽，C.H.Li，Ed.，学术出版社，1983，48-267页；和Barany and Merrifield，肽，E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，学术出版社，纽约，1980，3-285。固相肽合成的方法在下面的文献中有叙述Merrifield，R.B.，科学，232341(1986)；Carpino，L.A.and Han，G.Y.，J.Org.Chem.，373404(1972)；和Gauspohl，H.et al.，合成，5315(1992))。这六篇文章的全部内容都通过在此引述而合并于本文。
本发明通过下面的实施例进一步说明，但不已任何方式来加以限制。
实施例实施例1-制备TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微球体利用双乳化技术制备含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物的微球体(PLGA)。简要地说，在二氯甲烷中溶解基质成分，在水中溶解TP508。当涡旋形成油中水(W/O)乳液时，将两者逐步混合在一起。聚乙烯醇(水中3％)加入到乳液中，进一步涡旋形成二次乳液(O/W)，从而形成双乳液PLGA小滴组成的和在那些小滴内组成的O/W，第二分散相包括水中的TP508。在相分离的基础上，PLGA小滴形成形成含有持有TP508的腔的分散的微球体。为了引起微球体的相分离，加入2％的异丙醇溶液。通过离心收集颗粒，然后冻干除去残留的水分。可以改变基质的组成形成不同释放动力学的微球体(表1)。
表1不同的微球体配方的组合物
在Coulter计数器中测量微球体的平均直径，通过在276nm的光谱测试测量药物的陷入效率，接着在二氯甲烷中溶解已称重的微球体样品，和在水中萃取释放的药物(表2)。
表2配方直径和药物包陷效率
为了测量从不同的PLGA基质中释放TP508，将20mg微球体放置于在1.5ml的聚丙烯微型离心管中的1.0ml的PBS中。在37℃温育试管和在60rpm振摇。在各个时间，离心试管，并且除去含有释放的TP508的上清液，冷冻，随后分析。在微球体中加入新鲜的PBS，和连续地温育。在276nm处观察吸光值测量上清液中的TP508。对于每个配方，进行四分的释放测定。在37℃，38天的温育过程中，配方B和D没有显示可检测的药物释放。虽然在所有的情况中，药物释放的量在3-4天内落在可检测的限制范围以外(＜1ug/mg基质/天)，但剩余的配方都释放了可检测的TP508的量。配方A和C显示，更大的TP508的释放，在3-4天内释放了60-80％的包陷的药物。选择更快释放动力学的配方C进一步在体内研究中进行测试。
实施例2-含有TP508的PLGA微球体诱导兔子尺骨中的大的缺陷(1.5cm)中的骨形成配方在20个雄性新西兰兔子的每个尺骨中产生1.5cm的区段性缺陷。这些双侧的尺骨术准确地产生相同的大小是通过利用小的金属尺指导丁字锯子的切割刀片来进行的。每个兔子可作为自身的对照；所以用不含有TP508的微球体填充左侧的缺陷处，而用含有100或200ug TP508的微球体填充右侧缺陷处(10个动物/组)。如实施例1所述制备微球体。将给予双侧尺骨术的兔子任意分成两组。第一组在右侧的肢体中接受100ug的微球体(30mg)中的TP508，左侧的肢体中只接受微球体。同样处理第二组，但接受了200ug的TP508。以不同的比例混合含有TP508和没有TP508的微球体获得不同的剂量。以两星期的间隔，在第3个星期开始，将动物进行X衍射，在第9个星期时杀死动物。
在外科手术后的3和5个星期时，在缺陷处，100ug的TP508刺激矿质化。在第7和9个星期时的X衍射似乎是和第5个星期时得到的那些是一样的。在外科手术后第9个星期，杀死动物，除去尺跷骨，并且拍照。在大多数情况中，在对照的肢体中的尺骨中大的缺陷仍然是可见的。相反在TP508处理的肢体中，大多数缺陷已经成功地关闭。
在外科手术后第9个星期时杀死动物后，通过扭转测试测量修复的强度(利用了MTS-858Minibionix机器)。结果表示在表3和4。
表3用100ug TP508处理的区段性缺陷处的扭转测试
^p＜0.05，+p＜0/01表4用200ug的TP508处理的区段性缺陷处的扭转测试
在100ug的组中，如所有测试的参数测量的，TP508使愈合的缺陷处的机械强度增加了双倍以上(表3)。在200ug的组中注意到了甚至更强的修复(表4)，大多数参数大约比低剂量处理的组中看到的高约50％。
概要地说，用含有NPAR激动剂TP508的微球体处理尺骨骨手术表明有骨矿质化和生长的证据，而在大多数接受骨传导的微球体的对照骨手术中，没有骨生长和/或没有填充空缺的区域。对机械强度和坚硬度的机械测试证明了在这一模型中TP508对骨形成的明显效果。因为TP508诱导了这些位点中没有TP508时不发生的骨形成，这一骨诱导的发现是与前面的研究不同的，其中TP508加快了没有TP508时也愈合的骨折或小的裂隙缺陷处的正常的骨折愈合的速度。
本发明已经根据优选的实施方案被描述和显示了，本领域技术人员应该理解，在不脱离权利要求界定的本发明范围的情况下，可以有各种形式和细节中的变化。
权利要求
1.一种在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该位点是需要骨移植的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该位点是骨中的区段性裂隙，在非联合的骨折中的骨空腔。
4.根据权利要求1中所述的方法，其中激动剂是包括下面的结构式代表的多肽的凝血酶肽衍生物Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有12到23个氨基酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其至少具有6个氨基酸的C末端截断的片段，假设，在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO1中对应位置的不同。
7.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO1所述的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或至少具有9个氨基酸的C末端截断的片段，假设丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2个氨基酸是SEQ IDNO1中的对应的氨基酸的保守取代。
8.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val，其中X1是Glu或Gln和X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或SEQ ID NO2的C末端截断的片段，所述的片段至少具有6个氨基酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括氨基酸序列，Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)，其中X1-是Glu或Gln和X2-是Phe，Met，Leu，His或Val。
11.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列，Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9中的0，1，2，或3个氨基酸与SEQ ID NO5的对应的位置中的氨基酸不同。
12.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO5的对应位置中的氨基酸的保守取代。
13.根据权利要求11所述的方法，其中凝血酶肽的衍生物是另外包括在可移植的，可生物兼容的载体的药物组合物中给药的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中可植入的，可生物兼容的载体是骨传导的基质。
15.根据权利要求11所述的方法，其中载体包括聚乳酸/聚乙醇酸同聚物或共聚物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中受试者是农场动物，伴侣动物或实验室动物。
17.一种药物组合物，其包括可植入的，可生物兼容的载体和非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中载体是骨诱导的。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中凝血酶受体激动剂是凝血酶肽衍生物，包括下面的结构式代表的多肽Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体是可生物降解的合成多聚物。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中可生物降解的合成多聚物是聚乳酸/聚乙醇酸同聚物或共聚物。
22.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体包括胶原，纤维蛋白，磷酸钙盐，硫酸钙，胍萃取的异源骨或其组合。
23.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体是可注射的。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中载体是聚(丙烯富马酸)溶液或磷酸钙陶瓷糊。
25.根据权利要求19所述的药物组合物，其中药物组合物是作为微球体给药的。
26.根据权利要求19所述的药物组合物，其中药物组合物是在应用到需要的骨诱导位点之前是先成形的。
27.根据权利要求19所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物具有12到23个氨基酸。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Prp-Phe-Val)，或至少具有6个氨基酸的C末端截断的片段，假设在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO1的对应的位置不同。
29.根据权利要求27所述的药物组合物，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其中至少具有9个氨基酸的C末端截断的片段，假设在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO1中的对应的氨基酸的保守取代。
30.根据权利要求27所述的药物组合物，其中丝氨酸酯酶的保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val)，其中X1是Glu或Gln和X2是Phe，Met，Leu，His or Val)，或SEQ ID NO2的C末端截断的片段，所述的片段至少具有6个氨基酸。
31.根据权利要求所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)的氨基酸序列，其中X1-是Glu或Gln和X2-是Phe，Met，Leu，His或Val。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列，Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物的位置1-9中的0，1，2，或3个氨基酸是与SEQ IDNO5的对应位置中的氨基酸不同的。
34.根据权利要求32所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列，Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO5的对应位置中的氨基酸的保守取代。
35.一种在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给药治疗有效量的具有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)的肽的步骤。
36.一种在受试者中需要骨移植的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的具有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)的肽的步骤。
37.一种在受试者中，在区段性的骨裂隙，骨空腔或非联合的骨折中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对骨裂隙，骨空腔或非联合的骨折给予治疗有效量的具有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)的肽的步骤。
全文摘要
公开的是在需要骨诱导的患者中的位点中刺激骨生长的方法。该方法包括对该位点给予治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。
文档编号A61K38/48GK1635899SQ01815822
公开日2005年7月6日 申请日期2001年7月18日 优先权日2000年7月19日
发明者达芮尔·H·卡尼, 罗杰·S·库劳泽尔, 戴维·J·西蒙斯, 杨金萍, 威廉·R·雷丁 申请人:德克萨斯系统大学董事会
政府支持本发明全部或部分是由国家健康研究院的I R43 AR4550801和2 R44 AR45508-02援助基金的资助。政府在本发明中有一定的权利。
相关的申请本申请要求保护2000年7月19日递交的美国临时申请第60/219,300号的权益，其全部内容通过在此引证而合并于本文。
背景技术：
哺乳动物骨组织具有明显的再生能力，从而修复损伤和其他缺陷处。例如，骨生长通常足以引起最简单的和细微的骨折完全恢复。但是，不幸的是，在许多损伤，缺陷或症状中，骨生长是不能恰如其分地获得可接受的结果的。例如，在大的空间，通常不发生骨再生。所以，骨折不能愈合，除非这些碎片是在近处。如果损伤的结果丢失了明显量的骨组织，愈合过程可能是不完全的，导致不如意的外观和/或机械的结果。这经常是非联合的骨折或来自大的创伤的骨损伤。组织生长通常在例如外科除去肿瘤或囊腔引起的骨中的空隙中也是不适当的。在其他情况中，可能需要刺激骨不正常的，即异位的生长。当两个或多个脊柱骨诱导融合时，脊柱融合释放更低的背部疼痛是一个需要的异位骨形成的例子。通常，裂隙和区段缺陷需要骨移植来成功地修复或裂隙填充。开发有效的骨移植取代方法将消除在移植过程中从第二外科位点收获骨的需要，从而明显地减少患者经受的不舒服，和发生供体位点愈合综合症的危险。
在那些通常无法发生骨生长的未经处理的位点中刺激或诱导骨生长的化合物是“骨诱导”性的。骨诱导化合物作为处理如上所述的症状的药物具有巨大的价值。许多骨诱导蛋白质已经利用重组技术鉴定，分离和表达。例子包括在WO95/16035中的美国专利号5,902,705中公开的骨形态蛋白质(BMP)。但是，利用重组蛋白质作为治疗试剂通常具有许多缺点，包括生产的耗价，体内生物降解和短的半衰期。随后，科学家连续地研究没有前面提到的缺点的新的骨诱导试剂。
发明的概述已经发现，激活非蛋白质凝血酶受体的化合物是骨诱导的。例如，化合物TP508，非蛋白质水解凝血酶受体的激动剂刺激雄性新西兰兔子的尺骨中产生的区段性关键大小的缺陷处(实施例2)。正如X衍射所示，和组织学和机械测试证明，在与未处理的对照比较时，剂量100ug和200ug的TP508诱导的骨形成中有明显的增加。根据这些结果，本文公开了受试者中刺激骨的生长的新方法和新的可移植药物组合物。
本发明的一个实施方案是在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法。该方法包括对该位点给药治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。
本发明的另一个实施方案是含有可移植的，可生物兼容的载体和非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的药物组合物。
本发明的方法涉及在受试者中刺激骨生长，并且可以用于不发生骨生长，没有用自身骨移植治疗或给药骨生长因子的位点。该方法包括给药非蛋白质水解的凝血酶受体的激动剂。这样的激动剂包括与人的前凝血酶的氨基酸508到530之间的区段有同源性的小肽。这些小肽并不昂贵，可以大量制备，并且在低剂量时也是骨诱导的。另外，它们的冻干形式当在5℃和60％的相对湿度下，至少在30个月中是稳定的。
本发明的详细说明“骨诱导”指如果位点保持未处理，在很少或没有骨生长的受试者中的位点刺激骨生长。可以从骨生长的诱导得到治疗益处的位点认为是“需要骨诱导的”。例子包括非联合性的骨折或其他严重的或大面积的骨损伤。应该注意到，骨生长通常发生在骨损伤的时候，如简单的或细微的骨折和只有小裂隙的对抗很好的复合骨折，不需要其他治疗。这样的损伤不认为是“需要骨诱导的”。
简单的骨折修复似乎是与填充非联合性的骨折，区段性裂隙或除去骨肿瘤或囊引起的骨空腔需要的骨形成的诱导是非常不一样的。这些情况中需要骨的移植或新的骨生长的诱导，通常利用了一些类型的基质或支架作为骨生长的替代物。已诱导的骨生长也可以在受试者中的一些位点具有治疗优势，这些位点指“异位”位点，其中通常没有发现骨组织，如需要骨移植或骨融合的位点。融合通常用于治疗通过物理地结合一个或几个椎骨和它们的四周来治疗的较低的背疼痛。这样的融合产生的骨定位于通常不是骨组织占据的位点。在这些异位位点的骨诱导可作为“移植取代物”，从而在脊柱之间诱导骨生长，取代移植体的位置，避免了二次手术收集移植过程中的骨。骨生长的诱导也是治疗后天的和先天的craniofacial和其他骨骼或牙齿畸形所需要的(参见，例如，Glowacki et al.，Lancet 1959(1981))；进行牙齿和牙周的再构建，其中需要失去的骨的替代或骨的增大如颌骨；补充牙周疾病产生的牙周骨的损失，推迟落牙(参见例如，Sigurdsson et al.，牙周杂志，66511(1995))。
申请人已经发现，刺激或激活非蛋白质水解激活的凝血酶受体的化合物(下文中称为“NPAR”)是骨诱导的。这样的化合物称为NPAR激动剂。NPAR是大多数细胞表面上存在的高亲和力凝血酶受体。这一NPAR成分是负责凝血酶，蛋白质水解激活的凝血酶和凝血酶派生的肽与细胞的高亲和力结合的。NPAR似乎是介导不依赖它的蛋白质水解活性的凝血酶启动的许多细胞信号的。一个这样的信号的例子是膜联蛋白V和消减杂交鉴定的其他分子的上调(参见Sower，et al.，实验细胞研究247422(1999))。所以，NPAR的特征是，它在细胞表面与凝血酶有高亲和力反应，并且它被凝血酶和如下所述的凝血酶派生的肽激动剂的蛋白质水解失活的衍生物激活。NPAR激活可以根据当在存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C或与125I凝血酶高亲和力结合竞争凝血酶受体的分子时，加到成纤维细胞中时刺激细胞的繁殖的能力来进行测试，如美国专利号5,352,664和5,500,412和Glenn et al.，肽研究杂志，165(1988)中所述。NPAR是与其他凝血酶结合蛋白质和凝血酶的蛋白质水解激活受体的克隆家族，包括PAR1，PAR2，PAR3和PAR4受体是有区别的。PAR1具有特异的凝血酶裂解位点，允许裂解凝血酶暴露新的氨基末端区，作为在其自身回折诱导它的激活的黏连配体(参见，Vu et al.，细胞641057(1991))。PAR2具有相似的激活机制，但原则上是胰蛋白酶类似酶激活的(参见，Zhong，et al.，生物化学杂志，26716975(1992))。PAR3也具有相似的激活机制，并且似乎是作为血小板中的第二个凝血酶受体起作用的(参见，Ishihara，et al.，自然386502(1997))。PAR4已经在小鼠巨核细胞中检测，研究表明，它也在人血小板中起作用(参见，Kahn，et al.，自然，394690(1998))。与这些PAR受体相反，NPAR的激活不需要蛋白质水解的裂解。
几个证据表明，NPAR是与PAR受体不同的(1)细胞的群体已经分离，完全表达了功能性PAR1受体，但由于在NPAR信号转导途径中有缺陷，所以对凝血酶没有应答(参见，Kim，et al.，细胞生理学，160573(1994))；(2)嗜中性粒细胞以高亲和力结合125I凝血酶，它们的趋化性是受蛋白质水解激活的凝血酶或NPAR激动剂刺激的(参见，Ramakrishnan和Carney，细胞分子生物学41993(1993))，但是它们不表达PAR1(参见Jenkins，et al.，细胞科学杂志，1083059(1995))；(3)IIC9成纤维细胞过度表达PAR1，但不以高亲和力结合凝血酶(参见，Kim，D.Ph.D.Dissertation.Galveston，Texas大学医学分院，1995；和Low et al.，“癌症细胞3/生长因子和转化”，冷泉港实验室，纽约)；和(4)NPAR激动剂对来自PAR受体激动剂肽的那些的基因表达有明显的影响(参见，Sower，et al.，实验细胞研究247422(1999)。
NPAR激动剂的一个例子是凝血酶肽衍生物，即不超过约50个氨基酸，优选地不超过约30个氨基酸，与对应于前凝血酶氨基酸508-530(SEQ ID NO5)的人凝血酶具有足够的同一性能激活NPAR的多肽。本文所述的凝血酶肽衍生物优选地具有12-23个氨基酸，更优选地具有19-23个氨基酸，凝血酶肽衍生物的一个例子包括结构式(I)代表的成分Asp-Ala-R(I)
R是丝氨酸酯酶保守区域。丝氨酸酯酶，例如胰蛋白酶，凝血酶胰凝乳蛋白酶等等，具有高度保守的区域。“丝氨酸酯酶保守区域”指，具有一个这样的保守区域的氨基酸序列，并且足以与一个这样的保守区域同源，使凝血酶肽衍生物保留了NPAR激活能力的多肽。
在一个实施方案中，丝氨酸保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或具有SEQ ID NO1中的氨基酸序列的多肽的C末端截断的片段。但是，应该理解，在丝氨酸保守序列中的0，1，2或3个氨基酸可以与SEQ ID NO1的对应的氨基酸相区别。优选地，与对应的SEQ ID NO1中的氨基酸不同的丝氨酸保守序列中的氨基酸是保守的取代，并且更优选地是高度保守的取代。“C末端截断的片段”指在从C末端除去一个氨基酸或氨基酸的组后剩余的一个片段，所述的片段至少具有6个，更优选地至少9个氨基酸。
更优选地，丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val；X1是Glu或Gln，X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或其C末端截断的片段至少具有6个氨基酸，优选地至少具有9个氨基酸。
在优选的实施方案中，凝血酶肽衍生物包括一个丝氨酸酯酶保守序列和一个具有特异凝血酶氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的多肽。这一类型的凝血酶肽衍生物的一个例子包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)。X1和X2如上定义。当凝血酶肽衍生物包括SEQ ID NO4时，优选地它具有SEQ ID NO5的氨基酸序列(Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其N末端截断的片段，假设凝血酶肽衍生物位置1-9中的0，1，2或3个氨基酸与SEQID NO5的对应的位置的氨基酸不同。优选地，与SEQ ID NO5中的对应的氨基酸不同的凝血酶肽的衍生物中的氨基酸是保守取代，更优选地是高度保守的取代。“N末端截断的片段”指在从N末端除去一个氨基酸或氨基酸的组后剩余的片段，优选地是不超过6个氨基酸的组，更优选地是不超过3个氨基酸的组。
TP508是凝血酶肽衍生物的例子，并且具有SEQ ID NO5的氨基酸序列。
“保守取代”是用具有相同的静电荷和大约同样大小和形状的另一个氨基酸取代。当在它们的侧链中的碳数目和杂合原子的区别不超过约4个，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有大约相同的大小。当它们的侧链中的分支的数目的区别不超过一个时，它们约具有相同的形状。在它们的侧链中的具有酚或取代酚基团的氨基酸认为约具有相同的大小和形状。下面列出的是5个氨基酸组。用来自相同组的另一个氨基酸取代多肽中的一个氨基酸产生了保守取代组1甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，和具有C1-C4脂肪族的或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链(直链或单分支)的非天然存在的氨基酸。
组2谷氨酸，天冬氨酸和具有羧基取代C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组III赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍基取代C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组IV谷氨酸，天冬氨酸和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支或一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组V苯丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。
“高度保守的取代”是用在侧链中的和大小和形状接近的相同功能的基团的另一个氨基酸取代。有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸当侧链中的碳和杂合原子的总数的差别不超过两个时，它们的大小几乎相同。当在它们的侧链中，它们具有相同数目的分支时，它们具有相近的形状。高度保守的取代的例子包括，缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，苯丙甘氨酸取代苯丙氨酸。不高度保守的取代的例子包括丙氨酸取代缬氨酸，丙氨酸取代丝氨酸和天冬氨酸取代丝氨酸。
其他NPAR激动剂包括结合和激活NPAR的小的有机分子。这一类型的激动剂通常可以用高流量筛选，例如，评估当存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的分子时，加到成纤维细胞中时分子刺激细胞繁殖的能力的实验来鉴定，如美国专利号，5,352,664和5,500,412中所公开的。美国专利号5,352,664和5,500,412的全部内容都通过在此引述而合并于本文。
术语“NPAR激动剂”也包括已知激活NPAR的化合物和化合物的结合体。例子公开在美国专利号，5,352,664和5,500,412中，包括DIP-alpha凝血酶与乙酸肉豆蔻佛波醇的结合体。
用于本文所述的药物组合物的可移植生物兼容载体可作为NPAR激动剂的适当的递送或支持系统。生物兼容载体应该是非毒性的，非炎性的，非免疫原性的，在移植位点可避免不需要的反应的。适当的载体用于释放活性成分，优选地是在移植位点慢慢地，持续的释放。
适当的载体包括多孔的基质，其中骨祖先细胞可以迁移。成骨细胞经常可以附着于这样的多孔基质，然后可以作为骨和组织生长的支架。在一些申请中，载体应该具有足够的机械强度以维持它的三维结构，和辅助正在联合或移植到一起的骨的部分的固定。提供组织生长的支架的多孔基质可以加速骨的生长速度，可以说是“骨诱导性的”。骨传导载体用于本文所述的药物组合物中是非常优选的。
适当的骨传导载体的例子包括胶原(例如，小牛皮胶原)，纤维蛋白，磷酸钙神经酰胺(例如，羟磷灰石和磷酸三钙)，硫酸钙，胍萃取的异种骨和其联合。许多适当的载体是可以购买得到的，如COLLOGRAFT(Collagen Corporation，Palo Alto，CA)，是羟磷灰石，磷酸三钙和原纤维胶原的混合物，和INTERPORE(InterporeInternational，Irvine CA)，是羟磷灰石生物基质(是海洋核心碳酸钙转化成结晶的羟磷灰石而形成的)。
许多合成的生物降解多聚物可以作为骨传导的载体，具有持续释放的特征。这些多聚物的说明可以在Behravesh et al.，Clinical Orthopaedics 367S118(1999)，和Lichun et al.，“将来的控制药物递送的设计技术”中的骨生长因子的多聚体递送载体，Park and Mrsny编辑，美国化学协会，华盛顿，DC(2000)中找到。这些参考文献的全部内容都通过在此引述而合并于本文。这些多聚物的例子包括聚alpha羟基酯，如聚乳酸/聚乙醇酸同聚物和共聚物，PPHOS，聚酸酐和聚(丙烯富马酸)。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)同聚物和共聚物是本领域已知的持续释放的载体。释放的速度可以通过技术人员改变聚乳酸与聚乙醇酸的比例和多聚物的分子量来调整(参见，Anderson，et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.285(1997)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。将聚(乙二醇)作为混合体掺入多聚物形成微型颗粒载体另外允许改变活性成分的释放方案(参见，Cleek et al.，控制释放杂志，48259(1997)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。陶瓷，如磷酸钙和羟磷灰石也可以掺入配方提高机械质量。
PPHOS多聚物在多聚物骨架中含有替代的氮和没有碳的磷，如下面的结构式(II)所示 多聚物的特性可以通过适当改变与多聚物骨架结合的侧链基团R和R’来调整。例如，通过PPHOS降解和释放药物可以通过改变对水解不稳定的侧链基团的量来控制。咪唑基和乙二醇取代的PPHOS的更多的掺入后，可以观察到降解速度的增加(参见Laurencin et al.，J Biomed Mater.Res.27963(1993)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)，从而增加了药物释放的速度。
结构通式(III)所示的聚酸酐具有已经确定的降解和释放特性，可以通过改变疏水或亲水单体如葵二酸和1，3-双(p-羧氧苯氧基)丙烷(参见Leong et al.，J.Biomed.Mater.Res.19941(1985)，其全部内容引入作为参考)。为了改变机械强度，酸酐经常与酰胺共聚化形成聚酸酐共酰胺。适用于外科应用的聚酸酐共酰胺的例子是聚(苯三亚氨-甘氨酸-共-1，6-双(羧氧苯氧基)己烷和焦苯三亚氨丙氨酸1，6-双(p-羧氧苯氧基)己烷共聚物。
聚丙烷富马酸(PPF)是非常需要的生物兼容可移植载体，因为它们是可注射的，原位可聚合的，可生物降解的物质。“可注射”指物质可以通过针筒，通过用于注射糊和凝胶的标准的针来注射。PPF，结合了乙烯基单体(N-乙烯吡咯烷酮)和起始物(苄甲酰过氧化物)，形成了可以原位聚合的可注射溶液。特别适于填充多种大小和形状的骨骼缺陷(参见Suggs et al.，大分子304318(1997)，Peter et al.，J.Biomater.Sci.Poly.Ed.10363(1999)和Yaszemski et al.，Tissue Eng.141(1995)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。
本发明的药物组合物可以通过在需要骨诱导的位点移植给药。“移植”或“在一个位点给药”指，当NPAR激动剂从药物组合物中释放时，在需要治疗的位点的足够的附近从而使发生骨诱导(例如，在存在NPAR激动剂时有骨生长，没有时少而没有生长)。
药物组合物可以如需要在外科手术的参与下构型，或由外科手术过程中的技术人员构型。优选地，将基质构型成跨越组织缺陷处，和采取需要的新的组织的形式。例如，在非联合缺陷的骨的修复的情况中，利用跨越非联合缺陷的维向是需要的。在骨形成过程中，物质是通过人体慢慢吸收的，并且是由非常接近移植体形状的骨来替代的。或者，药物组合物可以在该位点中以微颗粒或微球体的形式给药。微颗粒可以通过外科暴露该位点与需要骨诱导的位点接触或放置在该位点的附近，和将微颗粒通过涂抹，喷洒，注射等等施加到该位点上或其附近。微颗粒也可以通过内部手术或剖开术递送到位点。PLGA微颗粒的制备和它们刺激骨生长的用途在实施例1和2中有叙述。
仍然在另一个或选方案中，药物组合物可以部分地内限在支持性的物理结构中，如网，线基质，不锈钢笼中，线的内体融合笼等等，然后在对需要骨诱导的位点给药。
应用本发明的的药物组合物的另一个或选方法是注射。可注射的组合物包括如上所述的聚(丙烯富马酸)共聚物的溶液和磷酸钙陶瓷的糊(参见Schmitz et al.，J.Oral Maxillofacial Surgery571122(1999)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。可注射的组合物可以直接注射到需要骨诱导的位点，并且可以常规地用于填充空隙和融合骨，而不需要侵入性的外科。
NPAR激动剂也可以通过移植的方法给药，例如将包含可接受的药物载体中的NPAR激动剂的溶液直接应用到位点或其附近。溶液的给药可以常规地通过针筒，通过外科打开或通过肠胃外给药到需要的位点来完成。可以利用标准的药物配方技术如Remington药物科学中所述的，Mack出版社，Easton，PA。适当的肠胃外给药的药物载体包括例如，无菌水，生理盐水，无菌盐水(含有约0.9％mg/ml的苄甲醇的盐水)，磷酸缓冲盐，Hank溶液，Ringer乳酸盐等等。
“治疗有效量”是导致骨生长的NPAR激动剂的量，其中在没有激动剂时只有少的或没有骨的生长。通常，给药激动剂足够的时期，达到需要的治疗或外观效果，即，足够的骨生长。给药的量将依赖于需要的骨生长的量，受试者的健康，大小，体重，年龄和性别，和药物配方的释放特征。通常，通过连续释放或直接应用到需要骨生长的位点给药约1ug/day到约1mg/day NPAR激动剂之间(优选地约5ug/day和约100ug/day)。
NPAR激动剂或本发明的可移植的药物组合物可以用于与可移植的假器官装置结合使用。例如，治疗有效量的药物组合物可以放置于假器官移植体上，它们放置在可植入的表面区上，与需要骨诱导的位点邻接。或者，构建假器官装置，使其能够以预定的速度连续地释放可移植的药物组合物或NPAR激动剂。修复可以通过包含金属或陶瓷的物质来进行。修复装置的例子包括髋骨装置，螺旋，杆和钛的笼，可用于脊柱的融合。
所以，本发明也提供了在受试者的需要骨诱导的位点植入家器官装置来刺激骨生长的方法。假器官至少是部分地用可植入的如本文所述的药物组合物包衣，并且可植入在需要骨诱导的位点，和在该位点维持足够的时期，允许刺激骨的生长。
“受试者”优选地是人，但也可以是需要治疗的动物，如伴侣动物(例如，狗，猫等等)，农场动物(例如，牛，猪，马等等)，和实验室动物(例如，大鼠，小鼠，滕鼠等等)。
凝血酶肽衍生物可以通过固相肽合成方法(例如，BOC或FMOC)，通过液相合成，或其他适当的技术包括前面提到的方法的结合来合成。BOC和FMOC方法是已确立和广泛使用的，在下面的文献中有叙述，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.882149(1963)；Meienhofer，激素蛋白质和肽，C.H.Li，Ed.，学术出版社，1983，48-267页；和Barany and Merrifield，肽，E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，学术出版社，纽约，1980，3-285。固相肽合成的方法在下面的文献中有叙述Merrifield，R.B.，科学，232341(1986)；Carpino，L.A.and Han，G.Y.，J.Org.Chem.，373404(1972)；和Gauspohl，H.et al.，合成，5315(1992))。这六篇文章的全部内容都通过在此引述而合并于本文。
本发明通过下面的实施例进一步说明，但不已任何方式来加以限制。
实施例实施例1-制备TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微球体利用双乳化技术制备含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物的微球体(PLGA)。简要地说，在二氯甲烷中溶解基质成分，在水中溶解TP508。当涡旋形成油中水(W/O)乳液时，将两者逐步混合在一起。聚乙烯醇(水中3％)加入到乳液中，进一步涡旋形成二次乳液(O/W)，从而形成双乳液PLGA小滴组成的和在那些小滴内组成的O/W，第二分散相包括水中的TP508。在相分离的基础上，PLGA小滴形成形成含有持有TP508的腔的分散的微球体。为了引起微球体的相分离，加入2％的异丙醇溶液。通过离心收集颗粒，然后冻干除去残留的水分。可以改变基质的组成形成不同释放动力学的微球体(表1)。
表1不同的微球体配方的组合物
在Coulter计数器中测量微球体的平均直径，通过在276nm的光谱测试测量药物的陷入效率，接着在二氯甲烷中溶解已称重的微球体样品，和在水中萃取释放的药物(表2)。
表2配方直径和药物包陷效率
为了测量从不同的PLGA基质中释放TP508，将20mg微球体放置于在1.5ml的聚丙烯微型离心管中的1.0ml的PBS中。在37℃温育试管和在60rpm振摇。在各个时间，离心试管，并且除去含有释放的TP508的上清液，冷冻，随后分析。在微球体中加入新鲜的PBS，和连续地温育。在276nm处观察吸光值测量上清液中的TP508。对于每个配方，进行四分的释放测定。在37℃，38天的温育过程中，配方B和D没有显示可检测的药物释放。虽然在所有的情况中，药物释放的量在3-4天内落在可检测的限制范围以外(＜1ug/mg基质/天)，但剩余的配方都释放了可检测的TP508的量。配方A和C显示，更大的TP508的释放，在3-4天内释放了60-80％的包陷的药物。选择更快释放动力学的配方C进一步在体内研究中进行测试。
实施例2-含有TP508的PLGA微球体诱导兔子尺骨中的大的缺陷(1.5cm)中的骨形成配方在20个雄性新西兰兔子的每个尺骨中产生1.5cm的区段性缺陷。这些双侧的尺骨术准确地产生相同的大小是通过利用小的金属尺指导丁字锯子的切割刀片来进行的。每个兔子可作为自身的对照；所以用不含有TP508的微球体填充左侧的缺陷处，而用含有100或200ug TP508的微球体填充右侧缺陷处(10个动物/组)。如实施例1所述制备微球体。将给予双侧尺骨术的兔子任意分成两组。第一组在右侧的肢体中接受100ug的微球体(30mg)中的TP508，左侧的肢体中只接受微球体。同样处理第二组，但接受了200ug的TP508。以不同的比例混合含有TP508和没有TP508的微球体获得不同的剂量。以两星期的间隔，在第3个星期开始，将动物进行X衍射，在第9个星期时杀死动物。
在外科手术后的3和5个星期时，在缺陷处，100ug的TP508刺激矿质化。在第7和9个星期时的X衍射似乎是和第5个星期时得到的那些是一样的。在外科手术后第9个星期，杀死动物，除去尺跷骨，并且拍照。在大多数情况中，在对照的肢体中的尺骨中大的缺陷仍然是可见的。相反在TP508处理的肢体中，大多数缺陷已经成功地关闭。
在外科手术后第9个星期时杀死动物后，通过扭转测试测量修复的强度(利用了MTS-858Minibionix机器)。结果表示在表3和4。
表3用100ug TP508处理的区段性缺陷处的扭转测试
^p＜0.05，+p＜0/01表4用200ug的TP508处理的区段性缺陷处的扭转测试
在100ug的组中，如所有测试的参数测量的，TP508使愈合的缺陷处的机械强度增加了双倍以上(表3)。在200ug的组中注意到了甚至更强的修复(表4)，大多数参数大约比低剂量处理的组中看到的高约50％。
概要地说，用含有NPAR激动剂TP508的微球体处理尺骨骨手术表明有骨矿质化和生长的证据，而在大多数接受骨传导的微球体的对照骨手术中，没有骨生长和/或没有填充空缺的区域。对机械强度和坚硬度的机械测试证明了在这一模型中TP508对骨形成的明显效果。因为TP508诱导了这些位点中没有TP508时不发生的骨形成，这一骨诱导的发现是与前面的研究不同的，其中TP508加快了没有TP508时也愈合的骨折或小的裂隙缺陷处的正常的骨折愈合的速度。
本发明已经根据优选的实施方案被描述和显示了，本领域技术人员应该理解，在不脱离权利要求界定的本发明范围的情况下，可以有各种形式和细节中的变化。
权利要求
1.一种在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该位点是需要骨移植的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该位点是骨中的区段性裂隙，在非联合的骨折中的骨空腔。
4.根据权利要求1中所述的方法，其中激动剂是包括下面的结构式代表的多肽的凝血酶肽衍生物Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有12到23个氨基酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其至少具有6个氨基酸的C末端截断的片段，假设，在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO1中对应位置的不同。
7.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO1所述的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或至少具有9个氨基酸的C末端截断的片段，假设丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2个氨基酸是SEQ IDNO1中的对应的氨基酸的保守取代。
8.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val，其中X1是Glu或Gln和X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或SEQ ID NO2的C末端截断的片段，所述的片段至少具有6个氨基酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括氨基酸序列，Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)，其中X1-是Glu或Gln和X2-是Phe，Met，Leu，His或Val。
11.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列，Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9中的0，1，2，或3个氨基酸与SEQ ID NO5的对应的位置中的氨基酸不同。
12.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO5的对应位置中的氨基酸的保守取代。
13.根据权利要求11所述的方法，其中凝血酶肽的衍生物是另外包括在可移植的，可生物兼容的载体的药物组合物中给药的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中可植入的，可生物兼容的载体是骨传导的基质。
15.根据权利要求11所述的方法，其中载体包括聚乳酸/聚乙醇酸同聚物或共聚物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中受试者是农场动物，伴侣动物或实验室动物。
17.一种药物组合物，其包括可植入的，可生物兼容的载体和非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中载体是骨诱导的。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中凝血酶受体激动剂是凝血酶肽衍生物，包括下面的结构式代表的多肽Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体是可生物降解的合成多聚物。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中可生物降解的合成多聚物是聚乳酸/聚乙醇酸同聚物或共聚物。
22.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体包括胶原，纤维蛋白，磷酸钙盐，硫酸钙，胍萃取的异源骨或其组合。
23.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体是可注射的。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中载体是聚(丙烯富马酸)溶液或磷酸钙陶瓷糊。
25.根据权利要求19所述的药物组合物，其中药物组合物是作为微球体给药的。
26.根据权利要求19所述的药物组合物，其中药物组合物是在应用到需要的骨诱导位点之前是先成形的。
27.根据权利要求19所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物具有12到23个氨基酸。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Prp-Phe-Val)，或至少具有6个氨基酸的C末端截断的片段，假设在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO1的对应的位置不同。
29.根据权利要求27所述的药物组合物，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其中至少具有9个氨基酸的C末端截断的片段，假设在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO1中的对应的氨基酸的保守取代。
30.根据权利要求27所述的药物组合物，其中丝氨酸酯酶的保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val)，其中X1是Glu或Gln和X2是Phe，Met，Leu，His or Val)，或SEQ ID NO2的C末端截断的片段，所述的片段至少具有6个氨基酸。
31.根据权利要求所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)的氨基酸序列，其中X1-是Glu或Gln和X2-是Phe，Met，Leu，His或Val。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列，Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物的位置1-9中的0，1，2，或3个氨基酸是与SEQ IDNO5的对应位置中的氨基酸不同的。
34.根据权利要求32所述的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列，Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO5的对应位置中的氨基酸的保守取代。
35.一种在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给药治疗有效量的具有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)的肽的步骤。
36.一种在受试者中需要骨移植的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的具有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)的肽的步骤。
37.一种在受试者中，在区段性的骨裂隙，骨空腔或非联合的骨折中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对骨裂隙，骨空腔或非联合的骨折给予治疗有效量的具有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ ID NO5)的肽的步骤。
全文摘要
公开的是在需要骨诱导的患者中的位点中刺激骨生长的方法。该方法包括对该位点给予治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。
文档编号A61K38/48GK1635899SQ01815822
公开日2005年7月6日 申请日期2001年7月18日 优先权日2000年7月19日
发明者达芮尔·H·卡尼, 罗杰·S·库劳泽尔, 戴维·J·西蒙斯, 杨金萍, 威廉·R·雷丁 申请人:德克萨斯系统大学董事会
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