二酮基哌嗪和包含它们的组合物的使用方法
专利名称：二酮基哌嗪和包含它们的组合物的使用方法
技术领域：
本发明涉及采用一些二酮基哌嗪抑制血小板活化因子作用的方法。本发明亦涉及采用这些二酮基哌嗪抑制白细胞介素8(IL-8)的生成和/或释放的方法。最后，本发明涉及包含二酮基哌嗪的药物组合物。
背景技术：
血小板活化因子(PAF；1-O-烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)是具有各种生理活性的有效的炎性磷酯介体。它由嗜碱粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、嗜曙红细胞、嗜中性白细胞、天然杀伤淋巴细胞、血小板和内皮细胞，以及由在适当免疫和非免疫的刺激下肾和心脏的组织产生和释放。参见PCT申请WO 94/04537。PAF通过结合在许多细胞和组织中发现的特异的PAF受体介导生物反应。对PAF和其类似物结构-活性的研究说明PAF结合这些受体的能力是结构特异的和立体有择的。参见PCTWO 94/04537。
当PAF介导基本的生物反应时，它还表现出在病理学免疫和炎性反应中起作用。许多出版的研究论文已经提供证据，说明PAF与疾病有关，其中包括关节炎、急性炎症、哮喘、变态反应、心血管疾病、肿瘤性疾病、内毒素休克、疼痛、牛皮癣、眼发炎、局部缺血、胃肠溃疡、心肌梗死、炎性肠疾病和急性呼吸窘迫综合征。参见PCT申请WO 94/04537。
PAF与病理学的发炎和免疫状态有关已经促进大量研究以鉴别PAF受体拮抗剂，并且已经鉴别许多不同化学结构的化学物为PAF拮抗剂。参见，例如，PCT申请WO 94/04537和WO 96/00212(和这两篇申请中引用的参考文献)，PCT申请WO 95/18610和WO 99/49865，美国专利4,940,709，5,358,938，5,434,151，5,463,083，5,648,486，5,741,809 5,792,776，5,780,503，5,856,323，日本申请63 290868，Shimazaki等，Chem.Phare.Bull.，35(8)，3527-3530(1987)，Shimazaki等，J.Med.Chem.，30，1709-1711(1987)，Yoshida等，Prog.Biochem.Pharmacol.，22，68-80(1988)，Shimazaki等，Lipids，26(12)，1175-1178(1991)。已知大量的病理学免疫和炎性反应由PAF介导，有鉴别抑制PAF活性的新的化合物和组合物的需要。
已经报道二酮基哌嗪具有许多生理活性.。参见，例如，美国专利4,289,759(免疫调节剂)，4,331,595(免疫调节剂)，4,940,709(PAF拮抗剂)，5,700,804(纤溶酶原活化因子抑制剂的抑制剂)，5,750,530(纤溶酶原活化因子抑制剂的抑制剂)，5,990,112(金属蛋白抑制剂)，PCT申请WO 97/36888(法呢-蛋白转移酶抑制剂)和WO 99/40931(中枢神经系统损伤治疗剂)，EP申请43219(免疫调节剂)，日本申请63 290868(PAF拮抗剂)，日本申请3176478(免疫抑制剂)，Shimazaki等，Chem.Phare.Bull.，35(8)，3527-3530(1987)(PAF拮抗剂)，Shimazaki等，J.Med.Chem.，30，17091711(1987)(PAF拮抗剂)，Shimazaki等，Lipids，26(12)，1175-1178(1991)(PAF拮抗剂)，Yoshida等，Prog.Biochem.Pharmacol.，22，68-80(1988)(PAF拮抗剂)，Alvarez等，J.Antibiotics，47(11)，1195-1201(1994)(钙激活中性蛋白酶抑制剂)。
由天冬氨酸和丙氨酸组成的二酮基哌嗪(3-甲基-2，5二酮基哌嗪-6-乙酸；DA-DKP)是已知的。已经报道它作为在30℃以上贮藏的人血清蛋白降解的结果形成。Chan等，Eur.J.Biochem.，227，524-528(1995)。不知道它具有生物活性。
发明概述本发明提供一种治疗血小板活化因子介导的疾病或病症的方法。这种方法包括给予需要该治疗的动物有效量的该结构式的二酮基哌嗪 R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
本发明进一步提供一种抑制炎症的方法。这种方法包括给予需要该治疗的动物有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐。
本发明还提供一种抑制血小板聚集的方法。这种方法包括以有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐和血小板接触。
此外，本发明提供一种抑制由细胞生产生、释放或者产生和释放白细胞介素8的方法。这种方法包括以有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐和细胞接触。
本发明进一步提供抑制血小板活化因子(PAF)作用的方法。这种方法包括以有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐和PAF接触。
最后，本发明提供一种药物组合物。这种组合物包括药学上可接受的载体和结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐。
本发明优选的实施方案的详细说明氨基酸的＂侧链＂指连在以上列出所有氨基酸共有的 主链上的氨基酸部分。例如，甘氨酸的侧链是-H，丙氨酸的侧链是-CH3，和丝氨酸的侧链是-CH2OH。
＂烷基＂指含有1-30个碳原子，优选1-18个碳原子的直链或支链烷基。＂低级烷基＂指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基。
＂芳基＂指具有至少一个芳环(例如苯基)的芳香基团。
＂烷芳基＂指具有与其相连的芳基的低级烷基(例如，-CH2C6H5或-CH3CH(C6H5)CH3)。
＂芳烷基＂指具有与其相连的烷基的芳基(例如，-C6H4-CH3)。
本文使用的＂抑制＂指减轻(完全或部分)或预防。
本文使用的＂介导＂指引起，恶化，或有关。
本文使用的＂治疗＂意指减轻(完全或部分)疾病或病症的症状，包括治愈疾病或病症，或者预防疾病或症状。
本发明基于3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(DA-DKP)抑制PAF活性的发现。这种抑制看来归因于DA-DKP与PAF和PAF受体的结合。认为DA-DKP与PAF结合归因于DA-DKP的羧基和PAF胆碱部分上的N+的离子配对。因此，预计其它的包括一个或多个羧基的二酮基哌嗪是PAF的有效抑制剂。实际上，其它的含羧基的非二酮基哌嗪化合物，例如聚-天冬氨酸或聚-谷氨酸，也可能是有效的PAF抑制剂。DA-DKP结合PAF受体的机理是未知的，但是假设它归因于DA-DKP的二酮基哌嗪环结构和/或DA-DKP的疏水R2侧链。
制备二酮基哌嗪的方法是本领域已知的，并且可能采用这些方法合成结构式(1)的二酮基哌嗪。参见，例如，美国专利4,694,081和5,817,751；Smith等，Bioorg Med.Chem.Letters，8，2369-2374(1998)。然而，当采用现有技术方法合成结构式(1)的二酮基哌嗪时，会遭遇困难或得到不令人满意的结果(参见共同待审的临时申请60/223,075，2000年8月4提交)。从而，如共同待审的临时申请60/223,075所述的方法合成结构式(1)的二酮基哌嗪是最优选的，它的全部公开引入本文作为参考。
临时申请60/223,075描述的合成方法采用了本领域公知的标准溶液相或固相肽合成法。固相肽合成法是优选的。
临时申请60/223,075描述的合成方法的第一步骤包括提供第一氨基酸。第一氨基酸选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组。这些氨基酸可以是D-或L-对映体形式，是商业上可得到的，或者能由本领域公知的方法制备(参见，例如，Williams，Synthesis Of OpticallyActive a-AminoAcids(Pergammon Press，1989))。优选的是疏水氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。特别优选的是丙氨酸。
第一氨基酸还优选以一种或多种保护基团保护，以防止合成期间不需要的副反应。这种保护基团，和连接和除去它们的方法，是本领域公知的。参见，例如，Green和Wuts，Protective Groups In Organic Chemistry(Wiley 1992)和Grant，Synthetic PeptidesA User′s Guide(Freemen 1992)。
第一氨基酸与以下结构式NH2CH(CH2COOR5)COOH的天冬氨酸衍生物或以下结构式NH2CH(CH2CH2COOR5)COOH的谷氨酸衍生物反应，其中R5是低级烷基或烷芳基。R5优选是苄基(-CH2C6H5；Bz)。已经发现苄基不仅保护这些氨基酸的侧链羧基，而且促进二肽的环化。此外，可在防止手性中心(连接R1和R2基团的碳原子)外消旋作用的中性条件下从二肽除去苄基。
天冬氨酸和谷氨酸衍生物NH2CH(CH2COOR5)COOH和NH2CH(CH2CH2COOR5)COOH是商业上可得到的或可由已知方法制备(参见，例如，Bodansky和Bodansky，The Practice ofPeptide Synthesis，63-66页(第2版，Springer-Verlag，1994)。天冬氨酸和谷氨酸衍生物的氨基或羧基任选以标准保护基(见上述)保护以便防止不需要的副反应。
如上所述，二酮基哌嗪的合成优选采用固相肽合成方法。第一氨基酸或者夭冬氨酸或谷氨酸衍生物经其羧基连接至固体载体以便固相合成。固体载体可以是任何与肽合成相容的载体，例如Grant和Atherton描述的方法，Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach(BL Press 1989)。适当的固体载体是商业上可得到的或者能由标准方法制备。参见PCT申请WO96/00391。固体载体包含固定第一氨基酸或者天冬氨酸或谷氨酸衍生物至载体表面的接头或间隔分子。许多具有各种性质的接头是本领域公知的。参见，例如，Grant，Synthetic PeptidesA User′s Guide(Freemen 1992)和PCT申请WO 96/00391。这种接头通常包括连接第一氨基酸或者天冬氨酸或谷氨酸衍生物的官能团。
优选地，第一氨基酸连接在固体载体上，并且，在偶合天冬氨酸或谷氨酸衍生物至第一氨基酸之前，如果存在，除去在键合的第一氨基酸的α氨基上的保护基团。然而，应避免任何侧链氨基的保护基团的除去，应该选择这样的条件以在不去保护侧链氨基时去保护氨基。适当的去保护条件是本领域已知的。例如，以20％至55％的仲胺碱例如哌啶，在极性非质子传递溶剂，例如二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷中可进行9-芴基甲氧基羰基的除去，。优选加入二异丙基硅烷以防止去保护期间的具说在大规模制备中存在的酯交换。
第一氨基酸和天冬氨酸或谷氨酸衍生物之间的反应在有效产生肽键的条件下进行，这样以形成二肽。这些条件是本领域公知的。例如，偶合催化剂(例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，2，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐，苯并三唑-1-基-氧代三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六磷酸盐，1-羟基苯并三唑，二异丙胺，二环己基碳二亚胺)可用于形成二肽。通常，使用过量的偶合催化剂，具有2至10当量或更多的量。通常相对于偶合的化学物质的反应性确定过量的范围。极性非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷，二氯甲烷和二甲亚砜)是优选的。反应时间可以是一个半小时至整夜，温度由室温至回流变化。
下一步，如果二肽与固体载体键合，采用本领域公知的标准方法由固体载体除去二肽。由固体载体有效除去二肽的条件将取决于固体载体和选择的接头。通常，采用强酸，例如三氟乙酸通过酸水解除去该肽。
接着环化二肽以形成二酮基哌嗪；这种二酮基哌嗪会具有仍然为酯形式的夭冬氨酸或谷氨酸衍生物的侧链羧基。环化通过在中性条件下加热二肽完成。典型地，二肽在约80℃至约180℃加热，优选约120℃。溶剂是中性溶剂。例如，这种溶剂包括醇(例如丁醇、甲醇、乙醇和高级醇，但不是酚)和共沸的共溶剂(例如甲苯、苯，或二甲苯)。优选地，醇是丁-2-醇，共沸溶剂是甲苯。持续加热直至反应完全，并且根据经验确定加热时间。典型地，二肽通过将其回流约8-24小时，优选约18小时环化。
最后，R5基团从二酮基哌嗪通过本领域公知的方法除去以便除去保护基(见上述)。当R5基团是苄基时，它优选从二酮基哌嗪通过采用碳载钯(Pd/C)催化剂氢化除去。应该避免强酸(无机酸，例如硫酸或盐酸)、强碱(碱金属碱，例如氢氧化钾或氢氧化钠)和强的还原剂(例如，氢化铝锂)的使用，以便保持最终化合物的手性。
一旦除去R5基团，可衍生游离酸，如果需要，形成标准衍生物，例如酰胺和酯。用于转化游离酸成为酰胺或酯的方法是本领域公知的。
结构式(1)的二酮基哌嗪生理学上可接受的盐还可用于本发明的实践。生理学上可接受的盐包括常规的无毒盐，例如衍生自无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)、有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸椽酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、抗坏血酸等)或碱(例如的药学上可接受金属阳离子或者衍生自N，N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺或乙二胺的有机阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)的盐。这类盐用常规方法，例如，通过用酸中和游离碱形式的化合物制备。
结构式(1)的二酮基哌嗪，或其生理学上可接受的盐，能用于治疗PAF介导的疾病或病症。为此，向需要该治疗的动物给药结构式(1)的二酮基哌嗪，或其生理学上可接受的盐。优选的动物是哺乳动物，例如兔、山羊、狗、猫、马或人。可以根据经验确定适于本发明的各种化合物的有效剂型、给药模式和剂量，并且在本领域的技术熟练人员做出这种决定。本领域的熟练人员理解剂量会随采用的特定化合物、治疗的疾病或病症、疾病或病症的严重性、给药途径、化合物的排泄速率、治疗持续时间、任何其它要给予动物的药物的鉴别、年龄、动物的大小和种类以及医学和兽医学领域已知的相似因素而变化。一般，本发明化合物的适当的每天剂量会是化合物产生治疗作用的最低有效剂量的那种剂量。然而，每天剂量会由主治医师或兽医在合理的医学判断范围内确定。如果需要，有效的每天剂量可以作为两、三、四、五、六个或更多子剂量给药，全天以适当的间隔单独给药。持续该化合物的给药直至获得一种可接受的反应。
本发明的化合物(即，结构式(1)的二酮基哌嗪和它生理学上可接受的盐)可以向动物患者给药以便通过任何适当的给药途径治疗，包括经口、鼻、直肠、阴道、非肠道(例如，静脉内、脊柱内、皮下、腹膜内或肌肉内)、脑池内、透皮、颅内、大脑内和局部(包括颊和舌下)给药。优选的给药途径是经口和静脉内。
对于本发明的化合物可单独给药，该化合物优选以药物制剂(组合物)形式给药。本发明的药物组合物包括作为活性组分的一种或多种本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的载体，并且，任选地包括一种或多种其它化合物、药物或其它物质。在与制剂内其它组分相容和对动物无损伤的意义上，每种载体必须是＂可接受的＂。药学上可接受的载体是本领域公知的。不考虑选择的给药途径，本发明的化合物通过本领域熟练人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。参见，例如，Renzington′sPliamiaceutical Sciences。
本发明的适于口服给药的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂，或者作为含水或非水液体内的溶液或悬浮液，或者水包油或油包水液体乳剂，或者作为酏剂或糖浆剂，或者作为锭剂(采用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)，等等，每个含有预定量的作为活性组分的本发明的化合物。本发明的化合物还可以大丸剂、药糖剂或糊剂给药。
本发明口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，活性组分与一种或多种药学上可接受的载体混合，所述载体例如枸椽酸钠或磷酸二钙，和/或以下任何一种(1)填充剂或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如，如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、一些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙醇、月桂基硫酸钠和它们的混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还包括缓冲剂。在采用例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充的明胶胶囊中，采用相似种类的固体组合物作为填充剂。
通过任选地加上一种或多种辅助组分压缩或模制制备片剂。采用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压片。通过在适合的机器中模制以惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物制备模制片。
本发明的药物组合物的片剂和其它固体剂型，例如糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，任选地被刻痕，或者以包衣和壳体，例如肠溶衣和其它药物制备领域公知的包衣制备。它们还可被配制成提供其中活性组分的缓释或控制释放，例如，采用各种比例提供需要的释放曲线的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可以通过，例如，经截留细菌滤器过滤进行消毒。这些组合物还任选包含遮光剂，并且是仅仅或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性组分的组合物。可以被使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。活性组分还可是微胶囊形式。
适于本发明化合物口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性组分之外，液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别地，棉子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，及其混合物。
除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括助剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂、增甜剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
悬浮液，除了活性化合物之外，可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxid)、膨润土、琼脂和西黄蓍胶，以及它们的混合物。
本发明的直肠或阴道给药用药物组合物制剂可以栓剂存在，它可通过混合本发明的一种或多种化合物与一种或多种适当的非刺激性赋形剂或载体(包括，例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)制备，它在室温下是固体，但是在体温下是液体，因此，会在直肠或阴道腔内熔化并释放这种活性化合物。适于阴道给药的本发明的制剂还包括含有本领域已知是适当的载体的阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
适于本发明的化合物局部或经皮给药的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂、滴剂和吸入剂。活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体，和任何缓冲剂，或需要的喷射剂混合。
软膏、糊剂、乳膏和凝胶除了活性组分之外，可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或者它们的混合物。
散剂和喷雾剂除了活性组分之外，可包含赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混和物。喷雾剂另外包含通常的喷射剂，例如氯氟代烃和挥发性的未取代的烃，例如丁烷和丙烷。
皮肤贴剂具有附加的提供控制本发明的化合物输送至体内的优点。这种剂型可通过在适当基质，例如弹性基质物质中，溶解、分散或掺入一种或多种本发明的化合物制备。吸收增强剂还可用于增加化合物经皮肤的流动。这种流动的速率可通过或者提供一种控制速率的膜，或者在聚合物基质或凝胶中分散该化合物控制。
药物制剂包括适于吸入或吹入或适于鼻或眼内给药的那些。为了通过吸入向上(鼻)或下呼吸道给药，由吹入器、喷雾器或加压包或其它输送气溶胶喷雾剂的方便装置方便地输送本发明的化合物。加压包可包括适当的喷射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量剂量的阀确定剂量单位。
另一方面，为了通过吸入或吹入给药，所述组合物可以是干粉形式，例如，本发明一种或多种化合物的粉末和适当粉末基质(例如乳糖或淀粉)的混合物。粉末组合物可以以，例如，胶囊剂或药筒，或者，例如明胶或薄膜包装单位剂量的形式存在，其中粉末可以借助于吸入器、吹入器或计量剂量的吸入器给药。
对于鼻内给药，本发明的化合物可通过滴鼻液或喷雾液给药，例如通过塑料瓶雾化器或计量剂量的吸入器给药。典型的雾化器是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
滴剂，例如滴眼液或滴鼻液，可以和还包括一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的含水或非水基质配制。喷雾液由加压包方便地输送。滴剂可借助于简单的加盖滴眼瓶或适于由特定形状的闭合逐滴输送液体成分塑料瓶输送。
适于非肠道给药的本发明的药物组合物包括一种或多种本发明的化合物，和一种或多种药学上可接受的载体组合成无菌等渗含水或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，或者能够刚好在使用之前重新配制成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，它包含抗氧化剂、缓冲剂、使制剂和预期受体血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
本发明的药物组合物中可采用的适当的含水和非水载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和它们适当的混合物，植物油，例如橄榄油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。能够保持适当的流动性，例如，通过利用包衣材料，例如卵磷酯，在分散液的情况下通过维持需要的粒度，以及通过利用表面活性剂。
这些组合物还可含有助剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。在该组合物中也需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，通过掺入延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶能产生可注射的药物形式的延长吸收。
在某些情况下，为了延长药物的作用，延缓皮下或肌肉注射的药物的吸收是需要的。这可通过利用具有不良水溶性的结晶或无定形物质的液体悬浮液完成。药物吸收的速率于是取决于溶解速率，其本身取决于结晶大小和结晶形式。另一方面，非肠道给药的延迟吸收通过在油载体中溶解或悬浮药物完成。
通过在可生物降解的聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成药物的微胶囊基质制备注射贮存形式。根据药物与聚合物的比，和采用的具体聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮存注射制剂还可通过使药物收集在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。注射材料可灭菌，例如通过经截留细菌过滤器过滤灭菌。
制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器，例如安瓿和小瓶中，并且在冻干条件下贮藏，在使用之前仅仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由以上描述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
如上所述，业已报道PAF在各种疾病和病症治疗中起作用。这些疾病和病症包括急性呼吸窘迫综合征，变态反应，关节炎，哮喘，自身免疫性疾病，支气管炎，心血管疾病，克罗恩氏病，囊性纤维化，肺气肿，胃肠道溃疡，炎症，炎性肠病，局部缺血，多器官功能失调综合征，心肌梗死，肿瘤性疾病，眼炎，疼痛，牛皮癣，呼吸道感染，脓毒病，休克，和溃疡性结膜炎。PAF还介导血小板聚集。结构式(1)的二酮基哌嗪可用于治疗这些疾病和病症以及任何其它PAF起作用的疾病和病症。本发明的化合物可以与其它适于给定疾病或病症的标准疗法组合给药。
已经报道PAF诱发白细胞介素8(IL-8)的产生和分泌(参见以下实施例3的讨论)。IL-8是促炎细胞因子，已经报道它在大量的疾病和病症的发病中起作用，包括急性呼吸窘迫综合征，变态反应，关节炎，哮喘，自身免疫性疾病，支气管炎，癌症，克罗恩氏，囊性纤维化，肺气肿，心内膜炎，胃炎，炎症性肠病，局部缺血再灌注(ischemia reperfusion)，多器官功能失调综合征，肾炎，胰腺炎，呼吸道病毒感染，脓毒病，休克，溃疡性结肠炎，和其它炎症疾病。已经发现结构式(1)的二酮哌抑制PAF诱导IL-8产生和/或释放。初步数据表明它们在无PAF时还抑制IL-8的产生和/或释放。已经具体发现脂多糖(LPS)-诱导的正常人的支气管上皮细胞的IL-8的产生和/或释放受抑制(数据未显示)。因此，本发明的二酮基哌嗪显示通过两种不同的机制起作用，并且可用于治疗IL-8以及PAF介导的疾病或病症。
实施例实施例13-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(5)的制备具有与它连接的9-芴基甲氧基羰基-保护的丙氨酸(Ala-Fmoc)的Wang树脂(3克(g)，2.52mmol，1当量，NovaBiochem)转移至洁净的100mL圆底烧瓶中，将哌啶(12mL)的二甲基甲酰胺(DMF；18mL)溶液加入烧瓶中的树指中。溶液搅拌1小时，用烧结玻璃漏斗分离树脂。以DMF(3×30mL)洗涤树脂，接着用二氯甲烷(DCM；3×30mL)洗涤，并且真空干燥5分钟。
部分干燥的树脂转移入洁净的100mL圆底烧瓶中，并且加入DMF(10mL)。接着，加入Boc-Asp(OBz)OH(3.25g，10.07mmol，4当量)，之后加入二异丙胺(2.83mL，2.04g，20.19mmol，8当量)和2(1H-苯并三唑-1-基)-1，2，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU；3.24g，10.09mmol，4当量，Acros)。使浆液在厌氧条件下反应12小时。反应结束时，该树脂显示阴性水合茚三酮试验，表明偶合反应完成。树脂真空过滤并以DMF(3×30mL)洗涤，之后以DCM(3×30mL)洗涤。将树脂在转移至洁净100mL圆底烧瓶之前室温真空下干燥10分钟。
将三氟乙酸(TFA；16.5mL)加至干燥树脂，在加入时树脂变成红色。在搅拌树脂又30分钟之后，过滤除去TFA，以DCM(4×20mL)洗涤树脂。有机组分混合，加入甲苯(20mL)。混合的有机物真空蒸发至干燥。痕量的TFA通过加入甲苯和蒸发除去。重复此步骤直至已经除去所有的TFA。这种步骤得到浅黄油状产物，它的NMR和质谱数据与预期的二肽苄基酯一致，以下显示了它的结构(3)。
将二肽3溶解在丁-2-醇(40mL)中并以甲苯(60mL)稀释。使这种溶液回流24小时。此周期结束时，溶液冷去至室温。接着在旋转式蒸发器上浓缩，同时保持温度在50℃。在浓缩时，沉淀出白色固体，过滤除去沉淀物。以甲苯(10mL)洗涤沉淀物和干燥。残余物(0.650g)产生阴性水合茚三酮试验。接着，由热甲醇中结晶。这种结晶产物的光谱学和分析结果确认它的结构是需要的化合物-Asp-Ala二酮基哌嗪苄基酯，以下表示为(4)。
这种化合物(400mg)溶解在甲醇(250mL)中，并且仔细地加入碳载钯(Pd/C；10％，0.4g)催化剂。烧瓶以氢气吹扫并保持在正的氢气压力。在大气氛下的溶液保持至少4小时。以助滤剂(硅藻土)除去催化剂并以甲醇洗涤。混合甲醇洗涤液，除去溶剂(产量200mg)。质谱和NMR分析显示游离酸Asp-Ala二酮基哌嗪(3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸，5)已经形成，不具有任何的交叉污染。 实施例2Asp-Ala二酮基哌嗪酰胺(6)的制备 向3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(0.151g，0.81mmol，1当量，实施例1描述的产物，5)的DMF(2.5mL)溶液中加入羰基二咪唑(0.26g，1.60mmol，2当量，Aldich)。室温下搅拌1小时之后，加入固体醋酸铵(0.63g，8.17mmol，10当量，Aldrich)。室温下持续搅拌过夜，此时反应物分布在水(20mL)和乙酸乙酯(10mL)之间。以第二等分的乙酸乙酯(10mL)洗涤水层，接着减压蒸发至干燥(61℃)。通过以水然后甲苯进一步共蒸发除去痕量的DMF，产生白色固体(362mg)。其被溶解最小体积甲醇的DCM(20∶80 v/v)中。分馏洗脱的溶剂，合并适当的馏分并减压下蒸发(40℃)产生白色固体。该产物接着由甲醇重结晶得到需要的产物(0.116g，76％收率，6)。
实施例3IL-8释放的抑制白细胞介素8(IL-8)是促炎细胞因子和有效的嗜中性白细胞的化学诱引剂和活化剂。还报道它是T-淋巴细胞和嗜曙红细胞的化学诱引剂和活化剂。IL-8由免疫细胞(包括淋巴细胞、嗜中性白细胞、单核细胞和巨噬细胞)、成纤维细胞和上皮细胞产生。报道表明IL-8在呼吸道病毒感染、哮喘、支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征、脓毒病、多器官功能失调综合征和其它的炎性疾病的发病中的重要作用。
已经报道PAF诱导人肺成纤维细胞中IL-8的转录和分泌。Roth等，J.Exp.Med.，184，191-201(1996)。还有报道PAF增强人单核细胞在脂多糖(LPS)反应中产生IL-8，但是PAF独自仅仅微弱地诱导这些细胞产生IL-8。Arbabi等，Archives Surgery，134，1348-1353(1999)。这些作者假定PAF＂起动＂先天免疫系统在对不足以引发炎症反应的次炎性刺激的反应中产生增强量的促炎介体。他们进一步推测如果这种起动泛化，它会变得有害。这种情况下，被认为由不起动先天免疫系统的较小的次刺激，会诱发炎症介体的攻击、扩散和未集中，可能导致多器官功能失调综合征NHBE 6122正常人支气管上皮细胞(Clonetics，San Diego，CA)以20,000细胞/孔加至24孔组织培养板(Falcon，now BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)上，并且使其在含有肾上腺素(完全培养基)的BEGM(支气管上皮生长培养基；Clonetics)中于37℃和5％CO2下粘着过夜。粘着之后，以不含肾上腺素的BEGM培养基洗涤细胞两次。它们接着在完全培养基或含有20μM 3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(DA-DKP；实施例1描述的产物，5；HEPES缓冲盐水(HBSS；Clonetics)中制备的储液)的完全培养基中以4mM于37℃和5％CO2下培养20分钟。接着加入溶于二甲亚砜(DMSO；组织培养基；Sigma，St.Louis，MO)的血小板活化因子(PAF；Sigma，St.Louis，MO)至100nM或500nM的最终浓度，该细胞在37℃和5％CO2下培养额外的6小时。使用含有DMSO和HBSS的培养基作为对照。
通过采用人IL-8配对抗体的ELISA(Endogen，Cambridge，MA)测定细胞上清液中的IL-8浓度。按照制造商指令和以下例外，采用Endogen，Cambridge，MA的ELISA试剂盒进行ELISA(1)涂1μg/ml抗体；(2)检测抗体30ng/ml；StrepAvidin HRP稀释1∶32,000。
结果如下表1-3所示。可以看出，NHBE 6122细胞中PAF诱导的IL-8分泌由用DA-DKP预培养的细胞抑制。
假定DA-DKP结合PAF，PAF受体，或者两者，阻滞产生(释放)IL-8的信号。
表1IL-8(pg/ml) SEMDMSO729.88 8.46HBSS809.62 198.23AA-DKP(20μM) 803.11 67.18PAF(100nM) 1094.68 103.21PAF+AA-DKP 714.91 88.95表2IL-8(pg/ml) SEMDMSO602.99 73.48HBSS581.86 64.36AA-DKP(20μM) 837.84 100.73PAF(500nM) 887.87 112.56PAF+AA-DKP 542.537.17表3IL-8(pg/ml) SEMDMSO209.79 13.24HBSS233.08 5.79AA-DKP(20μM) 184.86 34.73PAF(100nM) 355.36 11.28PAF+AA-DKP 201.93 20.64*对于表3，在试验之前4天均分细胞以产生5,000细胞/孔，并且使生长至70％融合。
权利要求
1.一种治疗血小板活化因子介导的疾病或病症的方法，包括给予需要该治疗的动物有效量的该结构式的化合物 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
2.权利要求1的方法，其中R1是-CH2COOH。
3.权利要求1的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
4.权利要求2的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
5.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症选自由变态反应、哮喘、急性呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、呼吸道感染、脓毒病和休克组成的组。
6.一种抑制炎症的方法，包括给予需要该治疗的动物有效量的该结构式的化合物 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
7.权利要求6的方法，其中R1是-CH2COOH。
8.权利要求6的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
9.权利要求7的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
10.一种抑制血小板聚集的方法，包括以有效量的该结构式的化合物接触血小板 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
11.权利要求10的方法，其中R1是-CH2COOH。
12.权利要求10的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
13.权利要求11的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
14.权利要求10的方法，其中接触在体内进行。
15.一种抑制由细胞产生、释放或者产生和释放白细胞介素8的的方法，包括以有效量的该结构式的化合物接触细胞 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
16.权利要求15的方法，其中R1是-CH2COOH。
17.权利要求15的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
18.权利要求16的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
19.权利要求15的方法，其中接触在体内进行。
20.一种抑制血小板活化因子(PAF)作用的方法，包括以有效量的该结构式的化合物接触PAF 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
21.权利要求20的方法，其中R1是-CH2COOH。
22.权利要求20的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
23.权利要求21的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
24.权利要求20的方法，其中接触在体内进行。
25.一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和该结构式的化合物 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、夭冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
26.权利要求25的组合物，其中R1是-CH2COOH。
27.权利要求25的组合物，其中R2是丙氨酸的侧链。
28.权利要求26的组合物，其中R2是丙氨酸的侧链。
全文摘要
本发明提供一种抑制血小板活化因子(PAF)作用的方法。例如，可以治疗PAF介导的疾病或病症(特别是炎症)或者可以抑制血小板聚集。本发明也提供抑制由细胞产生和/或释放的白细胞介素8(IL－8)的方法。按照本发明PAF的作用和IL－8的产生和/或释放由该结构式(1)的化合物抑制，其中R
文档编号A61P31/04GK1458844SQ01815837
公开日2003年11月26日 申请日期2001年8月2日 优先权日2000年8月4日
发明者戴维·巴-奥尔, C·杰拉尔德·柯蒂斯, 纳加拉杰·K·R·拉奥, 格雷格·托马斯 申请人:Dmi生物科学公司
技术领域：
本发明涉及采用一些二酮基哌嗪抑制血小板活化因子作用的方法。本发明亦涉及采用这些二酮基哌嗪抑制白细胞介素8(IL-8)的生成和/或释放的方法。最后，本发明涉及包含二酮基哌嗪的药物组合物。
背景技术：
血小板活化因子(PAF；1-O-烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)是具有各种生理活性的有效的炎性磷酯介体。它由嗜碱粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、嗜曙红细胞、嗜中性白细胞、天然杀伤淋巴细胞、血小板和内皮细胞，以及由在适当免疫和非免疫的刺激下肾和心脏的组织产生和释放。参见PCT申请WO 94/04537。PAF通过结合在许多细胞和组织中发现的特异的PAF受体介导生物反应。对PAF和其类似物结构-活性的研究说明PAF结合这些受体的能力是结构特异的和立体有择的。参见PCTWO 94/04537。
当PAF介导基本的生物反应时，它还表现出在病理学免疫和炎性反应中起作用。许多出版的研究论文已经提供证据，说明PAF与疾病有关，其中包括关节炎、急性炎症、哮喘、变态反应、心血管疾病、肿瘤性疾病、内毒素休克、疼痛、牛皮癣、眼发炎、局部缺血、胃肠溃疡、心肌梗死、炎性肠疾病和急性呼吸窘迫综合征。参见PCT申请WO 94/04537。
PAF与病理学的发炎和免疫状态有关已经促进大量研究以鉴别PAF受体拮抗剂，并且已经鉴别许多不同化学结构的化学物为PAF拮抗剂。参见，例如，PCT申请WO 94/04537和WO 96/00212(和这两篇申请中引用的参考文献)，PCT申请WO 95/18610和WO 99/49865，美国专利4,940,709，5,358,938，5,434,151，5,463,083，5,648,486，5,741,809 5,792,776，5,780,503，5,856,323，日本申请63 290868，Shimazaki等，Chem.Phare.Bull.，35(8)，3527-3530(1987)，Shimazaki等，J.Med.Chem.，30，1709-1711(1987)，Yoshida等，Prog.Biochem.Pharmacol.，22，68-80(1988)，Shimazaki等，Lipids，26(12)，1175-1178(1991)。已知大量的病理学免疫和炎性反应由PAF介导，有鉴别抑制PAF活性的新的化合物和组合物的需要。
已经报道二酮基哌嗪具有许多生理活性.。参见，例如，美国专利4,289,759(免疫调节剂)，4,331,595(免疫调节剂)，4,940,709(PAF拮抗剂)，5,700,804(纤溶酶原活化因子抑制剂的抑制剂)，5,750,530(纤溶酶原活化因子抑制剂的抑制剂)，5,990,112(金属蛋白抑制剂)，PCT申请WO 97/36888(法呢-蛋白转移酶抑制剂)和WO 99/40931(中枢神经系统损伤治疗剂)，EP申请43219(免疫调节剂)，日本申请63 290868(PAF拮抗剂)，日本申请3176478(免疫抑制剂)，Shimazaki等，Chem.Phare.Bull.，35(8)，3527-3530(1987)(PAF拮抗剂)，Shimazaki等，J.Med.Chem.，30，17091711(1987)(PAF拮抗剂)，Shimazaki等，Lipids，26(12)，1175-1178(1991)(PAF拮抗剂)，Yoshida等，Prog.Biochem.Pharmacol.，22，68-80(1988)(PAF拮抗剂)，Alvarez等，J.Antibiotics，47(11)，1195-1201(1994)(钙激活中性蛋白酶抑制剂)。
由天冬氨酸和丙氨酸组成的二酮基哌嗪(3-甲基-2，5二酮基哌嗪-6-乙酸；DA-DKP)是已知的。已经报道它作为在30℃以上贮藏的人血清蛋白降解的结果形成。Chan等，Eur.J.Biochem.，227，524-528(1995)。不知道它具有生物活性。
发明概述本发明提供一种治疗血小板活化因子介导的疾病或病症的方法。这种方法包括给予需要该治疗的动物有效量的该结构式的二酮基哌嗪 R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
本发明进一步提供一种抑制炎症的方法。这种方法包括给予需要该治疗的动物有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐。
本发明还提供一种抑制血小板聚集的方法。这种方法包括以有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐和血小板接触。
此外，本发明提供一种抑制由细胞生产生、释放或者产生和释放白细胞介素8的方法。这种方法包括以有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐和细胞接触。
本发明进一步提供抑制血小板活化因子(PAF)作用的方法。这种方法包括以有效量的结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐和PAF接触。
最后，本发明提供一种药物组合物。这种组合物包括药学上可接受的载体和结构式(1)的化合物或其生理学上可接受的盐。
本发明优选的实施方案的详细说明氨基酸的＂侧链＂指连在以上列出所有氨基酸共有的 主链上的氨基酸部分。例如，甘氨酸的侧链是-H，丙氨酸的侧链是-CH3，和丝氨酸的侧链是-CH2OH。
＂烷基＂指含有1-30个碳原子，优选1-18个碳原子的直链或支链烷基。＂低级烷基＂指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基。
＂芳基＂指具有至少一个芳环(例如苯基)的芳香基团。
＂烷芳基＂指具有与其相连的芳基的低级烷基(例如，-CH2C6H5或-CH3CH(C6H5)CH3)。
＂芳烷基＂指具有与其相连的烷基的芳基(例如，-C6H4-CH3)。
本文使用的＂抑制＂指减轻(完全或部分)或预防。
本文使用的＂介导＂指引起，恶化，或有关。
本文使用的＂治疗＂意指减轻(完全或部分)疾病或病症的症状，包括治愈疾病或病症，或者预防疾病或症状。
本发明基于3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(DA-DKP)抑制PAF活性的发现。这种抑制看来归因于DA-DKP与PAF和PAF受体的结合。认为DA-DKP与PAF结合归因于DA-DKP的羧基和PAF胆碱部分上的N+的离子配对。因此，预计其它的包括一个或多个羧基的二酮基哌嗪是PAF的有效抑制剂。实际上，其它的含羧基的非二酮基哌嗪化合物，例如聚-天冬氨酸或聚-谷氨酸，也可能是有效的PAF抑制剂。DA-DKP结合PAF受体的机理是未知的，但是假设它归因于DA-DKP的二酮基哌嗪环结构和/或DA-DKP的疏水R2侧链。
制备二酮基哌嗪的方法是本领域已知的，并且可能采用这些方法合成结构式(1)的二酮基哌嗪。参见，例如，美国专利4,694,081和5,817,751；Smith等，Bioorg Med.Chem.Letters，8，2369-2374(1998)。然而，当采用现有技术方法合成结构式(1)的二酮基哌嗪时，会遭遇困难或得到不令人满意的结果(参见共同待审的临时申请60/223,075，2000年8月4提交)。从而，如共同待审的临时申请60/223,075所述的方法合成结构式(1)的二酮基哌嗪是最优选的，它的全部公开引入本文作为参考。
临时申请60/223,075描述的合成方法采用了本领域公知的标准溶液相或固相肽合成法。固相肽合成法是优选的。
临时申请60/223,075描述的合成方法的第一步骤包括提供第一氨基酸。第一氨基酸选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组。这些氨基酸可以是D-或L-对映体形式，是商业上可得到的，或者能由本领域公知的方法制备(参见，例如，Williams，Synthesis Of OpticallyActive a-AminoAcids(Pergammon Press，1989))。优选的是疏水氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。特别优选的是丙氨酸。
第一氨基酸还优选以一种或多种保护基团保护，以防止合成期间不需要的副反应。这种保护基团，和连接和除去它们的方法，是本领域公知的。参见，例如，Green和Wuts，Protective Groups In Organic Chemistry(Wiley 1992)和Grant，Synthetic PeptidesA User′s Guide(Freemen 1992)。
第一氨基酸与以下结构式NH2CH(CH2COOR5)COOH的天冬氨酸衍生物或以下结构式NH2CH(CH2CH2COOR5)COOH的谷氨酸衍生物反应，其中R5是低级烷基或烷芳基。R5优选是苄基(-CH2C6H5；Bz)。已经发现苄基不仅保护这些氨基酸的侧链羧基，而且促进二肽的环化。此外，可在防止手性中心(连接R1和R2基团的碳原子)外消旋作用的中性条件下从二肽除去苄基。
天冬氨酸和谷氨酸衍生物NH2CH(CH2COOR5)COOH和NH2CH(CH2CH2COOR5)COOH是商业上可得到的或可由已知方法制备(参见，例如，Bodansky和Bodansky，The Practice ofPeptide Synthesis，63-66页(第2版，Springer-Verlag，1994)。天冬氨酸和谷氨酸衍生物的氨基或羧基任选以标准保护基(见上述)保护以便防止不需要的副反应。
如上所述，二酮基哌嗪的合成优选采用固相肽合成方法。第一氨基酸或者夭冬氨酸或谷氨酸衍生物经其羧基连接至固体载体以便固相合成。固体载体可以是任何与肽合成相容的载体，例如Grant和Atherton描述的方法，Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach(BL Press 1989)。适当的固体载体是商业上可得到的或者能由标准方法制备。参见PCT申请WO96/00391。固体载体包含固定第一氨基酸或者天冬氨酸或谷氨酸衍生物至载体表面的接头或间隔分子。许多具有各种性质的接头是本领域公知的。参见，例如，Grant，Synthetic PeptidesA User′s Guide(Freemen 1992)和PCT申请WO 96/00391。这种接头通常包括连接第一氨基酸或者天冬氨酸或谷氨酸衍生物的官能团。
优选地，第一氨基酸连接在固体载体上，并且，在偶合天冬氨酸或谷氨酸衍生物至第一氨基酸之前，如果存在，除去在键合的第一氨基酸的α氨基上的保护基团。然而，应避免任何侧链氨基的保护基团的除去，应该选择这样的条件以在不去保护侧链氨基时去保护氨基。适当的去保护条件是本领域已知的。例如，以20％至55％的仲胺碱例如哌啶，在极性非质子传递溶剂，例如二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷中可进行9-芴基甲氧基羰基的除去，。优选加入二异丙基硅烷以防止去保护期间的具说在大规模制备中存在的酯交换。
第一氨基酸和天冬氨酸或谷氨酸衍生物之间的反应在有效产生肽键的条件下进行，这样以形成二肽。这些条件是本领域公知的。例如，偶合催化剂(例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，2，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐，苯并三唑-1-基-氧代三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六磷酸盐，1-羟基苯并三唑，二异丙胺，二环己基碳二亚胺)可用于形成二肽。通常，使用过量的偶合催化剂，具有2至10当量或更多的量。通常相对于偶合的化学物质的反应性确定过量的范围。极性非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷，二氯甲烷和二甲亚砜)是优选的。反应时间可以是一个半小时至整夜，温度由室温至回流变化。
下一步，如果二肽与固体载体键合，采用本领域公知的标准方法由固体载体除去二肽。由固体载体有效除去二肽的条件将取决于固体载体和选择的接头。通常，采用强酸，例如三氟乙酸通过酸水解除去该肽。
接着环化二肽以形成二酮基哌嗪；这种二酮基哌嗪会具有仍然为酯形式的夭冬氨酸或谷氨酸衍生物的侧链羧基。环化通过在中性条件下加热二肽完成。典型地，二肽在约80℃至约180℃加热，优选约120℃。溶剂是中性溶剂。例如，这种溶剂包括醇(例如丁醇、甲醇、乙醇和高级醇，但不是酚)和共沸的共溶剂(例如甲苯、苯，或二甲苯)。优选地，醇是丁-2-醇，共沸溶剂是甲苯。持续加热直至反应完全，并且根据经验确定加热时间。典型地，二肽通过将其回流约8-24小时，优选约18小时环化。
最后，R5基团从二酮基哌嗪通过本领域公知的方法除去以便除去保护基(见上述)。当R5基团是苄基时，它优选从二酮基哌嗪通过采用碳载钯(Pd/C)催化剂氢化除去。应该避免强酸(无机酸，例如硫酸或盐酸)、强碱(碱金属碱，例如氢氧化钾或氢氧化钠)和强的还原剂(例如，氢化铝锂)的使用，以便保持最终化合物的手性。
一旦除去R5基团，可衍生游离酸，如果需要，形成标准衍生物，例如酰胺和酯。用于转化游离酸成为酰胺或酯的方法是本领域公知的。
结构式(1)的二酮基哌嗪生理学上可接受的盐还可用于本发明的实践。生理学上可接受的盐包括常规的无毒盐，例如衍生自无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)、有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸椽酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、抗坏血酸等)或碱(例如的药学上可接受金属阳离子或者衍生自N，N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺或乙二胺的有机阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)的盐。这类盐用常规方法，例如，通过用酸中和游离碱形式的化合物制备。
结构式(1)的二酮基哌嗪，或其生理学上可接受的盐，能用于治疗PAF介导的疾病或病症。为此，向需要该治疗的动物给药结构式(1)的二酮基哌嗪，或其生理学上可接受的盐。优选的动物是哺乳动物，例如兔、山羊、狗、猫、马或人。可以根据经验确定适于本发明的各种化合物的有效剂型、给药模式和剂量，并且在本领域的技术熟练人员做出这种决定。本领域的熟练人员理解剂量会随采用的特定化合物、治疗的疾病或病症、疾病或病症的严重性、给药途径、化合物的排泄速率、治疗持续时间、任何其它要给予动物的药物的鉴别、年龄、动物的大小和种类以及医学和兽医学领域已知的相似因素而变化。一般，本发明化合物的适当的每天剂量会是化合物产生治疗作用的最低有效剂量的那种剂量。然而，每天剂量会由主治医师或兽医在合理的医学判断范围内确定。如果需要，有效的每天剂量可以作为两、三、四、五、六个或更多子剂量给药，全天以适当的间隔单独给药。持续该化合物的给药直至获得一种可接受的反应。
本发明的化合物(即，结构式(1)的二酮基哌嗪和它生理学上可接受的盐)可以向动物患者给药以便通过任何适当的给药途径治疗，包括经口、鼻、直肠、阴道、非肠道(例如，静脉内、脊柱内、皮下、腹膜内或肌肉内)、脑池内、透皮、颅内、大脑内和局部(包括颊和舌下)给药。优选的给药途径是经口和静脉内。
对于本发明的化合物可单独给药，该化合物优选以药物制剂(组合物)形式给药。本发明的药物组合物包括作为活性组分的一种或多种本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的载体，并且，任选地包括一种或多种其它化合物、药物或其它物质。在与制剂内其它组分相容和对动物无损伤的意义上，每种载体必须是＂可接受的＂。药学上可接受的载体是本领域公知的。不考虑选择的给药途径，本发明的化合物通过本领域熟练人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。参见，例如，Renzington′sPliamiaceutical Sciences。
本发明的适于口服给药的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂，或者作为含水或非水液体内的溶液或悬浮液，或者水包油或油包水液体乳剂，或者作为酏剂或糖浆剂，或者作为锭剂(采用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)，等等，每个含有预定量的作为活性组分的本发明的化合物。本发明的化合物还可以大丸剂、药糖剂或糊剂给药。
本发明口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，活性组分与一种或多种药学上可接受的载体混合，所述载体例如枸椽酸钠或磷酸二钙，和/或以下任何一种(1)填充剂或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如，如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、一些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙醇、月桂基硫酸钠和它们的混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还包括缓冲剂。在采用例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充的明胶胶囊中，采用相似种类的固体组合物作为填充剂。
通过任选地加上一种或多种辅助组分压缩或模制制备片剂。采用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压片。通过在适合的机器中模制以惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物制备模制片。
本发明的药物组合物的片剂和其它固体剂型，例如糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，任选地被刻痕，或者以包衣和壳体，例如肠溶衣和其它药物制备领域公知的包衣制备。它们还可被配制成提供其中活性组分的缓释或控制释放，例如，采用各种比例提供需要的释放曲线的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可以通过，例如，经截留细菌滤器过滤进行消毒。这些组合物还任选包含遮光剂，并且是仅仅或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性组分的组合物。可以被使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。活性组分还可是微胶囊形式。
适于本发明化合物口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性组分之外，液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别地，棉子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，及其混合物。
除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括助剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂、增甜剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
悬浮液，除了活性化合物之外，可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxid)、膨润土、琼脂和西黄蓍胶，以及它们的混合物。
本发明的直肠或阴道给药用药物组合物制剂可以栓剂存在，它可通过混合本发明的一种或多种化合物与一种或多种适当的非刺激性赋形剂或载体(包括，例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)制备，它在室温下是固体，但是在体温下是液体，因此，会在直肠或阴道腔内熔化并释放这种活性化合物。适于阴道给药的本发明的制剂还包括含有本领域已知是适当的载体的阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
适于本发明的化合物局部或经皮给药的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂、滴剂和吸入剂。活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体，和任何缓冲剂，或需要的喷射剂混合。
软膏、糊剂、乳膏和凝胶除了活性组分之外，可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或者它们的混合物。
散剂和喷雾剂除了活性组分之外，可包含赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混和物。喷雾剂另外包含通常的喷射剂，例如氯氟代烃和挥发性的未取代的烃，例如丁烷和丙烷。
皮肤贴剂具有附加的提供控制本发明的化合物输送至体内的优点。这种剂型可通过在适当基质，例如弹性基质物质中，溶解、分散或掺入一种或多种本发明的化合物制备。吸收增强剂还可用于增加化合物经皮肤的流动。这种流动的速率可通过或者提供一种控制速率的膜，或者在聚合物基质或凝胶中分散该化合物控制。
药物制剂包括适于吸入或吹入或适于鼻或眼内给药的那些。为了通过吸入向上(鼻)或下呼吸道给药，由吹入器、喷雾器或加压包或其它输送气溶胶喷雾剂的方便装置方便地输送本发明的化合物。加压包可包括适当的喷射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量剂量的阀确定剂量单位。
另一方面，为了通过吸入或吹入给药，所述组合物可以是干粉形式，例如，本发明一种或多种化合物的粉末和适当粉末基质(例如乳糖或淀粉)的混合物。粉末组合物可以以，例如，胶囊剂或药筒，或者，例如明胶或薄膜包装单位剂量的形式存在，其中粉末可以借助于吸入器、吹入器或计量剂量的吸入器给药。
对于鼻内给药，本发明的化合物可通过滴鼻液或喷雾液给药，例如通过塑料瓶雾化器或计量剂量的吸入器给药。典型的雾化器是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
滴剂，例如滴眼液或滴鼻液，可以和还包括一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的含水或非水基质配制。喷雾液由加压包方便地输送。滴剂可借助于简单的加盖滴眼瓶或适于由特定形状的闭合逐滴输送液体成分塑料瓶输送。
适于非肠道给药的本发明的药物组合物包括一种或多种本发明的化合物，和一种或多种药学上可接受的载体组合成无菌等渗含水或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，或者能够刚好在使用之前重新配制成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，它包含抗氧化剂、缓冲剂、使制剂和预期受体血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
本发明的药物组合物中可采用的适当的含水和非水载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和它们适当的混合物，植物油，例如橄榄油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。能够保持适当的流动性，例如，通过利用包衣材料，例如卵磷酯，在分散液的情况下通过维持需要的粒度，以及通过利用表面活性剂。
这些组合物还可含有助剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。在该组合物中也需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，通过掺入延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶能产生可注射的药物形式的延长吸收。
在某些情况下，为了延长药物的作用，延缓皮下或肌肉注射的药物的吸收是需要的。这可通过利用具有不良水溶性的结晶或无定形物质的液体悬浮液完成。药物吸收的速率于是取决于溶解速率，其本身取决于结晶大小和结晶形式。另一方面，非肠道给药的延迟吸收通过在油载体中溶解或悬浮药物完成。
通过在可生物降解的聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成药物的微胶囊基质制备注射贮存形式。根据药物与聚合物的比，和采用的具体聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮存注射制剂还可通过使药物收集在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。注射材料可灭菌，例如通过经截留细菌过滤器过滤灭菌。
制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器，例如安瓿和小瓶中，并且在冻干条件下贮藏，在使用之前仅仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由以上描述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
如上所述，业已报道PAF在各种疾病和病症治疗中起作用。这些疾病和病症包括急性呼吸窘迫综合征，变态反应，关节炎，哮喘，自身免疫性疾病，支气管炎，心血管疾病，克罗恩氏病，囊性纤维化，肺气肿，胃肠道溃疡，炎症，炎性肠病，局部缺血，多器官功能失调综合征，心肌梗死，肿瘤性疾病，眼炎，疼痛，牛皮癣，呼吸道感染，脓毒病，休克，和溃疡性结膜炎。PAF还介导血小板聚集。结构式(1)的二酮基哌嗪可用于治疗这些疾病和病症以及任何其它PAF起作用的疾病和病症。本发明的化合物可以与其它适于给定疾病或病症的标准疗法组合给药。
已经报道PAF诱发白细胞介素8(IL-8)的产生和分泌(参见以下实施例3的讨论)。IL-8是促炎细胞因子，已经报道它在大量的疾病和病症的发病中起作用，包括急性呼吸窘迫综合征，变态反应，关节炎，哮喘，自身免疫性疾病，支气管炎，癌症，克罗恩氏，囊性纤维化，肺气肿，心内膜炎，胃炎，炎症性肠病，局部缺血再灌注(ischemia reperfusion)，多器官功能失调综合征，肾炎，胰腺炎，呼吸道病毒感染，脓毒病，休克，溃疡性结肠炎，和其它炎症疾病。已经发现结构式(1)的二酮哌抑制PAF诱导IL-8产生和/或释放。初步数据表明它们在无PAF时还抑制IL-8的产生和/或释放。已经具体发现脂多糖(LPS)-诱导的正常人的支气管上皮细胞的IL-8的产生和/或释放受抑制(数据未显示)。因此，本发明的二酮基哌嗪显示通过两种不同的机制起作用，并且可用于治疗IL-8以及PAF介导的疾病或病症。
实施例实施例13-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(5)的制备具有与它连接的9-芴基甲氧基羰基-保护的丙氨酸(Ala-Fmoc)的Wang树脂(3克(g)，2.52mmol，1当量，NovaBiochem)转移至洁净的100mL圆底烧瓶中，将哌啶(12mL)的二甲基甲酰胺(DMF；18mL)溶液加入烧瓶中的树指中。溶液搅拌1小时，用烧结玻璃漏斗分离树脂。以DMF(3×30mL)洗涤树脂，接着用二氯甲烷(DCM；3×30mL)洗涤，并且真空干燥5分钟。
部分干燥的树脂转移入洁净的100mL圆底烧瓶中，并且加入DMF(10mL)。接着，加入Boc-Asp(OBz)OH(3.25g，10.07mmol，4当量)，之后加入二异丙胺(2.83mL，2.04g，20.19mmol，8当量)和2(1H-苯并三唑-1-基)-1，2，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU；3.24g，10.09mmol，4当量，Acros)。使浆液在厌氧条件下反应12小时。反应结束时，该树脂显示阴性水合茚三酮试验，表明偶合反应完成。树脂真空过滤并以DMF(3×30mL)洗涤，之后以DCM(3×30mL)洗涤。将树脂在转移至洁净100mL圆底烧瓶之前室温真空下干燥10分钟。
将三氟乙酸(TFA；16.5mL)加至干燥树脂，在加入时树脂变成红色。在搅拌树脂又30分钟之后，过滤除去TFA，以DCM(4×20mL)洗涤树脂。有机组分混合，加入甲苯(20mL)。混合的有机物真空蒸发至干燥。痕量的TFA通过加入甲苯和蒸发除去。重复此步骤直至已经除去所有的TFA。这种步骤得到浅黄油状产物，它的NMR和质谱数据与预期的二肽苄基酯一致，以下显示了它的结构(3)。
将二肽3溶解在丁-2-醇(40mL)中并以甲苯(60mL)稀释。使这种溶液回流24小时。此周期结束时，溶液冷去至室温。接着在旋转式蒸发器上浓缩，同时保持温度在50℃。在浓缩时，沉淀出白色固体，过滤除去沉淀物。以甲苯(10mL)洗涤沉淀物和干燥。残余物(0.650g)产生阴性水合茚三酮试验。接着，由热甲醇中结晶。这种结晶产物的光谱学和分析结果确认它的结构是需要的化合物-Asp-Ala二酮基哌嗪苄基酯，以下表示为(4)。
这种化合物(400mg)溶解在甲醇(250mL)中，并且仔细地加入碳载钯(Pd/C；10％，0.4g)催化剂。烧瓶以氢气吹扫并保持在正的氢气压力。在大气氛下的溶液保持至少4小时。以助滤剂(硅藻土)除去催化剂并以甲醇洗涤。混合甲醇洗涤液，除去溶剂(产量200mg)。质谱和NMR分析显示游离酸Asp-Ala二酮基哌嗪(3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸，5)已经形成，不具有任何的交叉污染。 实施例2Asp-Ala二酮基哌嗪酰胺(6)的制备 向3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(0.151g，0.81mmol，1当量，实施例1描述的产物，5)的DMF(2.5mL)溶液中加入羰基二咪唑(0.26g，1.60mmol，2当量，Aldich)。室温下搅拌1小时之后，加入固体醋酸铵(0.63g，8.17mmol，10当量，Aldrich)。室温下持续搅拌过夜，此时反应物分布在水(20mL)和乙酸乙酯(10mL)之间。以第二等分的乙酸乙酯(10mL)洗涤水层，接着减压蒸发至干燥(61℃)。通过以水然后甲苯进一步共蒸发除去痕量的DMF，产生白色固体(362mg)。其被溶解最小体积甲醇的DCM(20∶80 v/v)中。分馏洗脱的溶剂，合并适当的馏分并减压下蒸发(40℃)产生白色固体。该产物接着由甲醇重结晶得到需要的产物(0.116g，76％收率，6)。
实施例3IL-8释放的抑制白细胞介素8(IL-8)是促炎细胞因子和有效的嗜中性白细胞的化学诱引剂和活化剂。还报道它是T-淋巴细胞和嗜曙红细胞的化学诱引剂和活化剂。IL-8由免疫细胞(包括淋巴细胞、嗜中性白细胞、单核细胞和巨噬细胞)、成纤维细胞和上皮细胞产生。报道表明IL-8在呼吸道病毒感染、哮喘、支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征、脓毒病、多器官功能失调综合征和其它的炎性疾病的发病中的重要作用。
已经报道PAF诱导人肺成纤维细胞中IL-8的转录和分泌。Roth等，J.Exp.Med.，184，191-201(1996)。还有报道PAF增强人单核细胞在脂多糖(LPS)反应中产生IL-8，但是PAF独自仅仅微弱地诱导这些细胞产生IL-8。Arbabi等，Archives Surgery，134，1348-1353(1999)。这些作者假定PAF＂起动＂先天免疫系统在对不足以引发炎症反应的次炎性刺激的反应中产生增强量的促炎介体。他们进一步推测如果这种起动泛化，它会变得有害。这种情况下，被认为由不起动先天免疫系统的较小的次刺激，会诱发炎症介体的攻击、扩散和未集中，可能导致多器官功能失调综合征NHBE 6122正常人支气管上皮细胞(Clonetics，San Diego，CA)以20,000细胞/孔加至24孔组织培养板(Falcon，now BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)上，并且使其在含有肾上腺素(完全培养基)的BEGM(支气管上皮生长培养基；Clonetics)中于37℃和5％CO2下粘着过夜。粘着之后，以不含肾上腺素的BEGM培养基洗涤细胞两次。它们接着在完全培养基或含有20μM 3-甲基-2，5-二酮基哌嗪-6-乙酸(DA-DKP；实施例1描述的产物，5；HEPES缓冲盐水(HBSS；Clonetics)中制备的储液)的完全培养基中以4mM于37℃和5％CO2下培养20分钟。接着加入溶于二甲亚砜(DMSO；组织培养基；Sigma，St.Louis，MO)的血小板活化因子(PAF；Sigma，St.Louis，MO)至100nM或500nM的最终浓度，该细胞在37℃和5％CO2下培养额外的6小时。使用含有DMSO和HBSS的培养基作为对照。
通过采用人IL-8配对抗体的ELISA(Endogen，Cambridge，MA)测定细胞上清液中的IL-8浓度。按照制造商指令和以下例外，采用Endogen，Cambridge，MA的ELISA试剂盒进行ELISA(1)涂1μg/ml抗体；(2)检测抗体30ng/ml；StrepAvidin HRP稀释1∶32,000。
结果如下表1-3所示。可以看出，NHBE 6122细胞中PAF诱导的IL-8分泌由用DA-DKP预培养的细胞抑制。
假定DA-DKP结合PAF，PAF受体，或者两者，阻滞产生(释放)IL-8的信号。
表1IL-8(pg/ml) SEMDMSO729.88 8.46HBSS809.62 198.23AA-DKP(20μM) 803.11 67.18PAF(100nM) 1094.68 103.21PAF+AA-DKP 714.91 88.95表2IL-8(pg/ml) SEMDMSO602.99 73.48HBSS581.86 64.36AA-DKP(20μM) 837.84 100.73PAF(500nM) 887.87 112.56PAF+AA-DKP 542.537.17表3IL-8(pg/ml) SEMDMSO209.79 13.24HBSS233.08 5.79AA-DKP(20μM) 184.86 34.73PAF(100nM) 355.36 11.28PAF+AA-DKP 201.93 20.64*对于表3，在试验之前4天均分细胞以产生5,000细胞/孔，并且使生长至70％融合。
权利要求
1.一种治疗血小板活化因子介导的疾病或病症的方法，包括给予需要该治疗的动物有效量的该结构式的化合物 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
2.权利要求1的方法，其中R1是-CH2COOH。
3.权利要求1的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
4.权利要求2的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
5.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症选自由变态反应、哮喘、急性呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、呼吸道感染、脓毒病和休克组成的组。
6.一种抑制炎症的方法，包括给予需要该治疗的动物有效量的该结构式的化合物 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
7.权利要求6的方法，其中R1是-CH2COOH。
8.权利要求6的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
9.权利要求7的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
10.一种抑制血小板聚集的方法，包括以有效量的该结构式的化合物接触血小板 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
11.权利要求10的方法，其中R1是-CH2COOH。
12.权利要求10的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
13.权利要求11的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
14.权利要求10的方法，其中接触在体内进行。
15.一种抑制由细胞产生、释放或者产生和释放白细胞介素8的的方法，包括以有效量的该结构式的化合物接触细胞 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
16.权利要求15的方法，其中R1是-CH2COOH。
17.权利要求15的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
18.权利要求16的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
19.权利要求15的方法，其中接触在体内进行。
20.一种抑制血小板活化因子(PAF)作用的方法，包括以有效量的该结构式的化合物接触PAF 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
21.权利要求20的方法，其中R1是-CH2COOH。
22.权利要求20的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
23.权利要求21的方法，其中R2是丙氨酸的侧链。
24.权利要求20的方法，其中接触在体内进行。
25.一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和该结构式的化合物 其中R1是-CH2COR3，或-CH2-CH2COR3；R2是选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、夭冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、半胱氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸和鸟氨酸组成的组的氨基酸的侧链；R3是-OH，-NH2，-OR4，-NHR4，或-NR4R4；和每个R4分别是烷基，芳基，烷芳基，或芳烷基；或者它们生理学上可接受的盐。
26.权利要求25的组合物，其中R1是-CH2COOH。
27.权利要求25的组合物，其中R2是丙氨酸的侧链。
28.权利要求26的组合物，其中R2是丙氨酸的侧链。
全文摘要
本发明提供一种抑制血小板活化因子(PAF)作用的方法。例如，可以治疗PAF介导的疾病或病症(特别是炎症)或者可以抑制血小板聚集。本发明也提供抑制由细胞产生和/或释放的白细胞介素8(IL－8)的方法。按照本发明PAF的作用和IL－8的产生和/或释放由该结构式(1)的化合物抑制，其中R
文档编号A61P31/04GK1458844SQ01815837
公开日2003年11月26日 申请日期2001年8月2日 优先权日2000年8月4日
发明者戴维·巴-奥尔, C·杰拉尔德·柯蒂斯, 纳加拉杰·K·R·拉奥, 格雷格·托马斯 申请人:Dmi生物科学公司
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