一种抗病毒组合物的制备方法

专利名称：：一种抗病毒组合物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药领域，具体涉及一种抗病毒复方制剂。
背景技术：
：《中华人民共和国卫生部新药转正标准》WS3-49(X-39)-92(z)公开了一种抗病毒口服液，该口服液由石膏、板蓝根、芦根、地黄、郁金、知母、石菖蒲、广藿香和连翘九味中药经过水提醇沉制备得到，广泛用于风热感冒、温病发热引起的上呼吸道感染、流感及流行性腮腺炎等病毒感染性疾患，具有较好的临床效果。但由于传统的制备工艺简陋导致该产品有效成分含量低，特别是挥发油成分，且该产品为液体制剂，不易贮存，携带也不方便。国家知识产权局2007年01月24日公开了一项"浓縮型抗病毒口服液的制备方法"(公开号为CN1899571A)的发明专利申请，该申请对上述口服液的传统制备进行了改进，采用传统方法炮制中药材原料，然后采用高速离心和膜分离技术将药物浓度在单位体积内提高一倍，有效成分的含量是原来相同剂量的两倍。2007年04月4日公开了一项"制备抗病毒口服液的新工艺"(公开号为CN1939525)的发明专利申请，该申请公开了将上述的口服液中的挥发油制备成包合物的方法，提高了抗病毒口服液中挥发油有效成分的含量。上述两项专利申请所公开的制备方法虽然在传统方法的基础上进行改进，但是仍然沿用原有水提醇沉工艺，提取过程中有效成分损失较大，所得产品仍无法克服传统产品有效成分含量低的缺点，不仅抗病毒的药效得不到充分发挥，造成较大的资源浪费，还使得患者服药量大。其次，上述两项专利申请的方案所得到的仍然是传统的液体剂型，不方便携带，且产品保质期短。
发明内容本发明要解决的问题是提高抗病毒复方中有效成分的含量。本发明解决上述技术问题的技术方案是一种抗病毒组合物的制备方法，该方法包含以下几个步骤.-(1)取广藿香2.9重量份、石菖蒲粗粉2.5重量份，装入C02超临界萃取釜中，在压力28MPa、温度55r下萃取2小时，收集挥发油，留药渣备用；(2)取知母2.5重量份、石膏5.7重量份、芦根粗粉6.1重量份，加水810倍，80°C下提取23次，每次12小时，过滤，合并提取液，在温度为10(TC真空度为一0.08一0.04MPa下减压浓缩成清膏，使其在50。C下的密度为1.05-1.15g/mL;(3)取连翘4.6重量份、板蓝根12.9重量份、郁金2.5重量份、地黄3.2重量份和步骤(l)所得药渣混合，用810倍80%乙醇加热回流提取23次，每次12小时，过滤，合并提取液，将乙醇提取液在温度为60。C真空度为一0.08一0.04MPa下减压浓缩成清膏，使其在5(TC下的密度为1.05~1.15g/mL;(4)取步骤(1)所得的挥发油、步骤(2)和(3)所得的清膏按常规方法制备成常用的制剂，如口服液、颗粒剂等。上述方法中，为了防止步骤(4)所述的挥发油挥发散失，可以在制备制剂前将挥发油用卩-环糊精包合，因此，本发明方法还包括以下步骤用等体积倍量的无水乙醇稀释，然后滴入到610倍量挥发油重量的卩-环糊精饱和溶液中，于406(TC搅拌35小时，静置24小时。本发明所述的组合物最好制备成颗粒剂以便于保存和携带。本发明所述的方法中，介质水、醇与被提原料的比例采用本领域的习惯做法，即水、醇的用量单位为体积单位；本发明方法，其中所述的抗病毒组合物的原料药的处方为《中华人民共和国卫生部新药转正标准》WS3-49(X-39)-92(z)所规定的抗病毒口服液的原料药的处方。本发明根据传统抗病毒复方中药材活性成分理化性质的不同，采用二氧化碳超临界提取方法提取广藿香、石菖蒲的亲脂性有效活性成分——挥发油，提取效率为水蒸汽蒸馏法的2倍以上，无溶剂残留毒性，天然活性成分中的热敏成分不易分解破坏，能最大限度的保持提取物天然特征；同时分别采用水、醇提取得到抗病毒复方中的活性部位，提取工艺简单，科学合理，最大限度的提取出药材中的有效成分，去掉杂质性成分，使得药物在原料药相同单位质量内有效成分芒果苷、连翘苷含量分别比现有制备方法提高16倍和2倍。本发明抗病毒颗粒剂中的有效成分的含量可通过以下方法测定1、芒果苷和连翘苷的含量测定对照品溶液的制备精密称取芒果苷、连翘苷适量，置50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，制成芒果苷浓度0.1172mg/ml、连翘苷浓度为0.0480mg/ml溶液，作为对照品溶液。供试品溶液的制备取本品2g，精密称重，置具塞三角烧瓶中，加甲醇50ml，超声40min，滤过，残渣加水10ml溶解，用水饱和正丁醇萃取4次(20mlx4)，合并正丁醇层，水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解，定容于10ml量瓶，摇匀，备用。分别精密吸取对照品溶液lOfil与供试品溶液5^1,注入高效液相色谱仪，测定，即得，每袋含芒果苷不低于2.5mg、连翘苷不低于0.5mg。照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定，色谱条件与适应性4.6mmx250mm，5pm碳十八键合相硅胶柱；10-30:70-90乙腈-0.05mo/L磷酸二氢钾(加％o磷酸)为流动相；检测波长277nm;理论塔板数按芒果苷计算应不低于5000，按连翘苷计算应不低于6000。2、广藿香醇的含量测定(内标法)色谱条件色谱柱为弹性石英柱，进样口温度为23(TC，检测器温度为25(TC，分流进样，程序升温70~230°C,于23(TC保持10~15分钟，流速1.0ml/min,理论塔板数按广藿香醇计算应不低于5000;校正因子的测定精密称取正二十垸适量，用正己烷制成4.0mg/ml的溶液，作为内标溶液，备用，另精密称取广藿香醇对照品适量，置10ml容量瓶中，加正己垸溶解，制成0.2mg/ml溶液，摇匀，精密量取上述广藿香醇对照品溶液0.2ml至2ml量瓶中，精密加入内标溶液0.2ml，加正己烷至刻度，摇匀，吸取lfil注入气相色谱仪，计算校正因子。供试品溶液的制备取本品2g，精密称重，加水20ml溶解，用三氯甲烷40ml加热回流提取两次，每次1小时，合并三氯甲烷层，水浴蒸干，残渣用适量正己烷溶解，转移至2ml量瓶，并加入100pL内标溶液，加正己烷至2mL刻度，摇匀，备用。精密吸取供试品溶液lpl,注入气相色谱仪，测定，即得，每袋含广藿香醇不低于48吗。本发明抗病毒制剂的药理作用可通过以下药效学实验证明一、抗呼吸道病毒作用'1试验材料1.1细胞MDCK细胞由中国医学科学院生物技术研究所提供，人胚肺二倍体细胞(MRC-5)由昆明动物研究所提供，A549细胞由本室冻存。1.2培养成份培养基为DMEM(Gibco)，胎牛血清(Gibco)、牛血清均购自广州畜牧厂。1.3病毒甲型流感病毒FM1、腺病毒7型、合胞病毒(RSV)，均为本研究室冻存。1.4药物抗病毒颗粒，按实施例1方法制备；抗病毒口服液；阳性对照药物病毒唑(广州肇庆星湖医药公司提供)。2方法和结果2.1药物细胞毒性实验在96孔培养板内，加入5000-2.0Xl()S/ml的细胞(MDCK、MRC-5、A549)，37'C下5。/。C02中培养，待细胞长成单层后，另加入不同浓度的待测药物。逐日观察细胞病变，培养4一7天则终止实验。2.2药物抗病毒作用加入无毒浓度下的各所试药物，每个药物四个浓度，每浓度四孔。其中两孔作为药物对照，两孔攻击lOOTCIDso的病毒，100ul/孔。33°C5%<:02培养4一7天'每日观察细胞变化(CPE)以确定药效。当病毒对照出现"++"则终止实验。2.3实验结果抗病毒颗粒和抗病毒口服液在无毒浓度下可抑制鼻病毒；抗病毒颗粒在无毒浓度下可抑制合胞病毒(RSV)。(结果见表l-4)表1抗病毒颗粒对甲1型流感病毒血凝滴度的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2抗病毒颗粒对鼻病毒所致细胞病变(GPE)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>细胞形态正常，药物可抑制病毒"-注"":药物毒性作用，细胞出现空泡、破碎、脱落。药物不抑制病毒，细胞出现CPE(细胞融合或圆縮)表3抗病毒口服液对鼻病毒所致细胞病变(CPE)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>-":细胞形态正常，药物可抑制病毒；注药物毒性作用，细胞山现空泡、破碎、脱落。药物不抑制病毒，细胞出现CPE(细胞融合或圆縮)_表4抗病毒颗粒对RSV病毒所致细胞病变(CPE)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注药物毒性作用，细胞出现空泡、破碎、脱落。药物不抑制病毒，细胞出现CPE(细胞融合或圆縮)细胞形态正常，药物可抑制病毒；"+'二、抗病毒颗粒对小鼠流感肺炎的死亡保护作用1实验材料1.1药物抗病毒颗粒，按实施例1方法制备。抗病毒口服液，购自广州市香雪制药股份有限公司，批号200710010;阳性对照药物病毒唑，由湖北医药工业研究所提供，批号070804。1.2动物NIH小鼠由广东省医学实验动物中心提供，符合清洁级实验标准，批号粤监证字2007A018,SCXK(粤)02004。小鼠词料为广州中医药大学实验动物中心提供的富含多种成分的配方。饲养环境室温为23土2T，相对湿度为75±10%。1.3毒种甲1型流感病毒FM1株，由中国药品生物检定所提供，鼠肺适应经小鼠增强毒力后，于鸡胚尿囊腔传代三次。并测定其半数致死量LD5。。1.4器材YJ-875医用净化工作台，苏州净化设备公司；压力蒸汽灭菌器，上海南华医疗器械厂；超纯水器，MiUipore;超低温冰箱，Sanyo日本；万分之一电子分析天平，FA/JA系列，上海良平仪器仪表有限公司；乙醚，天津化学试剂有限公司；0.9%生理盐水，开开援生物制药有限公司；架盘药物天平，福州天平仪器厂。2实验方法2.l稀释毒种试验前，取毒种用无菌生理盐水稀释成每滴0.05毫升含5个LD5。，放冰水中保存。2.2感染小鼠把小白鼠随机分组，分阳性药物组(病毒唑)、病毒对照组及试验药物组，雌雄各半。在乙醚轻度麻醉下，用己滴定流感病毒滴鼻感染，每鼠4滴，约0.05毫升。3.3给药取NIH小鼠105只，雌雄各半，随机分成7组，空白组、模型组、病毒对照组、抗病毒口服液组，供试药高、中、低剂量组。各试验组均在病毒攻击前3天开始给药，每天l次。感染病毒后继续给药，每天2次，灌胃0.4ml/只给药。3观察逐日观察动物发病及死亡数，共观察15天。死亡小鼠解剖观察鼠肺，观察流感病毒感染引起的肺实变程度。肺出现实变的程度按以下5级标准记录-双侧肺无病变出现；+:肺实变少于整个肺表面积的25%;++:肺实变占整个肺表面积的25、50%;+++:肺实变占整个肺表面积的50-75%;++++:肺实变占整个肺表面积的75%以上。4计算与统计学处理根据观察结果计算死亡保护率与延长生命率-死亡保护率=[(对照组死亡率-给药组死亡率)/对照组死亡率]X100延长生命率=[(给药组平均存活日数-对照组平均存活日数)/对照组平均存活日数]X100采用计算机统计软件包SPSS10.0进行数据处理，死亡率用/检验，存活时间用秩和检验。5实验结果7表5抗病毒颗粒对小鼠体内感染流感病毒的死亡保护和延长病鼠生命的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*与病毒对照组比较P<0.05,**P<0.01由表5可以看出抗病毒颗粒高、中、低剂量组对甲1型FM1株流感病毒感染小鼠死亡保护率分别为69.23%、58.85%、61.54%;平均存活时间分别为10.94天、10.23天、9.26天。在同等剂量(4.28g生药/kg)下，抗病毒颗粒剂对甲1型FM1株流感病毒感染小鼠死亡保护率及小鼠平均存活时间较抗病毒口服液分别高16.16%和1.12天。阳性对照药病毒唑组死亡保护率为84.62%,平均存活时间为13.80天。三、抗病毒颗粒对呼吸道致病菌的抑制作用1试验材料1.1实验药物1丄l抗病毒口服液:抗病毒口服液由广州市香雪制药股份有限公司提供，批号20060426，0.45克生药/毫升。l丄2抗病毒颗粒剂按实施例1方法制备，5.76克生药/毫升。l丄3双黄连口服液，河南竹林众生制药股份有限公司生产。l丄4氢化可的松，批号^C0117，天津津津药厂产品。l丄5阿司匹林肠溶片，批号060301，50毫克/片，桂林制药厂生产。l丄6乳糖酸红霉素批号20060602，30万单位/瓶，大连美罗大药厂生产。'1.2实验动物1.2.1新西兰白兔由广东省医学实验动物中心提供，体重为2.32.8kg，实验动物合格证号2006A025。1.2.2SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供，雄性，体重为220土20g实验动物合格证号2006A025。1.2.3昆明种小鼠由广东省医学实验动物中心提供，雄性，体重为24土2g实验动物合格证号2006A023。1.3培养基及试剂1.3.1营养肉汤批号061021,中国药品生物制品检定所生产。1.3.2营养琼脂批号070414，中国药品生物制品检定所生产。1.3.3小牛血清批号2006506，上海第二医科大学科技中心实验二室生产。1.3.4氯化钠(AR):批号061201-3，广州化学试剂厂生产。1.3.5无水葡萄糖(AR):批号061120,上海源聚生物科技有限公司生产。1.3.6角叉菜胶:批号127H1227,美国Sigma公司生产。1.3.7二甲苯:批号06薩-22，广州化学试剂厂生产。1.3.8即发干酵母(面包酵母)批号005A,中外合营梅山一马利酵母有限公司产品。1.4菌种金黄色葡萄球菌(26003-21)、大肠杆菌(44103-)、绿脓杆菌(10104-1)、肺炎链球菌(31003-16)、溶血性链球菌(32210-17)、流感杆菌(10105-32)，均购于中国药品生物制品检定所。L5主要仪器隔水式电热恒温箱型号PYX-DHS，上海科学仪器联营厂生产。手提式压力蒸汽消毒器型号YX-280，上海医疗器械厂工业公司江明医疗设备厂生产。GP2100型电子天平，德国产品。1.6实验条件无菌室空气洁净度达1万级，超净工作台洁净度100级(局部)符合规定。实验室通风光照良好，温度为2528°C，湿度为5080%，动物实验条件合格证号2007C0U。2方法和结果2.1体外抑菌试验2.1.1药物的配制均以样品原液作为初始浓度，按1:2作对倍稀释至10个浓度梯度，每管容量为lml。2.1.2培养基的制备肉汤培养基称取营养肉汤，按18克加蒸馏水1000毫升浓度比配制，加热溶解后于116"C高压灭菌20分钟。琼脂培养基称取营养琼脂，按34克加蒸馏水1000毫升浓度比配制，加热溶解后于116。C高压灭菌20分钟。血清肉汤葡萄糖培养基普通肉汤培养基加入10%小牛血清和1%葡萄糖。脱纤维tfn谅脂葡萄糖培养基含1%葡萄糖琼脂培养基于45'(3左右加入5%脱纤维乘，制成血平板和血斜面。葡萄糖酚红肉汤培养基按每1000毫升营养肉汤加5克葡萄糖和6毫升0.4%酚红水溶液的浓度比配制。血清葡萄糖酚红肉汤培养基葡萄糖酚红肉汤培养基加入10%小牛血清。2丄3菌液制备肺炎链球菌、溶血性链球菌分别接种在血琼脂斜面培养基，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、流感杆菌、绿脓杆菌分别接种在琼脂斜面培养基，37。C培养20小时，取一白金丝耳菌苔，分别接种于血清肉汤培养基或肉汤培养基中，37'C培养20小时，菌悬液按10倍稀释法，稀释至终浓度105CFU。2丄4试管稀释法本法能定量、较敏感地反映受试物的抗菌能力，重复性好。抗病毒颗粒剂及抗病毒口服液、双黄连口服液均以样品原液作为初始浓度，再用葡萄糖酚红肉汤或血清葡萄糖酚红肉汤按1:2作对倍稀释至10个浓度梯度；乳糖酸红霉素以1000u/ml浓度为起点，用葡萄糖酚红肉汤或血清葡萄糖酚红肉汤作对倍稀释至10个浓度梯度，每管lml;设阳性对照管(培养基加菌液)、阴性对照管(培养基加药液)和空白对照管(培养基加蒸馏水)，除阴性对照管、空白对照管不加菌外，其余各管加入上述稀释菌液0.1ml，摇匀，置37'C培养20小时。结果观察将每支管分别与其对应浓度的阴性管比较，根据培养管澄明度及颜色变化，判定是否有菌生长。若培养管呈现澄明，振摇后仍呈现澄明者，认为该管无菌生长，反之表明有菌生长；由于细菌的代谢产物与肉汤中的酚红产生变色反应，与其相应的阴性管对照，若产生颜色变化者(变深红或变黄)，认为该管有菌生长，反之表明无菌生长。细菌不生长的最低药物稀释度为该药的最低抑菌浓度(MIC)，继续培养至48小时，若仍呈现澄明无菌生长状态，此时最低药物稀释度为最低杀菌浓度(MBC)。每个药物浓度均设2支平行对照管，实验重复1次，MIC和MBC为4个数据的平均值。以上操作均在无菌条件下进行。2丄5实验结果见表6、表7，表6.抗病毒颗粒剂及抗病毒口服液对6种常见致病菌的最低抑菌浓度(MIC)"^菌_)-awjeei抗病毒颗粒剂抗病毒口服液双黄连口服液乳糖酸红霉素(u/ml)表7.抗病毒颗粒剂与抗病毒口服液对6种常见致病菌的最低杀菌浓度(MBC)匿(一抗病毒颗粒剂抗病毒口服液双黄连口服液乳糖酸红霉素(u/ml)2丄6小结以上结果表明，在相同实验条件下，抗病毒颗粒剂与抗病毒口服液对上呼吸道感染常见6种致病菌，各具不同的敏感性，其中抗病毒口服液对金黄色葡萄球菌最敏感(MIC:0.03g/ml，MBC:0.10g/ml),其次是绿脓杆菌(MIC:0.16g/ml，MBC:0.222/ml);抗病毒颗粒剂对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和流感杆菌最敏感(MIC分别为0.04g/ml，0.08g/ml和0.09g/ml，MBC分别为0.035g/ml、0.09g/ml、0.16g/ml)，其次是肺炎链球菌(MIC:0.14g/ml，MBC:0.27g/ml);由此提示，抗病毒颗粒剂总体抑、杀菌活性较强，其次是抗病毒口服液。2.2体内抗炎解热试验2.2.1对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响11金黄色葡萄球菌大肠杆菌绿脓杆菌流感杆菌性链生药浓度0.040.03原液稀释度1:1281:16生药浓度0.36>0.22原液稀释度1:16>1:2生药浓度0.080.16原液稀释度1:801:3生药浓度0.090.22原液稀释度1:641:2生药浓度0.140.22原液稀释度1:481:2生药浓度0.36>0.22原液稀释度1:16>1:21:32>1:21:51:41:61:5<0邻93.7250187O邻<0邻金黄色葡萄球菌大肠杆菌绿脓杆菌流感杆菌链性链生药浓度0.0350.10<0.98原液稀释度1:1601:51:20生药浓度0.36>0.22188原液稀释度1:16>1:2>1:2生药浓度0.090.22250原液稀释度1:641:21:3生药浓度0.160.22500原液稀释度1:401:21:3生药浓度0.27>0.22<0.98原液稀释度1:24>1:21:2.5生药浓度0.36>0.22<0邻原液稀释度1:16>1:21:2炎菌血菌肺球溶球炎菌血菌肺球溶球选用健康雄性大鼠，按体重随机分为模型对照组、抗病毒口服液组(4.9克生药/公斤)及抗病毒颗粒剂三个剂量组(2.4、4.9、和9.7克生药/公斤，分别相当于人临床日量的1倍、2倍和4倍等效量)、阳性对照药阿司匹林组(O.15克/公斤)和双黄莲口服液组(IO亳升/公斤)。给药组每天灌胃给药一次，连续给药3天；模型对照组给予等体积蒸馏水。致炎前按毛细管放大测量法测定各组大鼠右后足正常容积。末次给药后lh，于各组大鼠右后足跖皮下注射lW角叉菜胶0.1ml，分别测定致炎后2h、4h和6h的右后足容积，以致炎前、后足容积差值为肿胀度，给药组与对照组比较，进行统计学处理(t检验)。详见表8。表8抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂的各剂量组对角菜胶致大鼠足跖肿胀影响(x士SD，n=10).组别-剂量致炎后不同时间足肿胀度(ml)(g/kg)2h4h6h模型对照0.30±0.020.28±0.090.22±0.10阿司匹林0.150.12±0.04*'*(60)0.14±0.06**(50)0.11±0.06**(50)双黄莲口服液10ml/kg0.13±0.07**(57)0.15±0.09**(46)0.14±0.05**(36)抗病毒口服液4.90.23±0.05*:*(23)0.22±0.10(21)0.14±0.09(36)抗病毒低剂量2.40.18±0.0》**(40)0.19±0.08*(32)0.14±0.05*(36)颗粒剂中剂量4.90.16±0.05*:*A(47)0.19±0.09*(32)0.13土0.07*(41)高剂量9.70.21±0.09*(30)0.19±0.10*(32)0.13±0.06*(41)注与模艰对照组比较，丰PO.05，^P〈0.0I(t检验):"()"内数字为抑制率。与抗病毒口服液比较，AP<0.05(q检验)；结果表明，抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀均有不同程度的抑制作用，'其中抗病毒颗粒剂的总体抗炎效果较好，各剂量组均能明显抑制致炎后2h、4h、6h的足跖肿胀，与模型对照组比较，差异有显著性意义(P0.05或0.01);抗病毒口服液的总体抗炎效果次之，只有某些剂量在某些时间点有抑制足肿胀作用。2.2.2对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响选用健康雄性昆明种小鼠，按体重随机分为模型对照组、抗病毒口服液成品组(7.0克生药/公斤)及抗病毒颗粒剂三个剂量组(3.5、7.0、和14.0克生药/公斤，分别相当于人临床日量的1倍、2倍和4倍等效量)、阳性对照药阿司匹林组(O.20克/公斤)和双黄莲口服液组(20毫升/公斤)。给药组每天灌胃给药一次(20毫升/公斤)，连续给药5天；对照组给予等^量蒸馏水。末次给药后lh，给小鼠右耳廓涂二甲苯0.03毫升/只，左耳作对照。15分钟后脱颈椎处死小鼠，用直径8mm的打孔器将双耳同部位等面积切下，用精密电子天平称重，以左、右耳片重量之差为肿胀度。详见表9。12表9抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂对二二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(X土SD，n=12)组别剂量(g/kg)耳廓肿胀度(mg)抑制率(％)模型对照21.8±1.6阿司匹林0.2016.6±4.2**23.9双黄莲口服液20ml/kg17.5±2.4**19.7抗病毒口服液7.018.5±3.6*15.1抗病毒低剂量3.519.9±2.3*8.7颗粒剂中剂量7.018.9±2.6**13.3高剂量M.O17.3土3.6**20.6注与模型对照组比较，*P<0.05，"PO.01(t检验)。结果表明，抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀均有不同程度的抑制作用，其中抗病毒颗粒剂三个剂量组均能明显抑制耳廓肿胀，与模型对照组比较，差异有显著性意义(P〈0.05或0.01)。2.2.3对大鼠棉球肉芽肿形成的影响实验选用健康大鼠，按体重随机分为模型对照组、抗病毒口服液组(9.7克生药/公斤)及抗病毒颗粒剂三个剂量组(4.9、9.7、19.5克生药/公斤，分别相当于人临床日量的2倍、4倍和8倍等效量)、阳性对照药氢化可的松组(20毫克/公斤)和双黄莲口服液组(20毫升/公斤)。大鼠在戊巴比妥钠麻醉下，经常规消毒后，在腹部剪一小口，以血管钳扩充皮下组织，将灭菌棉球(重量为10士lmg)植入两侧腹股沟皮下，而后缝合。棉球加青霉素O.lmg，以防感染。术后第二天开始灌胃给药，每天一次，连续给药7天，第8天脱臼处死动物，剥离并取出棉球肉芽肿，剔除脂肪组织，于70'C烘箱干燥1小时后称重，减去棉球重量，即为肉芽肿重量。肉芽肿重量以亳克/IOO克体重表示，结果见表IO。表10抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂对大鼠棉球肉芽肿形成的影响(X士SD)组别剂量动物数肉芽肿重量抑制率(g/kg)(n)(mg/100gbw)(%)对照1197.1±46.3抗病毒口服液9.721137.8±9.4**61双黄莲口服液20ml/kg949.6±19.2*49氢化可的松20ml/kg1037.3±15.4**62抗病毒低剂量4.91033.6±11.0**65颗粒剂中剂量9.7946.1±7.0**53高剂量19.51038.4±1.9**61注与模型对照组比较*P<0.05,"PO.01(t检验)。结果表明，抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂各剂量组对大鼠棉球肉芽肿均有不同程度的抑制作用，其中抗病毒颗粒剂低、中、高剂量均能明显抑制肉芽组织的增生，抑制率分别为65%、53%和61%，与模型对照组比较PO.Ol。2.2.4对干酵母致大鼠发热的影响选用健康雄性大鼠，给药前每日用电子体温计从肛内测体温2次，连续2天，以使大鼠适应操作刺激。选取体温波动不超过0.3。C的大鼠分为16组模型对照组、抗病毒口服液组(4.9克生药/公斤)及抗病毒颗粒剂的三个剂量组(2.4、4.9、和9.7克生药/公斤，分别相当于人临床日用量的1倍、2倍和4倍等效量)、阳性对照药阿司匹林组(0.15克/公斤)和双黄莲口服液组(10毫升/公斤)。给药组每天灌胃给药一次，连续给药3天；模型对照组给予等体积蒸馏水。实验当天给药前每小时测定大鼠体温1次，连续2次，取均值作为正常体温。各鼠给药后立即于颈背部皮下注射20M的酵母悬液10ml/kg，诱发大鼠发热，然后分别测定致-热后4、6、8小时大鼠肛温。结果见表ll。表11抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂的各剂量组对干酵母致大鼠体温升高的影响(X士SD，n=IO)组别-剂量致热后不同时间体温升高值(％)4h6h8h模型对照组18.7±0.562.60±0.442.70±0.56阿司匹林0.150.12±0.35**(94)0.46±0.60**(82)0.76±0.51**(72)双黄莲口服液10ml/kg1.46±0.53(22)2.33±0.53(10)2.46±0.86(9)抗病毒口服液4.9U8±0.68*(37)2.00±0.71*(23)1.98±0.76*(27)抗病毒低剂量2.41.08±0.48**(42)1.79±0.54**(31)2.13±0.36"21)颗粒剂中剂量4.90.88±0.59**(53)1.73±0.58**(33)1.88±0.71*(30)高剂量9.71.30±0.56*(30)1.83±0.58**(30)2.23±0.46(17)注Lj模型对照组比较，*p<0.05,"PO.01(t检验)。"()"内数字为抑制率结果表明，抗病毒口服液及抗病毒颗粒剂的各剂量组对千酵母致大鼠体温升高有不同程度的解热作用，其中抗病毒颗粒剂的总体解热效果较好，各剂量对大鼠致热后4h、6h、8h的体温升高有明显解热作用，与模型对照组比较，差异有显著性意义(PO.05或0.01)。具体实施例方式例1颗粒剂的制备1、提取取广藿香2.9Kg、石菖蒲2.5Kg,装入萃取釜中，在压力28MPa、温度55'C下萃取2小时，收集得挥发油198g,药渣备用。药渣与连翘4.6Kg、板蓝根12.9Kg、郁金2.5Kg、地黄3.2Kg加8倍量80%乙醇，加热回流提取2次，每次2小时，经卧式螺旋卸料过滤离心机放出提取液，合并两次提取液，备用。取知母2.5Kg、石膏5.7Kg、芦根6.1Kg粗粉，加8倍量的水在8(TC下提取2次，每次2小时，经卧式螺旋卸料过滤离心机放出提取液，合并两次提取液，备用。2、浓缩将水提液和醇提液分别在温度为100'C和6(TC真空度为-0.06MPa下减压浓縮成水提和醉提浓縮液合计约11800mL(50'C时测其密度均为1.12g/mL)，同时测定其出膏率，14备用。3、干燥将步骤1的水提和醇提浓縮液合并，加入相当于其干膏量30%的糊精，溶解混匀，得到浸膏12000mL(5(TC时测其密度均为1.15g/mL)，在进风口温度为155165°C、出风口温度为IO(TC、压力为lbar条件下进行喷雾干燥即得9.27Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤1所得挥发油按1比例用无水乙醇稀释，滴入6倍量挥发油重量的p-环糊精饱和溶液中，于5(TC搅拌2小时，搅拌速度为200rpm,静置24小时，抽滤，控制温度在6(TC以下进行真空干燥即得1.39Kg白色粉末状包合物，包合率为70.2%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4所得挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒4(TC热风循环干燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次1~2袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.608mg/g、0.124mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为51pg每袋。例2颗粒剂的制备1、提取取广藿香2.9Kg、石菖蒲2.5Kg,装入萃取釜中，在压力28MPa、温度55。C下萃取2小时，收集得挥发油203g，药渣备用。药渣与连翘4.6Kg、板蓝根12.9Kg、郁金2.5Kg、地黄3.2Kg加10倍量80%乙醇，加热回流提取1次，每次3小时，经卧式螺旋卸料过滤离心机放出提取液，合并，得醇提液56000ml，备用o取知母2.5Kg、石膏5.7Kg、芦根6.1Kg粗粉，加10倍量的水在8(TC下提取1次，每次l小时，经卧式螺旋卸料过滤离心机放出提取液，合并，得水提液28000ml，备用。2、浓縮操作同实施例一,得水提和醇提浓縮液合计约11800mL(50'C时测其密度均为1.12g/mL),备用。3、干燥操作同实施例一，得到浸膏12000mL(5(TC时测其密度均为1.15g/mL)，在进风口温度为160170。C、出风口温度为110。C、压力为1.4bar条件下进行喷雾干燥即得9.25Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤l所得挥发油按l:1比例用无水乙醇稀释，滴入6倍量挥发油重量的P-环糊精饱和溶液中，于4(TC搅拌1小时，搅拌速度为200rpm'静置24小时，抽滤，控制温度在60。C以下进行真空干燥即得1.36Kg白色粉末状包合物，包合率为64.9%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4所得挥发油包合物以及干粉重量1.515倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒40'C热风循环干燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次12袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.596mg/g、0.118mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为49吗每袋。例3颗粒剂的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油202g，水提液和醇提液各28000、56000mL，备用。2、浓縮操作同实施例一，得水提和醇提浓缩液合计约11900mL(50'C时测其密度均为1.11g/mL),备用3、干燥操作同实施例一，得到浸膏12000mL(5(TC时测其密度均为1.15g/mL)，在进风口温度为165175'C、出风口温度为11(TC、压力为1.2bar条件下进行喷雾干燥即得9.27Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤l所得挥发油按l:1比例用无水乙醇稀释，滴入6倍量挥发油重量的(3-环糊精饱和溶液中，于60。C搅拌3小时，搅拌速度为300rpm，静置24小时，抽滤，控制温度在6(TC以下进行真空干燥即得1.38Kg白色粉末状包合物，包合率为67.8%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4所得的挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒40'C热风循环千燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次1~2袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.602mg/g、0.120mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为53pg每袋。例4颗粒剂的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油196g，水提液和醇提液各28000、56000mL，备用。2、浓缩操作同实施例一，得水提和醇提浓縮液合计约11530mL(5(TC时测其密度均为U2g/mL)，备用。3、干燥操作同实施例一，得到浸膏11600mL(50。C时测其密度均为1.14g/mL)，在进风口温度为165175°C、出风口温度为90°C、压力为1.4bar条件下进行喷雾干燥即得9.21Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤l所得挥发油按l:1比例用无水乙醇稀释，滴入8倍量挥发油重量的p-环糊精饱和溶液中，于50'C搅拌1小时，搅拌速度为300rpm，静置24小时，抽滤，控制温度在60'C以下进行真空干燥即得1.42Kg白色粉末状包合物，包合率为72.9%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色千燥粉末与步骤4所得的挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒40。C热风循环干燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次1~2袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.594mg/g、0.116mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为48吗每袋。例5颗粒剂的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油201g，水提液和醇提液各28000、56000mL，备用。2、浓縮操作同实施例一，得水提和醇提浓缩液合计约11860mL(5(TC时测其密度均为U2g/mL)，备用。3、干燥操作同实施例一，得到浸膏12000mL(50。C时测其密度均为U5g/mL),在进风口温度为175185'C、出风口温度为11(TC、压力为1.4bar条件下进行喷雾干燥即得9.20Kg黄褐色千燥粉末。4、包合物的制备取步骤1所得挥发油按1:1比例用无水乙醇稀释，滴入8倍量挥发油重量的P-环糊精饱和溶液中，于60。C搅拌2小时，搅拌速度为300rpm,静置24小时，抽滤，控制温度在60。C以下进行真空干燥即得1.43Kg白色粉末状包合物，包合率为74.3%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4所得的挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醉润湿，制软材，过筛，过筛颗粒4(TC热风循环干燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次12袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.612mg/g、0.122mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为52吗每袋。例6颗粒剂的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油199g，水提液和醇提液各28000、56000mL，备用。2、浓縮操作同实施例一，得水提和醇提浓缩液合计约11800mL(5CTC时测其密度均为1.12g/mL)，备用。3、干燥操作同实施例一，得到浸膏12000mL(5(TC时测其密度均为1.15g/mL)，在进风口温度为165175"、出风口温度为110'C、压力为1.2bar条件下进行喷雾干燥即得9.22Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤1所得挥发油按1:1比例用无水乙醇稀释，滴入8倍量挥发油重量的p-环糊精饱和溶液中，于40'C搅拌1小时，搅拌速度为300rpm，静置24小时，抽滤，控制温度在6(TC以下进行真空干燥即得1.42Kg白色粉末状包合物，包合率为72.1%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精浪匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒4(TC热风循环千燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次1~2袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.602mg/g、0.123mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为5(^g每袋。例7颗粒剂的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油204g，水提液和醇提液各28000、56000mL，'备用。2、浓縮操作同实施例一,得水提和醇提浓缩液合计约11800mL(5(TC时测其密度均为1.12g/mL)，备用。3、千燥操作同实施例一，得到浸膏12000mL(5(TC时测其密度均为1.15g/mL)，在迸风口温度为165175。C、出风口温度为110'C、压力为1.2bar条件下进行喷雾千燥即得9.21Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤l所得挥发油按h1比例用无水乙醇稀释，滴入10倍量挥发油重量的J5-环糊精饱和溶液中，于60。C搅拌1小时，搅拌速度为300rpm，静置24小时，抽滤，控制温度在60。C以下进行真空干燥即得1.44Kg白色粉末状包合物，包合率为75.8%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒4(TC热风循环干燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次1~2袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中芒果苷和连翘苷的含量分别为0.593mg/g、180.116mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为49^g每袋。例8颗粒剂的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油203g，水提液和醇提液各28000、56000mL，备用。.2、浓缩操作同实施例一,得水提和醇提浓缩液合计约11800mL(5(TC时测其密度均为L12g/mL),备用。3、干燥操作同实施例一，得到浸膏12000mL(50'C时测其密度均为1.15g/mL),在进风口温度为175185'C、出风口温度为100'C、压力为1.4bar条件下进行喷雾干燥即得9.26Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤l所得挥发油按l:l比例用无水乙醇稀释，滴入10倍量挥发油重量的p-环糊精饱和溶液中，于4(TC搅拌2小时，搅拌速度为300rpm，静置24小时，抽滤，控制温度在60'C以下进行真空干燥即得1.45Kg白色粉末状包合物，包合率为76.4%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒4(TC热风循环干燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次l2袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.606mg/g、0.126mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为53吗每袋。例9颗粒剂的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油203g，水提液和醇提液各28000、56000mL，备用。2、浓缩操作同实施例一，得水提和醇提浓缩液合计约U850mL(5(TC时测其密度均为1.13g/mL)，备用。3、干燥操作同实施例一，得到浸膏12000mL(5(TC时测其密度均为1.15g/mL)，在进风口温度为155165。C、出风口温度为11(TC、压力为1.2bar条件下进行喷雾干燥即得9.22Kg黄褐色干燥粉末。4、包合物的制备取步骤l所得挥发油按h1比例用无水乙醇稀释，滴入10倍量挥发油重量的j3-环糊精饱和溶液中，于50'C搅拌3小时，搅拌速度为300rpm，静置24小时，抽滤，控制温度在60'C以下进行真空干燥即得1.44Kg白色粉末状包合物，包合率为76.2%。5、制粒将步骤3所得的黄褐色干燥粉末与步骤4所得挥发油包合物以及干粉重量1.5倍量的糊精混匀，加入30%的95%乙醇润湿，制软材，过筛，过筛颗粒4(TC热风循环千燥，整粒。6、灌装、灭菌干燥颗粒灌装成2.5g/袋，灭菌即得。该制剂的用量为每天两次，每次12袋，温水冲服。用高效液相色谱法检测，测得抗病毒颗粒剂中含芒果苷和连翘苷的含量分别为0.607mg/g、0.114mg/g;用气相色谱法检测，测得广藿香醇含量为51pg每袋。例10口服液的制备1、提取操作同实施例一，收集挥发油203g，水提液和醇提液各28000、56000mL，备用。2、浓縮操作同实施例一,得水提和醇提浓縮液合计约11850mL(50'C时测其密度均为1.13g/mL)，备用。3、包合物的制备取步骤l所得挥发油按l:1比例用无水乙醇稀释，滴入10倍量挥发油重量的p-环糊精饱和溶液中，于5(TC搅拌3小时，搅拌速度为300rpm，得到p-环糊精包合液4410g，包合率为76.2%。4、配滤将步骤2所得的抗病毒浓缩液11850mL过滤后，加入蜂蜜4200g、蔗糖5600gp-环糊精包合液4410g混匀，过滤至澄清，加水定容至100L，定容液过滤。5、灌装、灭菌定容液灌装成10mL/支，灭菌即得。该制剂的用量为每天三次，每次12支，口服。用高效液相色谱法检测，测得本发明抗病毒口服液中芒果苷和连翘苷的含量分别为2.86mg/10mL、0.582mg/10mL;用气相色谱法检测，测得广藿香醇的含量为49吗/10ml。例ll对比例原工艺制备的抗病毒口服液1、提取按原抗病毒口服液的处方和工艺，取板蓝根900g、石膏400g、芦根425g、地黄225g、郁金175g、知母175g、石菖蒲175g、广藿香200g、连翘325g，加入8倍量的水，夹层加热煮沸提取3小时，同时收集含挥发油的乳浊液1960mL，备用。提取液过滤分离，备用。药渣再加6倍量的水提取1小时30分钟，提取液过滤分离，与第一次提取液合并，备用。药渣弃去。2、浓縮合并提取液，在65'C以下真空浓縮至相对密度1.12，放冷至室温，于搅拌中缓缓加入85%的乙醇，使含乙醇浓度达70±2%，静置24小时，过滤，取上清液回收乙醇并浓縮至相对密度为1.09(2CTC测)得抗病毒浓縮液合计2100mL，备用。3、配滤将步骤2所得的抗病毒浓縮液11850mL过滤后，加入蜂蜜4200g、蔗糖5600g(3-环糊精包合液4410g混匀，过滤至澄清，加水定容至100L,定容液过滤。4、灌装、灭菌定容液灌装成10mL/支，灭菌即得。该制剂的用量为每天三次，每次1~2支，口服。用高效液相色谱法检测，测得原工艺制备的抗病毒颗粒剂中芒果苷和连翘苷的含量分别为0.183mg/10mL、0.308mgZlOmL;用气相色谱法检测，测得广藿香醇的含量为36呢/10ml。2权利要求1、一种抗病毒组合物的制备方法，该方法包括以下几个步骤(1)取广藿香2.9重量份、石菖蒲粗粉2.5重量份，装入CO2超临界萃取釜中，在压力28MPa、温度55℃下萃取2小时，收集挥发油，留药渣备用；(2)取知母2.5重量份、石膏5.7重量份、芦根粗粉6.1重量份，加水8～10倍，80℃下提取2～3次，每次1～2小时，过滤，合并提取液，在温度为100℃真空度为-0.08～-0.04MPa下减压浓缩成清膏，使其在50℃下的密度为1.05～1.15g/mL；(3)取连翘4.6重量份、板蓝根12.9重量份、郁金2.5重量份、地黄3.2重量份和步骤(1)所得药渣混合，用8～10倍80％乙醇加热回流提取2～3次，每次1～2小时，过滤，合并提取液，将乙醇提取液在温度为60℃真空度为-0.08～-0.04MPa下减压浓缩成清膏，使其在50℃下的密度为1.05～1.15g/mL；(4)取步骤(1)所得的挥发油、步骤(2)和(3)所得的清膏按常规方法制备成常用的制剂。2、根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(4)所述挥发油在用于制备制剂前，经过如下处理用等体积倍的无水乙醇稀释，然后滴入到610倍量挥发油重量的P-环糊精饱和溶液中，于4060'C搅拌35小时，静置24小时。全文摘要本发明提供了一种抗病毒组合物的制备方法，该方法采用二氧化碳超临界提取方法提取广藿香、石菖蒲的亲脂性有效活性成分——挥发油，提取效率为水蒸汽蒸馏法的两倍以上，无溶剂残留毒性，天然活性成分中的热敏成分不易分解破坏，能最大限度的保持提取物天然特征；同时分别采用水、醇提取得到抗病毒复方中的活性部位，提取工艺简单，科学合理，最大限度的提取出药材中的有效成分，去掉杂质性成分，使得药物在原料药相同单位质量内有效成分芒果苷、连翘苷含量分别比现有制备方法提高16倍和2倍。文档编号A61K36/88GK101670074SQ20091019304公开日2010年3月17日申请日期2009年10月13日优先权日2009年10月13日发明者林朝展,祝晨蔯申请人:广州中医药大学